JPH07116238B2

JPH07116238B2 - 抗ガングリオシドＧＤ１ａ単クローン性抗体ＭＺ、これを産生する細胞及びこれから成る試薬

Info

Publication number: JPH07116238B2
Application number: JP62221862A
Authority: JP
Inventors: 靜雄島田; 大二岩田; 若生佐藤
Original assignee: 三井東圧化学株式会社
Priority date: 1987-09-07
Filing date: 1987-09-07
Publication date: 1995-12-13
Anticipated expiration: 2010-12-13
Also published as: JPS6467198A; DE3850325D1; EP0307186B1; DE3850325T2; US5192662A; CA1314246C; EP0307186A3; EP0307186A2

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、ガングリオシドGD_1aに対する単クローン性
抗体、それを産生する細胞、及びそれから成る、ガング
リオシドGD_1aの検出又は定量のための試薬に関する。

〔従来技術及びその欠点〕

従来ガングリオシドに対する単クローン性抗体として
は、GD_1aに対するものは未知である。

糖脂質は細胞の発生、分化、癌化の研究において特に注
目を浴びている生体物質である。糖脂質の中でシアル酸
を含有するスフィンゴ糖脂質を総称して、特にガングリ
オシドと呼び、ガングリオシドGD_1a（以下、単にGD_1aと
いう）もその１つである。

GD_1aはヒト及び種々の動物において特に神経系組織に多
く存在する物質である。癌患者又は自己免疫疾患の１種
である全身性エリテマトーデス（以下SLEという）患者
の血中のガングリオシド組成が健常人のそれとは顕著に
異なることが報告されている（Journal of Biochemistr
y 98巻843頁 1985年）。すなわち、血中に免疫複合体
の形で存在するガングリオシドは、健常人ではその主た
るものがGM₃であるのに対し、癌又はSLEの患者ではGM₃
はほとんどみられず、代りにGM₁やGD_1aが主たるガング
リオシドである。従って、血中のGD_1aを正確に定量する
ことができれば癌又はSLEにかかっているか否かを予想
することができる。

さらにGD_1aはGM₁等と共に脳神経系の主たるガングリオ
シドである。そのため脳神経系に脱髄等の器具的障害を
伴なう諸疾患が発現した場合には、GD_1aが血液中や脳脊
髄液中へ移行することが想定される。そこで、それらに
おけるGD_1aの濃度を定量することにより、器質的傷害を
伴なった脳神経系諸疾患にかかっているか否かをも予想
することができる。

GD_1aの定量、同定及び精製のための手段として、従来の
化学的及び生化学的方法に加えて、GD_1aに対する特異的
な抗体を用いる免疫学的方法が用いられるようになっ
た。従来、GD_1aに対する抗体は、それを適当な担体及び
免疫アジュバントと共にウサギに免疫することにより得
られる抗血清由来のものが使用されてきた。それはいわ
ゆる多クーロン性抗体であり、作られる抗体のロット、
又は免疫に用いられる個体により特異性が必ずしも一定
していないので、その欠点のない単クローン性抗体の取
得が望まれていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本願発明者らは、鋭意研究の結果、従来技術では得られ
ていなかったGD_1aに対して極めて特異的で高い抗体価を
有する抗GD_1a単クローン性抗体を作製することに成功
し、この発明を完成するに至った。

すなわち、この発明は、GD_1aのみを特異的に認識する抗
GD_1a単クローン性抗体を提供する。

さらにまた、この発明は、GD_1aで免疫化した動物由来の
抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞であって、上記
抗GD_1a単クローン性抗体を産生するハイブリドーマを提
供する。

また、この発明は、EBウイルスに感染したリンパ球に由
来し、上記抗GD_1a単クローン性抗体を産生する細胞株を
提供する。

さらに、この発明は、上記抗GD_1a単クローン性抗体から
成るガングリオシドGD_1a検出又は定量用試薬を提供す
る。

〔発明の効果〕

この発明により、GD_1aに対し、極めて特異的で高い抗体
価を有する抗GD_1a単クローン性抗体が提供された。この
単クローン性抗体は、後の実施例において明らかになる
ように、GD_1aに類似した糖鎖を有する他のガングリオシ
ドとは反応せず、GD_1aに対して極めて特異的に反応す
る。従って、この発明の抗GD_1a単クローン性抗体を用い
てGD_1aを極めて感度良く定量することができる。従っ
て、この発明の単クローン性抗体を用いて血中のGD_1aを
感度良く定量することができるので、この発明の単クロ
ーン性抗体を含むこの発明の試薬により、被検者が癌又
はSLE、さらには脳神経系の器質的傷害を伴なう諸疾患
にかかっている蓋然性を感度良く知ることができる。さ
らにまた、この発明により、上記単クローン性抗体を産
生する新規な細胞が提供された。

〔発明の具体的説明〕

この明細書において、糖質、脂質の名称及び結合様式の
表示等は、この分野の研究における一般名あるいは慣用
名に従った。また用いた糖脂質の構造は末尾の第３表に
示した。

この発明の単クローン性抗体は、GD_1aのみと特異的に結
合し、その特異性は極めて高い。すなわち、後の実施例
で明らかになるように、この発明の単クローン性抗体は
GD_1aに対する抗体価が2¹⁶以上と極めて高く、一方、GD
_1aの糖鎖と類似の糖鎖又はそれを有する他の糖脂質、す
なわち、Ga1Cer、LacCer、Gb₃、Gb₄、GA₂、GA₁、GM₃、GM₂、GM
₁、GD_1b、GT_1b、GQ_1b、Fuc-GM₁、nLc₄及びシアロシルnLc
₄（ただし、Galはガラクトース、Cerはセラミド、Lacは
ラクトース、FUCはフコース、nLc₄はパラグロボシドを
示す）に対しては実質的に特異的な反応を示さず、その
抗体価は2²以下である。

この発明の単クローン性抗GD_1a抗体MZは、以下単にMZと
略称するが、GD_1aで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と
骨髄腫細胞との融合におりハイブリドーマを作る方法
（以下ハイブリドーマ法と呼ぶ）又は、ヒトのＢリンパ
球にEBウイルス（以下、EBVという）を感染させて形質
転換を起こさせる方法（以下EBV形質転換法と呼ぶ）の
いずれによっても作製することができる。すなわち、上
記の方法で増殖性を与えられた抗体産生細胞から抗GD_1a
抗体を産生するクローンのみを選別し、単クローンとし
た後、これにより上記特性を有する単クローン性抗体を
分離することにより製造することができる。

ハイブリドーマ法について次に詳細に説明する。この発
明において、ハイブリドーマの作製は、公知の方法、例
えばNature 256巻、495頁、1975年に記載の方法又はそ
の変法（Journal of Experimental Medicine 150巻、10
08頁、1979年）等に準じて行なうことができる。

免疫原として用いるGD_1aを調製する動物種及び臓器は特
定されないが、一般にはGD_1aはそれを多量に含有する、
例えばウシのような動物の脳から調製される。この明細
書で後に記載される実施例及び試験例で使用されたGD_1a
も、特に断らない限り、ウシ脳から公知の方法で分離、
精製されたものである。また、免疫原としては、精製GD
_1aに加えて、それを表面に有する種々の細胞、さらには
GD_1aの抗原決定基である糖鎖部分を含有する物質又は細
胞のいずれを用いてもよい。

GD_1aを免疫する哺乳動物の種類は特に限定されないが、
細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮して選
択するのが望ましく、一般にはヒト、マウス、ラット又
は場合によってはウサギ等が使用される。

GD_1aの免疫にはin vivo及びin vitroの方法のいずれも
が使用できる。in vivoの免疫の場合はGD_1aを生理食塩
液、リン酸緩衝液（以下PBSという）等に適当濃度に希
釈後、これを動物に静脈内、皮下内又は腹腔内注射等に
より投与すればよい。より具体的に述べると、例えば精
製したGD_1aを用いる場合には、これをPBS等で適当濃度
に希釈し、サルモネラ菌ミネソタ株、ウシ血清アルブミ
ン（以下BSAと略）等の通常用いられる担体と共に、こ
れを動物に４〜14日毎に数回から十数回投与し、動物１
個体の総投与量が10〜300μｇ程度になるようにするの
が好ましい。また、in vivoの免疫に膜成分又は細胞自
体を用いる場合も同様にして行なわれ、例えば膜成分を
用いる場合は総投与量が１〜100mg/個体、細胞自体を用
いる場合は総投与量が10⁶〜10⁹個／個体となるようにす
るのが好ましい。この場合、必要に応じては適当な免疫
アジュバンド、例えばフロイントの完全アジュバンドを
用いることができる。このin vivoの免疫の場合、抗体
産生細胞は、脾細胞、リンパ節細胞、腹腔内リンパ球、
又は末梢血リンパ球のいずれであってもよいが最終免疫
４日後の脾細胞を用いるのが最も好ましい。

また、in vitroの系における免疫の場合には、いわゆる
in vitro感作の方法を用いることができる。これは脾細
胞、リンパ節細胞、腹腔内リンパ球及び末梢血リンパ球
のうちから適宜選ばれたリンパ球を免疫原であるGD_1aと
共に約１週間in vitroで培養することにより、GD_1aに対
する抗体産生細胞を出現させることを意図したものであ
る。この場合、GD_1aが精製品であれば細胞培養培地に溶
解させるか、あるいはヒツジ赤血球、リポソーム又はサ
ルモネラ菌ミネソタ株等の適当な担体に吸着させて、リ
ンパ球と共に培養する。また、GD_1aを含有する細胞自
体、又はその膜成分を免疫原とする場合は、培地に溶解
又は懸濁させ、リンパ球と共に培養する。また、細胞自
体を用いる場合は、マイトマイシン処理又は放射線照射
等の処理を行なった後に、リンパ球と培養することが望
ましい。リンパ球の培養用培地はPRMI 1640、ダルベッ
コーのMEM（以下、Ｄ−MEMという）等のリンパ球培養に
通常使用されるものであれば、いずれを用いてもかまわ
ないが、それらは使用時にウシ胎児血清（以下FCSとい
う）を５〜20％の濃度に添加することが望ましい。ま
た、培地には必要に応じて２−メルカプトエタノール
（以下２−MEという）及びポークウィードマイトジェン
（以下PWMという）をそれぞれ５×10^-5Ｍ及び５〜30μg
/mlの最終濃度に加えておくと、効率良くGD_1aのin vitr
o感作を成立させることができる。

リンパ球の培養時の細胞濃度は、培養に用いる器具によ
っても異なるが、一般には10⁶〜10⁷個/mlが好ましい。

免疫原である精製GD_1a、GD_1ae含有細胞及びその膜成分
は、それぞれ１〜20μg/ml、１〜100mg/ml、及び0.1〜1
0mg/mlの最終濃度で使用することが好ましい。

続いて、上記のようにin vivo又はin vitroの系での免
疫により得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合す
る。

骨髄腫細胞としては、既に公知の種々の細胞、例えばマ
ウスにおけるNS−１、P3、P3-U1、X45、X63.6.5.3.、SP
2、ラットにおけるY3、Ag1.2.3等を使用することができ
る。

細胞融合は公知の方法に準じて行なうことができ、例え
ば融合促進剤含有培地中に保温することにより行なわれ
る。

融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール
（以下PEGという）、センダイウイルス等が使用され、
さらに融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等
の補助剤を添加することができる。

リンパ球と骨髄腫細胞との使用比は一般の方法と変りが
なく、例えば骨髄腫細胞に対しリンパ球を約１〜10倍程
度用いればよい。

上記融合時の培地としては、細胞培養に利用される通常
の各種培地が利用でき、通常はFCSなどの血清を抜いて
おくことが好ましい。

融合は、上記免疫細胞と骨髄腫細胞の所定量を上記培地
内でよく混ぜ、遠心後上清を除去し、予め37℃程度に加
温したPEG溶液（PEGは例えば平均分子量1000〜6000程度
のものを使用）を、通常、培地に約30から60w/v％の最
終濃度で加えて混合することにより行なわれる。以後、
適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作
を繰り返すことによりハイブリドーマが形成される。

所望のハイブリドーマの分離は、上記細胞融合の細胞
を、通常のハイブリドーマ選択用培地で培養することに
より行なわれる。前記した骨髄腫細胞株はヒポキサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPR
T）欠損株であり、従つて、HAT培地（ヒポキサンチン、
アミノプテリン及びチミジンを含む培地）中では生育で
きない。それ故、HAT培地中で増殖してくる細胞を選択
すればよい。該HAT培地での細胞の培養は、目的とする
ハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間、
通常数日から数週間を行なえばよい。

このようにして得られるハイブリドーマは通常のクロー
ニング方法、例えば限界希釈法又は軟寒天法を用いて、
目的とする抗体産生株の検索及び単クローン化が行なわ
れる。

該抗体産生株の検索は、例えばELISA法（Japanese Jour
nal of Experimental Medicine 51巻、309頁、1981年）
及びプラーク法、凝集反応法、オクターロニー法、RIA
法等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法に
よって行なわれる。

このようにしてハイブリドーマ法により単クローン性抗
GD_1a抗体産生細胞株が得られる。

次にEBA形質転換法による単クローン性抗GD_1a抗体の作
製について述べる。本法はヒトＢリンパ球にEBVを感染
させると、その各々のＢリンパ球において増殖のみなら
ず、抗体産生が引き起こされるという原理に基づくもの
である。その場合、EBVは特定のＢリンパ球のクローン
のみに働いて上記の効果をもたらすのではなく、基本的
には全てのクローンに働き、それらに増殖及び抗体産生
を引き起こすのである。それ故、本法ではヒトＢリンパ
球にEBVを感染させた後、所望の抗体を産生するクロー
ンのみを選別し、これを用いて所望の単クローン性抗体
を得ることができる。

この方法によるヒトリンパ球の形質転換は、公知の方
法、例えばNature 267巻、52頁、1979年に記載の方法等
に準じて行なうことができる。

Ｂリンパ球を得る臓器は、それがリンパ系臓器であれば
特に限定されないが、ヒト由来の材料という特殊性を考
慮すると、一般には健常人の末梢血リンパ球が用いられ
る。

ウイルス源としてはEBV持続産生細胞、例えばEBV感染マ
ーモセット白血球細胞株であるＢ−95−８細胞（Procee
dings of the National Academy of Science of USA 70
巻、190頁、1973年）の培養上清等を用いることができ
る。

この方法では、先ずＢリンパ球をEBVに感染させるので
あるが、この場合、リンパ球画分からＢリンパ球のみを
特に分離する必要はなく、常法に従って得られるリンパ
球にEBVを感染させればよい。

先ず、リンパ球のペレットにウイルス液をリンパ球１×
10⁷個に対して10ml程度加えて混合し、37℃、５％CO₂の
条件下で１時間保温し、リンパ球をEBVに感染させる。

このようにして得られた感染リンパ球を細胞培養用培地
に分散し、２〜５週間、37℃、５％CO₂の条件下で培養
する。

培養用培地は特に限定されず、RPMI 1640、Ｄ−MEM等の
通常のリンパ球培養用のものであればいずれも用いても
かまわないが、それらに使用時にFCSを10〜20％の濃度
に添加することが好ましい。また、その培地には0.5〜1
mg/mlの最終濃度にグルタミンを加えるさらに効率良く
細胞を増殖させることができる。

このようにして得られる形質転換Ｂリンパ球は、前記ハ
イブリドーマ法の場合と同様な方法で、目的とする抗体
産生株の検索及び単クローン化が行なわれる。

該抗体産生株の検索は、ハイブリドーマ法の場合と同
様、ELISA法、RIA法等の一般に抗体の検出に用いられて
いる種々の方法で行なうことができる。

このようにして、EBV形質転換によってもMZを産生する
細胞株を得ることができる。

上記のこの発明のMZを産生する細胞株は、その取得法が
ハイブリドーマ法又はEBV形質転換法のいずれであって
も、通常の培地で継代培養が可能であり、また、液体窒
素中で容易に長期保存が可能である。

本願発明者は、MZ産生株の一例として、後述の実施例１
で得られたハイブリドーマHbMZ−１を「MZ−１」の名称
で財団法人発酵研究所（大阪市淀川区十三本町２−17−
85）に寄託している（受入番号IFO 50134）。

上記のようにして得た特定の細胞株からこの発明のMZを
得るには、それらの細胞株を常法に従って大量培養し、
その培養上清から分離する方法、あるいは、それらの細
胞株をそれと適合性のある哺乳動物に投与し増殖させ、
その血清又は腹水から分離する方法を採用することがで
きる。

この発明のMZは、GD_1aのみを特異的に極めて高感度に認
識するので、GD_1aの高感度検出又は定量試薬としての用
途を有する。上記したように、癌患者又はSLEという患
者の血中のガングリオシド組成が健常人のそれとは顕著
に異なることが報告されている（Journal of Biochemis
try 98巻 843頁 1985年）。従って、この発明のMZは
また、ガン及びSLE診断試薬としての用途を有する。

MZから成るこの発明の定量試薬を用いたGD_1aの免疫学的
同定及び定量は、一般の生体内物質の免疫学的定量の場
合と同様な方法で行なうことができる。その方法は特に
限定されないが、例えば、ラジオイミュノアッセイ（RI
A）、ELISA、薄層クロマトグラフィー（以下、TLCとい
う）−免疫染色、又は免疫組織化学等が使用できる。ま
た、RIA及びELISAでは、いわゆる競争法又はサンドウィ
ッチ法等が使用できるが、それらに限定されるものでは
ない。

それらの限定されるものではない。

さらに、この発明の試薬を用いたGD_1aの免疫学的同定及
び定量は、癌患者、SLE患者、及び脳神経系に器質的傷
害を有する患者血中のGD_1aのみに適用されるものではな
く、広く、ヒト及び各種実験材料の血中、体液中、臓器
中又は排泄物中GD_1aにも適用可能であることは言うまで
もない。

また、後述の試験例３で示されるように、この発明のMZ
は、他の糖脂質に対する単クローン性抗体と同様に、そ
れにより認識されるエピトープはGD_1aの糖鎖構造であ
る。従って、この発明の試薬は、GD_1aのみならず、GD_1a
の糖鎖構造を有する分子の検出及び定量にも有用であ
る。

後述の試験例４で明らかになるように、癌患者及びSLE
患者の体液中のGD_1a濃度は上昇するが、その変化は正常
状態に比して、せいぜい数倍から10数倍程度である。こ
の程度の変化は、従来の多クローン性抗体を用いては感
度良く検出することができなかった。また、従来の化学
的分析による場合には、ガングリオシドが大量に必要で
あるので、例えば上記Journal of Biochemistry 98巻
843頁 1985年では患者の血液を体外回路により固定化
プロテインＡカラムに通じさせ、そのカラムに免疫グロ
ブリンＧをガングリオシドとの免疫複合体の形で吸着さ
せた後、その複合体を回収し、ガングリオシドを得てい
る。しかしながら、体外回路を形成してこれに血液を循
環させるようなことは癌患者のように体力の低下した者
に対して頻繁に行なうことは実際上不可能である。

この発明の試薬は、感度が極めて高いので、患者から微
量の血液を採取してGD_1aの定量を行なうことができる。
従って、この発明により、癌及びSLEの実用的な診断が
初めて可能になった。

〔発明の実施例〕

実施例１精製したGD_1a100μｇとホルマリン処理サルモネラ菌ミ
ネソタ株（ATCC 9700）400μｇを40℃に保温した生理食
塩液4mlに加え、よく攪拌し、均一な懸濁液とした。得
られた懸濁液を、マウス及びラットに４日毎に１回当り
GD_1a10μｇ含有分づつ、合計４〜15回静脈内投与した。
最終投与の４日後に脾臓を摘出し、脾細胞３×10⁸個とN
S−１マウス骨髄腫細胞（ATCC TIB18）３×10⁷個を50％
ポリエチレングリコール存在下で細胞融合を行なわせ
た。このハイブリドーマを96ウェル平底の培養用プラス
チックプレート（ファルコン（登録商標））に分注し、
HAT培地を含む10％FCS添加Ｄ−MEM培地中で37℃、５％C
O₂の条件下で培養した。ハイブリドーマの増殖が認めら
れたウェルについて、以下に記載するELISA法を用い
て、培養上清中の抗GD_1a抗体の存在の有無を検索した。
ELISA法は96ウェルプラスチックプレート（ファルコン
（登録商標））を用い、先ずエチルアルコールに10μg/
mlの濃度に溶解したGD_1a液0.05mlずつを各ウェルに分注
し、溶媒を自然蒸発させ、GD_1aをプレートに吸着させ
た。その各ウェルに一次抗体としての被検培養上清を反
応させ、よく洗浄の後、二次抗体としてのパーオキシダ
ーゼで標識された抗マウス免疫グロブリン抗体（免疫動
物にマウスを用いた場合）、又は抗ラット免疫グロブリ
ン抗体（免疫動物にラットを用いた場合）を反応させ
た。

引き続き2,2′−アジノビス（３−エチルベンズ−チア
ゾリンスルフォン酸）の２アンモニウム塩（以下ABTS）
を基質としたパーオキシダーゼ反応を行なわせ、各ウェ
ルの発色度を肉眼で、あるいは96ウェルELISA用自動光
度計（波長414nm）を用いて読み取った。

培養上清中に抗GD_1a抗体価が認められたウェルのハイブ
リドーマは、さらに限界希釈法でクローニングを行な
い、単クローンとした。

このようにして得られた単クローン性のハイブリドーマ
はプラスチック培養フラスコで大量培養を行ない、所望
の単クローン性抗GD_1a抗体産生細胞株を得た。これらの
細胞株を免疫抑制剤のプリスタン（2,6,10,14−テトラ
メチルペンタデカン、アルドリッチ社製）で前処理した
ヌードマウスに移植し、得られた腹水から50％飽和硫酸
アンモニウム法により抗体を精製した。

このようにして、単クローン性抗GD_1a抗体を得ることが
できこのものをMZと命名した。後述の試験例で抗体とし
て用いたMZは、マウス由来の単クローン性GD_1a抗体であ
るMZ−１及びラット由来のものであるMZ−２を用いた。
また、このようなMZを産生するハイブリドーマをHbMZと
命名し、この実施例のマウス細胞を用いたハイブリドー
マをHbMZ−１、ラット細胞を用いたものをHbMZ−２と付
番した。

実施例２ヒト末梢血から、フィコールパック（ファルマシア社登
録商標）を用いて常法通りリンパ球（単核細胞）を調製
した後、培地に１×10⁷/mlの濃度に懸濁した。

培地は10％FCS添加RPMI 1640培地を用い、使用時に、さ
らに２−ME及びPWMをそれぞれ５×10^-5Ｍ、及び30μg/m
lの最終濃度に含有させて使用した。続いて、マールブ
ルック型培養瓶（Lancet 2巻、1279頁、1967年）の内筒
に１×10⁷/mlの濃度のリンパ球懸濁液を1ml、外筒にPWM
を含まない培地10mlをそれぞれ加え、内筒液と外筒液の
境界に透析チューブを張った。

GD_1aは内田らの方法（Journal of Biochemistry 87巻、
1829頁、1980年）に準じて作製した卵黄レシチン及びコ
レステロールから構成されるリポソームに取り込ませ、
５μg/mlのGD_1aの最終濃度で培養瓶の内筒に加えた。

かくして、リンパ球をGD_1aと共に37℃、５％CO₂の条件
下で６日間培養した。続いて、実施例１に記載したもの
と同様な方法でマウス骨髄腫細胞NS−１との細胞融合及
びMZ産生ハイブリドーマのクローニングを行ない、MZ産
生株１クローンを得、これにはHbHZ−１と付番した。

なお、本実施例の場合、ELISA法における二次抗体はパ
ーオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を用い
た。

実施例３先ず、EBVを持続的に産生放出しているＢ−95−８細胞
（ATCC CRL1612）を、グルタミンを0.86mg/mlの最終濃
度に含有し、さらに20％FCSが添加されたRPMI 1640培地
（以下、完全培地と呼ぶ）中に３×10⁵/mlの濃度に懸濁
し、37℃、５％CO₂の条件下で培養した。７日後に得ら
れる培養上清を以下に使用するウイルス液とした。

続いて、常法に基づき、フィコールパック（登録商標）
を用いて得られたリンパ球のペレットにウイルス液を、
リンパ球１×10⁷個に対し10mlの割合で加え、混合し、3
7℃、５％CO₂の条件下で１時間保温した。このEBV感染
リンパ球を２×10⁵〜６×10⁵/mlの濃度で完全培地に懸
濁し、それを平底の96ウェル培養用プラスチックプレー
ト（ファルコン（登録商標））の各ウェルに0.1mlづつ
分注し、37℃、５％CO₂の条件下で培養を開始した。そ
の４日後に各ウェル当り0.1mlづつ新鮮な完全培地を加
えた。その後、３〜４日毎に培養上清の半量を新鮮な完
全培地と交換し、培養を継続した。２〜４週間後、細胞
増殖のみられたウェルの培養上清中の抗GD_1a抗体価を前
記実施例１で述べたELISA法を用いて測定した。なお、
この場合、二次抗体は、パーオキシダーゼ標識抗ヒト免
疫グロブリン抗体を用いた。

上清中に抗GD_1a抗体価の認められたウェルの細胞を24ウ
ェル培養プレート、６ウェル培養プレート、6cmプラス
チックディッシュの培養上清中に抗GD_1a抗体価の認めら
れたものについて、常法に従って軟寒天法でクローニン
グを行ない、単クローン性の抗GD_1a産生細胞株１クロー
ン得、これを細胞株HZ−１と命名した。

この細胞株を大量培養して得られる培養上清から、50％
飽和硫酸アンモニウム沈殿法により本発明のMZを得、こ
れにMZ−３と付番した。

試験例１実施例１で得られMZ−１及びMZ−２の免疫グロブリン抗
体のクラスをELISA法により決定した。すなわち各MZに
パーオキサシダーゼで標識されたマウス免疫グロブリン
の各クラスに対する抗体を反応させ、続いてABTSを基質
としてパーオキシダーゼ反応を行なわせた。

その結果、MZ−１及びMZ−２は、いずれもIgMのクラス
に属するものと判明した。

試験例２実施例１及び３で得られた各MZの種々の糖脂質に対する
反応性をELISA法を用いて検討した。用いた糖脂質はGD
_1aの他に、類縁構造を有するGalCer（ウシ脳由来）、La
cCer（ウシ脳由来）、Gb₃（ヒト赤血球由来）、Gb₄（ヒ
ト赤血球由来）、GA₂（ウシ脳由来）、GA₁（ウシ脳由
来）、GM₃（ウシ脳由来）、GM₂（ウシ脳由来）、GM
₁（ウシ脳由来）、GD_1b（ウシ脳由来）、GT_1b（ウシ脳
由来）、GQ₁₆（ウシ脳由来）、Fuc−GM₁（ラット赤血球
由来）、nLc4（ヒト赤血球由来）、及びシアロシルnLc4
（ウシ赤血球由来）である（構造は末尾の第３表に示
す）。各糖脂質に対する抗体価は、ELISAで発色が肉眼
で認められる最大の希釈倍数（以下２の累乗の形で表わ
す）で示した。

その結果は、各MZのいずれもがGD_1aに対し高い抗体価を
示した。即ち、実施例１により得られたMZではGD_1aに対
する抗体価は2¹⁸であり、同実施例３のもので2¹⁶であっ
た。しかしながら、その他の糖脂質に対しては、いずれ
の抗体も反応しなかった（抗体価は、全て2²以下）。

試験例３上記各実施例で得られた各MZの糖脂質特異性をTLC−免
疫染色法を用いてさらに検討した。本法はシリカゲルの
TLCで糖脂質を分画した後、ELISA法と同様の原理を用い
て、その薄層プレート上で免疫染色を行なうものであ
る。この方法では、糖脂質検出の感度は非常に高く、か
つ、各糖脂質に微量混入する物質への反応を否定できる
利点がある。それ故、糖脂質に対する抗体の特異性を検
討するには、最も優れた方法の１つとして現在この分野
の研究で汎用されている。

本実施例では、東らによって報告された方法（Journal
of Biochemistry 95巻、1517頁、1934年）に準じてTLC
−酵素免疫染色を行なった。

先ず、GD_1aを始めとする各糖脂質（由来は試験例２の項
に記載に同じ）をシリカゲルの薄層プレート（マッヘラ
イ・ナーゲル社製、ポリグラム・シルＧ）にスポットし
た。

クロロホルム−メチルアルコール−0.25％塩化カリウム
（50:40:10、v/v）の溶液を溶媒として約25分間の展開
を行なった。展開後の各糖脂質の位置をオルシノールに
より求めた。

オルシノール反応用と並行して免疫染色用の展開を同時
に行ない、以下の方法で染色した。先ず、展開後の薄層
のプレートに１次抗体として実施例１及び実施例３で作
製した各MZ又は多クローン性抗GD_1aウサギ抗体のいずれ
かを反応させた。多クローン性抗GD_1aウサギ抗体は、公
知の方法でGD_1aをウサギに免疫し、追加免疫の２週間後
に採血して得られた抗血清を用いた。続いてマウス、ヒ
トあるいはウサギの免疫グロブリンに対する抗体（いず
れもパーオキシダーゼ標識）を適宜選択し、二次抗体と
してプレートに反応させた。さらに、基質として、４−
クロロ−１−ナフトールを用いてパーオキシダーゼ反応
による発色を行なわせた。

その結果は、第１表に示すように、この発明のMZは、い
ずれもGD_1aのスポットにのみ反応した。対照に用いた多
クローン性抗GD_1a抗体はGD_1aのみならず、GM₁及びGD_1a
とも反応した。

以上の結果から、実施例１で得られたMZもさらに実施例
３で得られたMZのいずれもGD_1aのみの特異的なものであ
ることが示された。さらに、その点において、それらの
単クローン性抗GD_1a抗体は、これまでの公知の方法で作
製され、使用されてきた多クローン性抗GD_1aウサギ抗体
に対して高い有意性を示すものである。

また、この実施例の結果から、この発明の単クローン性
抗GD_1a抗体はSAα２→3Ga1β１→3Ga1NAcβ１→４〔SA
α２→３〕Ga1β１→4Glcの糖鎖構造を認識するものと
結論される。

試験例４プロテインＡを固定したポリスチレンボールをガラスの
試験管に入れ、さらにその中に癌又はSLE患者の血清1ml
を入れ、４℃で１晩放置した。ポリエチレンボールを洗
浄後、0.3Mグリシン−塩酸緩衝液（pH2.8）により免疫
複合体がプロテインＡから解離すると共に、免疫複合体
自身もGD_1aと免疫グロブリンＧに解離する。試験管から
ポリスチレンボールを除去し、試験管にクロロホルム−
メチルアルコールの混液（2:1,v/v）12mlを加えよく振
盪した。遠心後、下層のクロロホルム層の画分を取り、
蒸発乾固させた。これを適当量の１％BSA含有PBSに溶解
し、下記のGD_1a測定用の検体とした。

GD_1aの測定は次に述べるELISA法を用いた。先ず、96ウ
ェルのマイクロタイトレーションプレート（以下プレー
トという）の各ウェルに検体液100μｌを入れ、続い
て、この発明のMZを結合したポリスチレンボールを加
え、プレートを37℃で３時間保温した。プレートを洗浄
後、さらに１％BSA及び0.05％ツイーン20（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレイト）含有PBSに溶解し
たビオチン化MZ（ビオチン化は常法により行なった）10
0μｌを加え室温で１時間反応させた。さらに洗浄後、
１％BSA及び0.05％ツイーン20含有PBSに溶解したパーオ
キシダーゼ標識アジビンを加え室温で１時間反応させ
た。洗浄後、ABTSを基質としてパーオキシダーゼ反応を
行なわせ、各ウェルの発色度を96ウェルELISA用自動光
度計（波長414nm）を用いて測定した。前記実施例２に
記載の方法でGD_1aをリポソームに封入し、それを用いた
標準曲線に基づいてGD_1a濃度を求めた。

その結果は、図面に示す通り、癌患者及びSLE患者にお
いては健常人と比較して高い値を示した。また、その場
合、GD_1aの高値は癌の種類に関係なく認められた。な
お、図において、縦軸のGD_1a濃度はある濃度単位（U/m
l）に補正して表わされているので試料相互間での相対
的な関係を示しているものである。

このように、この発明の単クローン性抗GD_1a抗体及びそ
れを使用した血中GD_1a測定系は、癌及びSLEの診断に極
めて有用なものである。

試験例５本試験例では、脳の脱髄等の器質的傷害を伴なうヒトの
疾患である多発性硬化症の動物モデルである実験的アレ
ルギー性脳脊髄炎の発症過程における血中GD_1aの濃度
を、本明細書の実施例１で得られた単クローン性抗GD_1a
抗体を用いて測定した。

まず、１群５匹の体重180g前後の雌性ルイス（Lewis）
系ラットの両後足蹠部に、モルモット脊髄とフロイント
の完全アジュバント（以下FCAと呼ぶ）のエマルジョン
を投与した。その１〜４週間後に採血し、血中のGD_1a濃
度を定量した。GD_1aの定量は実施例１で得られた単クロ
ーン性抗GD_1a抗体MZ−２を用いたELISA法（詳細は前記
実施例４に記載）により行なった。

結果は第２表に示すが、表中GD_1aの濃度はある濃度単位
（U/ml）に補正された値の、５匹の平均値であるので試
験区間での相対値を示すものである。本試験例の動物モ
デルにおいては、モルモット脊髄とFCAによる惹起投与
の約３週間後頃から、ラット脳内に脱髄現象が起こるこ
とが知られている。第２表に見られる様に、血中GD_1a濃
度は、モルモット脊髄とFCAの投与群において、投与の
３週後から血中にその上昇が見られた。

この様に、本発明の単クローン性抗体は脱髄などの脳神
経系の器質的傷害を伴なう諸疾患の診断に応用可能であ
ることが示された。

また、本試験例４及び５ではポリスチレンボールに結合
された「不溶化」抗体、及びビオチンで標識された抗体
としては、いずれもこの発明の単クローン性抗体を用い
たが、この場合は、１〜10ng/mlという極めて低いGD_1a
濃度範囲で直線の標準線が得られた。

一方、用いた不溶化抗体及び標識抗体が、いずれも従来
より使用されてきた多クローン性抗GD_1aウサギ抗体の場
合は、10〜100ng/mlの濃度範囲で直線の標準線が得られ
た。

また、不溶化抗体としてこの発明の単クローン性抗体GD
_1a、標識抗体として多クローン性抗GD_1aウサギ抗体を用
いた場合は５〜50ng/mlの濃度範囲で直線の標準線が得
られた。

このように、本試験例４及び５に用いた、いわゆるサン
ドウィッチ法によるGD_1aの測定では、単クローン性抗体
を用いることにより測定感度が上昇した。

また、いわゆる競争法によるGD_1aの定量においても、多
クローン性抗GD_1a抗体を用いた場合は10〜100ng/mlのGD
_1a濃度で直線の標準線が得られたが、この発明のMZを用
いると３〜30ng/mlの範囲で直線の標準線が得られた。

上記のように、GD_1aの測定にこの発明の単クローン性抗
体を使用したところ、多クローン性抗体使用の場合に比
較して、高い測定感度の測定系が得られた。それによ
り、従来、多クローン性抗体を用いた測定系では、測定
が不可能であった疾患状態における体液中GD_1a濃度の変
動を検出することが可能となった。このことも、従来の
多クローン性抗GD_1a抗体に対するこの発明の単クローン
性抗GD_1a抗体であるMZの優れている点である。

【図面の簡単な説明】

図面はこの発明の単クローン性抗GD_1a抗体MZ−１を用い
たELISA法により求めた各種癌患者及びSLE患者血中のGD
_1a濃度の個々の値を示すものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗ガングリオシドGD1a単クローン性抗体で
あって、GD1aを認識し、Ga1Cer、LacCer、Gb₃、Gb₄、GA₁、
GA₂、GM₁、GM₂、GM₃、GD_1b、GT_1b、GQ_1b、Fuc-GM₁、nLC₄及びシ
アロシルnLC₄を実質的に認識しない単クローン性抗体M
Z。
【請求項２】GD1aに対する抗体価が2¹⁶以上である特許
請求の範囲第１項記載の単クローン性抗体MZ。
【請求項３】GD1aを認識し、Ga1Cer、LacCer、Gb₃、Gb₄、
GA₁、GA₂、GM₁、GM₂、GM₃、GD_1b、GT_1b、GQ_1b、Fuc-GM₁、nLC₄及
びシアロシルnLC₄を実質的に認識しない抗ガングリオシ
ドGD1a単クローン性抗体MZを樹脂表面に吸着させた反応
試薬より構成されたことを特徴とするGD1a反応試薬。