JPH06107695A - 新規ヒト血液細胞関連抗原及びそれを認識する単クローン抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ナチュラルキラー活性を有する顆粒大リンパ球
性白血病細胞を抗原として感作された動物の脾臓細胞と
骨髄腫由来の細胞とを融合してつくられるハイブリドー
マ細胞ラインを培養して得られることを特徴とする新規
単クローン抗体および該抗体によって認識されるヒト血
液細胞関連抗原。 【効果】本発明の単クローン抗体は、ＬＧＬ白血病およ
び赤芽球癆の診断・治療を確実に行うことができ、さら
にパラフィン包埋組織切片中の抗原も検出できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト血液細胞関連抗原
および該抗原を認識し、血液関連疾患の診断、治療に利
用できる有用な単クローン抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】末梢血白血球分画中にあるリンパ球で細
胞質／核比が大きく細胞質の中にアズール顆粒を多く含
む顆粒大リンパ球（ｌａｒｇｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｌ
ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：以下ＬＧＬと略す）はナチュラル
・キラー（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ：以下ＮＫと
略す）活性および抗体依存性細胞障害活性（ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔ
ｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有し、ウィルス・
バクテリア・真菌感染に対する防御に働く抗腫瘍免疫監
視機構の主要担当細胞である。ナチュラル・キラー活性
は、特定の抗原で感作されなくても動物種を超えて広範
な腫瘍性標的細胞、なかんづくリンパ腫細胞を殺すこと
ができること、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ
ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌ
ｅｘ，ＭＨＣ）の制約を受けないことが特徴であり、古
典的な細胞障害性Ｔ−細胞が有するキラー活性とは明ら
かに異なるとされている。ＬＧＬは以上の活性以外に
は、赤血球造血の母細胞たる赤芽球系幹細胞の増殖を抑
制し生体内における赤血球数を一定に保持するのに一役
かっている。

【０００３】ところで、Ｔ細胞性慢性白血病（Ｔ−ｃｈ
ｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉ
ａ，Ｔ−ＣＬＬ）患者の末梢血中にこのＬＧＬの形態を
有するものがあることが１９７５年頃より知られるよう
になってきた。さらに症例を重ねるにつれ、この白血病
の末梢血中の白血球画分は種々のＬＧＬの特徴を備えて
いることが明らかとなり、ＬＧＬ白血病と呼ばれるよう
になった（田川他、総合臨床３３，１３１１−１３１
３，１９８４）。

【０００４】一方、赤芽球癆（Ｐｕｒｅ ｒｅｄ ｃｅ
ｌｌ ａｐｌａｃｉａ：以下ＰＲＣＡと略すことがあ
る）は、極めて強い貧血を来す疾患で、通常の貧血とは
異なり、現在の医学ではいかなる治療でも改善がみられ
ることは稀で、頻回の輸血以外に有効な治療法がない難
病である。この患者の末梢血の白血球画分中にはＬＧＬ
のみが残存していることが特徴であり、次に述べるよう
にこれらの残存ＬＧＬ細胞が疾患に関与しているらし
い。

【０００５】即ち、赤芽球癆患者は骨髄中にも赤芽球が
完全に消失しており、赤芽球コロニーの形成が非常に悪
い。（なお、赤芽球は赤血球へ分化する母細胞であり、
赤血球の生育をみる方法としては、現在赤芽球コロニー
法と呼ばれる方法が一般に用いられている）。ところ
が、この骨髄中からＬＧＬを除去すると赤芽球コロニー
の形成が正常になるところから、上記末梢血中の残存Ｌ
ＧＬが病気の原因となっていることが推定されている。

【０００６】このＬＧＬはヒト血液細胞関連抗原のうち
ＣＤ１６（ＣＤ番号については後述する）が陽性である
ことが知られている。さらにＬＧＬ分画自体は、さらに
多様な表面抗原及び細胞機能を有する亜分画からなりた
っているが、これら健常人の末梢血中の約１５％をも占
めるＣＤ１６陽性分画がすべて赤芽球系コロニーの抑制
作用を有しているか否かは不明であり、この抑制に特異
的なＬＧＬ分画を識別可能な新抗原が探し求められてい
る。今日、細胞分画の解析にはセルソーターなどの細胞
分離装置が利用されるが、それを使用するにしても亜分
画を構成する細胞を有効に識別できる抗体が必要とな
る。

【０００７】抗体の品揃えはがんの診断法の進歩にも重
要である。今日、種々のがんの補助診断法が考案され、
それに対応する機器の開発の進歩が著しいが、依然とし
て組織診断が最も確定的な診断方法である。病理組織は
凍結検体が大量に使用可能であれば種々の抗体による染
分けが可能であるが、通常大量の凍結検体は得られな
い。病理組織は通常ホルマリン等で固定した後パラフィ
ン中に包埋され、薄層切片に切りとられ、種々の染色法
で染色される。特定の抗体が使用できれば、対応する抗
原をマーカーとして特定の細胞の存在・分布を調べるこ
とにより、より正しい診断が可能であるが、パラフィン
切片を染色できる抗体はごく少数のものしかない。その
意味から、臨床における診断の確実性の向上のために、
パラフィン包埋した組織を組織染色できるさらに多くの
抗体の提供が望まれている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】細胞分類の方法のひと
つに単クローン抗体を用いた膜表面抗原の検索法があ
る。ヒト血液細胞関連抗原として数多くの抗原が知られ
ており、それらはＷＨＯのワークショップの認定に従っ
てＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ
ａｔｉｏｎ）名として統合されている。現在まで国際規
準に従って８０近いＣＤ番号が登録されているが、現在
までに登録されたＣＤ番号のみですべての血液関連の疾
患を説明することは可能ではない。特にＬＧＬ白血病細
胞については、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５７等の種々
の抗原が発現しているとの報告があり、更に新しい抗原
が見出されれば、ＬＧＬ白血病および赤芽球癆の診断・
治療を確実に行うことができると期待される。

【０００９】かつ赤芽球癆では今まで、その末梢血リン
パ球に特異的な抗原が見出されていないので、そのよう
な抗原が見出されれば診断はもとより原因究明および治
療に極めて有用な手段となると期待される。

【００１０】また、現状では未固定の生きている血液細
胞の表面にある血液細胞関連抗原（一般にはＣＤ抗原と
して定義されている）と反応する抗体は種々作製されて
おり、これらを用いて凍結切片を染色することは可能で
ある。しかしながら、ホルマリン固定後のパラフィン切
片と反応する抗体は少数である。一方、保存されている
検体については、パラフィン包埋されたものが大部分を
占める。現在市販されておりパラフィン切片の染色に利
用可能な単クローン抗体は、Ｂリンパ球細胞を染色する
ＭＢ−１、Ｔリンパ球細胞を染めるＵＣＨＬ−１、抗Ｃ
Ｄ−３抗体に限られている。さらに詳しく説明すればＭ
Ｂ−１抗体はＣＤ４５ＲＡ抗原と反応し、分離した未固
定のリンパ球では、Ｔ、Ｂ、Ｎｕｌｌ細胞上の抗原と結
合するが、ホルマリン標本ではＢ細胞だけを染める。Ｕ
ＣＨＬ−１は未固定のリンパ球ではＣＤ４５ＲＯ抗原と
反応し、ホルマリン標本ではＴ細胞を染める。また抗Ｃ
Ｄ−３抗体のホルマリン標本に対する染色性はあまり良
くない。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記の諸問題を解決する
ため、本発明者らはＮＫ活性を有するＣＤ１６陽性ＬＧ
Ｌ白血病でありかつ赤芽球癆を併発している患者の白血
病細胞（以下ＮＫ−ＬＧＬ細胞と略す、細胞の特性につ
いてはＢｌｏｏｄ，６８，８４６，１９８６；Ｂｌｏｏ
ｄ，７１，１１６１，１９８８に記載されている）に着
目し、この細胞に対する単クローン抗体（ｍＡｂ）を、
ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５
６，４９５−４９７，１９７５）による単クローン抗体
の取得方法にしたがって作製した。

【００１２】正常末梢血中のＬＧＬ細胞ではなくＮＫ−
ＬＧＬ細胞を原料とした理由は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌ
ｓｔｅｉｎの方法は、特定の抗原を精製せずに細胞表面
に表出している未知の抗原に対する抗体を作製するのに
有益な方法であるとは言え、正常末梢血中のＬＧＬ細胞
は均一ではなく特定の抗原を有する細胞のみを大量に調
製するのは困難である。これに比し、がん細胞や白血病
細胞は個々の症例のがん細胞、白血病細胞について言え
ばある単一細胞が単クローン性に増加している。したが
って、ある特定の生物活性を有する抗原を認識する単ク
ローン抗体の作製を意図した場合に、その生物活性を有
している白血病細胞を用いれば、抗原精製の過程を経る
ことなく作製できる利点がある。さらに生物活性がある
ことは判明しているが、いかなる抗原がその活性を発現
しているのか不明の場合には、この方法が唯一無二の方
法でもある。上記の理由を勘案して、白血病細胞自体を
抗原として用いることにした。即ち、ＫｏｈｌｅｒとＭ
ｉｌｓｔｅｉｎによって開発された単クローン抗体の作
製には必ずしも抗原の純度はあげる必要はないが抗原が
存在していれば何でもよいという訳ではない。まず第一
条件としてその抗原が生体内で異物として十分に認識さ
れ得るだけの抗原性および／または抗原量（質と量）が
必要である。ｍＡｂ ＬＨ４９２６抗原はＮＫ−ＬＧＬ
細胞のみに特異的ではないが、ＮＫ−ＬＧＬには特に豊
富に存在した結果本抗体を作製し得たと考えられる。

【００１３】さらに、生じた多数のクローンから本発明
の抗体をスクリーニングする段階で、ヒト結腸がん細胞
・肺がん細胞・メラノーマ細胞を用いてこれらに反応す
るクローンを除外した。さらにＴ−ＬＧＬ白血病細胞
（ＮＫ活性は陰性であるが、その他の既存の共通抗原Ｃ
Ｄ３・ＣＤ４・ＣＤ８を表面上にもつ細胞：以下Ｔ−Ｌ
ＧＬと略す）を用い、これらと反応しないクローンを選
別したのち免疫沈降法・結合阻害試験・二重染色法など
の免疫学実験法を実施し、既存の抗原との異同を明らか
にし本発明の抗体を完成させるにいたった。Ｔ−ＬＧＬ
細胞をスクリーニングに用いたことは重要である。この
方法により既存の抗原と反応する抗体を有効に除外し得
た。

【００１４】本発明の単クローン抗体を産生するハイブ
リドーマの一つはｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＬＨ４９２６
ＳＢＭ３２５と命名されて、工業技術院微生物工業技術
研究所に１９９２年２月２５日付けで、ブダペスト条約
の条件下に微工研条寄第３７６７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３７６７）として寄託された。ｍＡｂ ＬＨ４９２６
は、ＮＫ−ＬＧＬ画分に対して極めて強い反応を示す
が、さらに、骨髄／マクロファージ系細胞株Ｕ９３７
（９９．７％）、ＨＬ−６０（８．５％）、ＴＨＰ−１
（６．１％）、エプシュタイン・バー・ウイルス陰性バ
ーキット細胞株ＢＭ２Ｂ（３０．１％）とも反応する。
さらに健常者末梢血中のリンパ球３０％、Ｔ細胞（１
８．９％）、Ｂ細胞８２．５％、ＣＤ５６陽性細胞５
９．０％、ＣＤ１６陽性細胞（７２．２％）とも反応す
る。

【００１５】本発明の単クローン抗体（例えばｍＡｂ
ＬＨ４９２６）および本発明の抗体が認識する抗原（以
下、ＬＨ４９２６抗原と呼ぶ）は、次の事実より新規で
ある。ＬＨ４９２６抗原は、ｍＡｂ ＬＨ４９２６を用
いた免疫沈降法によりＮＫ−ＬＧＬ分画およびマクロフ
ァージ系細胞株Ｕ−９３７から単離され、還元状態で分
子量２２０ｋＤａ，１８０ｋＤａに泳動される。これと
類似の分子量をもつ既存の抗原としては、ＣＤ４５（分
子量２２０，２０５，１９０，１８０ｋＤａ）およびＣ
Ｄ５６（分子量２２０，１３５ｋＤａ）が知られてい
る。しかしＣＤ４５抗原については、公知の抗ＣＤ４５
抗体、例えばｍＡｂ ＵＣＨＬ−１によって認識される
抗原が、ｍＡｂ ＬＨ４９２６によって認識されないこ
と、およびＣＤ５６抗原については、その健常者末梢リ
ンパ球との反応性が、ｍＡｂ ＬＨ４９２６の過剰な存
在により影響を受けないことから除外し得た。よってＬ
Ｈ４９２６抗原は新規抗原であると判断される。

【００１６】本発明の抗体は血液関連細胞の型分類を一
層細分化することが期待できる。

【００１７】例えば、末梢血リンパ球中のＬＧＬ細胞の
種々の亜分画を分類するために、本発明の抗体をＬＧＬ
細胞を認識する他の種々の抗体（例えば抗ＣＤ１６、抗
ＣＤ５６、抗ＣＤ５７）と組み合わせて用い、容易にＬ
Ｈ４９２６抗原をもつ細胞と他細胞とを区別することが
可能である。これらの分類で得られた知見をＬＧＬ白血
病の型分類に応用すれば的確な治療方針のたて方も可能
となり得る。

【００１８】また、本発明の抗体は赤芽球癆の患者末梢
血リンパ球に特異的に反応することから、赤芽球癆の診
断に大いに貢献すると期待される。

【００１９】さらに、本発明の抗体の利用としては、螢
光強度を利用した細胞識別・分画装置への応用、本発明
の抗体が認識する抗原を表現している特定血液細胞画分
の除去、また逆にそのような細胞を特異的に補集する目
的に応用可能である。

【００２０】さらに、本発明の抗体は、ホルマリン等で
固定した後パラフィン中に包埋した切片中の抗原を識別
することができる。したがって、本発明の抗体を用い、
がん患者組織のパラフィン切片を染色して浸潤している
リンパ球を同定することができ、がんの診断がより簡便
にかつ適切になされるため、正しい治療方法に結びつけ
ることが可能である。パラフィン切片標本の保存は簡便
なために、多くの病院・研究所にも非常に大きなストッ
クがある。したがって、本発明の抗体を用いれば、国や
場所によらず、さらに過去にさかのぼってもがんの正し
い診断が可能である。本発明の抗体でパラフィン包埋組
織切片中の抗原を検出するには、例えば酵素抗体法を用
いることができる。すなわち、本発明の抗体を一次抗体
としてホルマリン固定後のパラフィン切片に反応させ、
次に本発明の抗体を抗原として認識する適切な二次抗
体、例えば酵素標識ヒツジ抗マウス抗体を反応させ、そ
の酵素に対する基質を用いて一次抗体の局在を判定する
ことができる。

【００２１】一次抗体及び二次抗体を溶解または希釈す
る緩衝液としては、常法に従って、例えばリン酸緩衝
液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いることができ
る。

【００２２】二次抗体の検出・測定は任意の常法に従っ
て行うことができる。二次抗体自体を例えば放射性核
種、蛍光物質、酵素等により標識しておき、直接または
間接的に検出・測定することが可能である。また、二次
抗体に対して特異的な三次抗体を用い、この三次抗体を
種々の方法により標識して検出・測定してもよい。

【００２３】三次抗体としては、二次抗体の調製に用い
た動物の種と異なる種の動物の抗体であって、二次抗体
の調製に用いた動物種の免疫グロブリンに対するもの又
はその断片が用いられる。例えば、二次抗体がウサギを
用いて調製された場合、三次抗体としてウサギ免疫グロ
ブリンに対するヤギの抗体を用いることがてきる。

【００２４】二次または三次抗体を標識するため、常用
の標識物質、例えば放射性核種、例えば¹²⁵I、 ³Ｈ、¹⁴
Ｃ；蛍光物質、例えばフルオレッセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド；酵
素、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、ウレアーゼ等を用いることができる。酵素
の検出には、その酵素に対応する基質、好ましくは発色
性の酵素基質が用いられ、例えば酵素としてパーオキシ
ダーゼが用いられる場合、その基質として過酸化水素、
発色試薬として、例えばオルソフェニレンジアミン、
３，３' ，５，５'−テトラメチルベンジジン等が用い
られる。

【００２５】本発明は組織のパラフィン包埋切片中の白
血病細胞抗原の検出用キットをも提供し、このキットは
少なくとも本発明の単クローン抗体を含んで成る。単ク
ローン抗体は溶液状又は凍結乾燥品でもよく、あるいは
固体担体に固定されたものでもよい。キットが固体担体
に固定されたモノクローナル抗体を含む場合、この固体
担体は好ましくはブロッキング剤により処理された後の
ものである。

【００２６】測定キットはさらに、第二の要素として二
次抗体、場合によっては三次抗体を含むことができる。
また、第三の要素として反応の有無を検出する試薬を含
むことができる。この場合の二次抗体または三次抗体の
標識が酵素である場合は、該酵素の基質を含む発色試薬
をキットに含めることもできる。しかしながら、酵素標
識された抗体及び対応する発色試薬等の検出試薬は市販
品を使用することもでき、本発明のキットの必須要素で
はない。

【００２７】本発明の測定キットはまた、任意的要素と
して、各種の試薬希釈用緩衝液、洗浄液等を含むことが
できる。

【００２８】本発明の抗体のホルマリン固定後の抗原と
の反応性は、上記抗体中、ＭＢ−１と異なる。またＵＣ
ＨＬ−１とは異なるエピトープ（抗原決定基）と反応す
る。したがって、組織標本の細分類に大きく貢献するこ
とが期待される。さらには特定の疾病の診断がより的確
になされることも期待される。例えば、白血病の中でも
ＬＧＬ白血病の形分類への応用が第一に考えられる。

【００２９】以下、ｍＡｂ ＬＨ４９２６を例にして、
本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の抗体はＬＨ
４９２６抗原を認識する単クローン抗体を全て包含する
ものであり、ｍＡｂ ＬＨ４９２６のみに限定されるも
のではない。そのような抗体は、本明細書の実施例を追
試することにより、あるいは本発明の抗体を用いてアフ
ィニティークロマトグラフィーで特異抗原を精製しこの
精製抗原を用いて、いずれも当業者の日常的技術で得る
ことが可能であろう。

【００３０】

【実施例】実施例１ （Ａ）ｍＡｂ ＬＨ４９２６の調製 まず、抗原細胞として白血球除去装置により患者静脈よ
り採取した白血病細胞を多く含む末梢血をリン酸塩緩衝
液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎ
ｅ，ＰＢＳ）で２倍に希釈、１／１０〜３０量に相当す
る単球除去剤（ＫＡＣ−２として市販）を添加し一時間
インキュベーション後、浮遊細胞をフィコール溶液（フ
ァルマシア社）に重層し、２０００回転、３０分間の遠
心処理により中間層に移動するリンパ球を回収した。Ｐ
ＢＳにて２回洗浄後、マクロファージ細胞除去のため直
径１０ｃｍプラスチックディッシュにまき、２〜３時間
後の浮遊細胞を１０％ジメチルスルフォキサイド、５０
％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地中にて凍結保
存した（５×１０⁷／バイアル）。細胞は、用時融解
し、洗浄後感作細胞およびスクリーニング陽性細胞とし
て用いた。感作動物にはＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、
雌）を用い、感作細胞（約５×１０⁶細胞）を０．２ｍ
ｌのＰＢＳに懸濁しマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）の腹
腔内に７〜１０日毎に数回（好ましくは３回）注射しマ
ウスを免疫した。最終免疫の３日後該マウスの脾臓の細
胞（脾細胞：抗体産生細胞）１．４×１０⁸ 個とマウス
ミエローマ細胞（腫瘍細胞）２×１０⁷ 個とを３５％程
度に調整したポリエチレングリコール４０００を用いて
融合させ、常法に従いＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋
１０％血清にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを含む培地）による融合細胞（ハイブリドーマ）の選
択的培養した。培養上清についてＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙ
ｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａ
ｓｓａｙ）法を用い標的細胞に対する交叉反応による第
一次スクリーニングを行った。上記のスクリーニングで
陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と判定されたハイブリドーマ
を、公知の方法を用いて目的の免疫グロブリンを分泌し
ているハイブリドーマのクローンをひろいあげた。クロ
ーンを徐々にふやし、１０⁵ 細胞／ｍｌに達した時点で
サブクローニングを行った。ハイブリドーマの単一性を
吟味するため、９６穴のマイクロウェルにフィーダーレ
イアー（ｆｅｅｄｅｒ ｌａｙｅｒ）として正常な脾細
胞をおよそ１０⁵ 細胞／ウェルまいた上にハイブリドー
マを一穴に１個より多くならないように（一穴平均確立
として０．１個）まき、約１週間培養後生育してくるク
ローンについて再びスクリーニングを行った。このサブ
クローニングをくり返すことにより、単一性のハイブリ
ドーマを得た。単一クローン化されたハイブリドーマの
産生する抗体（ｍＡｂ）のサブクラスは市販のマウスグ
ロブリン同定キットを用いてＩｇＧ₁ と同定された。

【００３１】次に、本発明の特異的なｍＡｂを製造する
ために、上記で得られたハイブリドーマを動物体内（ｉ
ｎ ｖｉｖｏ）で培養した。ハイブリドーマを哺乳動物
の腹腔に摂取し、７〜１４日後に腹水を採取し、これよ
りｍＡｂを得た。

【００３２】こうして得られた腹水からのｍＡｂの精製
は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースカラムと公知の方
法を組合わせて行った。抗原の解析は、放射線同位元素
でラベル化された腫瘍細胞の可溶化蛋白との免疫沈降反
応（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）にひ
きつづいたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤ
Ｓ・ＰＡＧＥ）により行った。

【００３３】（Ｂ）ｍＡｂ ＬＨ４９２６の反応特異性 種々ヒトがん細胞（肺がん細胞Ａ５４９、結腸がん細胞
ＢＭ３１４、ヒトメラノーマ細胞Ｃｏｌｏ３８、ヒト赤
白血病細胞Ｋ−５６２、ヒトＢ白血病細胞Ｒａｊｉ、ヒ
トＴ白血病細胞Ｍｏｌｔ−４およびＮＫ−ＬＧＬ，Ｔ−
ＬＧＬ細胞をパネル細胞としたＥＬＩＳＡアッセイを行
った。９６穴プレートのウェルあたり１０⁵個の細胞
（５０μl ，ＲＰＭＩ１６４０）を加え、１０μg ／ｍ
ｌのｍＡｂＬＨ４９２６（５０μl ）を添加し、１時間
４℃で反応後、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓ
ｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）を１ ％含むハン
クス緩衝液（Ｈａｎｋｓ’ ｂａｌａｎｃｅ ｓａｌｔ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＨＢＳＳ）で未吸着の抗体を洗い
出し、次に二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヒツジ
抗マウス抗体（カペル社）を１時間反応させた。ＨＢＳ
Ｓ−ＰＢＳにて４回洗浄後ｏ−フェニレンジアミンの発
色をマルチスキャン３４０（タイターテック社）を用い
４０５ｎｍの吸光度として測定した。その結果、ｍＡｂ
ＬＨ４９２６の反応性はＮＫ−ＬＧＬ細胞に特異的で
あった（図１参照）。

【００３４】（Ｃ）種々血液関連細胞との反応性 次にＬＨ４９２６抗原の末梢血血液細胞における局在を
明らかにするため、種々血液関連細胞および末梢血リン
パ球画分をｍＡｂ ＬＨ４９２６（１０μg ／ｍｌ）と
４℃，３０分間反応させた。二次抗体としてＦＩＴＣ標
識抗マウスＩｇＧ特異的ウサギ抗体Ｆ（ａｂ）' と４
℃、３０分間反応させた。ＨＢＳＳにて３回洗浄後、
２，５００個／μl の懸濁液に調製し、ファクスキャン
（ベクトン・ディキンソン社）にて抗体の結合能を調べ
た。非特異的マウスＩｇＧ₁抗体を陰性対照とし、それ
より強い螢光強度を有する細胞画分を陽性として、その
割合を％で表した。結果を図２に示す。各種疾患の比較
では、ＮＫ−ＬＧＬ白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ
（Ｍ３））および赤芽球癆の末梢血リンパ球系細胞に、
ＬＨ４９２６抗原が増加しているが、これに対して、Ｔ
−ＬＧＬ白血病、成人Ｔ細胞性白血病（ＡＴＬ）、慢性
Ｂ細胞性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（Ｃ
ＭＬ）、ＡＭＬ（Ｍ５）、急性リンパ球性白血病（ＡＬ
Ｌ）および鉄欠乏性貧血においてはＬＨ４９２６抗原は
僅かしか検出されなかった。この結果は本発明の抗体が
診断等に有用であることを裏付けている。

【００３５】（Ｄ）赤芽球癆患者白血病細胞とｍＡｂ
ＬＨ４９２６の反応性 赤芽球癆（ＰＲＣＡ）と診断された患者末梢血単核球
を、ＨＢＳＳに懸濁（１０，０００個／mm³）し、前記
（Ｃ）と同様の方法にてｍＡｂ ＬＨ４９２６と反応さ
せた。結果は図３に示すごとく、ＰＲＣＡ患者末梢血単
核球画分とｍＡｂＬＨ４９２６の反応（図３中、点線で
表す）は、陰性対照として用いた非感作マウスＩｇＧ₁
抗体（例えば、ＭＡ−９０４０，コスモバイオ社）の反
応（図３中、実線で示す）に比して明らかに陽性を示し
た。実施した３例中３例ともに同様の結果を示した。

【００３６】（Ｅ）ＬＨ４９２６抗原の分子量の解析 ｍＡｂ ＬＨ４９２６の認識する抗原の分子量について
ＮＫ−ＬＧＬ，マクロファージ系株細胞Ｕ−９３７を用
いて解析した。ＮＫ−ＬＧＬについては標識抗原を用い
た免疫沈降法を実施した。まず、パーオキシダーゼ法に
て細胞の表面蛋白を ¹²⁵Ｉ−Ｎａにて標識した。次に２
％ＮＰ−４０にて可溶化する画分を集め、抗原として用
いた。一方、１０μg ／mlのｍＡｂ ＬＨ４９２６（５
０μl ）はウサギ抗マウス抗体を結合させた２０％プロ
テインＡ−セファロースＣＬ４Ｂ（５０μl ）（ファル
マシア社製）と４℃、３０分間反応させた。結合しない
抗体は１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ−ＢＳＡと
略す）で４回洗浄することにより抗体結合ビーズ（不溶
化抗体）から除去した。次に上記の ¹²⁵Ｉで標識された
抗原（１×１０⁶ ｃｐｍ相当、１０μl ）を加え、６０
分間反応後、遠心によるＨＢＳＳ−ＢＳＡ洗浄を５回く
り返した。最終的に得られた複合体（ビーズ・抗体・抗
原複合物）を１ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む
１％ＳＤＳ緩衝液（１００μl ）で２分間煮沸後、３％
〜１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）で展開した。オートラジオグラフィーにより、
抗原分子を調べたことろ、約２２０ｋＤａに抗原分子の
バンドを認めた（図４，Ａ）。同時にＨＬＡ（ｈｕｍａ
ｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）クラスＩに
対するｍＡｂ Ｗ６／３２（ＭＡＳ１５３２ｃ，Ｓｅｒ
ａ−Ｌａｂ社）は、４５ｋＤａ，１２ｋＤａ抗原を認識
していることから実験手技の安定性が確認できた。

【００３７】次にウェスタンブロッティング法を用い
て、マクロファージ系株細胞Ｕ−９３７に存在するＬＨ
４９２６抗原について検索した。Ｕ−９３７細胞より可
溶化細胞分画を調製し、前述と同様ビーズ結合型ｍＡｂ
ＬＨ４９２６と反応（４℃，１時間）させた。未反応
の抗原を除去したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で抗原の分
子量にしたがって展開し、型のごとくニトロセルロース
膜に転写した。続いて転写後の抗原（ＳＤＳにより変性
していると推測される）を再度ｍＡｂ ＬＨ４９２６と
反応させたのち、 ¹²⁵Ｉ−抗マウス抗血清にて単クロー
ン抗体を検出した。結果は図４（Ｂ）に示すごとく分子
量約２２０ｋＤａを主とし、約１８０ｋＤａの部分にも
抗原分子を認めた。これらの結果からｍＡｂ ＬＨ４９
２６は、ＮＫ−ＬＧＬ細胞またはマクロファージ系細胞
株Ｕ−９３７細胞に存在するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での見
かけの分子量がそれぞれ約２２０ｋＤａおよび約１８０
ｋＤａに移動する分子を認識することがわかった。

【００３８】（Ｆ）ＬＨ４９２６抗原と既知のＣＤ抗原
との異同の解析 １９９１年２月までＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原としてＣＤ１ａから
ＣＤｗ７８までが登録されている。それらの中で分子量
が２２０ｋＤａまたは１８０ｋＤａ付近であるものにつ
いては、次の表１に示す抗原があげられる（杉村，Ｍｅ
ｄｉｃｉｎａ，２８，１１７０−１１７４，１９９１よ
り抜粋）。

【００３９】

【表１】 表１ CD 抗原分子量(kDa) 主な分布 CD15 〜200, 185, 165, 顆粒球 135, 105 CD35 p220 Ｂ・単球・顆粒球・赤血球・ＦＤＣ CD66 180 〜200 顆粒球 CD11a p180 Ｔ・Ｂ細胞・食細胞・ＮＫ・顆粒球 CD45 220, 205, 190, 180 Ｔ・Ｂ・顆粒球・単球 CD56 220/135 ＮＫ・単球・神経外胚葉細胞 以下、各抗原とｍＡｂ ＬＨ４９２６の差異について説
明する。 ｉ）ＣＤ１５抗原：第一に抗原分子量が２００ｋＤａ近
辺であり２２０ｋＤａより小さい。また、末梢血白血球
画分における存在についてもＣＤ１５抗原は好中球（顆
粒球の分化最終段階であり、顆粒球の代表と考えられ
る）に存在するが、ｍＡｂ ＬＨ４９２６抗体は好中球
と反応しない（図２参照）ことから区別できる。 ｉｉ）ＣＤ３５抗原：当抗原は赤血球、好中球で陽性で
あるが、ｍＡｂ ＬＨ４９２６は赤血球、好中球とは反
応しない（図２参照）。 ｉｉｉ）ＣＤ６６抗原：ＣＤ１５抗原と同様の理由によ
り区別できる。 ｉｖ）ＣＤ１１ａ抗原：分子量が１８０ｋＤａ近辺と報
告されており、２２０ｋＤａを主成分とするｍＡｂ Ｌ
Ｈ４９２６とは異なる。 ｖ）ＣＤ４５，ＣＤ５６抗原：抗原分子量が類似してい
るＣＤ４５，ＣＤ５６抗原との異同については次の実施
例（Ｇ）により確認された。

【００４０】（Ｇ）ＣＤ４５抗原との異同についての検
討 マクロファージ系株細胞Ｕ−９３７（１×１０⁷ 細胞）
より２％ＮＰ−４０可溶化画分を調製（５００μl ）
し、その一部を過剰量のｍＡｂ ＬＨ４９２６結合プロ
テインＡ−セファロースＣＬ４Ｂビーズ（不溶化ｍＡｂ
ＬＨ４９２６）と４℃で１時間反応させ、ｍＡｂ Ｌ
Ｈ４９２６と結合する抗原画分（IIとする，図５中のレ
ーンII）およびＬＨ４９２６抗原除去抗原画分（IIIと
する，図５中のレーンIII）に分離した。前述の処理を
していない全画分（Iとする，図５中のレーンI，ＬＨ４
９２６抗原およびＣＤ４５抗原の両方を含む）および画
分II、画分III各々１０μl （２×１０⁵ 細胞相当）を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で展開した。ゲル中の蛋白を型のご
とく電気的にニトロセルロース膜に転写した（ウェスタ
ン・ブロッティング法）。次に、膜に吸着した蛋白を、
ｍＡｂ ＬＨ４９２６（図５Ａ）もしくは抗ＣＤ４５ｍ
Ａｂ（例えば、Ｈｌｅ−１抗体；図５Ｂ、両抗体とも１
０μg ／mlに調製）と反応させ、 ¹²⁵Ｉ標識プロテイン
Ａを用いて検出した。

【００４１】結果は、図５に示すごとくＬＨ４９２６抗
原は抗原サンプルI、IIに認められた。一方、ＣＤ４５
抗原はｍＡｂ ＬＨ４９２６抗体にてｍＡｂ ＬＨ４９
２６抗原を吸収したサンプルIIIにおいてもIと同様に残
存していた（図中、←ＣＤ４５で示した）。このことか
らｍＡｂ ＬＨ４９２６によって認識される抗原部位は
公知のＣＤ４５を認識する抗体、例えばＨｌｅ−１抗体
によって認識される抗原部位とは異なることが明らかと
なった。なお、図５Ａの右端、図５Ｂの両端には標識分
子量マーカーの一部を追加している。

【００４２】（Ｈ）ＣＤ５６抗原との異同についての検
討 第一に、ｍＡｂ ＬＨ４９２６の作製のための免疫源に
用いたＮＫ−ＬＧＬ細胞はＣＤ５６抗原陰性である。第
二に、次に示す結合阻害実験を実施した。すなわち、健
常人の末梢血リンパ球画分に、過剰のｍＡｂ ＬＨ４９
２６（１mg／ml）存在下および非存在下にてＦＩＴＣ標
識抗ＣＤ５６抗体（ｌｅｕ１９，ベクトン・ディキンソ
ン社，１０μg ／ml）を添加し、４℃で１時間反応させ
た。ＨＢＳＳで４回洗浄した後、ファクスキャン（ベク
トン・ディキンソン社）にて抗ＣＤ５６抗体の結合の変
化を調べた。表２に示すごとくｍＡｂ ＬＨ４９２６は
抗ＣＤ５６抗体の結合には影響しなかった。

【００４３】

【表２】 表２ 各種抗ＣＤ抗体の健常人末梢血リンパ球細胞との反応性に及ぼすｍＡｂ ＬＨ４ ９２６の影響 陽性％ 抗原 ＣＤ４５ ＣＤ４５ＲＡ ＣＤ５６ 抗体 抗Ｈｌｅ−１ 抗Ｌｅｕ１８ 抗Ｌｅｕ１９ ＬＨ４９２６^a) − ９６．９ ６５．７ １９．７ による阻害 ＋ ９７．２ ６６．７ １９．２ ^a)１mg／ml実施例２ ＮＫ−ＬＧＬ白血病患者の剖検時得られた脾臓をホルマ
リン固定後パラフィン切片を作製した。標準的な組織染
色法に従って、一次抗体として本発明のＬＨ−４９２
６、および対照としてＭＢ−１およびＵＣＨＬ−１（Ｄ
ＡＫＯジャパン（株）、Ｍ７４２）と４５分間（室温）
反応させ、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてパーオキシ
デース標識ヒツジ抗マウス抗体を反応させた。洗浄後、
基質として０．０３％ジアミノベンジジン（０．００５
％Ｈ₂Ｏ₂含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液pH７．４）を加え
染色した。

【００４４】ｍＡｂ ＬＨ−４９２６は本患者の脾組織
中でも特に赤脾髄に特異的に浸潤する白血病細胞の細胞
膜を染色した（図７Ａ）。ＭＢ−１は、脾組織中の白血
病細胞の浸潤している赤脾髄においては殆ど染色され
ず、逆に白血病細胞の浸潤が認められない健常Ｂ細胞の
豊富な白脾髄の細胞がよく染まった（図７Ｂ）。ＵＣＨ
Ｌ─１は、脾組織中の、極小数の細胞にのみ反応性がみ
られ、赤脾髄の大部分を占める白血細胞とは反応性を示
さなかった（図７Ｃ）。これらの結果から、本発明の抗
体ｍＡｂ ＬＨ─４９２６のパラフィン包埋された組織
における反応特性はＭＢ−１およびＵＣＨＬ─１抗体と
は異なると結論された。

【００４５】参考のため、脾組織中の中心動脈、白脾髄
および赤脾髄の各位置を図６に模式的に示す。

【００４６】実施例３ ＬＨ−４９２６抗体の認識する抗原の認識部位（エピト
ープ）とＵＣＨＬ−１抗体のエピトープの異同について
検討した。まずＬＨ−４９２６抗体をヒコエリスリン
で、ＵＣＨＬ−１抗体をＦＩＴＣで直接に標識し、健常
人末梢血リンパ球をこれら２種の抗体と反応させ、フロ
ーサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社、機種
名ＦＡＣＳｃａｎ）で分析した（二重標識フローサイト
メトリー法）。その結果、リンパ球群はＬＨ−４９２６
陽性・ＵＣＨＬ─１陰性細胞群（図８Ａ中、左側の細胞
群）と、ＬＨ−４９２６陰性・ＵＣＨＬ─１陽性細胞群
（図８Ａ中、右側の細胞群）に分かれたことから、これ
らの抗体は相互排他的であり、明らかに異なったエピト
ープを認識すると結論された。陰性対照として非感作マ
ウスＩｇＧ１抗体（例えばＭＡ−９０４０，コスモバイ
オ（株））を用いた場合の細胞分布図を図８Ｂに示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｍＡｂ ＬＨ４９２６の種々がん細胞に対する
反応性のＥＬＩＳＡ法による検定結果を示す。

【図２】種々血液関連細胞におけるＬＨ４９２６抗原の
分布を示すグラフである。

【図３】赤芽球癆患者末梢血リンパ球とｍＡｂ ＬＨ４
９２６の反応性の結果を示すグラフである。

【図４】ｍＡｂ ＬＨ４９２６によって認識される可溶
化標識抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開像であり、図中
（Ａ）はＮＫ−ＬＧＬリンパ球、そして（Ｂ）はマクロ
ファージ系細胞株Ｕ９３７についての像である。

【図５】マクロファージ系細胞株Ｕ９３７に存在するＬ
Ｈ４９２６抗原はＣＤ４５抗原とは異なることを示すウ
エスタンブロティングの展開像である。

【図６】脾組織中の中心動脈、赤脾髄および白脾髄の各
部位を説明する図である。

【図７】ＮＫ−ＬＧＬ患者の脾臓をホルマリン固定後パ
ラフィン包埋し、免疫組織染色した結果を示す写真像で
あり、ＡはＬＨ−４９２６抗体を用いた場合、ＢはＭＢ
−１抗体を用いた場合、ＣはＵＣＨＬ−１抗体を用いた
場合の結果を示す。

【図８】ＬＨ−４９２６抗体とＵＣＨＬ−１抗体の認識
するエピトープが異なることを示す健常末梢リンパ球の
二重フローサイトメトリーのチャートであり、Ａは標識
した両抗体の特異性の相違を示し、Ｂは非特異的抗体に
よる細胞分布を示す陰性対照である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/535 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 柴野 賢 大阪府箕面市粟生間谷西２−６−１−206 (72)発明者 水木 満佐央 兵庫県伊丹市柏木町３−20−205 (72)発明者 松井 雅司 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 中西 俊博 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ナチュラルキラー活性を有する顆粒大リン
   パ球性白血病細胞を抗原として感作された動物の抗体産
   生細胞と腫瘍細胞とを融合してつくられたハイブリドー
   マ細胞ラインＬＨ４９２６ ＳＢＭ３２５（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−３７６７）を培養して得られる単クローン抗体ｍ
   Ａｂ ＬＨ４９２６によって認識されるヒト血液細胞関
   連抗原。
2. 【請求項２】分子量が還元状態の電気泳動法にて約２２
   ０ｋＤａまたは約１８０ｋＤａのいずれか一方、または
   二成分からなるがｍＡｂ ＵＣＨＬ−１によって認識さ
   れるＣＤ４５抗原、及びＣＤ５６抗原の何れとも異なる
   請求項１記載のヒト血液細胞関連抗原。
3. 【請求項３】ナチュラルキラー活性を有する顆粒大リン
   パ球性白血病細胞を抗原として感作された動物の抗体産
   生細胞と腫瘍細胞とを融合してつくられるハイブリドー
   マ細胞ラインを培養して得られる単クローン抗体であっ
   て、分子量が還元状態の電気泳動法にて約２２０ｋＤａ
   または約１８０ｋＤａのいずれか一方、または二成分か
   らなるがｍＡｂ ＵＣＨＬ−１によって認識されるＣＤ
   ４５抗原、及びＣＤ５６抗原の何れとも異なるヒト血液
   細胞関連抗原、を認識することを特徴とする単クローン
   抗体。
4. 【請求項４】請求項１記載の抗原で感作された動物の抗
   体産生細胞と腫瘍細胞とを融合してつくられるハイブリ
   ドーマ細胞ラインを培養して得られる単クローン抗体で
   あって、分子量が還元状態の電気泳動法にて約２２０ｋ
   Ｄａまたは約１８０ｋＤａのいずれか一方、または二成
   分からなるがｍＡｂ ＵＣＨＬ−１によって認識される
   ＣＤ４５抗原、及びＣＤ５６抗原の何れとも異なるヒト
   血液細胞関連抗原、を認識することを特徴とする単クロ
   ーン抗体。
5. 【請求項５】認識する抗原が赤芽球癆を惹起するタイプ
   の白血病細胞（赤芽球癆タイプＩＶ）上の抗原である請
   求項３または４記載の単クローン抗体。
6. 【請求項６】パラフィン包埋した組織切片中の白血病細
   胞抗原と反応し得る請求項３または４記載の単クローン
   抗体。
7. 【請求項７】白血病細胞抗原と反応し得る請求項６に記
   載の単クローン抗体からなる、組織のパラフィン包埋切
   片中の白血病細胞抗原を検出するためのキット。
8. 【請求項８】該抗体を認識する第二の抗体であって標識
   されているものをさらに含んでなる請求項７記載のキッ
   ト。
9. 【請求項９】標識が酵素であり、該酵素の基質および、
   該基質と該酵素との反応を検出するための試薬も含む、
   請求項８記載のキット。