JPH0159871B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は、広義には、新規な交雑細胞ライン
（hybrid cell line）さらに詳しくは本質的にすべ
ての正常のヒトの末梢Ｔ細胞および正常のヒトの
胸腺細胞のほぼ95％に見い出されるある抗原に対
するモノクローナル（monoclonal）抗体の生成
のための交雑細胞ラインに関する。 1975年におけるKohlerおよびMilsteinによる
免疫されたマウスからの脾細胞へのマウスの骨髄
腫の融合（fusion）［Nature 256、495−497
（1975）］は、均質な（いわゆる「モノクローナ
ル」）抗体をつくる連続な細胞ラインを得ること
ができることを初めて証明した。この基本の研究
以来、種々の交雑細胞［いわゆる「ハイブリドマ
類（hybridomas）」）の生成およびこれらのハイ
ブリドマ類によりつくられた抗体の種々の科学的
研究への使用について多くの努力が向けられてき
た。たとえば、次の文献を参照：Current
Topics in Microbiology and Immunology、
Volume 81−“Lymphocyte Hybridomas”、F.
Melchers M.Patter、およびN.Warner、
Editors、Springer−Verlag、1978、およびそこ
に含まれる参考文献；C.J.Barnstable、et al．、
Cell、14、９−20（May、1978）；P.Parhamおよ
びW.F.Bodmer、Nature 276、397−399
（November、1978）；Handbook of
Experimental Immunology、Third Edition
Volume ２、D.M.Wier、Editor Blackwell、
1978、Chapter 25；およびChemical and
Engineering News、January、1979、15−17。
これらの文献は同時にハイブリドマ類からモノク
ローナル抗体を生成する試みによつて得られる利
益および複雑さを示している。一般的技術は概念
的によく理解されているが、各特定の場合に多く
の困難に出合い、そして変更が要求される。事
実、一定のハイブリドマを生成しようと試みる前
には、所望のハイブリドマが得られるか、得られ
た場合抗体を生成するか、あるいはそのように生
成された抗体が所望の特異性をもつか、を確める
ことができない。成功の程度は、主として、使用
する抗原のタイプおよび所望のハイブリドマを単
離するために使用する選択技術によつて影響を受
ける。 人間のリンパ球細胞表面の抗原に対するモノク
ローナル抗体を生成する試みは、数例報告されて
いるだけである。たとえば、Current Topics in
Microbiology and Immunology、ibid、66−69
および164−169参照。これらの報告された実験に
おいて使用されている抗原は、培養したリンパ芽
様性白血病およびヒトの慢性リンパ球性白血病の
細胞ラインであつた。得られた多くのハイブリド
マ類は、すべてのヒト細胞の種々の抗原に対して
抗体を生成するように思われた。ハイブリドマ類
はいずれも、ヒトのリンパ球の前もつて定めた群
に対して抗体を生成しなかつた。 最近、本発明者らおよび他の研究者は、あるＴ
細胞に対する抗体をつくるハイブリドマの製造お
よび試験について文献に開示した。参照、たとえ
ば、Reinherz、E.L.、et al.、J.Immunol.123、
1312−1317（1979）；Reinherz、Ｅ、L.、et al.
Proc.Natl.Acad.Sci.、76、4061−4065（1979）；
およびKung、P.C.、et al.、Science、206、347
−349（1979）。 人間および動物の免疫系に含まれるリンパ球に
２つの主な群が存在することを理解すべきであ
る。これらのうちの第１群（胸腺誘導細胞、すな
わち、Ｔ細胞）は、ヘモポイエチン幹細胞から胸
腺において分化されている。胸腺内にある間、分
化する細胞は「胸腺細胞」と名づけられる。成熟
したＴ細胞は胸腺から出、そして組織、リンパ
管、および血流の間を循環する。これらのＴ細胞
は、再循環する小さいリンパ球の貯留（pool）の
大きい比率を形成する。それらは免疫学的特異性
を有し、そして細胞性免疫応答（組織移植注入の
ような）においてエフエクター（effector）細胞
として直接関与する。Ｔ細胞は液性抗体を分泌し
ないが、後述するリンパ球の第２群によるこれら
の抗体の分泌に時々要求される。Ｔ細胞のいくつ
かの型は免疫系の他の面において調節機能をはた
す。この細胞共働の過程の機構はまだ完全に理解
されていない。 リンパ球の第２群（骨髄誘導細胞、すなわち、
Ｂ細胞）は、抗体を分泌するものである。それら
もまたヘモポイエチン幹細胞から発生するが、そ
れらの分化は胸腺によつて決定されない。鳥類に
おいて、それらはフアブリキウス嚢（Bursa of
Fabricius）と呼ばれる胸腺に類似する器官にお
いて分化されている。しかし、哺乳動物において
は、同等の器官は発見されておらず、そしてこれ
らのＢ細胞は骨髄内で分化すると考えられる。 ここで、Ｔ細胞は「ヘルパー（helper）」、「サ
プレツサー（Suppressor）」および「キラー
（killer）」Ｔ細胞と呼ばれる、少なくともいくつ
かのサブタイプに分けられ、それらは（それぞ
れ）反応を促進し、反応を抑制し、あるいは異種
細胞を殺す（分離する）機能を有することが認め
られた。これらのサブクラスはネズミの系統につ
いてよく理解されているが、それらは人間の系に
ついてわずかに最近記載されただけである。たと
えば、次の文献を参照：R.L.Evans、et al．、
Journal of Experimental Medicine、Volume
145、221−232、1977；およびL.ChessおよびS.F.
Schlossman−“Functional Analys is of
Distinct Human Ｔ−Cell Subsets Bearing
Unique Differentiaton Antigens”
“Contemporary Topics in Immunobiology”、
O.Stutman、Editor、Plenum Press、1977、
Volume ７、363−379。 Ｔ細胞のクラスまたはサブクラスを同定または
抑制することができることは、種々の免疫調節の
不調または状態の診断または処置にとつて重要で
ある。 たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫は、
それらがＢ細胞またはＴ細胞のいずれを源とする
かによつて、異なる予後を有する。こうして、病
気の予後の評価はこれらのリンパ球の２つの群を
区別することに依存する。たとえば、次の文献を
参照：A.C.AisenberyおよびJ.C.Long、The
American Journal of Medicine、58：300
（March、1975）；D.Belpomme、et al．、
Immunological Diagnosis of Leukemias and
Lymphomas、S.Thierfelder、et al．、Editors、
Springer、Heidelberg、1977、33−45；および
Ｄ、Belpomme、et、al．、British Joural of
Haematology、1978、38、85。 ある種の病気の状態（たとえば、若年性リウマ
トイド関節炎およびある種の白血病）は、Ｔ細胞
のサブクラスの不釣合いに関する。自己免疫の病
気は一般に「ヘルパー」Ｔ細胞の過剰またはある
種の「サプレツサー」Ｔ細胞の欠乏に関連する
が、悪性の病気は一般に「サプレツサー」Ｔ細胞
の過剰に関連することが示唆された。 ある種の白血病において、過剰のＴ細胞は発育
の停止した状態において生成される。診断はこう
してこの不釣合い、すなわち、過剰を検知するこ
とができることに依存しうるであろう。たとえ
ば、次の文献を参照：J.Kersey、et al.、
“Surface Markers Derine Human Lymphoid
Malignancies with Differing Prognoses”、
Haematology and Blood Transfusion、
Volume 20、Springer−Verlag、1977、17−24、
およびその中に含まれる参考文献；およびE.L.
Reinherz、et al．、J.Clin.Invest.、64、392−397
（1979）。 後天性無ガンマグロブリン血症、すなわち免疫
グロブリンを生成しない疾患の状態は少なくとも
２つの明確な型からなる。型において、免疫グ
ロブリンを生成できないのはサプレツサーＴ細胞
の欠乏によるが、極はヘルパーＴ細胞の欠乏に
よる。両型において、患者のＢ細胞、すなわち抗
体の実際の分泌に関係するリンパ球の不足もしく
は欠乏は存在しないように思われる。しかしなが
ら、これらのＢ細胞は抑制されるか「ヘルプされ
ない」状態にあり、その結果免疫グロブリンの生
成は大きく減少するか、あるいは存在しない。こ
の型の後天性無ガンマグロブリン症は、それゆ
え、サプレツサーＴ細胞の過剰またはヘルプＴ細
胞の不存在を試験することによつて決定できる。 治療サイドにおいて、また明確に証明されてい
ないが、Ｔ細胞のサブタイプに対する抗体を過剰
量で投与することは自己免疫の病気または悪性の
病気において治療上有益であるという、いくらか
の示唆がある。たとえば、ヘルパーＴ細胞のガン
（ある種の皮膚Ｔ細胞リンパ腫およびある種のＴ
細胞急性リンパ芽球白血病）はヘルパーＴ細胞抗
原に対する抗体によつて処置できる。ヘルパー細
胞の過剰を原因とする自己免疫の処置も同じ方法
で達成できる。サプレツサーＴ細胞の過剰による
病気（たとえば、悪性腫瘍または型後天性無ガ
ンマグロブリン症）は、サプレツサーＴ細胞抗原
に対する抗体を投与することによつて処置でき
る。 ヒトＴ細胞の全群（いわゆる抗ヒト胸腺細胞の
グロブリン、すなわち、ATG）に対する抗血清
は、移植組織を受ける患者において治療上有用で
あると報告されている。細胞性免疫応答（移植組
織を拒否する機構）はＴ細胞に依存するので、Ｔ
細胞に対する抗体を投与すると、この拒否の過程
を防止または遅延する。たとえば、次の文献を参
照：Cosimi、et al．、“Randomized Clinical
Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft
Recipients：Importance of Ｔ Cell
Monitoring”Surgery 40：155−163（1976）お
よびその中にふくまれる参考文献；Wechter、et
al.、“Manufacture of Antithymocyte Globulin
for Clinical Trials”、Transplantation、28(4)、
303−307（1979）。 ヒトＴ細胞のクラスおよびサブクラスの同定お
よび抑制は、従来、動物をヒトＴ細胞で免疫し、
その動物を出血させて血清を取り、そしてこの抗
血清を（たとえば）自己由来の（autologous）
であるが、異種ではないＢ細胞で吸着して望まな
い反応性をもつ抗体を除去することによつて得
た、ヒトＴ細胞のための自発性自己抗体または選
択的抗血清を使用することによつて達成された。
これらの抗血清の製造は、とくに吸着および精製
の工程において、きわめて困難である。吸着され
且つ精製された抗血清でさえ、所望の抗体に加え
て、いくつかの理由で多くの不純物を含有する。
第１に、血清はＴ細胞で免疫する前に数百万の抗
体分子を含有する。第２に、この免疫法は注入し
たすべてのヒト細胞について見い出される種々の
抗原に対する抗体を生成させる。単一の抗原に対
する抗体は選択的に生成されない。第３に、この
ような方法で得られた特異性抗体の力価は通常極
めて低く（たとえば、１：100より大きい希釈度
において不活性）そして非特異性抗体に対する比
は１／10⁶より小である。 たとえば、前述のChessおよびSchlossmanの
文献（365ページ以降参照）および前述の
Chemical and Engineering Newsを参照。ここ
には先行技術の抗血清の欠点およびモノクローナ
ル抗体の利点が記載されている。 今回、本質的にすべての正常のヒトの末梢Ｔ細
胞および正常のヒトの胸腺細胞のほぼ95％につい
て見い出されるが、正常のヒトのＢ細胞または無
特徴細胞について見い出されない抗原に対する新
規なモノクローナル抗体を生成できる新規なハイ
ブリドマ（OKT11と表示する）が発見された。 そのように生成された抗体は本質的にすべての
正常なヒトの末梢Ｔ細胞についての単一の決定因
子に対して単一特異性（monospecific）であり、
そして他の抗ヒト免疫グロブリンを本質的に含有
しないが、これと対照的に先行技術の抗血清は多
数のヒト抗原に対して反応性の抗体で本来汚染さ
れており、そして先行技術のモノクローナル抗体
は正常なヒトの胸腺細胞の抗原について単一特異
性ではない。その上、このハイブリドマは培養し
て抗体を生成することができる。この場合動物を
免疫し、殺し、次いで先行技術の不純の抗血清を
得るときにさえ、必要な長たらしい吸着および精
製の工程を実施することを要しない。 したがつて、本発明の１つの目的は、本質的に
すべての正常なヒトの末梢Ｔ細胞について見い出
される抗原に対する抗体を生成するハイブリドマ
類を提供することである。 本発明のさらに別の面において、これらのハイ
ブリドマ類を製造する方法を提供する。 本発明の他の目的は、本質的にすべての正常な
ヒトの末梢Ｔ細胞について見い出される抗原に対
する本質的に均質な抗体を提供することである。 さらに他の目的は、この抗体を用いる病気の処
置または診断の方法を提供することである。 本発明のその他の目的および利益は、本発明の
開示を検討すると明らかになるであろう。 前述の目的および利益を達成するため、本発明
によれば、本質的にすべての正常のヒトの末梢Ｔ
細胞および正常のヒトの胸腺細胞のほぼ95％と見
い出される（が、正常のヒトのＢ細胞または無特
徴細胞について見い出されない）抗原に対する新
規な抗体を生成する新規なハイブリドマ、この抗
体それ自体、およびこの抗体を用いる診断および
治療の方法が提供される。該ハイブリドマは
MilsteinおよびKohlerの方法に一般に従つて製
造される。Ｔ細胞の急性リンパ芽球白血病（Ｔ−
ALL）をもつヒトからの白血病細胞でマウスを
免疫した後、免疫したマウスの脾細胞をマウスの
骨髄腫ラインからの細胞と融合し、そして得られ
たハイブリドマ類を正常のＥロゼツト（rosette）
陽性のヒトＴ細胞および／またはＥ−ヒト細胞に
選択的に結合する抗体を含有する上澄液を用いて
それらについて選別した。所望のハイブリドマ類
を引き続いてクローン系に分け（clone）、特性づ
けた。その結果、本質的にすべての正常なヒトの
末梢Ｔ細胞についての抗原に対する抗体
（OKT11と表示する）を生成するハイブリドマが
得られた。この抗体は本質的にすべての正常のヒ
トの末梢Ｔ細胞および正常のヒトの胸腺細胞のほ
ぼ95％と反応するが、正常のヒトのＢ細胞または
無特徴細胞と反応しない。 本発明において“超IgE（Hyper IgE）”とは、
この抗体の量が通常の値よりも多いことを意味す
る。これは一般にアレルギ性体質に表われる。 また“急性組織移植対宿主反応（Acute graft
versus host reaction）”とは、宿主による免疫
学的な、例えば生体移植の場合における全体或い
は部分的な拒絶反応のことである。 先行技術において示された困難および抗原とし
て悪性の細胞ラインを用いて報告された成功の不
足を見ると、本発明の方法が所望のハイブリドマ
を提供したことは驚くべきことであつた。交雑細
胞のこの予測されえない性質は１つの抗原または
ラインから他のものへの補外（extrapolate）を
許さないことに注意すべきである。事実、本発明
者らは、抗原としてＴ細胞の悪性細胞ラインを用
いると、所望の抗体を生成しないハイブリドマ類
が形成することを見い出した。細胞表面から分離
した精製した抗原を使用する試みも不成功に終つ
た。 主題のハイブリドマおよびそれにより生成され
た抗体の両者は、この明細書中で表示「OKT11」
で呼ばれ、言及される特定の物質は文脈から明ら
かである。主題のハイブリドマは、アメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（12301Parklawn Drive、Rockville、MD、
20852）に1979年12月13日に寄託され、ATCC番
号CRL8027が付された。 このハイブリドマおよび生ずる抗体の製造およ
び特性は、以下の説明および実施例から一層理解
できるであろう。 ハイブリドマを製造する方法は一般に次の工程
からなる： Ａ Ｔ−ALLをもつヒトからの白血病細胞でマ
ウスを免疫する。メスのCAF₁マウスが好まし
いことがわかつたが、他のマウスの系統を使用
できると考えられる。免疫スケジユールおよび
胸腺細胞の濃度は、有効量の適当に準備した脾
細胞を生成するようなものであるべきである。
0.2mlのリン酸塩緩衝食塩溶液中の２×10⁷細
胞／マウス／注射を用いて、14日の間隔で、３
回免疫を行うことは有効であることがわかつ
た。 Ｂ 免疫したマウスから脾臓を取り出し、適当な
媒質中の脾懸濁液を調製する。約１ml／脾臓の
媒体で十分である。これらの実験の技術はよく
知られている。 Ｃ 懸濁した脾細胞を適当な細胞ラインからのマ
ウスの骨髄腫の細胞と、適当な融合促進剤の使
用により融合する。脾細胞対骨髄腫細胞の好ま
しい比は約５対１である。約10⁸個の脾細胞に
ついて合計約0.5〜1.0mlの融合媒質は適当であ
る。多くのマウスの骨髄腫の細胞は知られてお
り、そして一般に学問的共同体のメンバーまた
は種々の寄託機関、たとえば、ザ・ソーク・イ
ンスチチユート・セル・デイストリビユーシヨ
ン・センター（the Salk Institute Cell
Distribution Center La Jolla、CA）から入
手できる。使用する細胞ラインは好ましくはい
わゆる「薬物抵抗性」型であつて、未融合の骨
髄腫細胞が選択した媒体中で生存せず一方交雑
細胞が生存するようにすべきである。最も普通
のクラスは８−アザグアニン抵抗性の細胞ライ
ンであり、これは酵素ヒポキサンチン・グアニ
ン・ホホリボシル・トランスフエラーゼ
（phophoribosyl transferase）を欠き、それゆ
えHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
およびチミジン）媒体により支持されない。ま
た使用する骨髄腫細胞ラインはいわゆる「非分
泌」型である、すなわち、それはそれ自体抗体
を生成しないことが一般に好ましいが、分泌型
を使用できる。しかしながら、ある場合におい
て、分泌する骨髄腫ラインは好ましいことであ
る。好ましい融合促進剤は平均分子量が約1000
〜約4000であるポリエチレングリコール（商業
的にPEG1000などとして入手できる）が好ま
しいが、この分野において知られている他の融
合促進剤を使用できる。 Ｄ 別の容器内において、未融合の脾細胞、未融
合の骨髄腫細胞、および融合しない細胞の混合
物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択的
媒質中で希釈し、未融合の細胞を死亡させるの
に十分な時間（約１週間）培養する。この希釈
は限定されたものの型であることができ、この
希釈において希釈剤の体積は統計的に計算して
各別々の容器［たとえば、微小力価の板の各ウ
エル（well）］中である数の細胞（たとえば、
１〜４）を単離する。媒体は薬物抵抗性（たと
えば、８−アザグアニン抵抗性）で未融合の骨
髄腫細胞ラインを支持しないもの（たとえば、
HAT媒質）である。それゆえ、これらの骨髄
腫細胞は死ぬ。未融合の脾細胞は非悪性である
ので、有限の数の世代をもつだけである。こう
して、ある期間（約１週間）後、これらの未融
合の脾細胞は再生しない。融合した細胞は、こ
れに対して、骨髄腫の親の悪性をもち、そして
脾細胞の親の選択的媒体中で生存できるので、
再生し続ける。 Ｅ ハイブリドマを含有する各容器（ウエル）中
の上澄液を、Ｅロゼツト陽性の精製したヒトＴ
細胞または胸腺細胞に対する抗体について測定
する。 Ｆ 所望の抗体を生成するハイブリドマを選択し
（たとえば、限定希釈により）そしてクローン
に分ける。 いつたん所望のハイブリドマを選択し、クロー
ンに分けると、終結の抗体は２つの方法の１つで
生成させることができる。最も純粋なモノクロー
ナル抗体は、所望のハイブリドマを適当な媒質中
で適当な長さの時間試験内で培養し、次いで所望
の抗体を上澄液から回収することによつて生成さ
れる。適当な媒質および適当な培養時間の長さ
は、既知であるか、あるいは決定容易である。こ
の試験管内技術は、他の特異性の抗ヒト免疫グロ
ブリンを本質的に含まない、単一特異性モノクロ
ーナル抗体を本質的に生成する。媒質は外因性血
清（たとえば、胎児の子牛の血清）を含有するの
で、少量の他の免疫グロブリンが存在する。しか
しながら、この試験管内の方法は、モノクローナ
ル抗体の濃度がわずかに約50μｇ／mlであるの
で、十分な量または濃度を生成できない。 非常に大きい濃度のわずかに純度に劣るモノク
ローナル抗体を生成させるため、所望のハイブリ
ドマをマウス、好ましくは先天性または半先天性
のマウスに注射できる。ハイブリドマは適当な潜
伏時間後抗体生成の腫瘍を形成させ、その結果宿
主マウスの血流および腹膜滲出液（腹水）中に高
濃度の所望とする抗体（約５〜20mg／ml）が生ず
る。これらの宿主マウスも正常の抗体を血流およ
び腹水の中に有するが、これらの正常な抗体の濃
度はモノクローナル抗体濃度のわずかに約５％で
あるにすぎない。その上、これらの正常の抗体は
特異性が抗ヒトでないので、収穫した腹水または
血清から得たモノクローナル抗体は汚染する抗ヒ
ト免疫グロブリンを本質的に含有しない。このモ
ノクローナル抗体は力価が高く（１：50000以上
の希釈で活性である）そして特異性免疫グロブリ
ン対非特異性免疫グロブリンの比が高い（約１／
20）。軽量の骨髄腫鎖を組込んだ生成した免疫グ
ロブリンは非特異性の「無意味な」ペプチド類で
あり、これらはモノクローナル抗体をその特異性
を減じないで単に希釈するだけである。 実施例 モノクローナル抗体の生成 Ａ 免疫および体細胞の交雑 メスのCAF₁マウス（Jackson研究所；生ま
れてから６〜８週間）を、0.2mlのリン酸塩緩
衝食塩溶液中の２×10⁷のヒトの白血病Ｔ−
ALL細胞で腹膜内的に14日の隔で免疫した。
第３回目の免疫後、脾をマウスから取り出し、
そしてステンレス鋼の組織を通すことによつて
単一細胞の懸濁液をつくつた。 細胞の融合をKohlerおよびMilsteinの方法
に従つて実施した。１×10⁸の脾細胞を、
RPMI 1640媒質（Gibco、Grand Island、
NY）中の35％のポリエチレングリコール
（PEG 1000）と５％のジメチルスルホキシド
とからなる融合媒質の0.5ml中において、２×
10⁷のP3×63Ag8U1骨髄腫細胞（Br.M.
Scharff、Albert Einstein College of
Medicine Bronx、NYにより供給）と融合し
た。これらの骨髄腫細胞はIgG1κL鎖（light
chains）を分泌する。 Ｂ ハイブリドマの選択および成長 細胞の融合後、細胞をHAT媒体（ハイポキ
サンチン、アミノプチリン、およびチミジン）
中で37℃において５％のCO₂を使用して湿つた
ふん囲気中で培養した。数週間後、ハイブリド
マ類を含有する培養液から40〜100μの上澄
液を、Mendes（J.Immunol．111：860、1973）
が記載するように健康なヒトの供与者の血液か
ら調製した、Ｅロゼツト陽性（E⁺）個体群と
Ｅロゼツト陰性（E⁺）個体群とに分けた10⁶の
末梢リンパ球のペレツトに加えた。これらの細
胞へ結合するマウスのハイブリドマ抗体の検出
は、ラジオイムノアツセイおよび／または間接
免疫蛍光法により決定した。培養液の上澄液で
培養した細胞を蛍光を付与した山羊の抗マウス
IgG（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy研究所、
Springfield、VA；Ｆ／Ｐ＝2.5）で染色し、
この蛍光性抗体被覆細胞を引き続いてシトフル
オログラフ（Cytofluorograf）FC200／4800A
（Ortho Instruments、Westwood、MA）につ
いて実施例に記載するように分析した。 E⁺リンパ球（Ｔ細胞）および／または胸腺
細胞と特異的に反応する抗体を含有するハイブ
リドマ培養液を選択し、供給体（feeder）細胞
の存在で限定希釈法により２回クローンに分け
た。引き続いて、クローンを２，６，10，14−
ペンタデカン（Aldrich Chemical Company
から商品名Pristineで市販されている）で準備
したCAF₁マウスに一定のクローンの１×10⁷細
胞（0.2mlの体積）を注射することによつて、
腹膜内に移植した。次いでこれらのマウスから
の悪性腹水を使用して、実施例において後述
するように、リンパ球を特性づけた。主題の交
雑抗体OKT11は、標準の技術によりサブクラ
スIgG1であると証明された。 実施例 OKT11の反応性の特性づけ Ａ リンパ球個体群の単離 人間の末梢血液の単核細胞を、健康な志願者
の提供者（15〜40才）から、Boyum、Scand.
J.Clin.Lab.Invest．21（Suppl.97）：77、1968
の技術に従い、フイコール−ハイパツク
（Ficoll−Hypaque）密度勾配遠心分離
（Pharmacia Fine Chemicals、Piscataway、
NJ）により単離した。分別しない単核細胞を、
Chess、et al.J.Immunol．113：1113（1974）
にすでに記載されているように、Sephadex Ｇ
−200抗−Ｆ（ab′）₂カラムクロマトグラフイー
により、表面Ig⁺(B)およびIg^-（ＴプラスNull）
の個体群に分離した。Ｔ細胞はIg^-個体群を５
％の羊の赤血球（Microbiological
Associates、Bethesda、MD）でＥロゼツト化
することによつて回収した。ロゼツト化した混
合物をフイコール−ハイパツク（Ficoll−
Hypaque）上に層状にし、回収したE⁺ペレツ
トを0.155モルのNH₄Cl（10ml／10⁸細胞）で処
理した。このようにして得られたＴ細胞の個体
群は、標準法により決定して、＜２％EACロゼ
ツト陽性および＞95％Ｅロゼツト陽性であつ
た。さらに、非ロゼツトIg^-（Null細胞）個体
群をフイコール表面から収穫した。この後者の
個体群は＜５％E⁺および２％sIg⁺であつた。
表面Ig⁺(B)個体群は、前述のようにSephadex
Ｇ−200カラムクロマトグラフイーおよび引き
続く正常なヒト・ガンマグロブリンによる溶離
から得られた。この個体群は＞95％表面Ig⁺お
よび＜５％E⁺であつた。 Ｂ 胸腺細胞の単離 正常人の胸腺を２月〜14才の年令の患者か
ら、心臓の矯正手術のもとに得た。胸腺の新ら
しく得た部分を媒体199（Gibco）中の５％胎児
の子牛の血清中に直ちに入れ、鉗子とはさみで
小さく切り、引き続いて金網を通してプレスす
ることによつて単細胞の懸濁液にした。細胞を
次に前節Ａで説明したように、フイコール−ハ
イパツクで層状にし、回し、洗浄した。このよ
うにして得られた胸腺細胞は＞95％生活力があ
り、そして90ロゼツト陽性であつた。 Ｃ Ｔ直系の細胞ラインおよびＴ急性リンパ芽球
白血病細胞（Ｔ−ALL細胞） 白血病細胞（Ｔ−ALLL細胞）は、Ｔ細胞
ALLの診断を受けた25人の患者から得た。こ
れらの個々の腫瘍は、羊の赤血球を用いるそれ
らの自発的ロゼツト生成（＞20％E⁺）、および
Ｔ細胞特異性異種抗血清抗HTL（B.K.）および
A99との反応性により、前述のように、Ｔ細胞
直系であると前もつて決定された。腫瘍集団を
10％DMSOおよび20％ABヒト血清と一緒に−
196℃の蒸気相液体窒素で、表面の特性づけま
で、寒冷保存した。分析したすべての腫瘍集団
は、細胞遠心調製のWright−Giemsaの形態学
により90％より多い芽球であつた。 実施例 シトフルオログラフ（cytofluorographic）分
析および細胞分離 すべての細胞個体群を用いるモノクローナル抗
体のシトフルオログラフ分析を、シトフルオログ
ラフ（Cytofluorographic）FC200／4800A
（Ortho Instruments）を用いて蛍光共役したや
ぎの抗マウスIgG（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy
Laboratories）を用いて間接免疫蛍光法により実
施した。要約すると、１〜２×10⁶細胞を0.15ml
のOKT5で１：500希釈において処理し、４℃で
30分間培養し、２回洗浄した。次いで細胞を0.15
mlの１：40希釈のＧ／Ｍ FITCで４℃において
30分間反応させ、遠心分離し、３回洗浄した。次
いで細胞をシトフルオログラフで分析し、蛍光の
強さ／細胞をパルス高さ分析器に記録した。同様
な反応性のパターンは１：10000の希釈で観察さ
れていたが、これよりさらに希釈すると反応性は
失なわれた。バツクグラウンドの染色は、非生成
性交雑クローン性で腹膜的に免疫したBalb／cJ
マウスからの１：500腹水の0.15ml部分を代わり
に使用することによつて得た。 ハイブリドマの生成、および生ずるモノクロー
ナル抗体の生成および特性づけは、上の実施例に
おけるように実施した。大量の主題の抗体を、主
題のハイブリドマのマウスへの腹腔内注射および
悪性腹水の収穫により調製したが、ハイブリドマ
は試験管内でこの分野においてよく知られた技術
により培養し、抗体を上澄液から取り出すことが
できることは、明らかに考えられる。 表１はOKT1、OKT3〜６およびOKT8〜11と
種々のヒトのリンパ球集団との反応性を示す。こ
の反応性のパターンは、患者の抗体OKT11を検
出し、他の抗体と区別できる１つの試験である。 第１図は、正常のヒトの胸腺の懸濁液、および
E^-およびE⁺末梢細胞を１：500希釈のOKT11、
OKT10、OKT8おびＧ／Ｍ FITCと反応させた
後、シトフルオログラフ上に得られた代表的蛍光
パターンを示す。OKT1およびOKT3細胞の抗原
（これは胸腺細胞が末梢Ｔ細胞に成熟したとき増
加する）と対照的に、OKT11抗原のそれは付随
して減少する。第１図の反応性のパターンは、被
検者の抗体OKT11を検知でき、他の抗体と区別
できる他の試験である。 表２は、OKT11および他のモノクローナル抗
体を用いる、ヒトのＴ直系リンパ球の抗原表現型
を示す。この表現型のパターンは、OKT11抗体
を検出し、それを他の抗体と区別する、なおほか
の方法を提供する。 表３は、末梢Ｔ細胞およびＴ細胞部分集合の水
準と種々の疾患の状態との間の間係を示す。これ
らの関係を診断の目的（たとえば、急性伝染性単
核症を検出するために）、これらの疾患の状態の
１つを有すると疑われる個体の血液試料を分析し
て、Ｔ細胞およびＴ細胞部分集合の水準を決定す
ることによつて、使用できる。また、これらの関
係を、疾患の状態の原因がＴ細胞部分集合の水準
の増加である（たとえば、型の後天性無ガンマ
グロブリン血症）治療目的に使用できる。治療に
使用するため、Ｔ細胞の部分集合の水準が健常人
のＴ細胞集団よりも高い患者に適当なモノクロー
ナル抗体を投与することにより、その過剰を減少
または排除できる。表３に示す関係は、OKT11
抗体を検出し、他の抗体を区別できる、ほかの方
法である。 本発明者らが製造したハイブリドマを生成する
他のモノクローナル抗体（表示したOKT1、
OKT3、OKT4およびOKT5）は、次に米国特許
出願に記載され、そして特許請求されている：
1979年３月20日付け出願第22132号；1979年４月
26日付け出願第33639号；1979年４月26日付け出
願第33669号；1979年９月18日付け出願第76642
号；および1979年10月９日付け出願第82515号。
本発明者らが製造したハイブリドマを生成するな
お他のモノクローナル抗体（表示したOKT6、
OKT8、OKT9およびOKT10）は、1979年12月
４日付けの、次の発明の名称を有する米国特許出
願に記載され、特許請求されている： Hybrid Cell Line Producing Monoclonal
Antibody to ａ Human Thymocyte Antien、
Antibody、and Methods；Hybrid Cell Line
Fro Producing Complement−Fixing
Monoclonal Antibody to Human Suppressor
Ｔ Cells、Antibody、and Methods；Hybrid
Cell Line For Producing Monoclonal
Antibody to Human Early Thymocyte
Antien、Antibody Methods；およびHybrid
Cell Line For Producing Monoclonal
Antibody to ａ Human Prrothymocyte
Antien、Antibody、and Methods（ヒトの胸腺
細胞抗原に対するモノクローナル抗体を生成する
交雑細胞ライン抗体、および方法；ヒトのサプレ
ツサーＴ細胞に対する補体固定モノクローナル抗
体を生成する交雑細胞ライン、抗体、および方
法；ヒトの初期の胸腺細胞抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を生成する交雑細胞ライン、抗原、お
よび方法；およびヒトの前胸腺細胞
（Prrothymocyte）抗原に対するモノクローナル
抗体を製造する交雑細胞ライン、抗体、および方
法）。本発明者らにより製造されたほかのハイブ
リドマ（表示したOKT1）は、本願と同日付け
の、次の発明の名称を有する米国特許に記載さ
れ、特許請求されている；Hybrid Cell Line
for Producing Monoclonal Antibody to ａ
Human Monocyte Antien、Antibody、and
Methods（ヒトの単球抗原に対するモノクローナ
ル抗体を生成する交雑細胞ライン、抗体、および
方法）。これらの出願を引用によつてここに加え
る。 本発明によれば、本質的にすべての末梢Ｔ細胞
および正常なヒトの胸腺細胞のほぼ95％上に見い
出される抗原に対する抗体を生成できるハイブリ
ドマ、このハイブリドマを生成する方法、本質的
にすべての正常なヒトの末梢Ｔ細胞および正常な
ヒトの胸腺細胞のほぼ95％上に見い出される抗原
に対するモノクローナル抗体、この抗体を生成す
る方法、およびこの抗体を用いる病気の処置また
は診断の方法あるいはＴ細胞または胸腺細胞の部
分集合の同定法が提供される。 【表】 【表】 【表】 【表】 ヒトの胸腺細胞の抗原に対する単一のモノクロ
ーナル抗体を生成する単一のハイブリドマだけを
説明してきたが、本発明はここに説明する特性を
示すすべてのモノクローナル抗体を包含すると考
えられる。主題の抗体OKT11はねずみのIgGの
４つのサブクラスの１つであるサブクラスIgG₁
に属することが決定された。免疫グロブリンＧの
これらのサブクラスは互いにいわゆる「固定され
た」領域において異なるが、特定の抗原に対する
抗体はいわゆる「可変の」領域をもち、この領域
は免疫グロブリンＧのどのサブクラスがそれに属
するかに無関係に機能的に同一である。すなわ
ち、ここに説明した特性を示すモノクローナル抗
体はサブクラスIgG₁、IgG₂a、IgG₂bまたはIgG₃、
あるいはクラスIgM、IgA、あるいは他の既知の
クラスIgであることができる。これらのクラスま
たはサブクラスの間の差異は抗体の反応パターン
の選択性に影響を及ぼさないが、抗体と他の物
質、たとえば、補体または抗マウス抗体とのほか
の反応に影響を及ぼすことがあるであろう。主題
の抗体はIgG₁に特定したが、ここに例示した反
応性のパターンを有する抗体類はそれらが属する
免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスに無関
係に本発明の範囲内に包含されると考えられる。 さらに、本発明の範囲内に、ここに例示したハ
イブリドマの技術を用いて前述のモノクローナル
抗体を生成する方法が包含される。ハイブリドマ
のただ１つの例をここに記載したが、当業者はこ
こに提供した免疫法、融合法および選択法に従
い、ここに説明した反応性の特性を有する抗体類
を生成しうる他のハイブリドマ類を得ることがで
きると考えられる。マウスの既知の種からの既知
の骨髄腫細胞系統から生成した個々のハイブリド
マはおのハイブリドマにより生成された抗体を参
照する以外それ以上同定できないので、前述の反
応性の特性を有する抗体を生成するすべてのハイ
ブリドマ類は本発明の範囲内に包含され、これら
のハイブリドマを用いるこの抗体をつくる方法も
同様に包含されると、考えられる。 本発明のほかの面は、モノクローナル抗体
OKT11またはここに明らかにした反応性のパタ
ーンを示す他のモノクローナル抗体を用いて病気
を処理または診断する方法である。主題の抗体を
使用して、表３に示す疾患を診断できる。これら
の技術は、OKT11抗体を単独で、または他の抗
体（たとえば、OKT3〜OKT10）と組み合わせ
て使用することにより、用いることができる。 Ｔ細胞またはＴ細胞部分集団に対する抗体のパ
ネルとの反応性のパターンは、先行技術の診断法
を用いて可能であるよりも、ある種の病気状態の
一層精確な検知を許すであろう。 OKT11⁺細胞の過剰を特徴とする病気の状態の
処置は、治療学的に有効な量のOKT11抗体を処
置の必要なとき個々の患者に投与することによつ
て、行なうことができる。OKT11⁺抗原と選択的
に反応させることにより、有効量のOKT11抗体
は過剰量のOKT11⁺細胞を減少し、こうしてその
過剰の効果を軽減する。有効量のOKT11抗体と
それぞれ診断学的または治療学的に許容できる担
体とからなる診断学的および治療学的組成物も、
本発明の範囲内に包含される。 末梢Ｔ細胞は組織移植の拒否に関係するので、
OKT11抗体の治療学的使用の一例は組織移植の
拒否を軽減または排除するのに有効な量の
OKT11抗体を、組織移植受容体へ投与すること
である。このようにして、OKT11抗体は前述の
抗胸腺細胞グロブリンの代わりに使用し、特異性
を有意に増加することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、正常のヒトの胸腺細胞およびE⁺お
よびE^-末梢細胞をOKT11および他のモノクロー
ナル抗体と１：500希釈およびＧ／Ｍ FITCに
おいて反応させた後、シトフルオログラフで得ら
れた蛍光パターンを示す。バツクグラウンドの蛍
光の染色は、非生成性クローン系で注入したマウ
スからの腹水の流体の１：500の希釈で各集団を
培養することによつて、得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｔ−ALLをもつヒトの白血病細胞で前もつ
   て免疫されたマウスからの脾細胞およびマウスの
   骨髄腫ラインからの細胞の融合により生成され、 (a) 本質的にすべての正常のヒトの末梢Ｔ細胞お
   よび正常のヒトの胸腺細胞のほぼ95％と反応す
   るが、正常のヒトのＢ細胞または無特徴細胞と
   反応せず、 (b) 重症筋無力症および多発性硬化症における正
   常の水準より低く；急性組織移植対宿主反応、
   超IgE、急性伝染性単核症、および初期の胆の
   う硬変症における正常の水準より高く；そして
   ホジキンス病および乾癬のすべての段階におい
   て存在しない、Ｔ細胞集団（OKT11）を定義
   する、 IgGモノクローナル抗体を生成するハイブリド
   マ。 ２ ATCC CRL8027の標示特性を有する特許請
   求の範囲第１項記載のハイブリドマ。