JPH01466A

JPH01466A - 急性伝染性単核症を検出する方法

Info

Publication number: JPH01466A
Application number: JP63-118397A
Authority: JP
Inventors: パトリツク・チユン―シユー・クング; ギデオン・ゴールドステイン
Original assignee: オーソ・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン
Priority date: 1979-12-04
Filing date: 1988-05-17
Publication date: 1989-01-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、広義には、新規な交雑細胞ライン（ｈｙｂｒ
ｉｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）さらに詳しくは正常のヒト
の抑制体Ｔ細胞に見い出されるある抗原に対する補体固
定モノクローナル（ｍｏｎｏｃ　Ｉｏｎａ　ｌ　）抗体
を用いる検出方法に関する。

１９７５年におけるＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉ
ｎによる免疫されたマウスからの牌細胞へのマウスの骨
髄腫の融合（ｆｕｓｉｏｎ）　　［Ｎａｔｕｒｅ　２５
６．４９５〜４９７　（１９７５）］は、均質な（いわ
ゆる「モノクローナル」）抗体をつくる連続な細胞ライ
ンを得ることができることを初めて証明した。この基本
の研究以来、種々の交雑細胞［いわゆる「ハイブリドマ
類（ｈｙｄｂｒｉｄｏｍａｓ）」］の生成及びこれらの
ハイブリドマ類によりつくられた抗体の種々の科学的研
究への使用について多くの努力が向けられてきた。たと
えば、次の文献を参照：ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　
ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ８ト“Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ″、　Ｆ、　Ｍ６１Ｃｈｅｒｓ
、　Ｍ。

Ｐａｔｔｅｒ、および瓢Ｎ＋Ｗａｒｎｅｒ、　Ｅｄｉｔ
ｏｒｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｓｒｌａｇ、　　ｌ　
９７８　、およびそこに含まれる参考文献；　Ｃ，Ｊ、
　Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ
、　ｌ　４．９＝２０　（Ｍａｙ　１９７８）　；　Ｐ
、　ＰａｒｈａｍおよびＷ。

Ｆ、　Ｂｏｄｍｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　２７６．３９７
〜３９９　（Ｎ。

ｖａｍｂｅｒ＋　　１９７８　）　；　Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、　Ｔｈ１ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｖｏｌｕｍｅ　
２．　Ｄ、　Ｍ。

Ｗｉｅｒ、　Ｅｄｉｔｏｒ、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　
　ｌ　９７８、Ｃｈａｐｔｅｒ２５；およびＣｈｅｍｉ
ｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ、　
Ｊａｎｕａｒｙｌ、１９７９．１５〜１７゜これらの文
献は同時にハイブリドマ類からモノクローナル抗体を生
成する試みによって得られる利益および複雑さを示して
いる。一般的技術は概念的によく理解されているが、各
特定の場合に多くの困難に出合い、そして変更が要求さ
れる。事実、一定のハイブリドマを生成しようと試みる
前には、所望のハイブリドマが得られるか、得られた場
合抗体を生成するか、あるいはそのように生成された抗
体が所望の特異性をもつか、を確かめることができない
。

成功の程度は、主として、使用する抗原のタイプおよび
所望のハイブリドマを単離するために使用する選択技術
によって影響を受ける。

人間のリンパ球細胞表面の抗原に対するモノクローナル
抗体を生成する試みは、数例報告されて６９および１６
４〜１６９参照。これらの報告された実験において使用
されている抗原は、培養したリンパ芽株性白血病および
ヒトの慢性リンパ球性白血病の細胞ラインであった。得
られた多くのハイブリドマ類は、すべてのヒト細胞の種
々の抗原に対して抗体を生成するように思われた。ハイ
ブリドマ類はいずれも、ヒトのリンパ球の前もって定め
たクラスに対して抗体を生成しなかった。

最近、本発明者らおよび他の研究者は、あるＴ細胞に対
する抗体をつくるハイブリドマの製造および試験につい
て文献に開示した。参照、たとえば、Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ
、　Ｅ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏ＋。

１２３．１３１２〜１３１７　（１９７９）；Ｒｅ１ｎ
ｈｅｒｚ、　Ｅ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

７６．４０６１〜４０６５　（＋９７９）；およびＫｕ
ｎｇ、　Ｐ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ
、　２０６．３４７〜３４９　（１９７９）。

人間および動物の免疫系に含まれるリンパ球に２つの主
なりラスが存在することを理解すべきである。これらの
うちの第１クラス（胸腺誘導細胞、すなわち、Ｔ細胞）
は、ヘモポイエチン幹細胞から胸腺において分化されて
いる。胸腺内にある間、分化する細胞は「胸腺細胞」と
名づけられる。成熟したＴＭＪ胞は胸腺から出、そして
組織、リンパ管、および血流の間を循環する。これらの
Ｔ細胞は、再循環する小さいリンパ球の貯留（ｐｏｏｌ
）の大きい比率を形成する。それらは免疫学的特異性を
有し、そして細胞性免疫応答（組織移植注入のような）
においてエフェクター（ｅｆ　ｒｅｃｔｏｒ）細胞とし
て直接関与する。Ｔ細胞は液性抗体を分泌しないが、後
述するリンパ球の第２クラスによるこれらの抗体の分泌
に時々要求される。Ｔ細胞のいくつかの型は免疫系の他
の面において調節機能をはたす。この細胞共働の過程の
機構はまだ完全に理解されていない。

リンパ球の第２クラス（骨髄誘導細胞、すなわち、Ｂ細
胞）は、抗体を分泌するものである。それらもまたへモ
ポイエチン幹細胞から発生するが、それらの分化は胸腺
によって決定されない。鳥類において、それらはファブ
リキウス嚢（Ｂｕｒｓａ　ｏｆＦａｂｒ　ｉｃ　１ｕｓ
）と呼ばれる胸腺に類似する器官において分化されてい
る。しかし、哺乳動物においては、同等の器官は発見さ
れておらず、そしてこれらのＢ細胞は骨髄内で分化する
と考えられる。

二こで、Ｔ細胞は「ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）Ｊ、「サ
プレッサー（５ｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）Ｊおよび［キラー
（ｋｉｌｌｅｒ）Ｊ　Ｔ細胞と呼ばれる、少なくともい
くつかのサブタイプに分けられ、それらは（それぞれ）
反応を促進し、反応を抑制し、ある゛いは異種細胞を殺
す（分離する）機能を有することが認められＩ：。

これらのサブクラスはネズミの系統についてよく理解さ
れているが、それらは人間の系についてわずかに最近記
載されただけである。たとえば、次の文献を参照：　Ｒ
，Ｌ、　Ｅｖａｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａ
ｌｏ［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｄｉｃｉｎｅ、
　Ｖｏｌｕｍｅ　ｌ　４５．２２１〜２３２．１９７７
；およびり、　ＣｈｅｓｓおよびＳ、　Ｆ、　Ｓｃｈｌ
ｏｓｓｍａｎ−“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ　ｏｆＤｉｓｔｉｎｃＬ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｔ−Ｃ
ｅｌｌ　　５ｕｂｓｅｔｓ　　Ｂｅａｒｉｎｇ　　Ｌｌ
ｎｉｑｕｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎｔ
ｉｇｅｎｓ”Ｃｏｎｔｅ’ｍｐｏｒａｒｙ　Ｔｏｐｉｃ
ｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｇｙ”、Ｏ，Ｓｔｕｔ
ｍａｎ、　　Ｅｄｉｔｏｒ。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　　ｌ　９７７、Ｖｏｌｕ
ｍｅ　７．３６３〜３７９゜Ｔ細胞のクラスまたはサブクラスを同定または抑制する
ことができることは、種々の免疫調節の不調または状態
の診断または処置にとって重要である。

たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫は、それらが
Ｂ細胞またはＴ細胞のいずれを源とするかによって、異
なる予後を有する。こうして、病気の予後の評価はこれ
らのリンパ球の２つの群を区別することに依存する。た
とえば、次の文献を参照：　Ａ−Ｃ，Ａ１５ｅｎｂｅｒ
ｙおよびＪ、　Ｃ，Ｌｏｎｇ、　ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　５８
　：　３００（Ｍａｒｃｈ、　　ｌ　９７５）　；　Ｄ
、　Ｂｅｌｐｏｍｍｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｍｎ＋ｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａ！　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｒ　Ｌｅ
ｕｋｅｍｉａｓ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈ。

ｍａｓ、　Ｓ、　Ｔｈ１ｅｒｆｅｌｄｅｒ、　ｅｔ、　
ａｌ、、　Ｅｄｉｔｏｒｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　　１９７７．３３〜４５；およ
びり、　Ｂｅｌｐｏｍｍｅ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｒ１
ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏ
ｇｙ、　　１９７８、−工」−１８５゜ある種の病気の
状態（たとえば、若年性リウマトイド関節炎およびある
種の白血病）は、Ｔ細胞のサブクラスの不釣合いに関す
る。自己免疫の病気は一般に「ヘルパーＪ　ＴＭ胞の過
剰またはある種の「サプレッサー」Ｔ細胞の欠乏に関連
するが、悪性の病気は一般に「サプレッサーＪＴ細胞の
過剰に関連することが示唆された。

ある種の白血病において、過剰のＴ細胞は発育の停止し
た状態において生成される。診断はこうしてこの不釣合
い、すなわち、過剰を検知することができることに依存
しうるであろう。たとえば、次の文献を参照：　Ｊ、　
Ｋｅｒｓｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、、”ＳｕｒｆａｃｅＭａ
ｒｋｅｒｓ　Ｄｅｆｉｎｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏ
ｉｄ　Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓｗｉｔｈ　Ｄｉｆｆｅ
ｒｉｎｇ　Ｐｒｏｇｎｏｓｅｓ”、　Ｈａｅｍａｔｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄＢｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、
　Ｖｏｌｕｍｅ　２０、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａ
ｇ、１９７７．１７−２４、およびその中に含まれる参
考文献；およびＥ、　Ｌ、　Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ、　ｅｔ
　ａｌ、。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　６４．３９２〜
３９７　（＋９７９）。

後天性無ガンマグロブリン性、すなわち免疫グロブリン
を生成しない疾患の状態は少なくとも２つの明確なタイ
プからなる。■型において、免疫グロブリンを生成でき
ないのは抑制体Ｔ細胞の欠乏によるが、Ｈ型はヘルパー
Ｔ細胞の欠乏による。

両タイプにおいて、患者のＢ細胞、すなわち抗体の実際
の分泌に関係するリンパ級の不足もしくは欠乏は存在し
ないように思われる。しかしながら、これらのＢ細胞は
抑制されるか「ヘルプされない」状態にあり、その結果
免疫グロブリンの生成は大きく減少するが、あるいは存
在しない。このタイプの後天性無ガンマグロブリン症は
、それゆえ、サプレッサーＴ細胞の過剰またはヘルパー
Ｔ細胞の不存在を試験することによって決定できる。

治療サイドにおいて、まだ明確に証明されていないが、
Ｔ細胞のサブタイプに対する抗体を過剰量で投与するこ
とは自己免疫の病気または悪性の病気において治療上有
益であるという、いくらかの示唆がある。たとえば、ヘ
ルパーＴ細胞のガン（ある種の皮膚Ｔ細胞リンパ腫およ
びある種のＴ細胞のＴ細胞急性リンパ芽球白血病）はヘ
ルパーＴ細胞抗原に対する抗体によってｊ＆置できる。

ヘルパー細胞の過剰を原因とする自己免疫の処置も同じ
方法で達成できる。サプレッサーＴ細胞の過剰による病
気（たとえば、悪性腫瘍または２型後天性無ガンマグロ
ブリン症）は、サプレッサーＴ細胞抗原に対する抗体を
投与することによって処置できる。

ヒトＴ細胞の全クラス（いわゆる抗ヒト胸腺細胞のグロ
ブリン、すなわち、ＡＴＧ）に対する抗血清は、移植組
織を受ける患者において治療上有用であると報告されて
いる。細胞性免疫応答（移植組織を拒否する機構）はＴ
細胞に依存するので、Ｔ細胞に対する抗体を投与すると
、この拒否の過程を防止または遅延する。たとえば、次
の文献を参照：Ｃｏ５１ｍ１．　ａｔ　ａｌ、、“Ｒａ
ｎｄｏｍｉｚｅｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｔｒｉａｌ　ｏ
ｆ　ＡＴＧ　ｉｎ　Ｃａｄａｖｅｒ　Ｒｅｎａｌ　Ａｌ
ｌｇｒａｆｔ　Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ：Ｉｍｐｏｒｔａ
ｎｃｅ　　ｏｆ　　Ｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｍｏｎｆｆｏｒ
ｉｎｇ”、　　Ｓｕｒｇｅｒｙ−先０：１５５〜１６３
　（１９７６）およびその中に含まれる参考文献。

ヒトＴ細胞のクラスおよびサブクラスの同定および抑制
は、従来、動物をヒトＴ細胞で免疫し、その動物を出血
させて血清を取り、そしてこの抗血清を（たとえば）地
元（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）であるが、異種ではないＢ
細胞で吸着して望まない反応性をもつ抗体を除去するこ
とによって得た、ヒトＴ細胞のための自発性自己抗体ま
たは選択的抗血清を使用することによって達成された。

これらの抗血清の製造は、とくに吸着および精製の工程
において、きわめて困難である。吸着され且つ精製され
た抗血清でさえ、所望の抗体に加えて、いくつかの理由
で多くの不純物を含有する。第１に、血清はＴ細胞で免
疫する前に数百刃の抗体分子を含有する。第２に、この
免疫法は注入したすべてのヒト細胞について見い出され
る種々の抗原に対する抗体を生成させる。単一の抗原に
対する抗体は選択的に生成されない。第３に、このよう
な方法で得られた特異性抗体の力価は通常極めて低く（
たとえば、ｌ：ｌｏＯより大きい希釈度において不活性
）そして非特異性抗体に対する比は１／ｌｏ’より小で
ある。

たとえば、前述のＣｈｅｓｓおよびＳｃｈ　ｌｏｓｓｍ
ａｎの文献（３６５ページ以降参照）および前述のＣｈ
ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅ
ｗｓを参照。ここには先行技術の抗血清の欠点およびモ
ノクローナル抗体の利点が記載されている。

今回、正常なヒトのサプレッサーＴ細胞（正常のヒトの
Ｔ細胞のほぼ３０％）および正常のヒトの胸腺細胞の約
８０％について見い出されるが、正常のヒトの骨髄細胞
の２％より少ないものおよびＢ細胞または無特徴細胞に
ついて見い出されない抗原に対する新規なモノクローナ
ル抗体を生成できる新規なハイブリドマ（ＯＫＴ８と表
示する）が発見された。さらに、モノクローナル抗体○
ＫＴ８は補体を固定する。

そのように生成された抗体は正常なヒトのＴ細胞のほぼ
３０％についての単一の決定因子に対して単一特異性（
ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆ　ｉｃ）であり、そして他の抗ヒ
ト免疫グロブリンを本質的に含有しないが、これと対照
的に先行技術の抗血清は多数のヒト抗原に対して反応性
の抗体で本来汚染されており、そして先行技術のモノク
ローナル抗体は正常なヒトの胸腺細胞の抗原について単
一特異性ではない。

その上、このハイブリドマは培養して抗体を生成するこ
とができる。この場合動物を免疫し、殺し、次いで先行
技術の不純の抗血清を得るときにさえ、必要な長たらし
い吸着および精製の工程を実施することを要しない。

したがって、本発明の１つの目的は、正常なヒトのサプ
レッサーＴ細胞について見い出される抗原に対する抗体
を生成するハイブリドマ類を提供することである。

本発明のさらに別の面において、これらのハイブリドマ
類を製造する方法を提供する。

本発明の他の目的は、正常なヒトのサプレッサーＴ細胞
について見い出される抗原に対する本質的に均質な抗体
を提供することである。

さらに他の目的は、この抗体を用いる病気の処置または
診断の方法あるいはＴ細胞または胸腺細胞のサブクラス
の同定法を提供することである。

本発明のその他の目的および利益は、本発明の開示を検
討すると明らかになるであろう。

前述の目的および利益を達成するため、本発明によれば
、正常なヒトのサプレッサーＴ細胞について見い出され
る抗原に対する新規な抗体を生成する新規なハイブリド
マ、この抗体それ自体、およびこの抗体を用いる診断お
よび治療の方法が提供される。該ハイブリドマはＭｉｌ
ｓｔｅｉｎおよびＫｏｈＩｅｒの方法に一般に従って製
造される。正常のヒト胸腺細胞でマウスを免疫した後、
免疫したマウスの肺細胞をマウスの骨髄腫ラインからの
細胞と融合し、そして得られたハイブリドマ類を正常の
Ｅゼット（ｒｏｓｅｔｔｅ）陽性のヒトＴ細胞および／
または胸腺細胞に選択的に結合する抗体を含有する上澄
剤を用いてそれらについて選別した。所望のハイブリド
マ類を引き続いてクローンに分け（ａｌｏｎｅ）、特性
つけた。その結果、正常なヒトのサプレッサーＴ細胞（
正常なヒトの末梢Ｔ細胞の約３０％）についての抗原に
対する抗体（ＯＫＴ８と表示する）を生成するハイブリ
ドマが得られた。この抗体は正常なヒトのＴ細胞の約３
０％と反応するばかりでなく正常なヒトの胸腺細胞の約
８０％および正常のヒトの骨髄細胞の２％より少ないも
のと反応するが、Ｂ細胞または無特徴細胞と反応しない
。

先行技術において示された困難および抗原として悪性の
細胞ラインを用いて報告された成功の不足を見ると、本
発明の方法が所望のハイブリドマを提供したことは驚く
べきことであった。交雑細胞のこの予測されえない性質
は１つの抗原またはラインから他のものへの補性（ｅｘ
ｔｒａｐｏｌａｔｅ）を許さないことに注意すべきであ
る。事実、本発明者らは、抗原としてＴ細胞の悪性細胞
ラインを用いると、所望の抗原を生成しないハイブリド
マ類が形成することを見い出した。細胞表面から分離し
た精製した抗原を使用する試みも不成功に終つｔこ。

主題のハイブリドマおよびそれにより生成された抗体の
両者は、この明細書中で表示ｒＯＫＴ８Ｊで呼ばれ、言
及される特定の物質は文脈から明らかである。主題のハ
イブリドマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、
　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、　２０８５２　）に１
９７９年９月１８日に寄託され、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８
０１４が付された。

このハイブリドマおよび生ずる抗体の製造および特性は
、以下の説明および実施例から一層理解できるであろう
るハイブリドマを製造する方法は一般に次の工程からなる
：Ａ、正常なヒト胸腺細胞でマウスを免疫する。

ＩスのＣＡＦ、マウスが好ましいことがわかったが、他
のマウスの系統を使用できると考えられる。

免疫スケジュールおよび胸腺細胞の濃度は、有効量の適
当に準備した牌細胞を生成するようなものであるへきで
ある。０．２ｍＱのリン酸塩緩衝食塩溶液中の２ＸＩＯ
’細胞／マウス／注射を用いて、１４日の間隔で、３回
免疫を行うことは有効であることがわかった。

Ｂ、免疫したマウスから肺臓を取り出し、適当な媒質中
の牌懸濁液を調製する。約１　ｍＱ／牌朦の媒体で十分
である。これらの実験の技術はよく知られている。

Ｃ０懸濁した牌細胞を適当な細胞ラインからのマウスの
骨髄腫の細胞と、適当な融合促進剤の使用により融合す
る。肺細胞対骨髄細胞の好ましい比は約５対ｌである。

約１０’個の牌細胞について合計約０．５〜ｌ−Ｏｍｆ
２の融合媒質は適当である。

多くのマウスの骨髄腫の細胞は知られており、そして一
般に学問的共同体のメンバーまたは種々の寄託機関、た
とえば、ザ・ソータ・インスチチュート・セル・ディス
トリビューション・センター（ｔｈｅ　５ａｌｋ　Ｉｎ
５ｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
　Ｃｅｎｔｅｒ。

Ｋａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）から入手できる。使用する
細胞ラインは好ましくはいわゆる「薬物抵抗性」型であ
って、未融合の骨髄腫細胞が選択した媒体中で存在せず
、一方交雑細胞が生存するようにすべきである。最も普
通のクラスは８−アザグアニン抵抗性の細胞ラインであ
り、これは酵素ヒボキサンチン・グアニン・ホホリポシ
ル・トランスフェラーゼ（ｐｈｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ
　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を欠き、それ１’ｌ）工Ｈ
ＡＴ　（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミ
ジン）媒体により支持されない。また使用する骨髄種細
胞ラインはいわゆる「非分泌」型である、すなわち、そ
れはそれ自体抗体を生成しないことが一般に好ましいが
、分泌型を使用できる。しかしながら、ある場合におい
て、分泌する骨髄腫ラインは好ましいことがある。好ま
しい融合促進剤は平均分子量が約１０００〜約４０００
であるポリエチレングリコール（商業的にＰＥＧ１００
０などとして入手できる）が好ましいが、この分野にお
いて知られている他の融合促進剤を使用できる。

Ｄ、別の容器内において、未融合の牌細胞、未融合の骨
髄腫細胞、および融合した細胞の混合物を、未融合の骨
髄種細胞を支持しない選択的媒質中で希釈し、未融合の
細胞を死亡させるのに十分な時間（約１週間）培養する
。この希釈は限定されたものの型であることができ、こ
の希釈において希釈剤の体積は統計的に計算して各別々
の容器［たとえば、微小力価の板の各ウェル（ｗｅｌｌ
）］中である数の細胞（たとえば、１〜４）を単離する
。

媒体は薬物抵抗性（たとえば、８−アザグアニン抵抗性
）で未融合の骨髄腫細胞ラインを支持しないもの（たと
えば、ＨＡＴ媒質）である。それゆえ、これらの骨髄腫
細胞は死ぬ。未融合の牌細胞は非悪性であるので、有限
の数の世代をもつだけである。こうして、ある期間（約
１週間）後、これらの未融合の肺細胞は再生しない。融
合した細胞は、これに対して、骨髄腫の親の悪性をもち
、そして肺細胞の親の選択的媒体中で生存できるので、
再生し続ける。

Ｅ、ハイブリドマを含有する各容器（ウェル）中の上澄
液を、Ｅロゼツト陽性の精製したヒトＴ細胞または胸腺
細胞に対する抗体について測定する。

Ｆ、所望の抗体を生成するハイブリドマを選択しくたと
えば、限定希釈により）そしてクローンに分ける。

いつＩ：ん所望のハイブリドマを選択し、クローンに分
けると、終結の抗体は２つの方法の１つで生成させるこ
とができる。最も純粋なモノクローナル抗体は、所望の
ハイブリドマを適当な媒質中で適当な長さの時間試験内
で培養し、次いで所望の抗体を上澄液から回収すること
によって生成される。適当な媒質および適当な培養時間
の長さは、既知であるか、あるいは決定容易である。こ
の試験管内技術は、他の特異性の抗ヒト免疫グロブリン
を本質的に含まない、単一特異性モノクローナル抗体を
木質的に生成する。媒質は外因性血清（たとえば、胎児
の子牛の血清）を含有するので、少量の他の免疫グロブ
リンが存在する。しかしながら、この試験管内の方法は
、モノクローナル抗体の濃度がわずかに約５０μｇ／ｍ
ａであるので、十分な量または濃度を生成できない。

非常に大きい濃度のわずかに純度に劣るモノクローナル
抗体を生成させるため、所望のハイブリドマをマウス、
好ましくは先天性または生先天性のマウスに注射できる
。ハイブリドマは適当な潜伏時間後抗体生成の腫瘍を形
成させ、その結果宿主マウスの血流および腹膜滲出液（
腹水）中に高濃度の所望とする抗体（約５〜２０ｍｇ／
ｍ１２）が生ずる。これらの宿主マウスも正常の抗体を
血流および腹水の中に有するが、これらの正常な抗体の
濃度はモノクローナル抗体濃度のわずかに約５％である
にすぎない。その上、これらの正常の抗体は特異性が抗
ヒトでないので、収穫した腹水または血清から得ｔ；モ
ノクローナル抗体は汚染する抗ヒト免疫グロブリンを本
質的に含有しない。このモノクローナル抗体は力価が高
＜（１：　５０．０００以上の希釈で活性である）そし
て特異性免疫グロブリン対非特異性免疫グロブリンの比
が高い（約１／２０）。軽量の骨髄腫鎖を組込んだ生成
した免疫グロブリンは非特異性の「無意味な」ペプチド
類であり、これらはモノクロール抗体をその特異性を減
じないで単に希釈するだけである。

実施例１メスのＣＡＦ、マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ研究所；生まれ
てから６〜８週間）を、０．２ｍ（２のリン酸塩酸緩衝
食塩溶液中の２８ＩＯ’のヒト胸腺細胞で腹膜内的に１
４日の間隔で免疫した。第３回目の免疫後、牌をマウス
から取り出し、そしてステンレス鋼の銅に組織を通すこ
とによって単一細胞の懸濁液をつくった。

細胞の融合をＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方
法に従って実施した。ｌＸｌ０’の肺細胞を、ＲＰＭＩ
１６４０媒質（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎ
ｄ、　ＮＹ）中の３５％のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧＩｏｏｏ）と５％のジメチルスルホキシドとからな
る融合媒質の０．５ｎ＋ａ中において、２Ｘ１０’のＰ
３Ｘ６３Ａｇ８Ｕｌ骨髄腫細胞（Ｂｒ、　Ｍ、　５ｃｈ
ａｒｆｆ。

Ａｌｂｅｒｔ　Ｅｉｎｓｔｅｉｎ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏ
ｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｂｒｏｎｘ。

ＮＹにより供給）と融合した。これらの骨髄腫細胞Ｉ　
ｇ　Ｇ　ｌ　ｇ　Ｌ鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎｓ）を
分泌する。

Ｂ、ハイブリドマの選択および成長細胞の融合後、細胞をＨＡＴ媒体（ハイポキサンチン、
アミノブチリン、およびチミジン）中で３７℃において
５％のＣＯ２を使用して湿った雰囲気中で培養した。数
週間後、ハイブリドマ類を含有する培養液から４０〜１
００μＱの上澄液を、ＭｅｎｄｅｓＱ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、ｌ　ｌ　ｌ　：　８６０．　１９７３）が記載する
ようにｉｉ＊なヒトの供与者の血液から調製した、Ｅロ
ゼツト陽性（Ｅつ個体群とＥロゼツト陰性（Ｅ−）個体
群とに分けた１０’の末梢リンパ球のペレットに加えた
。これらの細胞へ結合するマウスのハイブリドマ抗体の
検出は、ラジオイムノアッセイおよび／または間接免疫
蛍光法により決定した。培養液の上澄液で培養した細胞
を蛍光を付与した山羊の抗マウスＩｇＧ（Ｇ／ＭＦ　Ｉ
　Ｔ　Ｃ）（Ｍｅｌｏｙ研究所、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌ
ｄ、　ＶＡ　；Ｆ／Ｐ−２，５）で染色し、この蛍光性
抗体被覆細胞を引き続いてサイトフルオログラフ（Ｃｙ
ｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｆ）　Ｆ　Ｃ２００／　４８０
０　Ａ　（Ｏｒｔｈｏ　ｌｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｗ
ｅｓｔｗｏｏｄ、　ＭＡ）について実施例■に記載する
ように分析した。Ｅ＋リンパ球（Ｔ細胞）および／また
は胸腺細胞と特異的に反応する抗体を含有するハイブリ
ドマ培養液を選択し、供給体（ｆｅｅｄｅｒ）細胞の存
在で限定希釈法により２回クローンに分けた。引き続い
て、クローンを２．６．１０．１４−テトラメチルペン
タデカン（Ａｌｄｒｉｅｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ
ｐａｎｙから商品名Ｐｒ１ｓｔｉｎｅで市販されている
）で準備したＣＡＦＩマウスに一定のクローンのｌＸｌ
０’細胞（０，２＋＋＋Ｑの体積）を注射することによ
って、腹膜内に移植した。次いでこれらのマウスからの
悪性腹水を使用して、実施例■において後述するように
、リンパ球を特性づけた。主題の交雑抗体ＯＫＴ８は、
標準の技術によりサブクラス　ＩｇＧ２ａであると証明
された。

実施例■ 人間の末梢血液の単核細胞を、健康な志願者の提供者（
１５〜４０才）から、Ｂｏｙｕｍ、　５ｃａｎｄ、　Ｊ
。

Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　２１（Ｓｕｐ
ｐｌ　９７）　：　７７゜１９６８の技術に従い、フィ
コール−ハイパツク（Ｆｉｃｏｌｌ）ｌｙｐａｑｕｅ）
密度勾配遠心分離（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ、　ＰｉｓｃａＬａｗａｙ、　ＮＪ）に
より単離した。分別しない単核細胞を、Ｃｈｅｓｓ、　
ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉ　１３：　１１１３（１９７４）に
すでに記載されティるように、Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
　−２００抗−Ｆ　（ａｂ’）２カラムクロマトグラフ
イーにより、表面１ｇ”（Ｂ）およびＩｇ−（Ｔプラス
Ｎ　ｕｌｌ）の個体群に分離した。Ｔ細胞はＩｇ−個体
群を５％の羊の赤血球（Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ａ　５ｓｏｃｉａｔｅｓ、　Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ
、　ＭＤ）でＥロゼツト化することによって回収した。

ロゼツト化した混合物をフィコ−ルーツ＼イパツク（Ｆ
　１ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）上で層状にし、回収し
たＥ＋ベレットを０．１５５モルのＮＨ，ＣＱ（ｌ　Ｏ
ｍ＜１／　ｌ　Ｏ’細胞）で処理した。このようにして
得られたＴ細胞の個体群は、標準法により決定して、〈
２％ＥＡＣＯゼット陽性および〉９５％Ｅロゼツト陽性
であった。さらに、非ロゼツトＴ　ｇ−（Ｎｕｌｌ細胞
）個体群をフィコール表面から収穫した。この後者の個
体群はく５％Ｅ′″および≦２％ｓ１ｇ＋であった。表
面１ｇ”（Ｂ）個体群は、前述のようにＳ　ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ　−２００カラムクロマトグラフイーおよび引
き続く正常なヒト・ガンマグロブリンによる溶離から得
られた。この個体群は〉９５％表面１ｇ＋およびく５％
Ｅ＋であった。

正常のヒトの骨髄細胞細胞は、正常のヒトの篤志家の後
腸骨稜から針の吸引から得た。

Ｂ、胸腺細胞の単離正常人の胸腺を２月〜１４才の年令の患者から、心臓の
矯正手術のもとに得た。胸腺の新らしく得た部分を媒体
１９９　（Ｇ　１ｂｃｏ）中の５％胎児の子牛の血清中
に直ちに入れ、鉗子とはさみで小さく切り、引き続いて
金網を通してプレスすることによって単細胞の懸濁液に
した。細胞を次に前節Ａで説明したように、フィルコー
ル−ハイパツクで層状にし、回し、洗浄した。このよう
にして得られた胸腺細胞は〉９５％生活力があり、そし
て〉９０ロゼツト陽性であった。

Ｔ細胞ラインＣＥＭ、Ｈ３Ｂ〜２およびＭＯＬＴ−４を
、Ｈ、Ｌ　ａｚａｒｕｓ博士（Ｓ　１ｄｎｅｙ　Ｆ　ａ
ｒｂｅｒＣａｎｃｅｒ　　Ｉ　ｎ５ｔｉＬｕｔｅ、　Ｂ
　ｏｓｔｏｎ、　Ｍ　Ａ　）により提供された。白血病
細胞（Ｇ−ＡＬＬ細胞）は、Ｔ細胞ＡＬＬの診断を受け
た２５人の患者から得た。

これらの個々の腫瘍は、羊の赤血球を用いるそれらの自
発的ロゼツト生成（〉２０％Ｅつ、およびＴ細胞特異性
異種抗血清拭ＨＴＬ　（Ｂ、に、）およびＡ９９との反
応性により、前述のように、Ｔ細胞直系であると前もっ
て決定された。腫瘍集団をｌＯ％Ｓ　Ｍ　Ｓ　Ｏおよび
２０％ＡＢヒト血清と一緒に一１９６℃の蒸気相液体窒
素で、表面の特性っけまで、寒冷保存した。分析したす
べての腫瘍集団は、細胞遠心調製のＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉ
ｅｍｓａの形態学により９０％より多い芽球であった。

前記Ｔ細胞ラインＣＥＭ１Ｈ３Ｂ−２およびＭＯＬＴ−
４については、それぞれ下記文献に記載され且つＡＴＣ
Ｃに寄託されている細胞ラインである。

ＣＥＭ。

これは、Ｇ、Ｅ、Ｆｏｌｅｙらによって得られたＴ−リ
ンパ芽球細胞ラインである［Ｃａｎｃｅｒｌ　８　：５
２２−５２９頁（１９６５）参照］。この細胞は、急性
リンパ芽球白血病に感染したコーカシア（Ｃａｕｃａｓ
　１ａｎ）の４才の女性の末梢血軟膜（ｂｌｏｏｄ　ｂ
ｕｆｆｙｃｏａｔ）から得られた。このＣＥＭ細胞ライ
ンは、ＡＴＣＣに“ＡＴＣＣＣＣＬ１９９”として寄託
されている。

Ｈ３Ｂ−２；これは、Ｇ　、　Ｅ　、Ｆｏｌｅｙらによって得られた
Ｔ−リンパ芽球細胞ラインである。この細胞は、新生の
ンリアン（Ｓｙｒｉａｎ）ハムスターの第８継代腫瘍細
断片から得られた［Ｒ，Ａ、アダムス、Ｐ　ｒｏｅ。

Ａｍ、　Ａｓ５ｏｃ、　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、　８
　：　ｌｓ　（１９６７）参照１゜このＨ３Ｂ−２細胞
ラインは、ＡＴＣＣにＡＴＣＣＣＣＬ１２０．１″とし
て寄託されている。

ＭＯＬＴ−４；これは、再発した１９才の男子の急性リンパ芽球白血病
患者の末梢血管血液から得られた細胞ラインである［Ｊ
、　Ｎａｐ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　４９　：　
８９１〜８９５頁（１９７２）参照］。このＭＯＬＴ−
４細胞ラインは、ＡＴＣＣに“ＡＴＣＣＣＲＬ１５８２
”として寄託されている。

実施例■ すべての細胞個体群を用いるモノクローナル抗体のサイ
トフルオログラフ分析を、サイトフルオログラフ（Ｃｙ
ｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｆ）Ｆ　Ｃ２００／４８００Ａ
　（Ｏｒｔｈｏ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で蛍光共
役したヤギの抗マウスＩ　ｇＧ（Ｇ／Ｍ　　Ｆ　Ｉ　Ｔ
Ｃ）（Ｍｅｌｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ）を用
いて間接免疫蛍光法により実施した。要約すると、１〜
２ＸｌＯ’細胞を０．１５ｍ１２のＯＫＴ５でｌ　：　
５００希釈において処理し、４°Ｃで３０分間培養し、
２回洗浄した。次いで細胞をＱ、１５ｍ１２の１＝４０
希釈のＧ／Ｍ　　Ｆｌ−ＴＣで４°Ｃにおいて３０分間
反応させ、遠心分離し、３回洗浄した。次いで細胞をサ
イトフルオログラフで分析し、蛍光の強さ／細胞をパル
ス高さ分析器に記録した。同様な反応性のパターンはｌ
：１０．０００の希釈で観察されたが、これよりさらに
希釈すると反応性は失なわれた。バックグラウンドの染
色は、非生成性交雑クローンで腹膜に免疫したＢ　ａｌ
ｂ／ｃ　Ｊマウスからのｌ　：　５００腹水の０−１５
＋ｎＱ部分を代わりに使用することによって得た。

抗体および補体を中介するリンパ溶解を含む実験におい
て、胸腺および末梢Ｔｍ胞は選択的溶解後−夜培養し、
次いでサイトフルオログラフで引き続いて分析した。

実施例■ モノクローナル抗体および補体を用いるリンパ集団の溶
解４０ＸＩＯ’の末梢Ｔ細胞または胸腺細胞を、１５ｄの
プラスチック管（Ｆａｌｃｏｎ、　０ｘｎａｒｄ、　Ｃ
Ａ）に入れた。細胞のペレットをＰＢＳ中でｌ：２００
に希釈した０、８ｃ、ｃ−のＯＫＴ３．ＯＫＴ４．ＯＫ
Ｔ８または正常の腹水の対照で培養し、再懸濁し、そし
て２０℃で６０分間培養した。引き続いて、０．２ｃ、
ｃ、の新鮮なウサギの補体を抗体処理した集団に加え、
再懸濁し、さらに振とう水浴中で３７°Ｃにおいて６０
分間培養した。この時間の終りにおいて、細胞は回転沈
下させ、生きている細胞をトリパン青の排除により数え
た。計数後、細胞を２回５％ＦＣ３中で洗い、最後の培
地［ＲＰ　Ｍ　Ｉ　ｌ　６４０　（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ
ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、　Ｇｒ
ａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ　Ｙ）、２０％のＡＢ”ヒ
ト血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、２０
０ミリモルのし一グルタミン、２５ミリモルのＨＥＰＥ
Ｓ緩衝剤、および０．５％の重炭酸ナトリウムを含有す
る］中に入れ、５％のＣＯ２を含む湿った雰囲気中で３
７°Ｃにおいて一夜培養し　ｌこ　。

ハイブリドマの生成、および生ずるモノクローナル抗体
の生成および特性づけは、上の実施例におけるように実
施した。大量の主題の抗体を、主題のハイブリドマのマ
ウスへの腹腔内注射および悪性腹水の収穫により調製し
たが、ハイブリドマは試験管内でこの分野においてよく
知られた技術により培養し、抗体を上澄液から取り出す
ことができることは、明らかに考えられる。

第１図は、ＯＫＴ６．ＯＫＴ８．ＯＫＴ９およびＯＫＴ
ＩＯと種々のヒトのヒトのリンパ球の集団との反応を示
す。ＯＫＴ８のモノクローナル抗体は正常なヒトのＴｍ
胞のほぼ３０％、正常のヒトの胸腺細胞のほぼ８０％、
正常のヒトの骨髄細胞の２％より少ないものと反応する
が、そしてＢ細胞または無枠微細胞と反応しない。この
反応性のパターンは、被験者の抗体ＯＫＴ８を検出し、
他の抗体と区別する１つの試験である。

第１図は、正常のヒトの胸腺の懸濁液をｌ：５００希釈
のＯＫＴ３．ＯＫＴ４、ＯＫＴ５．ＯＫＴ６．ＯＫＴ８
．ＯＫＴ９．ＯＫＴ１０およびＧ／Ｍ　　ＦＩＴＣと反
応させた後、サイトフルオログラフ上に得られた代表的
蛍光パターンを示す。

同様な反応性のパターンは、１２の追加の試験の正常の
ヒトの胸腺集団を用いたとき見られた。図示すように、
有意差はこれらのモノクローナル抗体のおのおのとの反
応性の百分率および蛍光の強さの両方において存在する
。たとえば、ＯＫＴ９は低い蛍光強さで胸腺細胞のほぼ
１０％と反応するが、ＯＫＴ５．ＯＫＴ６．ＯＫＴ８お
よびＯＫＴ　Ｉ　Ｏは高い蛍光の強さにおいて胸腺細胞
のほぼ７０％と反応する。胸腺細胞の７５％と反応する
ＯＫＴ４は、ＯＫＴ９と、より大きい蛍光強さのパター
ンを与えるモノクローナル抗体との間の中間体である。

さらに、第１図は、胸腺細胞のほぼ１５％がＯＫＴ３で
間接の免疫蛍光により検知されることを示す。ＯＫＴＩ
は示されていないが、その反応性のパターンは胸腺細胞
へのＯＫＴ３に実質的に同一である。第１図の反応性の
パターンは、被験者の抗体ＯＫＴ８を検知でき、他の抗
体と区別できる他の試験である。

表２は、実施例■に記載する一連の溶解実験により決定
された、ヒトの末梢Ｔ細胞および胸腺細胞についての種
々のモノクローナル抗体により定義される抗体の分布を
示す。ＯＫＴ３、ＯＫＴ４およびＯＫＴ８のみは補体の
固定モノクローナル抗体であるので、これらの３種を使
用しＩ；。

表２Ａに示すように、全Ｔ細胞集団はＯＫＴ３と反応す
るが、ＯＫＴ４．ＯＫＴ５およびＯＫＴ８は、それぞれ
、Ｔ細胞の６０％、２５％および３４％と反応する。Ｏ
ＫＴ４および補体を用いる溶解は、合計の数を６２％だ
け減少し、そしてとくにＯＫＴ４＋集団を消した。さら
に、ＯＫＴ５”およびＯＫＴ８＋細胞の百分率は増加し
、そしてＯＫＴ５＋およびＯＫＴ８”Ｔ細胞の絶対数へ
の効果は存在しない。これらの実験は、ＯＫＴ４”がＯ
ＫＴ５″″およびＯＫＴ８″″集団と区別されることを
示唆した。この結論は、ＯＫＴ８および補体を用いるＴ
細胞の溶解により、さらに支持された。

この場合において、ＯＫＴ４”Ｔ細胞の百分率は増加し
、絶対数は同一にとどまり、そしてＯＫＴ８゛およびＯ
ＫＴ５“集団は排除された。その上、これらの結果は、
ＯＫＴ８＋集団がＯＫＴ４”集団に対して相反的であり
、そして全ＯＫ　Ｔ　５　”Ｔ細胞の部分集合を含有す
ることを、明らかにした。

ヒトの胸腺細胞集団を用いる同様な実験は、異なる結果
を与えた。表２Ｂに示すように、胸腺細胞のほぼ７５％
はＯＫＴＡ４＋またはＯＫＴ８＋であった。その上に、
ＯＫＴ４またはＯＫＴ８のいずれかを用いる溶解後、胸
腺細胞のわずかに２５％が残った。残留する胸腺細胞の
大部分はＯＫＴ３と反応性であったが、少部分のみがＯ
ＫＴ６と反応性であった。これらの発見は、ヒトの胸腺
細胞の大部分が同じ細胞上にＯＫＴ４．ＯＫＴ５．ＯＫ
Ｔ６およびＯＫＴ８表面抗原を有することを明らかにす
る。その上に、表２はＯＫＴ８またはＯＫＴ４’を用い
る処理後、ＯＫＴ３抗原ををする熟成胸腺細胞の著しい
増加が存在することを示す。

こうして、ＯＫＴ４またはＯＫＴ８の溶解後残留する細
胞の大きい比率はＯＫＴ３＋であるので、ＯＫＴ３反応
性の胸腺細胞の大部分は０Ｋ７４″″またはＯＫＴ８＋
部分集団にすでに分離している。

ＯＫＴ３“部分集団がＯＫＴ４”およびＯＫＴ８”の両
方であった場合、いずれかのモノクローナル抗体を用い
る溶解はＯＫＴ３反応性胸腺細胞を除去したであろう。

ＯＫＴ３反応性胸腺細胞部分集団の、胸腺細胞フラクシ
ョンを定める他のモノクローナル抗体への関係を決定す
るため、胸腺細胞をＯＫＴ３および補体で処理し、次い
で残留細胞を未処理の胸腺細胞の集団と比較した。表２
Ｂに示すように、ＯＫＴ３および補体は胸腺細胞の２５
％を除去しｔ；。

その上、ＯＫＴ４．ＯＫＴ５．ＯＫＴ６またはＯＫＴ８
反応性集団の主要な損失はなかった。これらの発見は、
ＯＫＴ６フーカー（ｍａｒｋｅｒ）を有する胸腺細胞の
非常に大部分がＯＫＴ３−集団中に含有されることを示
唆する。その上、これらの発見は、ＯＫＴ４．ＯＫＴ５
およびＯＫＴ８で定義される抗原を同時に表わす胸腺細
胞がＯＫＴ３−集団へ同様に制限されることを示唆する
。また、胸腺細胞のＯＫＴ９反応性の集団は、分別しな
い胸腺細胞のＯＫＴ３および補体の処理後、減少せず、
こうしてＯＫＴ９＋部分集合がＯＫＴ３−胸腺細胞集団
に大きく制限されることに、注意すべきである。

これらの結果に基づいて、ヒトの胸腺細胞の胸腺肉生長
の段階を記載することが可能であった。

第２図に示すように、実質的にすべての胸腺細胞はＯＫ
　Ｔ　１０マーカーを有する。さらに、胸腺細胞は初期
の段階においてＯＫＴ９マーカー（それぞれＴｈｙｌお
よびＴｈｙ２）を獲得する。この段階は、胸腺細胞の大
部分を定め、未分別集団のほぼ１０％になる。引き続い
て、ヒトの胸腺細胞はＯＫＴ６により定義される胸腺特
有の抗原を獲得し、同時！：　ＯＫ　Ｔ　４．ＯＫＴ５
８よびＯＫＴ８（Ｔｈｙ４）を表わす。この後者の部分
集団は、胸腺細胞の大部分を表わし、モして胸腺集団の
７０〜８０％以上になる。さらに成熟すると、胸腺細胞
はＯＫＴ６反応性を失ない、ＯＫＴ３　（およびＯＫＴ
１）反応性を獲得し、ＯＫＴ４＋およびＯＫＴ５”１Ｏ
ＫＴ８”部分集合（Ｔｈｙ７およびＴｈｙ８）に分離す
る。最後に、胸腺細胞が末梢Ｔ細胞区画中へ輸送される
とき、それはＯＫＴ　ｌ　Ｏマーカーを失なうように思
われる。なぜなら、この抗原は実質的にすべての末梢１
９７３球上で欠乏するからである。これらの胸腺発育の
３つの主要段階の間の可能な移行状態は、第２図中にＴ
ｈｙ３、Ｔｈｙ５およびＴｈｙ６で表示する。

Ｔ直系の急性リンパ芽球白血球は未成熟の胸腺細胞から
誘導されると考えられるので、Ｔ−ＡＬＬを有する個体
からの腫瘍細胞とこれらの胸腺内分化の提案した段階と
の間の関係を決定した。普通の抗Ｔ細胞試薬を用いて前
もって研究した、Ｔ−ＡＬＬをもつ個体からの２５の腫
瘍細胞集団と３種のＴ細胞ラインを、研究した。第３表
に示すように、Ｔ−ＡＬＬ白血病の細菌の大部分は、Ｏ
ＫＴＩＯ単独またはＯＫＴ９およびＯＫＴＩＯと反応性
であるが、他のモノクローナル抗体と反応しなかった。

こうして、研究したｌ　５／２５の場合は初期の胸腺抗
原（段階１）を有すると思われた。

これと対照的に、５／２５の場合はＯＫＴ６と反応性で
あり、より成熟した集団からの誘導を示唆した（段階■
）。このＴ−ＡＬＬ群は、表３中に示されるＯＫＴ４．
ＯＫＴ８およびＯＫＴ９反応性に関してそれ自体異質で
あった。２／５患者かラノ細胞は、ＯＫＴ４．ＯＫＴ６
およびＯＫＴ８を含む普通の胸腺細胞の抗原のほとんど
を有する。

ＯＫＴ８反応性が観察されたが、ＯＫＴ５はこれらの５
段階■腫瘍のいずれにも存在しないことを注意するに値
する。この後者の結果は、ＯＫＴ５およびＯＫＴ８が同
じ抗原について異なる抗原または異なる決定因子を定め
ることを明らかに示唆する。最後に、１／２５患者の腫
瘍は、そのＯＫＴ３との反応性により定義されるように
、成熟した胸腺細胞集団（段階■）から来た。この個体
の腫瘍は、さらに、ＯＫＴ５．ＯＫＴ８およびＯＫＴＩ
Ｏと反応性であった。分析した２５白血球の集団のうち
で、わずかに４種の腫瘍が明瞭に分類できなかった。３
種はＯＫＴ４およびＯＫＴ８に対して陽性であったが、
ＯＫＴ３およびＯＫＴ６に欠乏し、そしてほとんどＴｈ
ｙ４およびＴｈｙ７．８からの移行を表わすように思わ
れた。２５の場合の１つはＯＫＴ８およびＯＫＴ　１０
反応性を有したので、Ｔｈｙ３からＴｈｙ４への移行で
あるように思われた。

Ｔ−ＡＬＬ＠瘍集団から誘導されたＴ細胞ラインも、胸
腺内分化の特別の状態からの細胞を表わした。表４に示
すように、Ｈ３ＨはＯＫＴ９およびＯＫＴ　ｌ　Ｏと排
他的に反応したので、段階ｌから誘２５される腫瘍集団
を定めるであろう。これと対照的に、ＣＥＭはＯＫＴ４
．ＯＫＴ６．ＯＫＴ８．ＯＫＴ９ｊりよびＯＫＴ　ｌ　
Ｏと反応性であり、そして段階■胸腺細胞から誘導され
るように思われた。最後に、ＭＯＬＴ−４はＯＫＴ６．
ＯＫＴ８．ＯＫＴ９およびＯＫＴＩＯを表わしたので、
ＨＳ　Ｂ　−２およびＯＥＭの間の段階において白血病
の変態を表わすように思われる。

Ｔ細胞の急性リンパ芽球白血病の後の段階（たとえば、
段階■）をもつ患者は段階ＩＡＬＬをもつ患者よりも延
長された病気のない生存を有することが示されたので、
ＯＫＴ６抗体を使用すると、Ｔ細胞を有する所定の患者
の予後に関して結論を帰ることができる。

表５は、末梢Ｔ細胞およびＴ細胞部分集合のレベルの間
の関係、および種々の病気の状態を示す。

これらの関係は、これらの病気の状態の１つを有するこ
とが予測される個体の血液試料を分析して、Ｔ細胞およ
びＴ細胞部分集合を決定することによって、診断学的目
的（たとえば、急性伝染性単核症を検出するために）で
使用できる。また、これらの関係は、病気の状態の原因
がＴ細胞サブセットの高いレベル（たとえば、Ｉ型後天
性無ガンマグロブリン血症）である、治療学的目的に使
用できる。治療学的使用のため、高いＴ細胞サブセット
のレベルをもつ患者に適当なモノクローナル抗体を投与
すると、その過剰を減少または排除する。

表２〜５中に示す関係はＯＫＴ８抗体を検知し、他の抗
体と区別できるほかの方法である。

本発明者らが製造したハイブリドマを生成する他のモノ
クローナル抗体（表示したＯＫＴＩ、ＯＫＴ３．ＯＫＴ
４およびＯＫＴ５）は、次の米国特許出願に記載され、
そして特許請求されている＝１９７９年３月２日付は出
願第２２．１３２号；１９７９年４月２６日付は出願第
３３，６３９号；　１９７９年４月２６日付は出願第３
３．６６９号；　１９７９年９月１８日付は出願第７６
．６４２号；および１９７９年１０月９日付は出願第８
２．５１５号。本発明者らが製造したハイブリドマを生
成するなお他のモノクローナル抗体（表示しＩ：　ＯＫ
　Ｔ　８．ＯＫＴ９およびＯＫＴ　ｌ　Ｏ）は、本願と
同日付けの、次の発明の名称を有する米国特許出願に記
載され、特許請求されている：Ｈｙｂｒｉｄ　Ｃｅ１ｌ
　Ｌ　ｉｎｅ　Ｆｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔ−Ｆ　ｉｘｉｎｇＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｏ　Ｈｕｍａｎ　５ｕｐｐｒｅｓ
ｓｏｒ　Ｔ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、　ａｎ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　；Ｈｙｂｒｉｄ　　Ｃｅ１ｌ　　
ＬＩｎｅ　　Ｆｏｒ　　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　　Ｍ。

ｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｔｏ　Ｈｕ
ｉａｎ　　Ｅａｒｉｙ　Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ　　Ａｎｔ
ｉｇｅｎ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｎｄ　　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ；ａｎｄ　　！（ｙｂｒｉｄ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｌｉｎ
ｅ　　Ｆｏｒ　　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　　Ｍ。

ｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｔｏ　　ａ
　　Ｈｕｍａｎ　　Ｐ　ｒｏＬｈｙｍｏｃｙｔｅＡｎｔ
ｉｇｅｎ、　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、　ａｎｄ　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ（ヒトのサプレッサーＴ細胞に対する補体固定
上ツクローナル抗体を生成する交雑細胞ライン、抗体、
および方法；ヒトの初期の胸腺細胞抗原に対するモノク
ローナル抗体を生成する交雑細胞ライン、抗原、および
方法；およびヒトの前胸腺細胞（Ｐ　ｒｏｔｈｙｍ。

ｃｙｔｅ）抗原に対するモノクローナル抗体を製造する
交雑細胞ライン、抗体、および方法）。これらの出願を
引用によってここに加える。

本発明によれば、正常なヒトの胸腺細胞のほぼ１０％主
に見い出される抗原に対する抗体を生成できるハイブリ
ドマ、このノ＼イブリドマを生成する方法、正常なヒト
のサプレッサーＴ細胞上に見い出される抗原に対するモ
ノクローナル抗体、この抗体を生成する方法、およびこ
の抗体を用いる病気の処置または診断の方法あるいはＴ
細胞または胸腺細胞の部分集合の固定法が提供される。

本明細書において“′超！　ｇ　Ｅ　（Ｈｙｐｅｒ　Ｉ
　ｇ　Ｅ　）”とは、この抗体の量が通常の値よりも多
いことを意味する。これは一般にアレルギー性体質に表
われる。

また“急性組織移植宿主反応（Ａｃｕｔｅ　ｇｒａｆｔ
　ｖｅｒｓｕｓ　ｈｏｓｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）”とは
、例えば生体移植の場合における宿主による免疫学的な
、全体或いは部分的な拒絶反応のことである。

表↓ ヒトのリンパ集団についてのモノクローナル抗体の反応
性虹　　　にＯＫＴ６　　　０％　　０％　　　０％　　７０％ＯＫ
Ｔ８　　３０％　　０％　　く２％　　８０％０Ｋ７９
　　　　０％　　　０％　　　　０％　　Ｋ１０％ＯＫ
ＴＩＯ＜５％　　１０％　　　≦２０％　　　９５％＊
カッコ内の数字は試験した試料の数を表わす；％は値は
平均である。

表４モノクローナル抗体との反応性Ｈ５Ｂ−２−＊　　　　−−− ＯＥＭ　　　　−＋　　　　　−＋ＩＪＯＬＴ−４−−−＋Ｈ５Ｂ−２−＋　　　　　＋ＣＥＭ　　　　　　　十　　　　　　　＋　　　　　　
　　＋ＭＯＬＴ−４＋　　　　　＋　　　　　＋＊−お
よび十の反応性についての基準は、表３におけるのと同
一であった。

表５　　病気状態における末梢Ｔｆａｌｌ胞レベル＊し
病気の状態　　　　　　　　　　　　　　　ＯＫＴ３ゝ
初期の胆のう硬変症（２）Ｎ多発性硬化症（進展した病気Ｘ８）　　　　　　　　−
無力能症（初期の未処置Ｘ３）　　　　　　　　　　０
急性移植対宿主（３）　　　　　　　　　　　　０〜−
後天性無ガンマグロプリン症１型「型超１ｇＧ（４）　　　　　　　− 急性伝染性単核症（４）＊’　　　　　　　　　　　　
＋ホジキンス病段階■およびＩ　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ段階
■およびＩＶ　　　　　　　　　　　　　　　　−−乾
ｇ（３／　５　）　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＮＮ＝正常の限界内０＝不存在＋＝正常より大きい＋＋＝正常より非常に大きい一＝正常より小さい一−＝正常より非常に小さい＊１これらのレベルは正常にもどった後、約１週間で臨
Ｆカッコ内の数値は、評価した患者の数を示す。

＊２　゛°病気状態における末梢Ｔ細胞レベル”は、府
記実力レベルと同じ方法で測定された。すなわち、普通
とだ患者からの血液を分析した。

Ｔ細胞レベル＋−−− Ｎ　　　　　　−−− 〇　　　　　　〇　　　　　　〇　　　　　　〇−〇　
　　　　　＋　　　　　　＋＋Ｎ　　　　　Ｏ〜−〇〜−− 〇〜−−＋＋　　　　　　＋＋　　　　　　ＱＮ　　　
　　　　Ｎ　　　　　　　Ｎ　　　　　　　ＯＮ　　　
　　　　Ｎ　　　　　　　Ｎ　　　　　　　Ｏ十〜＋＋
　　　　　　Ｎ　　　　　　　Ｎ　　　　　　　Ｏｋの
症候が消える。

転倒■および■に記載されたように普通の血液中の末梢
Ｔ細胞り健常な検体からの血液の分析の代りに、成る病
気と診断されヒトの胸腺細胞の抗原に対する単一のモノ
クローナル抗体を生成する単一のハイブリドマだけを説
明してきたが、本発明はここに説明する特性を示すすべ
てのモノクローナル抗体を包含すると考えられる。主題
の抗体ＯＫＴ８はねずみのＩｇＧの４つのサブクラスの
１つであるサブクラスＩｇＧ、に属することが決定され
た。免疫グロブリンＧのこれらのサブクラスは互いにい
わゆる「固定された」領域において異なるが、特定の抗
原に対する抗体はいわゆる「可変の」領域をもち、この
領域は免疫グロブリンＧのどのサブクラスがそれに属す
るかに無関係に機械的に同一である。すなわち、ここに
説明した特性を示すモノクローナル抗体はナブクラスＩ
　ｇＧ、、Ｉ　ｇＧ！ａＳＩ　ｇＧ、ｂ。

または１ｇＧ３、あるいはクラスＩｇＭ、ＩｇＡ。

あるいは他の既知のクラスＩｇであることができる。こ
れらのクラスまたはサブクラスの間の差異は抗体の反応
パターンの選択性に影響を及ぼさないが、抗体と他の物
質、たとえば、補体または抗マウス抗体とのほかの反応
に影響を及ぼすことがあるであろう。主題の抗体はＩｇ
Ｇ、に特定したが、ここに例示した反応性のパターンを
有する抗体類はそれらが属する免疫グロブリンのクラス
またはサブクラスに無関係に本発明の範囲内に包含され
ると考えられる。

さらに、本発明の範囲内に、ここに例示したハイブリド
マの技術を用いて前述のギノクローナル抗体を生成する
方法が包含される。ハイブリドマのただ１つの例をここ
に記載したが、当業者はここに提供した免疫法、融合法
および選択法に従い、ここに説明した反応性の特性を有
する抗体類を生成しうる他のハイブリドマ類を得ること
ができると考えられる。マウスの既知の種からの既知の
骨髄腫細胞系統から生成した個々のハイブリドマはこの
ハイブリドマにより生成された抗体を参照する以外それ
以上同定できないので、前述の反応性の特性を有する抗
体を生成するすべてのハイブリドマ類は本発明の範囲内
に包含され、これらのハイブリドマを用いるこの抗体を
つくる方法も同様に包含されると、考えられる。

本発明のほかの而は、モノクローナル抗体ＯＫＴ９また
はここに明らかにした反応性のパターンを示す他のモノ
クローナル抗体を用いて病気を処理または診断する方法
である。主題の抗体を使用して、第２図に要約するよう
に、胸腺内分化の検出および研究することができる。そ
の上、主題の抗体を使用して、表５中に示すように、病
気の状態を診断することができる。これらの技術は、０
・ＫＴ８抗体を単独で、または他の抗体（たとえば、Ｏ
ＫＴ３〜ＯＫＴ　Ｉ　Ｏ）と組み合わせて使用すること
により、用いることができる。Ｔ細胞またはＴ細胞部分
集団に対する抗体のパネルとの反応性のパターンは、先
行技術の診断法を用いて可能であるよりも、ある種の病
気状態（たとえば、急性伝染性単核症）の−層正確な検
知を許すであろう。

ＯＫＴ８＋細胞の過剰を特徴とする病気の状態（たとえ
ば急性伝染性単核症または悪性腫瘍）の処置は、治療学
的に有効な量のＯＫＴ８抗体を処置の必要なとき個々の
患者に投与することによって、行なうことができる。Ｏ
ＫＴ８”抗原と選択的に反応させることにより、有効量
のＯＫＴ８抗体は過剰量のＯＫＴ８＋細胞を減少し、こ
うしてその過剰の効果を軽減する。有効量のＯＫＴ８抗
体とそれぞれ診断学的または治療学的に許容できる担体
とからなる診断学的および治療学的ｕｉ成物も、本発明
の範囲内に包含される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、正常のヒトの胸腺細胞をＯＫＴ８村よび他の
モノクローナル抗体とｌ　：　５００希釈およびＧ／Ｍ
　　ＦＩＴＣと反応させた後、サイトフルオログラフで
得た蛍光パターンを示す。バックグラウンドの蛍光の染
色は、非生成性クローンを注入したマウスからの腹水の
流体のｌ：５００の希釈で各集団を培養することによっ
て、得た。第２図は、人間における胸腺内の分化の段階を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

個体からのＴ細胞をＯＫＴ３、ＯＫＴ４、ＯＫＴ６およ
びＯＫＴ８からなる群より選ばれた少なくとも１種のモ
ノクローナル抗体の診断学的に有効な量と反応させ、そ
して該抗体のおのおのと反応する合計の末梢Ｔ細胞固体
群の割合を測定することを特徴とする固体における急性
伝染性単核症を検出する方法。