JPS6362518B2 - - Google Patents
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- JPS6362518B2 JPS6362518B2 JP55034205A JP3420580A JPS6362518B2 JP S6362518 B2 JPS6362518 B2 JP S6362518B2 JP 55034205 A JP55034205 A JP 55034205A JP 3420580 A JP3420580 A JP 3420580A JP S6362518 B2 JPS6362518 B2 JP S6362518B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、広義には、新規な交雑細胞ライン
（hybrid cell line）さらに詳しくはすべての正常
なヒトＴ細胞に見い出されるある抗原に対するモ
ノクローナル抗体およびこの抗体を用いる識別方
法に関する。 1975年におけるKohlerおよびMilsteinによる
免疫されたマウスからの脾細胞へのマウスの骨髄
腫の融合（fusion）［Nature256、495−497
（1975）］は、均質な（いわゆる「モノクローナ
ル」）抗体をつくる連続な細胞ラインを得ること
ができることを初めて証明した。この基本の研究
以来、種々の交雑細胞［いわゆる「ハイブリドマ
類（hybridomas）」］の生成およびこれらのハイ
ブリドマ類によりつくられた抗体の種々の科学的
研究への使用について多くの努力が向けられてき
た。たとえば、次の文献を参照：Current
Topics in Microbiology and Immunology、
Volume81−“Lymphocyte Hybridomas”、F.
Melchers、M.Potter、およびN.Warner、
Editors、Springer−Verlag、1978、およびそこ
に含まれる参考文献；C.J.Barnstable、et al.、
Cell、14、９−20（May、1978）；P.Parham及び
W.F.Bodmer、Nature 276、397−399
（November、1978）；Handbook of
Experimental Immunology、Third Edition
Volume ２、D.M.Wier、Editor、Blackwell、
1978、Chapter2.5；およびChemical and
Engineering News January １、1979、15−17。
これらの文献は同時にハイブリドマ類からモノク
ローナル抗体を生成する試みによつて得られる利
益および複雑さを示している。一般的技術は概念
的によく理解されているが、各特定の場合に多く
の困難に出会い、そして変更が要求される。事
実、一定のハイブリドマを生成しようと試みる前
には、所望のハイブリドマが得られるか、得られ
た場合抗体を生成するか、あるいはそのように生
成された抗体が所望の特異性をもつか、を確かめ
ることができない。成功の程度は、主として、使
用する抗原のタイプおよび所望のハイブリドマを
単離するために使用する選択技術によつて影響を
受ける。 人間のリンパ球細胞表面の抗原に対するモノク
ローナル抗原を生成する試みは、数例報告されて
いるだけである。たとえば、Current Topics in
Micrbiology and Immunology、ibid、66−69お
よび164−169参照。これらの報告された実験にお
いて使用されている抗原は、培養したリンパ芽球
性白血病およびヒト慢性リンパ球性白血病の細胞
ラインであつた。得られた多くのハイブリドマ類
は、全てのヒト細胞の種々の抗原に対して抗体を
生成するように思われた。ハイブリドマ類はいず
れも、ヒトのリンパ球の前もつて定めたクラスに
対して抗体を生成しなかつた。 人間および動物の免疫系に含まれるリンパ球に
２つの主なクラスが存在することを理解すべきで
ある。これらのうちの第１クラス（胸腺誘導細
胞、すなわち、Ｔ細胞）は、ヘモポイエチン幹細
胞から胸腺において分化されている。胸腺内にあ
る間、分化する細胞は「胸腺細胞」と名づけられ
る。成熟したＴ細胞は胸腺から出、そして組織、
リンパ管、および血流の間を循環する。これらの
Ｔ細胞は、再循環する小さいリンパ球の貯留
（pool）の大きい比率を形成する。それらは免疫
額的特異性を有し、そして細胞介在免疫応答（組
織移植注入のような）においてエフエクター
（effector）細胞として直接関与する。Ｔ細胞は
液性抗体を分泌しないが、後述するリンパ球の第
２クラスによるこれらの抗体の分泌に時々要求さ
れる。Ｔ細胞のいくつかの型は免疫系の他の面に
おいて調節機能をはたす。この細胞共働の過程の
機構はまだ完全には理解されていない。 リンパ球の第２クラス（骨髄誘導細胞、すなわ
ち、Ｂ細胞）は、抗体を分泌するものである。そ
れらもまたヘモポイエチン幹細胞から発生する
が、それらの分化は胸腺によつて決定されない。
鳥類において、それらはフアブリキウス嚢
（Bursa of Fabricius）と呼ばれる胸腺に類似す
る器官において分化されている。しかし、哺乳動
物においては、同等の器は発見されておらず、そ
してこれらのＢ細胞は骨髄内で分化すると考えら
れる。 ここで、Ｔ細胞は「ヘルパー（helper）」、「抑
制体（Auppressor）」及び「キラー（killer）」Ｔ
細胞と呼ばれる、少なくとも幾つかのサブタイプ
に分けられ、それらは（それぞれ）反応を促進
し、反応を抑制し、あるいは異種細胞を殺す（分
離する）機能を有することが認められた。これら
のサブクラスはネズミの系統についてよく理解さ
れているが、それぞれ人間の系についてわずかに
最近記載されただけである。たとえば、次の文献
を参照：R.L.Evans、et al.、Journal of
Experimental Medicine、Volume 145、221−
232、1977；及びL.ChessおよびS.F.Schlossman
−“Functional Analusis of Distinct Human
Ｔ−Cell Subsets Bearing Unique
Differentiation Antigens”“Contemporary
Topics in Immunbiolgy”、O.Stutman、
Editor、Plenum Press、1977、Volume ７、
363−379。 Ｔ細胞のクラスまたはサブクラスを同定または
抑制することができることは、種々の免疫調節の
不調または状態の診断または処置にとつて重要で
ある。 たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫は、
それ等がＢ細胞またはＴ細胞のいずれを源とする
かによつて、異なる予後を有する。こうして、病
気の予後の評価はこれらのリンパ球の２つのクラ
スを区別することに依存する。たとえば、次の文
献を参照：A.C.AisenberyおよびJ.C.Long、The
American Journal of Medicine、58：300
（March、1975）；D.Belpomme、et al.、
Immunological Diagnosis of Leukemias amd
Lumphomas、S.Thierfelder、et al.、Editors、
Springer、Hedelberg、1977、33−45；およびD.
Belpomme、et、al.、British Journal of
Haematology、1978、38、85。ある種の病気の
状態（たとえば、若年性リウマトイド関節炎およ
びある種の白血病）は、Ｔ細胞のサブクラスの不
釣合いに関連する。自己免疫の病気は一般に「ヘ
ルパー」Ｔ細胞の過剰またはある種の「抑制体」
Ｔ細胞の欠乏に関連するが、悪性の病気の一般に
「抑制体」Ｔ細胞の過剰に関連することが示唆さ
れた。ある種の白血病において、過剰のＴ細胞は
発育の停止し状態において生成される。診断はこ
うしてこの不釣合い、すなわち、過剰を検知する
ことができることに依存しうるであろう。たとえ
ば、次の文献を参照：J.Kersey、et al.、
“Surface Markers Define Human Lymphoid
Malignancies with Differing Prognoses”、
Haematology and Blood Transfusion、
Volume 20、Springer−Verlag、1977、17−24、
およびその中に含まれる参考文献。 治療サイドにおいて、まだ明確に証明さていな
いが、Ｔ細胞のサブタイプに対する抗体を過剰量
で投与することは自己免疫の病気または悪性の病
気において治療上有益であるという、いくらかの
示唆がある。ヒトＴ細胞の全クラス（いわゆる抗
ヒト胸腺細胞にグロブリン、すなわち、ATG）
に対する抗血清は、移植組織を受ける患者におい
て治療上有用であると報告されている。細胞介在
免疫応答（移植組織を拒否する機構）はＴ細胞に
依存するので、Ｔ細胞に対する抗体を投与する
と、この拒否の過程を防止または遅延する。たと
えば、次の文献を参照：Cosimi、et al.、
“Randomized Clinical Trial of ATG in
Cadaver Renal Allgraft Recipients：
Importance of Ｔ Cell Monitoring”、
Surgery 40：155−163（1976）およびその中に含
まれる参考文献。 ヒト細胞のクラスおよびサブクラスの同定およ
び抑制は、従来、動物をヒト細胞で免疫し、その
動物を出血させて血清を取り、そしてこの抗血清
を（たとえば）地元（autologous）であるが、
異種ではないＢ細胞で吸着して望まない反応性を
もつ抗体を除去することによつて得た、ヒトＴ細
胞のための自発性自己抗体または選択的抗血清を
使用することによつて達成された。これらの抗血
清の製造は、とくに吸着および精製の工程におい
て、極めて困難である。吸着され且つ精製された
抗血清でさえ、所望の抗体に加えて、いくつかの
理由で、多くの不純物を含有する。第１に、血清
は、Ｔ細胞で免疫する前に数百万の抗体分子を含
有する。第２に、この免疫法は注入したすべての
ヒトＴ細胞について見い出される種々の抗原に対
する抗体を生成させる。単一の抗原に対する抗体
は選択的に生成されない。だい３にこのような方
法で得られた特異性抗体の力価は通常極めて低く
（たとえば、１：100より大きい希釈度において不
活性）そして非特異性抗体に対する比は１／106
より小である たとえば、前述のChessおよびSchlossmanの
文献（365ページ以降参照）および前述の
Chemical and Engineering Newsを参照。ここ
は選考技術の抗血清の欠点およびモノクローナル
抗体の利点が記載されている。 今回、本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞
について見い出される抗原に対する新規なモノク
ローナル抗体を生成できる新規なハイブリドマが
見出された。そのように生成された抗体は正常な
ヒトＴ細胞について単一の決定因子に対して単一
特異性（monospecific）であり、そして他の抗
ヒト免疫グロブリンを本質的に含有しないが、こ
れと対照的に選考技術の抗血清は多数のヒト抗原
に対して反応性の抗体で本来汚染されており、そ
して先行技術モノクローナル抗体はヒトＴ細胞の
抗原について単一特異性ではない。その上、この
ハイブリドマは培養して抗体を生成することがで
きる。この場合動物を免疫し、殺し、次いで先行
技術の不純の抗血清を得るときにさえ、必要な長
たらしい吸着および精製の工程を実施することを
要しない。 したがつて、本発明の１つの目的は、本質的に
すべての正常なヒトＴ細胞について見い出される
抗原に対する抗体を生成するハイブリドマ類を提
供することである。 本発明のさらに別の面において、これ等のハイ
ブリドマ類を製造する方法を提供する。 本発明の他の目的は、本質的にすべての正常な
ヒトＴ細胞について見い出される抗原に対する本
質的に均質な抗体を提供することである。 さらに他の目的は、これらの抗体を用いる病気
の識別方法を提供することである。 本発明のその他の目的および利益は、本発明の
開示を検討すると明らかになるであろう。 前述の目的および利益は達成するため、本発明
によれば、本質的にすべての正常なヒトＴ細胞に
ついて見い出される抗原に対する新規な抗体を生
成する新規なハイブリドマ、この抗体それ自体、
およびこの抗体を用いる診断および治療の方法が
提供される。該ハイブリドマはMilsteinおよび
Kohlerの方法に一般に従つて製造される。正常
のＥロゼツト（rosette）陽性のヒトＴ細胞でマ
ウスを免疫した後、免疫したマウスの脾細胞をマ
ウスの骨髄腫ラインからの細胞と融合し、そして
得られたハイブリドマ類を正常のＥロゼツト陽性
のヒトＴ細胞に選択的に結合する抗体を含有する
上澄液を用いてそれらについて選別した。所望の
ハイブリドマ類を引き続いてクローニングし、特
性づけた。その結果、本質的に全ての正常なヒト
Ｔ細胞についての抗原に対する抗体（OKT1と表
示する）を生成するハイブリドマが得られた。こ
の抗体は本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞
と反応するが、他の正常な末梢の血液のリンパ様
細胞と反応しない。更に、この抗体により認識さ
れる細胞表面の抗原は成熟した胸腺抗原について
のみ検出され、そして正常なヒト胸腺細胞の90％
より多くはこの抗原を完全に欠いている。 先行技術において示された困難および抗原とし
て悪性の細胞ラインを用いて報告された成功の不
足を見ると、本発明の方法が所望のハイブリドマ
を提供したことは驚くべきことであつた。交雑細
胞のこの予測されえない性質は１つの抗原または
細胞ラインから他のものへの補外（extrapolate）
を許さないことに注意すべきである。事実、本発
明者らは、抗原としてＴ細胞の悪性細胞ラインを
用いると、所望の抗体を生成しないハイブリドマ
類が形成することを見い出した。細胞表面から分
離した精製した抗原を使用する試みも不成功に終
つた。 このハイブリドマおよび生ずる抗体の製造およ
び特性は、以下の説明および実施例から一層理解
できるであろう。 ハイブリドマを製造する方法は一般に次の工程
からなる： Ａ Ｅロゼツト陽性の精製した正常なヒト末梢Ｔ
細胞でマウスを免疫する。メスのBalb／cJマ
ウスが好ましいことがわかつたが、他のマウス
の系統を使用できると考えられる。免疫スケジ
ユールおよびＴ細胞の濃度は、有効量の適当に
準備した脾細胞を生成するようなものであるべ
きである。0.2mlのリン酸塩緩衝食塩液中の２
×107細胞／マウス／注射を用いて、14日の間
隔で、３回免疫を行なことは有効であることが
わかつた。 Ｂ 免疫したマウスから脾臓を除去し、適当な媒
体中の脾懸濁液を調製する。約１ml／脾臓の媒
体で十分である。これらの実験の技術はよく知
られている。 Ｃ 懸濁した脾細胞を適当な細胞ラインからのマ
ウスの骨髄腫の細胞と、適当な融合媒体の使用
により融合する。脾細胞対骨髄腫細胞の好まし
い比は５対１である。約108この脾細胞につい
て合計約0.5〜1.0mlの融合媒体は適当である。
多くのマウスの骨髄腫の細胞は知られており、
そして一般に学問的共同体のメンバーまたは
種々の寄託機関、たとえば、ザ・ソーク・イン
スチチユート・セル・デイストビユーシヨン・
センター（the Salk Institute Cell
Distribution Center、La Jolla、CA）から入
手できる。使用する細胞ラインは好ましくはい
わゆる「薬物抵抗性」型であつて、未融合の骨
髄腫細胞が選択した媒体中で生存せず、一方交
雑細胞が生存するようにすべきである。最も普
通の群は８−アザグアニン抵抗性の細胞ライン
であり、これは酵素ヒポキサンチン・グアニ
ン・ホホリボシル・トランスフエラーゼ
（phophoribosyl transferase）を欠き、それゆ
えHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
およびチミジン）媒体により支持されない。ま
た、使用する骨髄腫細胞ラインはいわゆる「非
分泌」型である。すなわち、それはそれ自体抗
原体を生成しないことが一般的に好ましいが、
分泌型を使用できる。しかしながら、ある場合
において、分泌する骨髄腫ラインは好ましいこ
とがある。好ましい融合促進剤は平均分子量が
約1000〜約4000であるポリエチレングリコール
（商業的にPEG1000などとして入手できる）が
好ましいが、この分野においては知られている
他の融合促進剤を使用できる。 Ｄ 別の容器内において、未融合の脾細胞、未融
合の骨髄腫細胞、および融合した細胞の混合物
を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択的媒
体中で希釈し、未融合の細胞を死亡させるのに
十分な時間（約１時間）培養する。この希釈は
限定されたものの型であることができ、この希
釈において希釈剤の体積は統計的に計算して各
別々の容器［たとえば、マイクロタイタープレ
ートの各ウエル］中である数の細胞（たとえ
ば、１〜４）を単離する。媒体は薬物抵抗性
（たとえば、８−アザグアニン抵抗性）で未融
合の骨髄腫細胞ラインを支持しないもの（たと
えば、HAT媒体）である。それゆえ、これら
の骨髄腫細胞は死ぬ。未融合の脾細胞は非悪性
であるので、有限の数の世代をもつだけであ
る。こうして、ある期間（約１時間）後、これ
らの未融合の脾細胞は再生しない。融合した細
胞は、これに対して、骨髄腫の親の悪性をも
ち、そして脾細胞の親の選択的媒体中で生存で
きるので、再生し続ける。 Ｅ ハイブリドマを含有する各容器（ウエル）中
の上澄液を、Ｅロゼツト陽性の精製したヒトＴ
細胞に対する抗体について評価する。 Ｆ 所望の抗体を生成するハイブリドマを選択し
（たとえば、限定希釈により）そしてクローニ
ングする。 いつたん所望のハイブリドマを選択し、クロ
ーニングすると終結の抗体は２つの方法で１つ
で生成させることができる。最も純粋なモノク
ローナル抗体は、所望のハイブリドマを適当な
媒体中で適当な長さの時間試験内で培養し、次
いで所望の抗体を上澄液から回収することによ
つて生成される。適当な媒体及び適当な培養時
間の長さは、既知であるか、あるいは決定容易
である。この試験管内技術は、他の特異性の抗
ヒト免疫グロブリンを本質的に含まない、単一
特異性モノクローナル抗体を本質的に生成す
る。媒体は外因性血清（たとえば、胎児の子牛
の血清）を含有するので、少量の他の免疫グロ
ブリンが存在する。しかしながら、この試験管
内の方法は、モノクローナル抗体の濃度がわず
かに約50μｇ／mlであるので、十分な量または
濃度を生成できない。 非常に多きい濃度のわずかに純度に劣るモノ
クローマル抗体を生成させるため、所望のハイ
ブリドマをマウス、好ましくは先天性または半
先天性のマウスに注射できる。ハイブリドマは
適当な潜伏時間後抗体生成の腫腸を形成させ、
その結果宿主マウスの血流および腹膜滲出液
（腹水）中に高濃度の所望とする抗体（約５〜
20mg／ml）が生ずる。これらの宿主マウスの正
常の抗体を血流および腹水中に有するが、これ
らの正常な抗体の濃度はモノクローナル抗体濃
度のわずかに約５％であるにすぎない。その
上、これらの正常の抗体は特異性が抗ヒトでな
いので、収穫した腹水または血清から得たモノ
クローナル抗体は汚染する抗ヒト免疫グロブリ
ンを本質的に含有しない。このモノクローナル
抗体は力価が高く（１：30000以上の希釈で活
性である）そして特異性免疫グロブリン対非特
異性免疫グロブリンの比が高い（約１／20）。
Ｋ軽量の骨髄腫鎖を組込んだ生成した免疫グロ
ブリンは非特異性の「無意味な」ペプチド類で
あり、これらはモノクローナル抗体をその特異
性を減じ得ないで単に希釈するだけである。 実施例 モノクローナル抗体の生成 Ａ 免疫および体細胞の交雑 メスのBalb／cJマウス（Jackson研究所；生
まてから６週間）を、0.2mlのリン酸塩緩衝食
塩溶液中の２×107のＥロゼツト精製したＴ細
胞で腹膜内的に14日の間隔で免疫した。第３回
目の免疫後、脾をマウスから取り出し、そして
ステンレス鋼の鋼に組織を通すことによつて単
一細胞の懸濁液をつくつた。 細胞の融合をKohlerおよびMilsteinの方法
に従つて実験した。１×103の脾細胞を、
RPMI1640媒体（Gibco、Grand Islamd、
NY）中の35％のポリエチレングリコール
（PEG1000）と５％のジメチルスルホキシドと
からなる融合媒体の0.5ml中において、２×107
のP3×63Ag8U1骨髄腫細胞（Br.M.Scharff、
Albert Einstein College of Medicine
Bronx、NYにより供給）と融合した。これら
の骨髄腫細胞はIgG1κL鎖（light chains）を分
泌する。 Ｂ ハイブリドマの選択および成長 細胞の融合後、細胞をHAT媒体（ハイポキ
サンチン。アミノプチリン、およびチミジン」
中で37℃において５％のCO2を使用して湿つた
ふん囲気中で培養した。数週間後、ハイブリド
マ類を含有する培養液から40〜100μの上澄
液を、Mendes（J.Immunol.111：860、1973）
が記載するように健康なヒトの供与者の血液か
ら調製した、Ｅロゼツト陽性（E+）個体群と
Ｅロゼツト陰性（E-）個体群とに分けた106末
梢リンパ球のペレツトに加えた。これらの細胞
へ結合するマウスのハイブリドマ抗体の検出
は、ラジオイムノアセイおよび／または間接免
疫蛍光法により決定した。第１の方法におい
て、細胞は初め100μの親和性精製した 125I
山羊の抗マウスIgG（106cpm／μｇ；500μｇ／
μｇ）の100μと反応させた（山羊の抗マウ
スのヨウ素化の詳細はKung、et al.、Ｊ．
Biol.Chem.251(8)：2399、1976に記載されてい
る）。別法として、培養液の上澄液で培養した
細胞を蛍光を付与した山羊の抗マウスIgG
（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy研究所、
Springfidld、VA；Ｆ／Ｐ＝2.5）で染色し、
この蛍光性抗体被覆細胞を引き続いてシトフル
オログラフ（Cytofiuorograf）FC20／4800A
（Ortho Instruments、Wwstwood、MA）に
ついて実施例に記載するように分析した。
E+リンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する抗
体を含有するハイブリドマ培養液を選択し、ク
ローニングした。引き続いて、クローンを２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカン
（Aldrich Chemical Companyから商品名
Prististineで市販されている）で準備した
Balb／cJマウスに一定のクローンの１×107細
胞（0.2mlの体積）を注射することによつて、
腹膜内に移植した。ついでこれらのマウスから
の悪性腹水を使用して、実施例において後述
するように、リンパ球を特性づけた。主題の交
雑抗体OKT1は、標準の技術によりサブクラス
IgG1であると証明された。 実施例 OKT1の反応性の特性づけ Ａ リンパ球個体群の単離 人間の末梢血液の単核細胞を、健康な志願者
の提供者（15〜40才）から、Boyum.、Scand.
Ｊ．Clin.Lab.Invest.21（Suppl.97）：77、1968
の技術に従い、フイコール−ハイパツク
（Ficoll−Hypaque）密度勾配遠心分離
（Pharmacia Fine Chenicals、Piscataway、
NJ）により単離した。分別しない単核細胞を、
Chess、et al.、Ｊ．Immnuol.113：1113
（1974）にすでに記載されているように、
Sephadex Ｇ−200抗（ab′）2カラムクロマトグ
ラフイーにより、表面Ig+(B)およびIg-（Ｔプラ
スNull）の個体群に分離した。Ｔ細胞はIg-個
体群を５％の羊の赤血球（Microbiological
Associates、Bethesda、MD）でＥロゼツト化
することによつて回収した。ロゼツト化した混
合物をフイコール−ハイパツク（Ficoll−
Hypawque）上で層状にし、回収したいE+ペ
レツトを0.155モルのNH4l（10ml／108細胞）で
処理した。このようにして得られたＴ細胞の個
体群は、標準法により決定して、＜２％EACロ
ゼツト陽性および＞95％Ｅロゼツト陽性であつ
た。さらに、非ロゼツトIg-（Null細胞）個体
群をフイコール表面から収穫した。この後者の
個体群は＜５％E-および２％sIg+であつた。
表面Ig+(B)個体群は、前述のようにSephadex
Ｇ−200カラムクロマトグラフイーおよび引き
続く正常なヒト・ガンマグロブリンによる溶離
から得られた。この個体群は＞95％表面Ig+お
よび＜５％E+であつた。 正常なヒト大食細胞は、ポリスチレンへの付
着により、単核個体群から得た。こうして、単
核細胞を最終培地（RPMI1640、2.5ミリモル
のHEPS［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−
ピペラジンプロパンスルホン酸］緩衝剤、0.5
％の重炭酸ナトリウム、200ミリモルのＬ−グ
ルタミン、および１％ペニシリン−ストレプト
マイシンからなり、20％の熱失活したヒトAB
血清を補足した）中に２×106細胞濃度で再懸
濁し、プラスチツクのペトリ皿（100×20mm）
（Falcon Tissue Culture Dish；Falcon、
Oxnard、CA）中で37℃において一夜培養し
た。よく洗つて非付着性細胞を除去した後、
2.5ミリモルのDTAを含有する冷たい血清不含
媒体で強く洗い、時々使い捨て注射器のプラン
ジヤーのゴムの先端で引つかいて、付着した固
体群を脱着した。85％より多い細胞個体群は、
ラテツクス粒子を摂取することができ、そして
ライト−ギエムサ（Wright−Giemsa）染色に
より単球の形態学的特性を有した。 Ｂ 正常な胸腺 正常人の胸腺を２月〜14才の年令の患者か
ら、心臓の矯正手術のもとに得た。胸腺の新し
く得た部分を媒体199（Gibco）中の５％胎児の
子牛の血清中に直ちに入れ、鉗子とはさみで小
さく切り、引き続いて金網を通してプレスする
ことによつて単細胞の懸濁液にした。細胞を次
に前節Ａで説明したように、フイコール−ハイ
パツクで層状にし、回し、洗浄した。このよう
にして得られた胸腺細胞は＞95％生活力があ
り、そして90ロゼツト陽性であつた。 Ｃ 細胞ライン（Cell lines） 正常な４個体からエプスタイン−バールウイ
ルス（Epstein−Barr Virus）（EBV）変形し
た細胞ラインを前述のように調製した。Ｔ細胞
ラインCEMHSB−２、及びHJD−１は、Dr.
H.Lazarus（Sidney Farber Cancer Institute、
Boston、MA）により提供された。 上記細胞を調製するに当つて、確立したリン
パ芽球細胞ラインへのヒトリパ球の形質転換
は、エプスタイン−バールウイルスの生物学的
性質としてよく知られている。このような細胞
の形質転換は、度々文献に記載され例えばジエ
イ・エイチ・ポペ、エム・ケイ・ホーンおよび
ダブリユ・スエツトがインターナシヨナル・ジ
ヤーナル・オブ・カンサー３号857867頁
［PoPe、J.H.、M.K.Horne and W.Scott in
Int.J.Caancer.3；857−867、（1968）．］におけ
る“ヘルペス様ウイルスを含有するヒト白血球
ラインからロ別したものによる試験管内におい
てヒト胎児リンパ球の形質転換”
［“Transformation of Fetal Human
Lymphocytes In−Vitro By Filtrates of ａ
Human Leukemic Cell Line Containing
Herpes−Like Virus”］という標題の論文に
詳細説明されている。 Ｄ Ｔ急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ALL）細
胞およびＴ慢性リンパ球性白血病（Ｔ−CLL）
細胞 白血病細胞は12人のＴ−ALLの患者から得た。
これらの固体の細胞は、Schlossman、et al、
Proc.Nad.Acad.Sci.73：1288（1976）によるすで
に記載され得いるように、羊の赤血球との自発ロ
ゼツト形成（＞20％E+）、およびＴ細胞特異性異
質抗血清、抗HTL（抗−B.K.）およびA99との反
応性によりＴ細胞結合をもつとすでに決定され
た。３固体からの腫瘍細胞はウサギおよび／また
は馬の抗TH2と反応性（TH2 +）であつたが、残
る９個体からの細胞は非反応性であつた
（TH2 -）。ウサギおよび／または馬抗TH2は、特
有の機能特性“TH2 +”を有する、Ｔ細胞個体群
の特殊なサブセツトと結合するウサギまたは馬か
ら誘導された異種抗血清のことである。このこと
は下記の文献に述べられている。イー・エル・エ
ヌ・ラインヘルツとエス・エフ・シユロスマン
［Reinhelz、E.L.N.、Schlorsmann、S.F.］の
Journal of Immunology 122、1335−1341
（1979）。TH2 -T−CLLの２人の患者からの白血
病細胞も使用した。両方の急性および慢性の白血
病細胞を10％のジメチルスルホキシドおよび20％
のABヒト血清中の−196℃の蒸気相液体窒素中
で、表面特性づけの時間まで、凍結保存した。分
析した腫瘍個体群は、すべての場合においてライ
ト−ギユムサ（Wright−Giemsa）形態学により
＞90％芽細胞であつた。 実施例 シトフルオログラフ（（cytofluorographic）分
析および細胞分離 すべての細胞個体群のシトフルオログラフ分析
を、シトフルオログラフ（Cytifluorograf）
FC200／4800A（Ortho Instruments）で蛍光共役
した羊の抗マウスIgG（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy
Laboratories）を用いて間接免疫蛍光法により実
施した。要約すると、１〜２×106細胞を0.15ml
にOKT1で１：1000希釈において処理し、４℃で
30分間培養し、２回洗浄した。次いで細胞を0.15
mlの１：40希釈のＧ／Ｍ FITCで４℃において
30分間反応させ、遠心分離し、３回洗浄した。次
いでこれらの細胞をシトフルオログラフで分析し
た。蛍光の強さ／細胞をパルス高さ分析器に記録
した。同様な反応性のパターンは１：30000の希
釈で観察されたが、これよりさらに希釈すると反
応性は失なわれた。バツクグラウンドの染色は、
非生成性交雑分枝系で腹膜的に免疫したBalb／
cJマウスからの１：1000腹水の0.15ml部分を代わ
りに使用することによつて得た。 OKT1+細胞およびOKT1-細胞を分離するよう
に設計した実験において、100×106の未分別単核
細胞または胸腺細胞を、４mlの１：1000希釈の
OKT1で標識付し、Ｇ／Ｍ FITOで現象した。
同一の染色アプローチを用いて、前記実施例Ａ
におけるように単離したヒトＴ細胞を調製した。
蛍光で活性化した細胞分類体（FACS−１）
（Becton−Dickinson、Mountain View、CA）
を用いて、リンパ球をOKT1+個体群とOKT1-個
体群とに分離し、および／またはＴ細胞を弱反応
性OKT1+T細胞（蛍光の20％より小）および強
反応性OKT1+T細胞（蛍光の20％以上）に分別
した。後の種類の生活力はすべての場合において
トリパン（Trypan）ブルー排除により＞95％で
あつた。すべての分離した個体群の純度は≧95％
であつた。 実施例 機能的研究 未分離およびFACS分別のリンパ様細胞の有糸
応答を、Chess、et alによりすでに記載されたよ
うに、微量培養において、コンカナバリン
（Concanavalin）Ａ（Con Ａ）（Calbiochem、La
Jolla、CA）およびフイトへマグクルチニン
（phytohemagglutinin）（PHA）の最適投与に対
して試験した。異種抗原増殖応答を、これらの同
じ個体群について、マイトマイシン処理Laz156、
刺激としてDr.H.Lasarusから得られたEBV変形
したヒトＢリンパ芽球様細胞ラインを用いて、同
時に測定した。破傷風トキソイド
（Massachusetts Department of Public Health
Biological Laboratories、Boston、MA）に対
する増殖を、Evans、et al.（J.Innunol.129：
1423、1978）によりすでに記載されているよう
に、10μｇ／mlの最終濃度を用いて試験した。上
に記載される方法で得られた５％の大食細胞を、
すべての個体群に試験管内培養の開始時に加え
た。糸状体（mitogen）刺激された培養を４日後
0.2μCiのトリチウム化サイミジン（tritiated
thymidine）（1.9Ci／ミリモルの比活性；
Schwartz−Mann Division of Becton−
Dickinson、Orangeburg、NY）でパルスし、18
時間後MASH装置（Microbiological
Associates、…Bethesda、MD）で収穫した。ト
リチウム化サイミジンの結合をパツカード・シン
チレーシヨン・カウンター（Packard
Instrument Company、Downer's Grove、IL）
で測定した。バツクグラウンドのトリチウム化サ
イミジンの結合は、有糸体のかわりに媒体を用い
て得た。破傷風トキソイド刺激培養物および異種
抗原刺激培養物、５日後、前述のように、トリチ
ウム化サイミジンで18時間パルスし、収穫し、計
数した。 ハイブリドマの生成、および生ずるモノクロー
ナル抗体の生成および特性づけは、上の実施例に
おけるように実施した。大量の主題の抗体を、主
題のハイブリドマのマウスへの腹膜内注射及び悪
性腹水の収穫により調製したが、ハイブリドマは
試験管内でこの分野においてよく知られた技術に
より培養し、抗体を上澄液から取り出すことがで
きることは、明らかに考えられる。 主題のハイブリドマの試料は、アメリカン・タ
イプ・カルチヤー・コレクシヨン（12301
Parklawn Drive、Rockville、MD、20852）に
1979年３月13日に寄託され、ATCC番号
CRL8000が付された。 第１図に示すように、一定の正常な個体の全ヒ
ト末梢血液Ｔ細胞の個体群はOKT1と反応性であ
るが、これに対して同じ個体から単離された全Ｂ
細胞、無特徴細胞および大食細胞の個体群は
OKT1と非反応性である。他の正常な15個体から
のリンパ球の個体群について同様な結果が得られ
た。こうしてモノクローナル抗体は、本質的にす
べての正常なヒト末梢Ｔ細胞の表面上に含有され
る抗原と反応性であるが、第１図に示す他の３つ
の細胞の型の表面上の抗原と非反応性であると、
特性づけられる。この特異の反応性は、主題の抗
体OKT1を検出でき、そして他の抗体と区別でき
る１つの試験である。 第２図に示すよう内、６ケ月の乳児からの正常
なヒト胸腺細胞のほとんど大部分はOKT1と完全
に非反応性であるが、胸腺細胞の約５〜10％は反
応性である。この発見の意味は、幹細胞が成熟し
たＴ細胞に変わる分化過程の間、胸腺細胞がある
段階で、OKT1と反応性である、Ｔ細胞上に見い
出される同じ表面の抗原を獲得するということに
ある。これらの胸腺細胞は、胸腺から血流中へ出
る直前の分化の後の段階にあると信じられる。２
ケ月〜19才の年令の正常な個体からの６つの追加
の胸腺の試料を用いて、同様な結果（５〜10％の
反応性）が得られた。第２図における反応性のパ
ターンは、主題の抗体OKT1を検出し、それを他
の抗体と区別する第２の方法を提供する。 主題の抗体の診断的使用は第３図に図解されて
おり、この図においてＴ急性リンパ芽球性白血病
（Ｔ−ALL）患者からの白血病細胞はOKT1と非
反応性であるが、これに対してＴ慢性リンパ芽球
性白血病（Ｔ−CLL）患者からの白血病細胞は
OKT1と反応性であつたことが示される。したが
つて主題の抗体は、白血病の２種の白血病の間を
区別する方法を提供する。Ｔ−ALLおよびＴ−
CLLのある段階の間を区別することは困難であ
り、そして予後および処置の養生法の両方はこれ
らの２種の白血病の間で実質的に相違するので、
主題の抗体を使用して提供された２種の間を区別
する直接的方法は優位の進歩であることを理解で
きる。 主題の抗体OKT1のほかの特性づけは、第４図
に図解される種々のヒトＴ細胞ラインに対する反
応によつて示される。この図からわかるように、
主題の抗原のヒトＴ細胞ラインに対する反応性は
不均質であり、ラインHJD−１について強く、
ラインCEMについて中程度であり、ラインHSB
−２について不存在である。このOKT1の種々の
入手容易なヒトＴ細胞ラインに対する特異の反応
性は、主題の抗体を特性づけかつ説明するなお他
の方法を提供する。 第５図は、OKT1とヒトＢ細胞ラインLaz007
との反応性の欠乏を図解する。試験した他の
EBV変形Ｂ細胞ラインについて同一のパターン
が得られた。これは、正常なヒト個体群の末梢血
液から得られたＢ細胞とのOKT1の反応性の欠乏
をさらに確認し、そして主題の抗体OKT1を特性
づけかつ区別するなお他の方法を提供する。 機械的性能を、蛍光活性化細胞セパレーター
（FACS）分離したリンパ様個体群について実施
した。これらの研究の結果は下表〜に示され
ており、そして主題のモノクローナル抗体の前述
の特性づけを裏書きする。 表に示すように、PHA、Ｃ on Ａ、可溶性
抗原、および混合リンパ球培養物中の異種抗原へ
の応答の本質的にすべてはOKT1に対して応答性
の細胞の個体群に帰する。OKT1に非反応性の個
体群はこれらのＴ細胞機能のいずれをも生じない
ように思われ、わずかの応答はOKT1+細胞によ
る起こりうる汚染によるものと考えられる。これ
らの機能の研究がさらに明らかにするように
OKT1が反応性である抗原はＴ細胞上に存在し、
その理由はそのような反応性の個体群がＴ細胞の
機能を示すが、そのように反応性ではない個体群
はこれらの機能のいずれをも示さないことにあ
る。表は、FACSで分離された強くOKT1反応
性Ｔ細胞と弱くOKT1反応性Ｔ細胞との間に有糸
応答または異種抗原応答において機能的差異が存
在しないことを明らかに示している。両者の個体
群は等しくよく、かつ分別しないＴ細胞個体群と
同じ方法で増殖した。表が示唆するように、
MLC検定における全範囲の胸腺細胞の活性は
OKT1と反応性の胸腺細胞の個体群の部分にほと
んど完全に帰因するので、OKT1が反応する表面
抗原は成熟した胸腺細胞上にのみ存在する。ま
た、表はOKT1+リンパ球とOKT1+末梢Ｔ細胞
との間の機能的差異を示し、この差異は前者が有
糸応答性を欠くからである。 本発明によれば、本質的にすべての正常なヒト
Ｔ細胞上に見い出される抗原に対する抗体を生成
できるハイブリドマ、このハイブリドマを生成す
る方法。本質的にすべてのヒトＴ細胞上に見い出
さられる抗原に対するモノクローナル抗体、この
抗体を生成する方法、およびこの抗体を用いる病
気の処置または診断の方法が提供される。 ヒトＴ細胞の抗原に対する単一のモノクローナ
ル抗体を生成する単一のハイブリドマだけを説明
してきたが、本発明はここに説明する特性を示す
すべてのモノクローナル抗体を包含すると考えら
れる。主題の抗体OKT1はねずみのIgGの４つの
サブクラスの１つであるサブクラスIgG1に属す
ることが決定された。免疫グロブリンＧのこれら
のサブクラスは互いにいわゆる「固定された」領
域において異なるが、特定の抗原に対する抗体は
いわゆる「可変の」領域をもち、この領域は免疫
グロブリンＧのどのサブクラスがそれに属するか
に無関係に機能的に同一である。すなわち、ここ
に説明した特性を示すモノクローナル抗体はサブ
クラスIgG1、IgG2a、IgG2bまたはIgG3、あるい
はクラスIgM、IgA、あるいは他の既知のクラス
Igであることができる。これらのクラスまたはサ
ブクラスの間の差異は抗体の反応パターンの選択
性に影響を及ぼさないが、抗体と他の物質、たと
えば、相補助的抗体または抗マウス抗体とのほか
の反応に影響を及ぼすことがあるであろう。主題
の抗体はIgG1に特定したが、ここに例示した反
応性のパターンを有する抗体類はそれらが属する
免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスに無関
係に本発明の範囲内に包含されると考えられる。 さらに、本発明の範囲内に、ここに例示したハ
イブリドマの技術を用いて前述のモノクローナル
抗体を生成する方法が包含される。ハイブリドマ
のただ１つの例をここに記載したが、当業者はこ
こに提供した免疫法、融合法および選択法に従
い、ここに説明した反応性の特性を有する抗体類
を生成しうる他のハイブリドマ類をうることがで
きると考えられる。マウスの既知の種からの既知
の骨髄腫細胞系統から生成した個々のハイブリド
マはこのハイブリドマにより生成された抗体を参
照する以外それ以上同定できないので、前述の反
応性の特性を有する抗体を生成するすべてのハイ
ブリドマ類は本発明の範囲内に包含され、これら
のハイブリドマを用いるこの抗体をつくる方法も
同様に包含されると、考えられる。 本発明のほかの面は、モノクローナル抗体
OKT1またはここに明らかにした反応性のパター
ンを示す他のモノクローナル抗体を用いて病気を
処理または診断する方法である。上に考察したよ
うに、主題の抗体によれば、Ｔ細胞の慢性リンパ
芽球性白血病とＴ細胞の急性リンパ芽球性白血病
を判別することができ、そして器官の移植を受け
た患者を処置して移植組織の拒否を減少または排
除することができる。 【表】 【表】 【表】 【表】
（hybrid cell line）さらに詳しくはすべての正常
なヒトＴ細胞に見い出されるある抗原に対するモ
ノクローナル抗体およびこの抗体を用いる識別方
法に関する。 1975年におけるKohlerおよびMilsteinによる
免疫されたマウスからの脾細胞へのマウスの骨髄
腫の融合（fusion）［Nature256、495−497
（1975）］は、均質な（いわゆる「モノクローナ
ル」）抗体をつくる連続な細胞ラインを得ること
ができることを初めて証明した。この基本の研究
以来、種々の交雑細胞［いわゆる「ハイブリドマ
類（hybridomas）」］の生成およびこれらのハイ
ブリドマ類によりつくられた抗体の種々の科学的
研究への使用について多くの努力が向けられてき
た。たとえば、次の文献を参照：Current
Topics in Microbiology and Immunology、
Volume81−“Lymphocyte Hybridomas”、F.
Melchers、M.Potter、およびN.Warner、
Editors、Springer−Verlag、1978、およびそこ
に含まれる参考文献；C.J.Barnstable、et al.、
Cell、14、９−20（May、1978）；P.Parham及び
W.F.Bodmer、Nature 276、397−399
（November、1978）；Handbook of
Experimental Immunology、Third Edition
Volume ２、D.M.Wier、Editor、Blackwell、
1978、Chapter2.5；およびChemical and
Engineering News January １、1979、15−17。
これらの文献は同時にハイブリドマ類からモノク
ローナル抗体を生成する試みによつて得られる利
益および複雑さを示している。一般的技術は概念
的によく理解されているが、各特定の場合に多く
の困難に出会い、そして変更が要求される。事
実、一定のハイブリドマを生成しようと試みる前
には、所望のハイブリドマが得られるか、得られ
た場合抗体を生成するか、あるいはそのように生
成された抗体が所望の特異性をもつか、を確かめ
ることができない。成功の程度は、主として、使
用する抗原のタイプおよび所望のハイブリドマを
単離するために使用する選択技術によつて影響を
受ける。 人間のリンパ球細胞表面の抗原に対するモノク
ローナル抗原を生成する試みは、数例報告されて
いるだけである。たとえば、Current Topics in
Micrbiology and Immunology、ibid、66−69お
よび164−169参照。これらの報告された実験にお
いて使用されている抗原は、培養したリンパ芽球
性白血病およびヒト慢性リンパ球性白血病の細胞
ラインであつた。得られた多くのハイブリドマ類
は、全てのヒト細胞の種々の抗原に対して抗体を
生成するように思われた。ハイブリドマ類はいず
れも、ヒトのリンパ球の前もつて定めたクラスに
対して抗体を生成しなかつた。 人間および動物の免疫系に含まれるリンパ球に
２つの主なクラスが存在することを理解すべきで
ある。これらのうちの第１クラス（胸腺誘導細
胞、すなわち、Ｔ細胞）は、ヘモポイエチン幹細
胞から胸腺において分化されている。胸腺内にあ
る間、分化する細胞は「胸腺細胞」と名づけられ
る。成熟したＴ細胞は胸腺から出、そして組織、
リンパ管、および血流の間を循環する。これらの
Ｔ細胞は、再循環する小さいリンパ球の貯留
（pool）の大きい比率を形成する。それらは免疫
額的特異性を有し、そして細胞介在免疫応答（組
織移植注入のような）においてエフエクター
（effector）細胞として直接関与する。Ｔ細胞は
液性抗体を分泌しないが、後述するリンパ球の第
２クラスによるこれらの抗体の分泌に時々要求さ
れる。Ｔ細胞のいくつかの型は免疫系の他の面に
おいて調節機能をはたす。この細胞共働の過程の
機構はまだ完全には理解されていない。 リンパ球の第２クラス（骨髄誘導細胞、すなわ
ち、Ｂ細胞）は、抗体を分泌するものである。そ
れらもまたヘモポイエチン幹細胞から発生する
が、それらの分化は胸腺によつて決定されない。
鳥類において、それらはフアブリキウス嚢
（Bursa of Fabricius）と呼ばれる胸腺に類似す
る器官において分化されている。しかし、哺乳動
物においては、同等の器は発見されておらず、そ
してこれらのＢ細胞は骨髄内で分化すると考えら
れる。 ここで、Ｔ細胞は「ヘルパー（helper）」、「抑
制体（Auppressor）」及び「キラー（killer）」Ｔ
細胞と呼ばれる、少なくとも幾つかのサブタイプ
に分けられ、それらは（それぞれ）反応を促進
し、反応を抑制し、あるいは異種細胞を殺す（分
離する）機能を有することが認められた。これら
のサブクラスはネズミの系統についてよく理解さ
れているが、それぞれ人間の系についてわずかに
最近記載されただけである。たとえば、次の文献
を参照：R.L.Evans、et al.、Journal of
Experimental Medicine、Volume 145、221−
232、1977；及びL.ChessおよびS.F.Schlossman
−“Functional Analusis of Distinct Human
Ｔ−Cell Subsets Bearing Unique
Differentiation Antigens”“Contemporary
Topics in Immunbiolgy”、O.Stutman、
Editor、Plenum Press、1977、Volume ７、
363−379。 Ｔ細胞のクラスまたはサブクラスを同定または
抑制することができることは、種々の免疫調節の
不調または状態の診断または処置にとつて重要で
ある。 たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫は、
それ等がＢ細胞またはＴ細胞のいずれを源とする
かによつて、異なる予後を有する。こうして、病
気の予後の評価はこれらのリンパ球の２つのクラ
スを区別することに依存する。たとえば、次の文
献を参照：A.C.AisenberyおよびJ.C.Long、The
American Journal of Medicine、58：300
（March、1975）；D.Belpomme、et al.、
Immunological Diagnosis of Leukemias amd
Lumphomas、S.Thierfelder、et al.、Editors、
Springer、Hedelberg、1977、33−45；およびD.
Belpomme、et、al.、British Journal of
Haematology、1978、38、85。ある種の病気の
状態（たとえば、若年性リウマトイド関節炎およ
びある種の白血病）は、Ｔ細胞のサブクラスの不
釣合いに関連する。自己免疫の病気は一般に「ヘ
ルパー」Ｔ細胞の過剰またはある種の「抑制体」
Ｔ細胞の欠乏に関連するが、悪性の病気の一般に
「抑制体」Ｔ細胞の過剰に関連することが示唆さ
れた。ある種の白血病において、過剰のＴ細胞は
発育の停止し状態において生成される。診断はこ
うしてこの不釣合い、すなわち、過剰を検知する
ことができることに依存しうるであろう。たとえ
ば、次の文献を参照：J.Kersey、et al.、
“Surface Markers Define Human Lymphoid
Malignancies with Differing Prognoses”、
Haematology and Blood Transfusion、
Volume 20、Springer−Verlag、1977、17−24、
およびその中に含まれる参考文献。 治療サイドにおいて、まだ明確に証明さていな
いが、Ｔ細胞のサブタイプに対する抗体を過剰量
で投与することは自己免疫の病気または悪性の病
気において治療上有益であるという、いくらかの
示唆がある。ヒトＴ細胞の全クラス（いわゆる抗
ヒト胸腺細胞にグロブリン、すなわち、ATG）
に対する抗血清は、移植組織を受ける患者におい
て治療上有用であると報告されている。細胞介在
免疫応答（移植組織を拒否する機構）はＴ細胞に
依存するので、Ｔ細胞に対する抗体を投与する
と、この拒否の過程を防止または遅延する。たと
えば、次の文献を参照：Cosimi、et al.、
“Randomized Clinical Trial of ATG in
Cadaver Renal Allgraft Recipients：
Importance of Ｔ Cell Monitoring”、
Surgery 40：155−163（1976）およびその中に含
まれる参考文献。 ヒト細胞のクラスおよびサブクラスの同定およ
び抑制は、従来、動物をヒト細胞で免疫し、その
動物を出血させて血清を取り、そしてこの抗血清
を（たとえば）地元（autologous）であるが、
異種ではないＢ細胞で吸着して望まない反応性を
もつ抗体を除去することによつて得た、ヒトＴ細
胞のための自発性自己抗体または選択的抗血清を
使用することによつて達成された。これらの抗血
清の製造は、とくに吸着および精製の工程におい
て、極めて困難である。吸着され且つ精製された
抗血清でさえ、所望の抗体に加えて、いくつかの
理由で、多くの不純物を含有する。第１に、血清
は、Ｔ細胞で免疫する前に数百万の抗体分子を含
有する。第２に、この免疫法は注入したすべての
ヒトＴ細胞について見い出される種々の抗原に対
する抗体を生成させる。単一の抗原に対する抗体
は選択的に生成されない。だい３にこのような方
法で得られた特異性抗体の力価は通常極めて低く
（たとえば、１：100より大きい希釈度において不
活性）そして非特異性抗体に対する比は１／106
より小である たとえば、前述のChessおよびSchlossmanの
文献（365ページ以降参照）および前述の
Chemical and Engineering Newsを参照。ここ
は選考技術の抗血清の欠点およびモノクローナル
抗体の利点が記載されている。 今回、本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞
について見い出される抗原に対する新規なモノク
ローナル抗体を生成できる新規なハイブリドマが
見出された。そのように生成された抗体は正常な
ヒトＴ細胞について単一の決定因子に対して単一
特異性（monospecific）であり、そして他の抗
ヒト免疫グロブリンを本質的に含有しないが、こ
れと対照的に選考技術の抗血清は多数のヒト抗原
に対して反応性の抗体で本来汚染されており、そ
して先行技術モノクローナル抗体はヒトＴ細胞の
抗原について単一特異性ではない。その上、この
ハイブリドマは培養して抗体を生成することがで
きる。この場合動物を免疫し、殺し、次いで先行
技術の不純の抗血清を得るときにさえ、必要な長
たらしい吸着および精製の工程を実施することを
要しない。 したがつて、本発明の１つの目的は、本質的に
すべての正常なヒトＴ細胞について見い出される
抗原に対する抗体を生成するハイブリドマ類を提
供することである。 本発明のさらに別の面において、これ等のハイ
ブリドマ類を製造する方法を提供する。 本発明の他の目的は、本質的にすべての正常な
ヒトＴ細胞について見い出される抗原に対する本
質的に均質な抗体を提供することである。 さらに他の目的は、これらの抗体を用いる病気
の識別方法を提供することである。 本発明のその他の目的および利益は、本発明の
開示を検討すると明らかになるであろう。 前述の目的および利益は達成するため、本発明
によれば、本質的にすべての正常なヒトＴ細胞に
ついて見い出される抗原に対する新規な抗体を生
成する新規なハイブリドマ、この抗体それ自体、
およびこの抗体を用いる診断および治療の方法が
提供される。該ハイブリドマはMilsteinおよび
Kohlerの方法に一般に従つて製造される。正常
のＥロゼツト（rosette）陽性のヒトＴ細胞でマ
ウスを免疫した後、免疫したマウスの脾細胞をマ
ウスの骨髄腫ラインからの細胞と融合し、そして
得られたハイブリドマ類を正常のＥロゼツト陽性
のヒトＴ細胞に選択的に結合する抗体を含有する
上澄液を用いてそれらについて選別した。所望の
ハイブリドマ類を引き続いてクローニングし、特
性づけた。その結果、本質的に全ての正常なヒト
Ｔ細胞についての抗原に対する抗体（OKT1と表
示する）を生成するハイブリドマが得られた。こ
の抗体は本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞
と反応するが、他の正常な末梢の血液のリンパ様
細胞と反応しない。更に、この抗体により認識さ
れる細胞表面の抗原は成熟した胸腺抗原について
のみ検出され、そして正常なヒト胸腺細胞の90％
より多くはこの抗原を完全に欠いている。 先行技術において示された困難および抗原とし
て悪性の細胞ラインを用いて報告された成功の不
足を見ると、本発明の方法が所望のハイブリドマ
を提供したことは驚くべきことであつた。交雑細
胞のこの予測されえない性質は１つの抗原または
細胞ラインから他のものへの補外（extrapolate）
を許さないことに注意すべきである。事実、本発
明者らは、抗原としてＴ細胞の悪性細胞ラインを
用いると、所望の抗体を生成しないハイブリドマ
類が形成することを見い出した。細胞表面から分
離した精製した抗原を使用する試みも不成功に終
つた。 このハイブリドマおよび生ずる抗体の製造およ
び特性は、以下の説明および実施例から一層理解
できるであろう。 ハイブリドマを製造する方法は一般に次の工程
からなる： Ａ Ｅロゼツト陽性の精製した正常なヒト末梢Ｔ
細胞でマウスを免疫する。メスのBalb／cJマ
ウスが好ましいことがわかつたが、他のマウス
の系統を使用できると考えられる。免疫スケジ
ユールおよびＴ細胞の濃度は、有効量の適当に
準備した脾細胞を生成するようなものであるべ
きである。0.2mlのリン酸塩緩衝食塩液中の２
×107細胞／マウス／注射を用いて、14日の間
隔で、３回免疫を行なことは有効であることが
わかつた。 Ｂ 免疫したマウスから脾臓を除去し、適当な媒
体中の脾懸濁液を調製する。約１ml／脾臓の媒
体で十分である。これらの実験の技術はよく知
られている。 Ｃ 懸濁した脾細胞を適当な細胞ラインからのマ
ウスの骨髄腫の細胞と、適当な融合媒体の使用
により融合する。脾細胞対骨髄腫細胞の好まし
い比は５対１である。約108この脾細胞につい
て合計約0.5〜1.0mlの融合媒体は適当である。
多くのマウスの骨髄腫の細胞は知られており、
そして一般に学問的共同体のメンバーまたは
種々の寄託機関、たとえば、ザ・ソーク・イン
スチチユート・セル・デイストビユーシヨン・
センター（the Salk Institute Cell
Distribution Center、La Jolla、CA）から入
手できる。使用する細胞ラインは好ましくはい
わゆる「薬物抵抗性」型であつて、未融合の骨
髄腫細胞が選択した媒体中で生存せず、一方交
雑細胞が生存するようにすべきである。最も普
通の群は８−アザグアニン抵抗性の細胞ライン
であり、これは酵素ヒポキサンチン・グアニ
ン・ホホリボシル・トランスフエラーゼ
（phophoribosyl transferase）を欠き、それゆ
えHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
およびチミジン）媒体により支持されない。ま
た、使用する骨髄腫細胞ラインはいわゆる「非
分泌」型である。すなわち、それはそれ自体抗
原体を生成しないことが一般的に好ましいが、
分泌型を使用できる。しかしながら、ある場合
において、分泌する骨髄腫ラインは好ましいこ
とがある。好ましい融合促進剤は平均分子量が
約1000〜約4000であるポリエチレングリコール
（商業的にPEG1000などとして入手できる）が
好ましいが、この分野においては知られている
他の融合促進剤を使用できる。 Ｄ 別の容器内において、未融合の脾細胞、未融
合の骨髄腫細胞、および融合した細胞の混合物
を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択的媒
体中で希釈し、未融合の細胞を死亡させるのに
十分な時間（約１時間）培養する。この希釈は
限定されたものの型であることができ、この希
釈において希釈剤の体積は統計的に計算して各
別々の容器［たとえば、マイクロタイタープレ
ートの各ウエル］中である数の細胞（たとえ
ば、１〜４）を単離する。媒体は薬物抵抗性
（たとえば、８−アザグアニン抵抗性）で未融
合の骨髄腫細胞ラインを支持しないもの（たと
えば、HAT媒体）である。それゆえ、これら
の骨髄腫細胞は死ぬ。未融合の脾細胞は非悪性
であるので、有限の数の世代をもつだけであ
る。こうして、ある期間（約１時間）後、これ
らの未融合の脾細胞は再生しない。融合した細
胞は、これに対して、骨髄腫の親の悪性をも
ち、そして脾細胞の親の選択的媒体中で生存で
きるので、再生し続ける。 Ｅ ハイブリドマを含有する各容器（ウエル）中
の上澄液を、Ｅロゼツト陽性の精製したヒトＴ
細胞に対する抗体について評価する。 Ｆ 所望の抗体を生成するハイブリドマを選択し
（たとえば、限定希釈により）そしてクローニ
ングする。 いつたん所望のハイブリドマを選択し、クロ
ーニングすると終結の抗体は２つの方法で１つ
で生成させることができる。最も純粋なモノク
ローナル抗体は、所望のハイブリドマを適当な
媒体中で適当な長さの時間試験内で培養し、次
いで所望の抗体を上澄液から回収することによ
つて生成される。適当な媒体及び適当な培養時
間の長さは、既知であるか、あるいは決定容易
である。この試験管内技術は、他の特異性の抗
ヒト免疫グロブリンを本質的に含まない、単一
特異性モノクローナル抗体を本質的に生成す
る。媒体は外因性血清（たとえば、胎児の子牛
の血清）を含有するので、少量の他の免疫グロ
ブリンが存在する。しかしながら、この試験管
内の方法は、モノクローナル抗体の濃度がわず
かに約50μｇ／mlであるので、十分な量または
濃度を生成できない。 非常に多きい濃度のわずかに純度に劣るモノ
クローマル抗体を生成させるため、所望のハイ
ブリドマをマウス、好ましくは先天性または半
先天性のマウスに注射できる。ハイブリドマは
適当な潜伏時間後抗体生成の腫腸を形成させ、
その結果宿主マウスの血流および腹膜滲出液
（腹水）中に高濃度の所望とする抗体（約５〜
20mg／ml）が生ずる。これらの宿主マウスの正
常の抗体を血流および腹水中に有するが、これ
らの正常な抗体の濃度はモノクローナル抗体濃
度のわずかに約５％であるにすぎない。その
上、これらの正常の抗体は特異性が抗ヒトでな
いので、収穫した腹水または血清から得たモノ
クローナル抗体は汚染する抗ヒト免疫グロブリ
ンを本質的に含有しない。このモノクローナル
抗体は力価が高く（１：30000以上の希釈で活
性である）そして特異性免疫グロブリン対非特
異性免疫グロブリンの比が高い（約１／20）。
Ｋ軽量の骨髄腫鎖を組込んだ生成した免疫グロ
ブリンは非特異性の「無意味な」ペプチド類で
あり、これらはモノクローナル抗体をその特異
性を減じ得ないで単に希釈するだけである。 実施例 モノクローナル抗体の生成 Ａ 免疫および体細胞の交雑 メスのBalb／cJマウス（Jackson研究所；生
まてから６週間）を、0.2mlのリン酸塩緩衝食
塩溶液中の２×107のＥロゼツト精製したＴ細
胞で腹膜内的に14日の間隔で免疫した。第３回
目の免疫後、脾をマウスから取り出し、そして
ステンレス鋼の鋼に組織を通すことによつて単
一細胞の懸濁液をつくつた。 細胞の融合をKohlerおよびMilsteinの方法
に従つて実験した。１×103の脾細胞を、
RPMI1640媒体（Gibco、Grand Islamd、
NY）中の35％のポリエチレングリコール
（PEG1000）と５％のジメチルスルホキシドと
からなる融合媒体の0.5ml中において、２×107
のP3×63Ag8U1骨髄腫細胞（Br.M.Scharff、
Albert Einstein College of Medicine
Bronx、NYにより供給）と融合した。これら
の骨髄腫細胞はIgG1κL鎖（light chains）を分
泌する。 Ｂ ハイブリドマの選択および成長 細胞の融合後、細胞をHAT媒体（ハイポキ
サンチン。アミノプチリン、およびチミジン」
中で37℃において５％のCO2を使用して湿つた
ふん囲気中で培養した。数週間後、ハイブリド
マ類を含有する培養液から40〜100μの上澄
液を、Mendes（J.Immunol.111：860、1973）
が記載するように健康なヒトの供与者の血液か
ら調製した、Ｅロゼツト陽性（E+）個体群と
Ｅロゼツト陰性（E-）個体群とに分けた106末
梢リンパ球のペレツトに加えた。これらの細胞
へ結合するマウスのハイブリドマ抗体の検出
は、ラジオイムノアセイおよび／または間接免
疫蛍光法により決定した。第１の方法におい
て、細胞は初め100μの親和性精製した 125I
山羊の抗マウスIgG（106cpm／μｇ；500μｇ／
μｇ）の100μと反応させた（山羊の抗マウ
スのヨウ素化の詳細はKung、et al.、Ｊ．
Biol.Chem.251(8)：2399、1976に記載されてい
る）。別法として、培養液の上澄液で培養した
細胞を蛍光を付与した山羊の抗マウスIgG
（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy研究所、
Springfidld、VA；Ｆ／Ｐ＝2.5）で染色し、
この蛍光性抗体被覆細胞を引き続いてシトフル
オログラフ（Cytofiuorograf）FC20／4800A
（Ortho Instruments、Wwstwood、MA）に
ついて実施例に記載するように分析した。
E+リンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する抗
体を含有するハイブリドマ培養液を選択し、ク
ローニングした。引き続いて、クローンを２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカン
（Aldrich Chemical Companyから商品名
Prististineで市販されている）で準備した
Balb／cJマウスに一定のクローンの１×107細
胞（0.2mlの体積）を注射することによつて、
腹膜内に移植した。ついでこれらのマウスから
の悪性腹水を使用して、実施例において後述
するように、リンパ球を特性づけた。主題の交
雑抗体OKT1は、標準の技術によりサブクラス
IgG1であると証明された。 実施例 OKT1の反応性の特性づけ Ａ リンパ球個体群の単離 人間の末梢血液の単核細胞を、健康な志願者
の提供者（15〜40才）から、Boyum.、Scand.
Ｊ．Clin.Lab.Invest.21（Suppl.97）：77、1968
の技術に従い、フイコール−ハイパツク
（Ficoll−Hypaque）密度勾配遠心分離
（Pharmacia Fine Chenicals、Piscataway、
NJ）により単離した。分別しない単核細胞を、
Chess、et al.、Ｊ．Immnuol.113：1113
（1974）にすでに記載されているように、
Sephadex Ｇ−200抗（ab′）2カラムクロマトグ
ラフイーにより、表面Ig+(B)およびIg-（Ｔプラ
スNull）の個体群に分離した。Ｔ細胞はIg-個
体群を５％の羊の赤血球（Microbiological
Associates、Bethesda、MD）でＥロゼツト化
することによつて回収した。ロゼツト化した混
合物をフイコール−ハイパツク（Ficoll−
Hypawque）上で層状にし、回収したいE+ペ
レツトを0.155モルのNH4l（10ml／108細胞）で
処理した。このようにして得られたＴ細胞の個
体群は、標準法により決定して、＜２％EACロ
ゼツト陽性および＞95％Ｅロゼツト陽性であつ
た。さらに、非ロゼツトIg-（Null細胞）個体
群をフイコール表面から収穫した。この後者の
個体群は＜５％E-および２％sIg+であつた。
表面Ig+(B)個体群は、前述のようにSephadex
Ｇ−200カラムクロマトグラフイーおよび引き
続く正常なヒト・ガンマグロブリンによる溶離
から得られた。この個体群は＞95％表面Ig+お
よび＜５％E+であつた。 正常なヒト大食細胞は、ポリスチレンへの付
着により、単核個体群から得た。こうして、単
核細胞を最終培地（RPMI1640、2.5ミリモル
のHEPS［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−
ピペラジンプロパンスルホン酸］緩衝剤、0.5
％の重炭酸ナトリウム、200ミリモルのＬ−グ
ルタミン、および１％ペニシリン−ストレプト
マイシンからなり、20％の熱失活したヒトAB
血清を補足した）中に２×106細胞濃度で再懸
濁し、プラスチツクのペトリ皿（100×20mm）
（Falcon Tissue Culture Dish；Falcon、
Oxnard、CA）中で37℃において一夜培養し
た。よく洗つて非付着性細胞を除去した後、
2.5ミリモルのDTAを含有する冷たい血清不含
媒体で強く洗い、時々使い捨て注射器のプラン
ジヤーのゴムの先端で引つかいて、付着した固
体群を脱着した。85％より多い細胞個体群は、
ラテツクス粒子を摂取することができ、そして
ライト−ギエムサ（Wright−Giemsa）染色に
より単球の形態学的特性を有した。 Ｂ 正常な胸腺 正常人の胸腺を２月〜14才の年令の患者か
ら、心臓の矯正手術のもとに得た。胸腺の新し
く得た部分を媒体199（Gibco）中の５％胎児の
子牛の血清中に直ちに入れ、鉗子とはさみで小
さく切り、引き続いて金網を通してプレスする
ことによつて単細胞の懸濁液にした。細胞を次
に前節Ａで説明したように、フイコール−ハイ
パツクで層状にし、回し、洗浄した。このよう
にして得られた胸腺細胞は＞95％生活力があ
り、そして90ロゼツト陽性であつた。 Ｃ 細胞ライン（Cell lines） 正常な４個体からエプスタイン−バールウイ
ルス（Epstein−Barr Virus）（EBV）変形し
た細胞ラインを前述のように調製した。Ｔ細胞
ラインCEMHSB−２、及びHJD−１は、Dr.
H.Lazarus（Sidney Farber Cancer Institute、
Boston、MA）により提供された。 上記細胞を調製するに当つて、確立したリン
パ芽球細胞ラインへのヒトリパ球の形質転換
は、エプスタイン−バールウイルスの生物学的
性質としてよく知られている。このような細胞
の形質転換は、度々文献に記載され例えばジエ
イ・エイチ・ポペ、エム・ケイ・ホーンおよび
ダブリユ・スエツトがインターナシヨナル・ジ
ヤーナル・オブ・カンサー３号857867頁
［PoPe、J.H.、M.K.Horne and W.Scott in
Int.J.Caancer.3；857−867、（1968）．］におけ
る“ヘルペス様ウイルスを含有するヒト白血球
ラインからロ別したものによる試験管内におい
てヒト胎児リンパ球の形質転換”
［“Transformation of Fetal Human
Lymphocytes In−Vitro By Filtrates of ａ
Human Leukemic Cell Line Containing
Herpes−Like Virus”］という標題の論文に
詳細説明されている。 Ｄ Ｔ急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ALL）細
胞およびＴ慢性リンパ球性白血病（Ｔ−CLL）
細胞 白血病細胞は12人のＴ−ALLの患者から得た。
これらの固体の細胞は、Schlossman、et al、
Proc.Nad.Acad.Sci.73：1288（1976）によるすで
に記載され得いるように、羊の赤血球との自発ロ
ゼツト形成（＞20％E+）、およびＴ細胞特異性異
質抗血清、抗HTL（抗−B.K.）およびA99との反
応性によりＴ細胞結合をもつとすでに決定され
た。３固体からの腫瘍細胞はウサギおよび／また
は馬の抗TH2と反応性（TH2 +）であつたが、残
る９個体からの細胞は非反応性であつた
（TH2 -）。ウサギおよび／または馬抗TH2は、特
有の機能特性“TH2 +”を有する、Ｔ細胞個体群
の特殊なサブセツトと結合するウサギまたは馬か
ら誘導された異種抗血清のことである。このこと
は下記の文献に述べられている。イー・エル・エ
ヌ・ラインヘルツとエス・エフ・シユロスマン
［Reinhelz、E.L.N.、Schlorsmann、S.F.］の
Journal of Immunology 122、1335−1341
（1979）。TH2 -T−CLLの２人の患者からの白血
病細胞も使用した。両方の急性および慢性の白血
病細胞を10％のジメチルスルホキシドおよび20％
のABヒト血清中の−196℃の蒸気相液体窒素中
で、表面特性づけの時間まで、凍結保存した。分
析した腫瘍個体群は、すべての場合においてライ
ト−ギユムサ（Wright−Giemsa）形態学により
＞90％芽細胞であつた。 実施例 シトフルオログラフ（（cytofluorographic）分
析および細胞分離 すべての細胞個体群のシトフルオログラフ分析
を、シトフルオログラフ（Cytifluorograf）
FC200／4800A（Ortho Instruments）で蛍光共役
した羊の抗マウスIgG（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy
Laboratories）を用いて間接免疫蛍光法により実
施した。要約すると、１〜２×106細胞を0.15ml
にOKT1で１：1000希釈において処理し、４℃で
30分間培養し、２回洗浄した。次いで細胞を0.15
mlの１：40希釈のＧ／Ｍ FITCで４℃において
30分間反応させ、遠心分離し、３回洗浄した。次
いでこれらの細胞をシトフルオログラフで分析し
た。蛍光の強さ／細胞をパルス高さ分析器に記録
した。同様な反応性のパターンは１：30000の希
釈で観察されたが、これよりさらに希釈すると反
応性は失なわれた。バツクグラウンドの染色は、
非生成性交雑分枝系で腹膜的に免疫したBalb／
cJマウスからの１：1000腹水の0.15ml部分を代わ
りに使用することによつて得た。 OKT1+細胞およびOKT1-細胞を分離するよう
に設計した実験において、100×106の未分別単核
細胞または胸腺細胞を、４mlの１：1000希釈の
OKT1で標識付し、Ｇ／Ｍ FITOで現象した。
同一の染色アプローチを用いて、前記実施例Ａ
におけるように単離したヒトＴ細胞を調製した。
蛍光で活性化した細胞分類体（FACS−１）
（Becton−Dickinson、Mountain View、CA）
を用いて、リンパ球をOKT1+個体群とOKT1-個
体群とに分離し、および／またはＴ細胞を弱反応
性OKT1+T細胞（蛍光の20％より小）および強
反応性OKT1+T細胞（蛍光の20％以上）に分別
した。後の種類の生活力はすべての場合において
トリパン（Trypan）ブルー排除により＞95％で
あつた。すべての分離した個体群の純度は≧95％
であつた。 実施例 機能的研究 未分離およびFACS分別のリンパ様細胞の有糸
応答を、Chess、et alによりすでに記載されたよ
うに、微量培養において、コンカナバリン
（Concanavalin）Ａ（Con Ａ）（Calbiochem、La
Jolla、CA）およびフイトへマグクルチニン
（phytohemagglutinin）（PHA）の最適投与に対
して試験した。異種抗原増殖応答を、これらの同
じ個体群について、マイトマイシン処理Laz156、
刺激としてDr.H.Lasarusから得られたEBV変形
したヒトＢリンパ芽球様細胞ラインを用いて、同
時に測定した。破傷風トキソイド
（Massachusetts Department of Public Health
Biological Laboratories、Boston、MA）に対
する増殖を、Evans、et al.（J.Innunol.129：
1423、1978）によりすでに記載されているよう
に、10μｇ／mlの最終濃度を用いて試験した。上
に記載される方法で得られた５％の大食細胞を、
すべての個体群に試験管内培養の開始時に加え
た。糸状体（mitogen）刺激された培養を４日後
0.2μCiのトリチウム化サイミジン（tritiated
thymidine）（1.9Ci／ミリモルの比活性；
Schwartz−Mann Division of Becton−
Dickinson、Orangeburg、NY）でパルスし、18
時間後MASH装置（Microbiological
Associates、…Bethesda、MD）で収穫した。ト
リチウム化サイミジンの結合をパツカード・シン
チレーシヨン・カウンター（Packard
Instrument Company、Downer's Grove、IL）
で測定した。バツクグラウンドのトリチウム化サ
イミジンの結合は、有糸体のかわりに媒体を用い
て得た。破傷風トキソイド刺激培養物および異種
抗原刺激培養物、５日後、前述のように、トリチ
ウム化サイミジンで18時間パルスし、収穫し、計
数した。 ハイブリドマの生成、および生ずるモノクロー
ナル抗体の生成および特性づけは、上の実施例に
おけるように実施した。大量の主題の抗体を、主
題のハイブリドマのマウスへの腹膜内注射及び悪
性腹水の収穫により調製したが、ハイブリドマは
試験管内でこの分野においてよく知られた技術に
より培養し、抗体を上澄液から取り出すことがで
きることは、明らかに考えられる。 主題のハイブリドマの試料は、アメリカン・タ
イプ・カルチヤー・コレクシヨン（12301
Parklawn Drive、Rockville、MD、20852）に
1979年３月13日に寄託され、ATCC番号
CRL8000が付された。 第１図に示すように、一定の正常な個体の全ヒ
ト末梢血液Ｔ細胞の個体群はOKT1と反応性であ
るが、これに対して同じ個体から単離された全Ｂ
細胞、無特徴細胞および大食細胞の個体群は
OKT1と非反応性である。他の正常な15個体から
のリンパ球の個体群について同様な結果が得られ
た。こうしてモノクローナル抗体は、本質的にす
べての正常なヒト末梢Ｔ細胞の表面上に含有され
る抗原と反応性であるが、第１図に示す他の３つ
の細胞の型の表面上の抗原と非反応性であると、
特性づけられる。この特異の反応性は、主題の抗
体OKT1を検出でき、そして他の抗体と区別でき
る１つの試験である。 第２図に示すよう内、６ケ月の乳児からの正常
なヒト胸腺細胞のほとんど大部分はOKT1と完全
に非反応性であるが、胸腺細胞の約５〜10％は反
応性である。この発見の意味は、幹細胞が成熟し
たＴ細胞に変わる分化過程の間、胸腺細胞がある
段階で、OKT1と反応性である、Ｔ細胞上に見い
出される同じ表面の抗原を獲得するということに
ある。これらの胸腺細胞は、胸腺から血流中へ出
る直前の分化の後の段階にあると信じられる。２
ケ月〜19才の年令の正常な個体からの６つの追加
の胸腺の試料を用いて、同様な結果（５〜10％の
反応性）が得られた。第２図における反応性のパ
ターンは、主題の抗体OKT1を検出し、それを他
の抗体と区別する第２の方法を提供する。 主題の抗体の診断的使用は第３図に図解されて
おり、この図においてＴ急性リンパ芽球性白血病
（Ｔ−ALL）患者からの白血病細胞はOKT1と非
反応性であるが、これに対してＴ慢性リンパ芽球
性白血病（Ｔ−CLL）患者からの白血病細胞は
OKT1と反応性であつたことが示される。したが
つて主題の抗体は、白血病の２種の白血病の間を
区別する方法を提供する。Ｔ−ALLおよびＴ−
CLLのある段階の間を区別することは困難であ
り、そして予後および処置の養生法の両方はこれ
らの２種の白血病の間で実質的に相違するので、
主題の抗体を使用して提供された２種の間を区別
する直接的方法は優位の進歩であることを理解で
きる。 主題の抗体OKT1のほかの特性づけは、第４図
に図解される種々のヒトＴ細胞ラインに対する反
応によつて示される。この図からわかるように、
主題の抗原のヒトＴ細胞ラインに対する反応性は
不均質であり、ラインHJD−１について強く、
ラインCEMについて中程度であり、ラインHSB
−２について不存在である。このOKT1の種々の
入手容易なヒトＴ細胞ラインに対する特異の反応
性は、主題の抗体を特性づけかつ説明するなお他
の方法を提供する。 第５図は、OKT1とヒトＢ細胞ラインLaz007
との反応性の欠乏を図解する。試験した他の
EBV変形Ｂ細胞ラインについて同一のパターン
が得られた。これは、正常なヒト個体群の末梢血
液から得られたＢ細胞とのOKT1の反応性の欠乏
をさらに確認し、そして主題の抗体OKT1を特性
づけかつ区別するなお他の方法を提供する。 機械的性能を、蛍光活性化細胞セパレーター
（FACS）分離したリンパ様個体群について実施
した。これらの研究の結果は下表〜に示され
ており、そして主題のモノクローナル抗体の前述
の特性づけを裏書きする。 表に示すように、PHA、Ｃ on Ａ、可溶性
抗原、および混合リンパ球培養物中の異種抗原へ
の応答の本質的にすべてはOKT1に対して応答性
の細胞の個体群に帰する。OKT1に非反応性の個
体群はこれらのＴ細胞機能のいずれをも生じない
ように思われ、わずかの応答はOKT1+細胞によ
る起こりうる汚染によるものと考えられる。これ
らの機能の研究がさらに明らかにするように
OKT1が反応性である抗原はＴ細胞上に存在し、
その理由はそのような反応性の個体群がＴ細胞の
機能を示すが、そのように反応性ではない個体群
はこれらの機能のいずれをも示さないことにあ
る。表は、FACSで分離された強くOKT1反応
性Ｔ細胞と弱くOKT1反応性Ｔ細胞との間に有糸
応答または異種抗原応答において機能的差異が存
在しないことを明らかに示している。両者の個体
群は等しくよく、かつ分別しないＴ細胞個体群と
同じ方法で増殖した。表が示唆するように、
MLC検定における全範囲の胸腺細胞の活性は
OKT1と反応性の胸腺細胞の個体群の部分にほと
んど完全に帰因するので、OKT1が反応する表面
抗原は成熟した胸腺細胞上にのみ存在する。ま
た、表はOKT1+リンパ球とOKT1+末梢Ｔ細胞
との間の機能的差異を示し、この差異は前者が有
糸応答性を欠くからである。 本発明によれば、本質的にすべての正常なヒト
Ｔ細胞上に見い出される抗原に対する抗体を生成
できるハイブリドマ、このハイブリドマを生成す
る方法。本質的にすべてのヒトＴ細胞上に見い出
さられる抗原に対するモノクローナル抗体、この
抗体を生成する方法、およびこの抗体を用いる病
気の処置または診断の方法が提供される。 ヒトＴ細胞の抗原に対する単一のモノクローナ
ル抗体を生成する単一のハイブリドマだけを説明
してきたが、本発明はここに説明する特性を示す
すべてのモノクローナル抗体を包含すると考えら
れる。主題の抗体OKT1はねずみのIgGの４つの
サブクラスの１つであるサブクラスIgG1に属す
ることが決定された。免疫グロブリンＧのこれら
のサブクラスは互いにいわゆる「固定された」領
域において異なるが、特定の抗原に対する抗体は
いわゆる「可変の」領域をもち、この領域は免疫
グロブリンＧのどのサブクラスがそれに属するか
に無関係に機能的に同一である。すなわち、ここ
に説明した特性を示すモノクローナル抗体はサブ
クラスIgG1、IgG2a、IgG2bまたはIgG3、あるい
はクラスIgM、IgA、あるいは他の既知のクラス
Igであることができる。これらのクラスまたはサ
ブクラスの間の差異は抗体の反応パターンの選択
性に影響を及ぼさないが、抗体と他の物質、たと
えば、相補助的抗体または抗マウス抗体とのほか
の反応に影響を及ぼすことがあるであろう。主題
の抗体はIgG1に特定したが、ここに例示した反
応性のパターンを有する抗体類はそれらが属する
免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスに無関
係に本発明の範囲内に包含されると考えられる。 さらに、本発明の範囲内に、ここに例示したハ
イブリドマの技術を用いて前述のモノクローナル
抗体を生成する方法が包含される。ハイブリドマ
のただ１つの例をここに記載したが、当業者はこ
こに提供した免疫法、融合法および選択法に従
い、ここに説明した反応性の特性を有する抗体類
を生成しうる他のハイブリドマ類をうることがで
きると考えられる。マウスの既知の種からの既知
の骨髄腫細胞系統から生成した個々のハイブリド
マはこのハイブリドマにより生成された抗体を参
照する以外それ以上同定できないので、前述の反
応性の特性を有する抗体を生成するすべてのハイ
ブリドマ類は本発明の範囲内に包含され、これら
のハイブリドマを用いるこの抗体をつくる方法も
同様に包含されると、考えられる。 本発明のほかの面は、モノクローナル抗体
OKT1またはここに明らかにした反応性のパター
ンを示す他のモノクローナル抗体を用いて病気を
処理または診断する方法である。上に考察したよ
うに、主題の抗体によれば、Ｔ細胞の慢性リンパ
芽球性白血病とＴ細胞の急性リンパ芽球性白血病
を判別することができ、そして器官の移植を受け
た患者を処置して移植組織の拒否を減少または排
除することができる。 【表】 【表】 【表】 【表】
第１図は、示す細胞個体群を、１：1000の希釈
でOKT1、およびＧ／Ｍ FITCと反応させた後、
シトフルオログラフで得た蛍光パターンを示す。
第２図は、ヒト胸腺細胞をOKT1およびＧ／Ｍ
FITCと反応させた後、シトフルオログラフで得
られた蛍光パターンを示す。第３図は、急性リン
パ芽球様白血病患者および慢性リンパ芽球様白血
病患者の両方からの白血病細胞をOKT1および
Ｇ／Ｍ FITCと反応させた後、シトフルオログ
ラフで得た蛍光パターンである。第４図は、ヒト
Ｔ細胞系統をOKT1およびＧ／Ｍ FITCと反応
させた後、シトフルオログラフで得た蛍光パター
ンを示す。第５図は、Ｂ細胞のリンパ芽球様系統
のLaz007をOKT1およびＧ／Ｍ FITCと反応さ
せた後、シトフルトログラフで得た蛍光パターン
を示す。
でOKT1、およびＧ／Ｍ FITCと反応させた後、
シトフルオログラフで得た蛍光パターンを示す。
第２図は、ヒト胸腺細胞をOKT1およびＧ／Ｍ
FITCと反応させた後、シトフルオログラフで得
られた蛍光パターンを示す。第３図は、急性リン
パ芽球様白血病患者および慢性リンパ芽球様白血
病患者の両方からの白血病細胞をOKT1および
Ｇ／Ｍ FITCと反応させた後、シトフルオログ
ラフで得た蛍光パターンである。第４図は、ヒト
Ｔ細胞系統をOKT1およびＧ／Ｍ FITCと反応
させた後、シトフルオログラフで得た蛍光パター
ンを示す。第５図は、Ｂ細胞のリンパ芽球様系統
のLaz007をOKT1およびＧ／Ｍ FITCと反応さ
せた後、シトフルトログラフで得た蛍光パターン
を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトのＴ細胞で前もつて免疫されたマウスか
らの脾細胞とマウスの骨髄腫ラインからの細胞と
の融合により形成されたハイブリドマにより生成
され、 (a) 本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞と反
応するが、正常なヒト末梢Ｂ細胞、無特徴細胞
または大食細胞と反応せず、 (b) 正常ヒト胸腺細胞の約５％〜約10％と反応
し、 (c) Ｔ細胞の慢性リンパ芽球性白血病をもつヒト
からの白血病の細胞と反応するが、Ｔ細胞の急
性リンパ芽球性白血病をもつヒトからの白血病
の細胞と反応せず、そして (d) エプスタイン−バールのウイルス変形したヒ
トＢ細胞ラインと反応しない、 群IgGのモノクローナル抗体。 ２ サブクラスIgG1である特許請求の範囲第１
項記載のモノクローナル抗体。 ３ P3×63AgU1骨髄腫の細胞と、Ｅロゼツト精
製したヒトＴ細胞で前もつて免疫したBalb／cJ
マウスからの脾細胞との融合によつて形成された
ハイブリドマから生成された特許請求の範囲第１
項記載のモノクローナル抗体。 ４ ATCC番号CRL8000の同定特性を有するハ
イブリドマから生成された特許請求の範囲第１項
記載のモノクローナル抗体。 ５ 白血病の細胞をモノクローナル抗体と混合
し、反応が起こるかどうかを観察することからな
り、該モノクローナル抗体は、 (a) 本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞と反
応するが、正常なヒト末梢Ｂ細胞、無特徴細胞
または大食細胞と反応せず、 (b) 正常なヒト胸腺細胞の約５％〜10％と反応
し、 (c) Ｔ細胞の慢性リンパ芽球性白血病をもつヒト
からの白血病の細胞と反応するが、Ｔ細胞の急
性リンパ芽球性白血病をもつヒトからの白血病
の細胞と反応せず、そして (d) エプスタイン−バールのウイルス変形したヒ
トＢ細胞ラインと反応しない、 ものであることを特徴とする、Ｔ細胞急性リンパ
芽球性白血病（Ｔ−ALL）細胞を含む分析試料
とＴ細胞慢性リンパ芽球性白血病（Ｔ−CLL）
細胞を含む分析試料の識別方法。 ６ 該抗体がATCC番号CRL8000の同定特性を
有するハイブリドマから生成したものである特許
請求の範囲第５項記載の方法。 ７ (i) マウスをＥロゼツト陽性の精製したヒト
Ｔ細胞で免疫し、 (ii) 脾臓を該マウスから取り出し、そして脾細胞
の懸濁液をつくり、 (iii) 該脾細胞をマウスの骨髄腫の細胞と融合促進
剤の存在下で融合し、 (iv) 融合した細胞を別のウエルにおいて、未融合
の骨髄腫の細胞を支持しない媒体中で希釈し、
そして培養し、 (v) ハイブリドマを含有する各ウエル中の上澄液
を所望の抗体の存在について評価し、 (vi) 所望の抗体を生成するハイブリドマ類を選び
且つクローン化し、そして (vii) 該クローンの上澄液から抗体を回収する、 ことを特徴とする、 (a) 本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞と反
応するが、正常なヒト末梢Ｂ細胞、無特徴細胞
または大食細胞と反応せず、 (b) 正常なヒト胸腺細胞の約５％〜約10％と反応
し、 (c) Ｔ細胞の慢性リンパ芽球性白血病をもつヒト
からの白血病の細胞と反応するが、Ｔ細胞の急
性リンパ芽球性白血病をもつヒトからの白血病
の細胞と反応せず、そして (d) エプスタイン−バールのウイルス変形したヒ
トＢ細胞ラインと反応しない、 モノクローナル抗体の製造方法。 ８ 該マウスが系統Balf／cJであり、そして該
骨髄腫細胞がP3×63AgU1である特許請求の範囲
第７項記載の方法。 ９ (i) マウスをＥロゼツト陽性の精製したヒト
Ｔ細胞で免疫し、 (ii) 脾臓を該マウスから取り出し、そして脾細胞
の懸濁液をつくり、 (iii) 該脾細胞をマウスの骨髄腫の細胞と融合促進
剤の存在下で融合し、 (iv) 融合した細胞を別のウエルにおいて、未融合
の骨髄腫の細胞を支持しない媒体中で希釈し、
そして培養し、 (v) ハイブリドマを含有する各ウエル中の上澄液
を所望の抗体の存在について評価し、 (vi) 所望の抗体を生成するハイブリドマ類を選び
且つクローン化し、 (vii) 該クローンの上澄液から抗体を回収し、 (viii) 該クローンをマウスの腹膜内に移植し、 (ix) 悪性の腹水または血清を該マウスから収穫す
る、 ことを特徴とする、 (a) 本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞と反
応するが、正常なヒト末梢Ｂ細胞、無特徴細胞
または大食細胞と反応せず、 (b) 正常なヒト胸腺細胞の約５％〜約10％と反応
し、 (c) Ｔ細胞の慢性リンパ芽球性白血病をもつヒト
からの白血病の細胞と反応するが、Ｔ細胞の急
性リンパ芽球性白血病をもつヒトからの白血病
の細胞と反応せず、そして (d) エプスタイン−バールのウイルス変形したヒ
トＢ細胞ラインと反応しない、 モノクローナル抗体の製造方法。 １０ 該マウスが系統Balf／cJであり、そして
該骨髄腫細胞がP3×63AgU1である特許請求の範
囲第９項記載の方法。
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