FI75362B - Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot maenniskans t-celler, medelst en ny hybridcellinje. - Google Patents

Description

*a£&*· kuulutusjulkaisu jWfo [β] (11) UTLÄGQNINGSSKRIFT 7 D 3 6 2 c P -1: .'ti t/.'.:-. Ly (51) Kv.ik 4/lnt.CI4 C 12 N 5/00, 15/00, C 12 P 1/00, A 61 K 39/395

S UO M l-FI N L AN D

(Fl) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 800846 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 19.03-80

Patentti-ja rekisterihallitus (23) Alkupäivä - Giltighetsdag 19.03.80

Patent- och registerstyrelson (41) Tullut julkiseksi-Biivit offentiig 21.09.80 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - 29 02 88

Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad ^ " (86) Kv hakemus - Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus - Begärd prioritet 20.03-79 USA(US) 22132 Toteennäytetty-Styrkt (71) Ortho Pharmaceutical Corporation, U.S. Route 202, Raritan, New Jersey, USA(US) (72) Patrick Chung-Shu Kung, Bridgewater, New Jersey,

Gideon Goldstein, Short Hills, New Jersey, USA(US) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen T-soluille uuden hybridisol ui injan avulla - Förfarande för framställning av en mono-klonal antikropp mot människans T-celler, medelst en ny hybridcel1inje

Keksintö kohdistuu menetelmään ihmisen T-soluille spesifisen vasta-aineen valmistamiseksi. Menetelmässä käytetään hyväksi uutta hybridisolulinjaa, jonka avulla voidaan valmistaa monoklonaalinen ihmisen kaikkien normaalien T-solujen pinnalta löydetylle antigeenille spesifinen vasta-aine. Vasta-ainetta voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin.

Kohler ja Milstein yhdistävät vuonna 1975 hiiren myeloomaso-luja immunisoitujen hiirien pernasoluihin (Nature 256 (1975) 495-497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybri-domien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immuno- 2 75362 logy, volyymi 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et ai., Cell 14 (toukokuuta 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, volyymi 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hvyin, vaikeuksia esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen.

Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybri-domaa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riipuu pääasiassa käytetystä anti-geenilajista ja halutun hybridoman eristämisessä käytetystä selek-tiotekniikasta.

Monoklonaalisia ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81, 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hydridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkor-vasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemo-poieettisista kantasoluista. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvas-ta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologi-

II

3 75362 siin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka T-solut eivät eritä vasta-ainetta elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immuunijärjestelmän toiminnoissa säätelevästi. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita.

Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, mutta kateen-korva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja-", "heikentäjä-" ja "tappaja"-T-soluksi, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232, ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary in Immunobiology", toimittaja 0. Stutman, Plenum Press 1977, volyymi 7, 363-379.

Eri T-solulajien tai alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregulatooristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-so-luista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää täytyy pystyä erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lym-homas", toimittajat S. Thiefelder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al, Britisch Journal of Haematology 38 (1978) 85. Tietyissä tautitilois- 7Γ·362 sa (esim. nuorten nivelreumassa ja tietyissä leukemiamuodoissa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-%-soluista on puutetta, kun taas pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-so-luja esiintyy ylimäärin. Tietyissä leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan. Katso esimerkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", volyymi, 20, Springer-Verlag 1977, 17-24, ja julkaisun sisältämät viitteet.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa ylimäärin esiintyvällä T-solujen alaryhmälle spesifisiä vasta-aineita autoimmuuni-sia tai pahanlaatuisia sairauksia poteville potilaille nämä vaikuttavat sairauden kehitykseen edullisesti. Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyytti-globuliini eli ATG), ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: "Importance of T Cell Monitoring" Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autolo-gisilla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen im-

II

5 7 S 3 6 2 munointia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen, jotka vaikuttavat useisiin antigeenilajeihin, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/106.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaa-lisen vasta-aineen etuja.

Nyt on keksitty uusi hybridoma, joka pystyy tuottamaan uuden monoklonaalisen vasta-aineen, joka on spesifinen käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista löydetylle pinta-antigeenille. Näin muodostunut vasta-aine on mono-spesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien T-solujen pinta-anti-geenideterminantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen T-so-lun antigeenille). Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

Esillä olevasta hybridomasta (0KT1) on talletettu näyte ATCC-talletuslaitokseen, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, maaliskuun 13 päivänä vuonna 1979 ATCC-talletusnumerolla CRL 8000.

Esillä olevalle monoklonaaliselle vasta-aineelle 0KT1 on tunnusomaista, että se 6 75362 a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 5-10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyytte-jä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi kuviossa 4 esitetyllä tavalla ihmisen T-solulinjo-jen HJD-1, CEM ja HSB-2 kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen kanssa.

Vasta-aineen 0KT1 valmistus hybridisolulinjän ATCC CRL 8000 avulla on kuvattu patenttivaatimuksissa 1 ja 2.

Hybridoma valmistettiin pääpiirteittäin Milsteinin ja Kohlerin esittämällä menetelmällä. Tässä immunisoitiin ensin hiiriä normaaleilla E-rosettipositiivisilla ihmisen T-soluilla, ja sen jälkeen immunisoitujen hiirien pernasolut yhdistettiin hiiren myeloomasolu-linjan soluihin, ja viljelmän pintanesteestä erotettiin ne hybrido-mat, jotka tuottivat ihmisen normaaleihin E-rosettipositiivisiin T-soluihin selektiivisesti sitoutuvaa vasta-ainetta. Halutut hybrido-mat kloonattiin ja karakterisoitiin. Tulokseksi saatiin hybridoma, joka tuottaa käytännöllisesti katsoen kaikista normaaleista ihmisen T-soluista löydetylle pinta-antigeenille spesifistä vasta-ainetta (lyhennys OKTl). Tämä vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta se ei reagoi muiden normaalien perifeeristen veren lymfasolujen kanssa. Lisäksi tämän vasta-aineen tunnistama solun pinta-antigeeni on löydetty ainoastaan täysin kehittyneistä tymosyyteistä, ja se puuttuu täydellisesti ainakin 90 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyt-tejä.

Otettaessa huomioon tähän asti esiintyneet vaikeudet ja huonot tulokset käytettäessä pahanlaatuisten tautien solulinjoja antigeeninä on yllättävää, että esillä olevalla menetelmällä saatiin aikaan haluttu hybridoma. On korostettava, että hybridisolujen valmistuksessa esiintyvien arvaamattomien tekijöiden vuoksi ei pystytä tietyllä an-

II

^5362 tigeeni-solu-yhdistelmällä saatujen tulosten perusteella ennustamaan jonkin muun antigeeni-solu-yhdistelmän käyttäytymistä. On nimittäin havaittu, että käytettäessä pahanlaatuisen taudin T-solulinjoja antigeeninä muodostui hybridomeja, jotka eivät tuottaneet haluttua vasta-ainetta. Käytettäessä solujen pinnalta eristettyjä puhdistettuja antigeenejä ei myöskään saatu positiivisia tuloksia.

Hybridooman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus ja karakterisointi on tarkemmin selostettu keksinnön kuvauksessa ja esimerkeissä.

Hybridoaran valmistusmenetelmä koostuu pääpiirteittäin seuraa-vista vaiheista: A. Hiiriä immunisoidaan E-rosettipositiivisilla puhdistetuilla normaaleilla ihmisen T-soluilla. Yleensä naaraspuoliset Balb/cJ-hii-ret on havaittu tähän parhaiten soveltuviksi, mutta myös muiden hii-rikantojen käyttöä voidaan ajatella. Immunisointiaikataulun ja T-so-lupitoisuuden pitäisi olla sellainen, että saadaan käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä splenosyyttejä. Kolme immunisointia n 2 x 10 solulla hiiri/ruiske 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta neljäntoista päivän välein on havaittu tehokkaaksi.

B. Pernat poistetaan immunisoiduista hiiristä, ja valmistetaan pernasuspensio sopivaan väliaineeseen. Sopiva väliainemäärä on yksi millilitra yhtä pernaa kohti. Nämä koemenetelmät ovat sinänsä tunnettuja.

C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään sopivasta solulinjasta saatuihin hiiren myeloomasoluihin sopivan katalysaattorin avulla. Edullinen suhde on noin viisi pernasolua yhtä myeloomasolua kohti.

O

Noin 10 splenosyytille sopiva yhdistämiseen käytetyn väliaineen kokonaistilavuus on noin 0,5-1,0 ml. Monet hiiren myeloomasolulinjät ovat tunnettuja ja saatavissa yleensä akateemisista tutkimuslaitoksista tai erilaisista talletuspankeista, esimerkkinä mainittakoon the Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, Ca. Käytetyn solu-linjan pitäisi edullisesti kuulua ns. lääkeaineille vastustuskykyiseen lajiin, jotta myeloomasolut eivät eläisi selektiivisessä väliaineessa, jossa hybridisolut puolestaan elävät. Yleisimpään lajiin kuuluvat 8-atsaguaniinille vastustuskykyiset solulinjat, joista puuttuu hypoksantiiniguaniinifosforibosyyli-transferaasientsyymi, ja täten tämä laji ei elä HAT-väliaineessa (sisältää hypoksantiinia, amino-pteriiniä ja tymidiiniä). On myös yleensä edullista, että käytetty 8 " 5 3 6 2 myeloomasolulinja kuuluisi ns. "ei-erittävään" lajiin, jolloin se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, mutta myös vasta-aineita tuottavia lajeja voidaan käyttää. Kuitenkin eräissä tapauksissa vasta-aineita tuottavat myeloomasolulin jät voivat olla edullisia. Edullinen solujen yhdistämiseen käytettävä katalysaattori on polyetyleenigly-koli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 1000-4000 (kaupallisesti saatavissa nimikkeellä PEG 100 jne.), mutta myös muita sinänsä tunnettuja yhdistämiskatalysaattoreita voidaan käyttää.

D. Vapaiden pernasolujen, vapaiden myeloomasolujen ja yhdistettyjen solujen seos laimennetaan, ja laimennuksia viljellään erillisillä alustoilla selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat myelooma-solut kuolevat noin yhdessä viikossa. Laimennus voi olla ns. rajattu laimennus, jossa laimennukseen käytetyn nesteen tilavuus on tilastollisesti laskettu niin, että pystytään eristämään haluttu määrä soluja kullekin erilliselle alustalle (esim. mikrotitrauslevyn kuhunkin syvennykseen) . Väliaineena käytetään esim. HAT-väliainetta, jossa lääkeaineille (esim. 8-atsaguaniinille) vastustuskykyinen vapaa myelooma-solulinja ei kasva. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niiden lisääntymiskyky on rajattu. Täten tietyn ajan kuluttua (noin yhdessä viikossa) vapaiden pernasolujen lisääntyminen lakkaa. Yhdistetyt solut sen sijaan lisääntyvät jatkuvasti, koska ne ovat toisaalta peräisin myeloomasoluista, jotka on eristetty pahanlaatuisesta kasvaimesta, ja toisaalta pernasoluista, jotka pystyvät elämään selektiivisessä väliaineessa.

E. Tarkastetaan, löytyykö eri kasvatusalustojen pintanesteestä, joka sisältää hybridoman, E-rosettipositiivisille puhdistetuille ihmisen T-soluille spesifistä vasta-ainetta.

Kun haluttu hybridoma on eristetty ja kloonattu, muodostuvaa vasta-ainetta voidaan tuottaa eri tavoin. Puhtainta monoklonaalista vasta-ainetta saadaan viljelemällä haluttua hybridomaa in vitro sopivassa väliaineessa sopivan pituisen ajan, minkä jälkeen haluttu vasta-aine eristetään pintanesteestä. Sopiva väliaine ja viljelyajan pituus ovat tunnettuja tai ne voidaan helposti määrittää. Tämä in vitro-mene-telmä tuottaa käytännöllisesti katsoen monospesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia spesifisiä immunoglobuliineja. Muita immunoglo-buliineja on mukana pieni määrä, koska väliaine sisältää ksenogeenistä 11 9 75362 seerumia (esim. vasikan sikiöseerumia). Tällä in vitro-menetelmällä ei kuitenkaan saada tiettyihin tarkoituksiin riittävää vasta-ainemäärää tai riittävän suurta vasta-ainepitoisuutta, koska monokloonisen vasta-aineen pitoisuus on vain noin 50 yug/ml.

Haluttaessa valmistaa paljon suurempia pitoisuuksia hieman epä-puhtaampaa monoklonaalista vasta-ainetta haluttu hybridoma voidaan ruiskuttaa hiiriin, edullisesti syngeenisiin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen hiiriin sopivan inkubaatioajän kuluttua, mikä johtaa halutun vasta-aineen pitoisuuden kohoamiseen hiiren veressä (noin 5-20 mg/1) ja peritoneaalisessa tulehdusnesteessä (vesivatsa). Vaikka näiden hiirten veressä ja vesivatsassa on myös tavallisia vasta-aineita, näiden pitoisuus on vain noin 5 % monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuudesta. Koska sitä paitsi nämä tavalliset vasta-aineet eivät ole ihmisen vastaisia spesifisyydeltään, eristetyistä vesivatsoista ja seerumista saatu monoklonaalinen vasta-aine ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan kontaminoivia ihmisen vastaisia immunoglobu-liineja. Tämän monokloonisen vasta-aineen tiitteri on korkea (aktiivinen laimennuksissa 1:30000 ja myös suuremmissa laimennuksissa), ja sen spesifisen ja ei-spesifisen immunoglobuliinin suhde on korkea (noin 1/20). Sellaiset muodostuneet immunoglobuliinit, joiden rakenteessa on kevyitä K-myeloomaketjuja, ovat ei-spesifisiä, ei-vaikutta-via peptidejä, jotka pelkästään laimentavat monokloonista vasta-ainetta vaikuttamatta haitallisesti sen spesifisyyteen.

Esimerkki 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus A. Immunisointi ja somaattinen solujen hybridisointi Naaraspuolisia Balb/cJ-hiiriä (Jackson Laboratories, hiirien n ikä 6-8 viikkoa) immunisoitiin intraperitoneaalisesti 2 x 10' E-posi-tiivisella puhdistetulla T-solulla 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein. Neljän päivän kuluttua kolmannesta iramunisointikerrasta hiiristä poistettiin pernat, ja näistä valmistettiin yhtä solulaatua sisältävä suspensio puristamalla kudos ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan lävitse.

Solujen yhdistäminen suoritettiin Kohlerin ja Milsteinin kehittämällä menetelmällä. 1 x 10^ splenosyyttiä yhdistettiin 0,5 ml:ssa yhdistämisväliainetta, joka koostui 35 %:sta polyetyleeniglykolia 10 75362 (PEG 1000) ja 2 %:sta dimetyylisulfoksidia RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Grand Island, NY), 2 x 10^ P3X63Ag8Ul-myeloomasoluun, jotka toimitti tohtori M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine,

Bronx, NY. Nämä myeloomasolut erittävät IgG^:n K-kevyitä ketjuja.

B. Hybridoman eristys ja kasvatus

Kun solut oli yhdistetty, niitä viljeltiin HAT-väliaineessa (sisälsi hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä) 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä kosteassa atmosfäärissä. Useita viikkoja myöhemmin 40-100 yul viljelmien hybridomapitoista pintaliuosta siirrettiin alustalle, joka sisälsi 10^ perifeeristä lymfosyyttiä, jotka oli jaettu E-rosettipositiivisiin (E+) ja E-rosenttinegatiivisiin (E-) populaatioihin, nämä oli valmistettu terveiden luovuttajien verestä Mendesin kuvaamalla menetelmällä (J. Immunol. Ill (1973) 860). Näihin soluihin sitoutuneet hiiren hybridoman tuottamat vasta-aineet todettiin radioimmunomäärityksellä ja/tai epäsuoralla immunofluoresenssi-menetelmällä. Ensimmäisessä menetelmässä solujen annettiin ensin reagoida 100 yul:n kanssa affiniteettikromatografisesti puhdistettua vuohessa valmistettua 1251 anti-hiiri-IgG-immunglobuliinia (106 cpm//ug, 500 yug/yul) . Z?odin liittämisen immuoglobuliiniin ovat yksityiskohtaisesti kuvanneet Kung et ai., J. Biol. Chem. 251 (1976) 23927. Vaihtoehtoisesti viljelmien pintaliuoksilla inkuboidut solut värjättiin fluoresiinilla käsitellyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA, F/p = 2,5), ja fluoresoivat vasta-aineella värjätyt solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograafilia FC200/4800A (Ortho Instruments, Westwood, MA) esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Hybridomaviljelmät, jotka sisälsivät spesifisesti E+-lymfosyyttien (T-solujen) kanssa reagoivia vasta-aineita, eristettiin ja kloonattiin. Sen jälkeen kloonit siirrettiin mtraperitoneaalisesti ruiskuttamalla 1 x 10 tietyn kloonin solua (0,2 ml:n tilavuudessa) Balb/cJ-hiiriin, jotka oli esikäsitelty 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaanilla, jota toimittaa Aldrich Chemical Company kauppanimellä "Pristine". Näiden hiirien pahanlaatuisia vesivatsoja käytettiin sen jälkeen lymfosyyttien karakterisoimiseen esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Hybridivasta-aineen OKTl todettiin standardimenetelmillä kuuluvan IgG^-alaluokkaan.

Il 11 7 5 3 6 2

Esimerkki 2 OKTl-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen

Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointimenetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH) Boymin esittämällä tavalla, Scand. J. Glin. Lab. Invest. 21 (suppl. 97) 1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig- (T- ja nollasolu) populaatioiksi käyttämällä Sepahdex G-200 anti-F(ab')2-pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974) 1113. T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig“-populaa-tio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clrlla (10 ml 108 solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2-%:isesti EAC-rosetti-positiivinen ja >95-%risesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig” (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli >5-%:isesti E-positiivinen ja <2-%:isesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylvästä eluoimalla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%:isesti pinta-Ig-positiivinen ja <5-%:isesti E-positiivinen.

Normaalit ihmisen makrofagit erotettiin yksitumaisesta populaatiosta kiinnittämällä ne polystyreeniin. Tällöin yksitumaiset solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen viljelyväliaineeseen (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES /74-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinipropaanisulfoni-happo7puskuria, 200 mM L-glutamiinia ja penisilliini-streptomysiiniä sekä 20 % kuumentamalla inaktivoitua ihmisen AB-seerumia) solujen määrän ollessa 2 x 108 solua, ja niitä inkuboitiin muovisissa petri-maljoissa (100 x 200 mm) (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon, Exnard, CA) 37°C:ssa yön yli. Petrimaljat pestiin huolellisesti kiinnitty-mättömien solujen poistamiseksi, ja muoviin kiinnittynyt populaatio irrotettiin pesemällä voimakkaasti kylmällä 2,5 mM EDTArta sisältävällä liuoksella, jossa ei ollut seerumia, ja silloin tällöin raapimalla petrimaljaa kertakäyttöisen injektioruiskun kumikärjellä. Yli 7 5 3 6 2 12 85 % solupopulaatiosta pystyi käyttämään ravinnokseen lateksihiukka-sia, ja Wright-Giemsa-värjäyksellä niillä havaittiin morfologisesti olevan monosyyttien tunnusmerkit.

B. Normaali kateenkorva

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199 (Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiöseerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla, ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja ^90-%:ises-ti E-rosettipositiivisia.

C. Solulinjat

Neljästä terveestä yksilöstä saatuja Epstein-Barr-viruksella (EBV) transformoituja B-solulinjoja valmistettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla. T-solulinjat CEM, HSB-2 ja HJD-1 toimitti tohtori H. Lazarus, Sideny Farber Cancer Insitute, Boston, MA.

D. T-solujen akuutin lymfoblastileukemian (T-ALL) solut ja T-solujen kroonisen lymfaattisen leukemian (T-CLL) solut

Leukemiasolut saatiin kahdeltatoista akuuttia lymfoblastileuke-miaa sairastavalta potilaalta. Näiden yksilöiden solujen oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu kuuluvan T-soluihin, koska solut muodostivat spontaanisesti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (>20% E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten heteroanti-seerumien, anti-HTL (anti-B.K.)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten Schlossman et ai. ovat aikaisemmin kuvanneet, Proc. Nat. Acad. Sei.

73 (1976) 1288. Kolmen yksilön kasvainsolut reagoivat aktiivisesti (TH2+) kaniinin ja/tai hevosen anti-TI^n kanssa, mutta yhdeksän muun yksilön solut eivät näiden kanssa reagoineet. Käytettiin myös leuke-miasoluja, jotka oli saatu kahdelta TH2~-T-CLL-leukemiaa sairastavalta potilaalta. Sekä akuutin että kroonisen T-solujen leukemian soluja kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:ises-sa dimetyylisulfoksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumissa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Analysoidut kasvainpopulaatiot

II

13 -362 olivat >90-%risesti blasteja Wright-Giemsa-morofologialtaan kaikissa tapauksissa.

Esimerkki 3

Solufluorograafinen analyysi ja solujen erotus

Kaikkien solupopulaatioiden solufluorograafinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgGrllä (G/M FITC) (Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solu-fluorografiaa PFC200/4800A) (Ortho Instruments). Tällöin 1-2 x 106 solua käsiteltiin 0,15 ml :11a vasta-ainetta OKTl laimennuksen ollessa 1:1000, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentri-fugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograafilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennukselle 1:30000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml :11a suhteessa 1:1000 laimennettua vesivatsanes-tettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuottavalla hybridi-kloonilla immunisoidusta BAlb/cJ-hiirestä.

Kokeissa, joiden tarkoituksena oli erottaa 0KT1+- ja OKTl~-solut toisistaan, 100 x 10^ fraktioimatonta yksitumaista solua tai tymo-syyttia merkittiin 4 ml:11a suhteessa 1:1000 laimennettua vasta-ainetta OKTl ja kehitetitin G/M FITCrllä. Samanlaista värjäysmenetelmää käytettiin ihmisen T-solujen preparoinnissa, jotka oli eristetty esimerkissä IA kuvatulla tavalla. Käyttämällä fluoresenssiaktivointiin perustuvaa solulajittelijaa (FACS-1) (Becton-Dickinson, Mountain Wiew, CA) lymfosyytit jaettiin 0KT1+- ja OKTl”-populaatioiksi ja/tai T-solut fraktioitiin heikosti reagoiviksi OKTl+-T-soluiksi (fluoresenssi alle 20 %) ja voimakkaasti reaktiivisiksi OKTl+-soluiksi (fluoresenssi yli 20 %). Lajien elinkykyisyys oli >95 % Trypan-sini-sellä määritettynä kaikissa tapauksissa. Kaikkien erotettujen populaatioiden puhtausaste oli >95 %.

14

Esimerkki 4

Solujen toiminnan tutkiminen

Fraktioimattomien ja FACS:illa fraktioitujen lymfasolujen mi-togeenista vastetta tutkittiin mikroviljelmässä optimaalisilla annoksilla Concanavalin A:ta (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) ja fyto-hemaqlutiinia (PHA) Chessin et ai. kuvaamalla menetelmällä. Allo-antigeeninen proliferatiivinen vaste määritettiin samanaikaisesti näille samoille populaatioille käyttäen stimulanttina mitomysiinillä käsiteltyä Laz 156:a, EBVrllä transformoitua ihmisen B-lymfoblastodi-solulinjaa, jonka oli toimittanut tohtori H. Lazarus. Proliferaatio tetanus-toksoidin läsnäollessa (Massachusetts Department of Public Healt Biological Laboratories, Boston, MA) testattiin Evansin et ai. kuvaamalla menetelmällä (J. Immunol. 129 (1978) 1423) käyttämällä loppukonsentraatiota 10/um/ml. 5 % edellä kuvatulla menetelmällä saatuja makrofageja lisättiin kaikkiin polylaatioihin aloitettaessa kasvattaa in vitro-viljelmiä. Mitogeenilla stimuloituja viljelmiä käsiteltiin neljän päivän kuluttua 0,2 yuCirlla tritioitua tymidiiniä (ominaisaktiivisuus 1,9 Ci/mM, Schwartz-Mann Division of Becton-Dickinson, Orangeburg, NY), ja tuotteet erotettiin 18 tunnin kuluttua MASH II-laitteistolla (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Tritioidun tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin Packard-tuike-laskurilla (Packard Instrument Company, Downer'a Grove, IL). Taustan tritioidun tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin korvaamalla mito-geeni väliaineella. Tetanus-toksoidilla ja alloantigeenilla stimuloidut viljelmät käsiteltiin viiden päivän kuluttua tritioidulla tymi-diinillä 18 tunnin ajan, tuotteet erotettiin, ja aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri solupopulaatioille, joiden on annettu reagoida OKTl:n (laimennus 1:1000) ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 2 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri ihmisen tymosyyteille, joiden on annettu reagoida 0KTl:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 3 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri sekä akuuttia lymfoblastileukemiaa että kroonista lymfoblas-tileukemiaa sairastavista potilaista saaduille leukemiasoluille, joiden on annettu reagoida 0KTl:n ja G/M FITC:n kanssa.

Il 15 ’<62

Kuviossa 4 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri ihmisen T-solulinjoille, joiden on annettu reagoida OKTl:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 5 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssi-spektri B-lymfoblastoidisolulinjalle Laz 007, jonka on annettu reagoida 0KTl:n ja G/M FITC:n kanssa.

Hybridoma ja sen tuottama monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin ja karakterisoitiin edellä esitettyjen esimerkkien mukaan. Vaikka suuri määrä kyseistä vasta-ainetta valmistettiin ruiskuttamalla kyseistä hybridomaa intraperitoneaalisesti hiiriin ja erottamalla eläimistä pahanlaatuiset vesivatsat, on selvästi mahdollista, että hybridoomaa voidaan viljellä myös alalla hyvin tunnetuilla in vitro-menetelmillä, jolloin vasta-aine eristetään viljelmien pintanesteestä.

Kuten kuviosta 1 ilmenee, normaalin ihmisen kaikki perifeeriset T-verisolut reagoivat 0KTl:n kanssa, mutta samasta yksilöstä eristetyt B-solut, nollasolut ja makrofagit eivät reagoi lainkaan OKTl:n kanssa. Samanlaiset tulokset saatiin viidestätoista muusta normaalista yksilöstä eristetyille lymfosyyttipopulaatioille. Monoklonaaliselle vasta-aineelle on siten tunnusomaista, että se reagoi käytännöllisesti kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen pinnalta löydetyn antigeenin kanssa, mutta se ei reagoi kolmen muun mainitun solu-tyypin minkään pinta-antigeenin kanssa. Tätä reaktiivisuuseroa voidaan käyttää kyseisen vasta-aineen OKTl toteamiseen ja erottamaan se muista vasta-aineista.

Kuviosta 2 ilmenee, että suurin osa kuuden kuukauden ikäisen lapsen normaaleista tymosyyteistä ei reagoi lainkaan OKTl:n kanssa, jolloin vain 5-10 % tymosyyteistä on reaktiivisia. Tästä voidaan vetää se johtopäätös, että siinä erilaistumisprosessissa, jossa kanta-solut kehittyvät kypsiksi T-soluiksi, tymosyytit saavat jossakin vaiheessa saman pinta-antigeenin, joka on löydetty T-soluista ja joka reagoi OKTl:n kanssa. On todennäköistä, että siinä tymosyyttejä esiintyy myöhemmissä erilaistumisvaiheissa juuri ennen kuin ne irtoavat kateenkorvasta verenkiertoon. Samanlaisia tuloksia (5-10 % aktiivisuus) saatiin käytettäessä kuutta muuta kateenkorvanäytettä, jotka oli saatu normaaleista yksilöistä, joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 19 vuoteen. Kuvion 2 reaktiivisuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta kyseinen vasta-aine OKTl ja erottaa se muista vasta-aineista .

__ - V

16 η ί 3 6 2

Kuviosta 3 ilmenee, että akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolut eivät reagoineet OKTl:n kanssa, mutta kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolut reagoivat. Kyseisen vasta-aineen avulla on siten mahdollista erottaa nämä kaksi leukemiamuotoa toisistaan. Koska näitä leukemiamuotoja on tietyissä vaiheissa vaikeaa erottaa toisistaan ja koska niiden prognoosi ja hoitomenetelmät eroavat olennaisesti, on selvää, että tämä yksinkertainen menetelmä näiden kahden leukemiamuodon erottamiseksi esillä olevaa vasta-ainetta käyttäen on merkittävä edistysaskel.

Esillä olevaa vasta-ainetta 0KT1 voidaan edelleen karakterisoida sen perusteella, miten se reagoi erilaisten ihmisten T-solulinjo-jen kanssa, tätä on havainnollistettu kuviossa 4. Kuviosta nähdään, että kyseisen antigeenin reaktiivisuus ihmisen T-solulinjojen kanssa vaihteli, solulinjan HJD-1 kanssa reaktio oli voimakas, solulinjan CEM kanssa lievä ja solulinjan HSB-2 kanssa reaktiota ei tapahtunut lainkaan. Tämän erilaisen reaktiivisuuden avulla on myös mahdollista karakterisoida 0KT1.

Kuviosta 5 nähdään, että 0KT1 ei reagoi ihmisen B-solulinjan Laz 007 kanssa. Samalla tavalla käyttäytyivät myös muut tutkitut EBV:llä transformoidut B-solulinjät. Tämä tukee edelleen sitä käsitystä, että OKT1 ei reagoi normaalin yksilön perifeerisen veren B-solujen kanssa, ja myös tällä tavalla on mahdollista karakterisoida OKTl ja erottaa se muista vasta-aineista.

Kyseisen vasta-aineen toimintaa tutkittiin lymfoidipopulaatioil-la, jotka oli fraktioitu fluoresenssimittaukseen perustuvalla solujen lajittelijalla (FACS). Tulokset on esitetty taulukossa I-III, jotka tukevat edelleen edellä esitettyjä esillä olevan monoklonaali-sen vasta-aineen karakterisointituloksia.

Taulukosta I ilmenee, että käytännöllisesti katsoen kaikki seka-lymfosyyttiviljelmän (MLC) solut, jotka reagoivat PHA:n, Con A:n, liukoisten antigeenien ja alloantigeenien kanssa, kuuluvat solupopulaatioon, joka reagoi OKTl:n kanssa. Populaatio, joka ei reagoinut OKTl:n kanssa, ei saanut aikaan mitään näistä T-solujen toiminnoista, vähäinen positiivinen reaktio aiheutui mahdollisesti siitä, että populaatio sisälsi epäpuhtauksina OKTl+-soluja. Nämä toimintaa koskevat tutkimukset havainnollistavat edelleen sitä, että OKTl:n kanssa reagoiva antigeeni esiintyy ainoastaan T-soluissa, koska positiivisesti ° T 3 6 2 17 reagoiva populaatio toimii T-solujen tavoin, mutta negatiivisesti reagoivasta populaatiosta ei ole löydetty mitään T-solujen toimintoja. Taulukosta II nähdään, että mitogeenin tai alloantigeenin läsnäollessa FACS:illa fraktioitujen OKTl:n kanssa voimakkaasti reagoivien ja OKTl:n kanssa heikosti reagoivien T-solujen välillä ei ole mitään toiminnallista eroa. Molemmat populaatiot lisääntyivät samalla tavalla kuin fraktioimaton T-solupopulaatio. Taulukosta III voidaan päätellä, että OKTl:n kanssa reagoiva pinta-antigeeni esiintyy ainoastaan täysin kehittyneissä tymosyyteissä, koska koko tymosyyttisarjän aktiivisuus MLC-analyysissä aiheutuu lähes täysin siitä tymosyyttipopulaa-tion osasta, joka reagoi OKTl:n kanssa. Taulukosta III nähdään myös OKTl+-lymfosyyttien ja perifeeristen OKTl+-T-solujen väliset toiminnalliset erot, koska edellinen ei reagoi mitogeenin läsnäollessa.

Kyseisen vasta-aineen 0KT1 havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgGj, IgG2a, IgG2b tai IgG2 tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-ainei-den kanssa.

Kuten edellä on mainittu, esillä olevan vasta-aineen avulla on mahdollista erottaa T-solujen krooninen lymfoblastileukemia T-solujen akuutista lymfoblastileukemiasta, ja sitä voidaan käyttä sellaisten potilaiden hoidossa, joille on suoritettu elinten siirtoja, hylkimis-taipumuksen vähentämiseen tai poistamiseen.

18 " r ‘ 6 9 ο σν ro vo oo ' ' w oo vo ro ro o

O CO O N P

I P <—I

I—I

3 Eh +1+1 +1 +1 +1

<—I t*H

-P o n oo in n r-

β LD LD CN (N LD

-P n ο p η η*

P

Q) <Ti 00 00 CM

> β oo ro vo ro r- (0 oo Ί· ^ oo C o o id in β

•P + ΙΟ ι—I CN

£ »H

H Eh +1 +1 +1 +1 +1 0 « •P O h Γ' in rf π ld r~- m oo ro β LD 00 CN ,-H in

<U

•p ro cn oo o +> ro cm n ro

-P P P

So in

M

0 <P +> >1 e <u +> >i cnspop^vom

I—I 'HMIOrHinNlO

I β id -p m ro O in

I E P

I—I β + cn ro ro r—I r-H

Eh +· :β X -H r-l X +1 +1 + 1 +1 +1 HO cn Eh 0 β SO H N Μ Ί1 in ro X ·ΓΟ ^ P (N Γ0 P r-~ r~ X Ή ·· β I Pi -P Γ~ VO ΙΟ 00 ι—I + Λ: β O ro ro ro (Ν β ι—I *Η ι—ι Εη ι—t —ι β Εη β Ο Η

Eh « X cn Cm Ο β +»

Cl) (U ie m ιη η ιο -Ρ cn m LO h ro h cn -h in vo ro h •h β

P E H CM CN N

dl β CD -P +1+1 +1 +1 +1

+1 -H

-P cn CN H 00 H CN

Ρ Ai ro O m cn oo

QJ s O O O'. 00 N

Cu P VO CN CN in

β x -p Ν' ro CN CN

β Ai β H h

•ro -P H

β β o +> « cn

•H

o

•H

+1 -P

X -rl Π3

β P -P

P I O O Φ h cn -p cn β

•P +> Ai -P

β E β O β lp >1 β +> β »H -P cn cn p •p C >1 β ·Ρ ·· :β p < β β co :β β β +) U cn .ρ β < U +) Ρ < ·Ρ β O Κ ι-} 0) 0) CP Ρ] Ai ac+SEH> ιι ly ή ™ 75362 CD O) o o

X X

I m vo m in •H n o in o~ m m tn cm O r^Oi-Hin n n in ex3 ϋη h in m

tn cxj m vc 'T

tn <D +> m in oo rH

p U 3 (0 .-I +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 3 X -H o n .ρω oo o· o oh cm on m m h c tn i o~ m m o > m vo ί <xj ·· o Eh tt oo vn tt vo m m m +i ma;

^ Eh -H H-> TT O O O' O' CN

CD « <D rd mono m vo > O xl > i—i m c <x3 i G lö C cd vo vo m m m vo ro m H Sh +> m m cm m on m m g txj 3 o r'· ro mmm

rH 0) -H i—I

O tn +> o ionin r'· cm oo +i G tn tn (0 (Ö i +i +i +i +i +i +i +i +i c a: <ts eh CD AI io vo in oo h oo m rv •n G a; -P in vt o oo M o o cm p ·· (0 n} o n vo m no m o ro 1—I M £ ^ OE-i-H-h -rr γη σν on ro in m «00 vorHM o h m

H I O > tP MM

H Eh

O G I

a: CD +j + :i0

A! Μ (XJ Ai O' 00 M VO M CO CM VO

3 > g M in^ro^i· in vo o

i-h M o En ttö o n o ov i—i iM

P o +> « M

ix3 t? -M OM nincN m vo n

E-ι Π3 (0 — ·· M

CD e - +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

Sh -h “ U

O 4J Eh >i oo (N n on m ro on on

H -Η3Η+1τΓΜΙΟθη "<T O CM CP

+s +>MfciM<N'rnn oh oo on on

en a; O tD

O (ecnS+Jioior-· >j m m A! sh l \ m in o o o vo n

•H Ph En O tn i—IM M

CD XI

+> tt3 tx3 on o ro cm n in vo oo n g on m vo oh n m n O VO On VO M VO O' h +s HJ+J <n m rj es n m

en cxJ

ns e +i+i +i +i +i +i +i +i

(C3 -H

AI 0+> on cm m m ro in vo o» AI -h p on vo vo vo ononin

(CJ 4JM 'VT o cn n VOCNOM

B X O

M (0 tn onvoin oo on on O Sh i mMon oo O' n

> Cu Eh M

(X3

en I CD CD

tn en I C G

G M +> -H -H

1X3 ε 1X3 tX3 <e3 A >i <XJ G 3 tn m m

G G >i M M

·· :exJ M < tö <C <XJ

M :«X3 rt -H +· +>

Eh tn h-> Vh G < U Sh G CJ Sh X, -Htoo OtCGltl) O K Xl tl) o xi a;+> u en s > u en s: > 7 5 3 6 2 20

Ή CN

α> <d o o 4-)

•H

4-1 O CO N< H H (N 'ί Φ £*1 1—I ι-H CO CO I—!

So 1 CO +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

Γ-H O

Eh 6 n· vo ,h m ui h n o

«>1 rf M ITI ^ (N 4) (N O

O + cm n cn h N (N (N Cn CN O' 00

00 CO CN rH

4-· cn CN

*r4 -P +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 κ4

>1 VO OO CN O r^OCNO

+ tn m co cn ή cn o n1 oo

pH O m t" rH pH

« fi vo m H O 4-)

H

H

+ I

Ο Ή Αί .hm

Ai 4-) E-) :cö 0 CO X -¾

-H EO

3 O—'CCO Γ0 CN O O CO O N* CN

Id 4-> 1-4 CN pH iH CN pH pH

E4 4-1 -.H 00 VO

cd 4j ·.

5 Ή .—. +1 +| +| +| +1 +| +1 +|

H 4-) U

O >hEh Ν' N1 i— vo cordon-

•H ίΗ H CN cn 00 Ν' Γ' Ν' VO VO

4-> cn Pm >1 cn r~-

Ai O 4-1 cd e S Ή VO Ν’ 14 >i\ (1)

Cu V O +) +) cd e o 44 iHOVOin CN 00 Ν' m

44 O pH P' pH

cd +) σν Γ' 6 •H +) +1 +| +| +1 +1 +| +1 +1 0 >1 •h>i m oo m o m vo vo o 44 CO 00 CO in Ν' ΓΗΝ·νΟΟΟ

Ai O O oo

Cd | >4 >i r- co &4 E4

II

dl d)

m I G G

H 44 ·Η Ή ε cd cd cd >1 Cd 0 0

44 td (H 1—I

G >1 -H -H

:cd pH rij Cd Cd

:cd cd -H +J 4J

104) H U G < G U G < H

h ie o Piorcd) Piowd) ^«44 s u λ >

Claims (4)

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen tai makrofagien kanssa, b) reagoi noin 5-10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi vomakkaasti ihmisen T-solulinjan HJD-1 kanssa, lievästi T-solulinjan CEM kanssa, eikä lainkaan T-solulinjan HS3-2 kanssa ja e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen kanssa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8000 i) immunoimalla hiiriä puhdistetuilla E-rosettipositiivisilla ihmisen T-soluilla, ii) poistamalla pernat immunisoiduista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren myeloomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivisille puhdistetuille T-soluille spesifistä vasta-ainetta, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8000, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) viljelemällä hybridoomaa ATCC CRL 3000 sopivassa väiaineessa sa, ja π ^ 3 6 ?

22. U * viii) ottamalla vasta-aine talteen mainitun hybridooman pinta-nesteestä .

2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen tai makrofagien kanssa, b) reagoi noin 5-10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi voimakkaasti ihmisen T-solulinjan HJD-1 kanssa, lievästi T-solulinjan CEH kanssa eikä lainkaan T-solulinjan HSB-2 kanssa, ja e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen kanssa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8000 i) immunoimalla hiiriä puhdistetuilla E-rosettipositiivisilla ihmisen T-soluilla, ii) poistamalla pernat immunisoiduista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren myeloomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivisille puhdistetuille T-so-luille spesifistä vasta-ainetta, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8000, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, ja 11 23 75 3 62 B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) siirtämällä hybridooma ATCC CRL 8000 intraperitoneaa1isesti hiiriin, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen hiirien pahanlaatuisesta vesi-vatsasta tai seerumista. 24

1. Förfarande för framställning av en monoklonal antikropp, som a) reagerar med praktiskt taget alla människans normala perife-ra T-celler, men inte reagerar med människans normala perifera B-celler, nollceller eller makrofager, b) reagerar med cirka 5-10 % av människans normala tymocyter, c) reagerar med leukemiceller frän människor med kronisk lyrafo-blastleukemi i T-cellerna, men inte reagerar med leukemiceller frän människor med akut lymfoblastleukemi i T-cellerna, d) reagerar starkt med människans T-cellinje HJD-1, mättligt med T-cellinjen CEM och inte alls med T-cellinjen HSB-2, och e) inte reagerar med människans B-cellinjer, som transformerats med Epstein-Barr-virus, kännetecknat därav, att förfarandet omfattar de följande stegen: man A) framställer hybridoma ATCC CRL 8000 genom i) immunisering av möss med människans E-rosett-positiva, rena-de T-celler, ii) avlägsning av mjältarna frän de immuniserade mössen och framställning av en mjältcellsuspension, iii) fusionering av nämnda mjältceller med musmyelomaceller i närvaro av en fusionskatalysator, iv) utspädning och odling av de fusionerade cellerna i separata brunnar i ett medium, där fria myelomaceller inte växer, v) evaluering av supernatanten i olika brunnar som innehäller ett hybridoma med avseende pä närvaro av en antikropp mot E-rosett-positiva renade T-celler, vi) väljning och kloning av hybridoma ATCC CRL 8000, som pro-ducerar en antikropp, vilken reagerar med praktiskt taget alla människans normala perifera T-celler, men inte med människans normala perifera B-celler, nollceller eller makrofager, och B) framställer den monoklonala antikroppen genom vii) odling av hybridoma ATCC CRL 8000 i ett lämpligt medium, och viii) tillvaratagande av antikroppen frän supernatanten över nämnda hybridoma. Il