FI75364C - Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp foer maenskliga cytotoxiska och suppressor-t-celler medelst en ny hybridcellinje. - Google Patents

Description

775^71 KUULUTUSJULKAISU

Mfi [Z] (11) UTLÄQGNINQSSKRIFT 75 364 -¾¾ C (45) PaU - _

I u o C .. υ ! J 4 u 0 i i C >w fcj o U Xt, 3 O

(51) Kv.lk.Vlnt.Ct4 C 12 N 5/00, 15/00, C 12 P 1/00, A 61 K 39/395

SUOMI-FINLAND

(Fl) (21) Patenttihakemus-Patentansökning 802917 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 17.09.80

Patentti-ja rekisterihallitus (23) Alkupäivä-Giitighetsdag 17.09.80

Patent- och registerstyrelsen (41) Tullut julkiseksi-Biivit offentiig 19.03.81 (44) Mähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - 2q 02 88

Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad -7 ’ (86) Kv. hakemus - Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus - Begärd prioritet 18.09.79 09.10.79 USA(US) 0766A2, 082515 Toteennäytetty-Styrkt (71) Ortho Pharmaceutical Corporation, U.S. Route 202, Raritan, New Jersey, USA(US) (72) Patrick Chung-Shu Kung, Bridgewater, New Jersey,

Gideon Goldstein, Short Hills, New Jersey, USA(US) (7^) Oy Kolster Ab (5M Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen syto-toksisille ja heikentäjä-T-solui1 le uuden hybridisolulinjan avulla -Förfarande för framställning av en monoklonal antikropp för mänskliga cytotoxiska och suppressor-T-celler medelst en ny hybridcel1inje

Keksintö kohdistuu menetelmään monoklonaalisen, ihmisen normaalien sytotoksisten ja heikentäjä-T-solujen pinnalta löydetylle antigeenille spesifisen vasta-aineen valmistamiseksi. Vasta-aine valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla, ja sitä voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasolu-ja immunisoitujen hiirien pernasoluihin (Nature 256 (1975) 495-497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns."monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hyb-ridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybrido-mien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, 75364 M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et ai., Cell 14 (toukokuuta 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experiment Immunology, 3. painos, volyymi 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybrido-maa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenila-jista ja halutun hybridoman eristyksessä käytetystä selektioteknii-kasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topic in Microbiology and Immunology, volyymi 81, 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä hybridomista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoi-eettisista kantasoluista. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia, soluja nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat immuunijärjestelmän toiminnoissa sää-

II

3 75364 televästi. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita.

Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, mutta kateenkor-va ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat ka-teenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, nämä suhteellisesti ottaen joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232, ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distrinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja 0. Stut-man, Plenum Press 1977, volyymi 7, 363-379.

Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregulatooristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää pystytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Jousnal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lyhmphomas", toimittajat S. Thier-felder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al, British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa kasvaimissa ja agammaglobulinemiassa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuu-nisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agamnaglobulinemiassa tiettyjä 4 75364 "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin.

Tietyissä leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan. Katso esimerkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", volyymi 20, Springer-Verlag 1977, 17-23 ja julkaisun sisältämät viitteet.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immunoglo-buliinia ei muodostu lainkaan, kuuluu ainakin kaksi erilaista tautimuotoa. Muodossa I ylimäärin esiintyvät "heikentä-jä"-T-solut estävät immunoglobuliinin muodostumisen, kun taas muodossa II sama häiriötila aiheutuu siitä, että "aut-taja"-T-soluista on puutetta. Molemmissa tautimuodoissa potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta; B-solujen toiminta on kuitenkin heikentynyt tai "sitä ei auteta", minkä vuoksi immunoglobuliini-tuotanto vähenee huomattavasti tai loppuu kokonaan. Potilaan agammaglobulinemiatyyppi voidaan täten saada selville kokeilla, joissa määritetään, onko heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa ylimäärin esiintyvälle T-solujen alaryhmälle spesifisiä vasta-aineita autoimmuunisia tai pahanlaatuisia sairauksia poteville potilaille nämä vaikuttavat sairauden kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-solusyöpää (tiettyjä ihoimukudoskasvaimia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfo-blastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa auttaja-T-solujen antigeenille spesifisellä vasta-aineella. Autoimmuunisia sairauksia, jotka ovat aiheutuneet ylimäärin esiintyvistä T- s 75364 soluista, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Heikentäjä-T-solujen ylimäärästä aiheutuvia tauteja (esim. pahanlaatuisia tauteja tai tyyppiä I olevaa agammaglobulinemiaa) voidaan hoitaa antamalla potilaalle heikentäjä-T-solujen antigeenin vasta-ainetta.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG), ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring" Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen, jotka vaikuttavat useisiin antigeenilajeihin, joita on löydetty kaikista immunointiin käytetyistä ihmisen T-so-luista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä mene- 6 75364 telmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/106.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-leh-dessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

Erästä tunnetuilla antiseerumilla identifioitua Τ'-solujen alaryhmää nimitetään TH2+-alaryhmäksi, ja sen on havaittu sisältävän sekä soluvälitteisessä lymfolyysissä tarvittavia sytotoksisia efektorisoluja että immunoregulato-risia heikentäjä-T-soluja, jotka heikentävät sekä T-solujen että B-solujen toimintaa. Tämä alaryhmä sisältää noin 20...30 % ihmisen perifeerisistä T-soluista. Katso esim.

E.L. Reinherz, et ai., V. Immunol. 123 (1979) 83 ja New Engl. V. Med. 300 (1979) 1061.

Nyt on keksitty uusi hybridoma (nimeltään OKT5), joka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen ihmisen normaaleista perifeerisistä sytotok-sisista ja heikentäjä-TH2+“T-soluista (noin 20 % ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista) löydetylle pinta-antigeenille. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien sytotoksisten ja heikentä jä-TH2+-solujen pinta-antigeenideterminantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen sytötoksien tai heikentäjä-T-solun anti- li 7 75364 geenille). Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

Sekä esillä olevaa hybridomaa että muodostunutta vasta-ainetta nimitetään tästä lähtien "0KT5":ksi; asiayhteydestä selviää, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan.

Esillä oleva hybridoma 0KT5 on talletettu laitokseen "The American Type Culture Collection", 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18.9.1979 ja 28.9.1979, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8013 ja CRL 8016.

Vasta-aineelle OKT5 on tunnusomaista, että se a) reagoi yli 90 %:n kanssa sytotoksisia ja heikentä-jä-TH2+-soluja (joita on 20-30 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista), mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makro-fagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymo-syyttejä, c) ei reagoi TH2~-T-solujen eikä OKT4+-T-solujen kanssa, mutta reagoi 68 %:n kanssa OKT4“-T-soluja, d) määrittelee T-solupopulaation (OKT5+), joka on voimakkaasti sytotoksinen ja jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä, normaaleina pitoisuuksina kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja normaalia suurempina pitoisuuksina tyyppiä I olevassa agammaglobulinemiassa ja akuutissa mononukleoosi-infektiossa.

Vasta-aineen OKT5 valmistus uuden hybridisolulinjän ATCC CRL 8016 avulla on kuvattu patenttivaatimuksissa 1 ja 2. Hybridoma valmistettiin pääpiirteittäin Milsteinin ja Kohlerin esittämällä menetelmällä. Tässä immunoitiin ensin 8 75364 hiiriä normaalilla ihmisen tymosyyteillä, ja sen jälkeen im-munoitujen hiirien pernasolut yhdistettiin hiiren myelooma-solulinjan soluihin, ja viljelmän pintanesteestä seulottiin ne hybridomat, jotka tuottivat ihmisen normaaleihin E-ro-settipositiivisiin T-soluihin selektiivisesti sitoutuvaa vasta-ainetta. Halutut hybridomat kloonattiin ja karakterisoitiin. Tulokseksi saatiin hybridoma, joka tuottaa normaaleista ihmisen sytotoksisista ja heikentäjä-TH2+-T-so-luista löydetylle pinta-antigeenille spesifistä vasta-ainetta (nimitys 0KT5). Tämä vasta-aine reagoi ihmisen normaalien perifeeristen sytotoksisten ja heikentäjä-TH2+-T-solu-jen kanssa, mutta se ei reagoi muiden normaalien perifeeristen veren lymfasolujen kanssa, mukaan luettuna auttaja-T-solut. Lisäksi tämän vasta-aineen tunnistama solun pinta-antigeeni on löydetty noin 80 %:lta ihmisen normaaleja tymo-syyttejä.

Otettaessa huomioon tähän asti esiintyneet vaikeudet ja huonot tulokset käytettäessä pahanlaatuisten tautien so-lulinjoja antigeeninä on yllättävää, että esillä olevalla menetelmällä saatiin aikaan haluttu hybridoma. On korostettava, että hybridisolujen valmistuksessa esiintyvien arvaamattomien tekijöiden vuoksi ei pystytä tietyllä antigeeni-solu-yhdistelmällä saatujen tulosten perusteella ennustamaan jonkin muun antigeeni-solu-yhdistelmän käyttäytymistä. On nimittäin havaittu, että käytettäessä pahanlaatuisen taudin T-solulinjoja antigeeninä muodostui hybridomeja, jotka eivät tuottaneet haluttua vasta-ainetta. Käytettäessä solujen pinnalta eristettyjä puhdistettuja antigeenejä ei myöskään saatu positiivisia tuloksia.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus ja karakterisointi on tarkemmin selostettu keksinnön kuvauksessa ja esimerkeissä.

Hybridoman valmistusmenetelmä koostuu pääpiirteittäin seuraavista vaiheista:

II

9 75364 A. Hiiriä immunoidaan normaaleilla ihmisen tymosyy-teillä. Yleensä naaraspuoliset CAF-hiiret on havaittu tähän parhaiten soveltuviksi, mutta myös muiden hiirikantojen käyttöä voidaan ajatella. Immunointiaikataulun ja T-solupi-toisuuden pitäisi olla sellainen, että saadaan käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä splenosyyttejä. Koi- •7 me immunointia 2 x 10 solulla/hiiri/ruiske 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta neljäntoista päivän välein on havaittu tehokkaaksi.

B. Pernat poistetaan immunoiduista hiiristä, ja valmistetaan pernasuspensio sopivaan väliaineeseen. Sopiva vä-liainemäärä on yksi millilitra yhtä pernaa kohti. Nämä koemenetelmät ovat sinänsä tunnettuja.

C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään sopivasta solu-linjasta saatuihin hiiren myeloomasoluihin sopivan katalysaattorin avulla. Edullinen suhde on noin viisi pernasolua

O

yhtä myeloomasolua kohti. Noin 10 splenosyytille sopiva yhdistämiseen käytetyn väliaineen kokonaistilavuus on noin 0,5-1,0 ml. Monet hiiren myeloomasolulinjät ovat tunnettuja ja saatavissa yleensä akateemisista tutkimuslaitoksista tai erilaisista talletuspankeista, esimerkkinä mainittakoon the Salk Institue Cell Distribution Center, La Jolla, Ca. Käytetyn solulinjan pitäisi edullisesti kuulua ns. lääkeaineille vastustuskykyiseen lajiin, jotta myeloomasolut eivät eläisi selektiivisessä väliaineessa, jossa hybridisolut puolestaan elävät. Yleisimpään lajiin kuuluvat 8-atsaguanii-nille vastustuskykyiset solulinjat, joista puuttuu hypoksan-tiiniguaniinifosforibosyyli-transferaasientsyymi, ja täten tämä laji ei elä HAT-väliaineessa (sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä). On myös yleensä edullista, että käytetty myeloomasolulinja kuuluisi ns. "ei-erittävään" lajiin, jolloin se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, mutta myös vasta-aineita tuottavia lajeja voidaan käyttää. Kuitenkin eräissä tapauksissa vasta-aineita tuottavat myeloomasolulin jät voivat olla edullisia. Edullinen solujen yh- 10 75364 distämiseen käytettävä katalysaattori on polyetyleeniglyko-li, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 1000-4000 (kaupallisesti saatavissa nimikkeellä PEG 100 jne.), mutta myös muita sinänsä tunnettuja yhdistämiskatalysaattoreita voidaan käyttää.

D. Vapaiden pernasolujen, vapaiden myeloomasolujen ja yhdistettyjen solujen seos laimennetaan, ja laimennuksia viljellään erillisillä alustoilla selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut kuolevat noin yhdessä viikossa. Laimennus voi olla ns. rajattu laimennus, jossa laimennukseen käytetyn nesteen tilavuus on tilastollisesti laskettu niin, että pystytään eristämään haluttu määrä soluja kullekin erilliselle alustalle (esim. mikrotitrauslevyn kuhunkin syvennykseen). Väliaineena käytetään esim. HAT-väliainetta, jossa lääkeaineille (esim. 8-atsaguaniinille) vastustuskykyinen vapaa myeloomasolulinja tuhoutuu. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niiden lisään-tymiskyky on rajattu. Täten tietyn ajan kuluttua (noin yhdessä viikossa) vapaiden pernasolujen lisääntyminen lakkaa. Yhdistetyt solut sen sijaan lisääntyvät jatkuvasti, koska ne ovat toisaalta peräisin myeloomasoluista, jotka ovat peräisin pahanlaatuisesta kasvaimesta, ja toisaalta pernasoluista, jotka pystyvät elämään selektiivisessä väliaineessa.

E. Tarkastetaan, löytyykö eri kasvatusalustojen pinta-nesteestä, joka sisältää hybridoman, E-rosettipositiivisille puhdistetuille ihmisen T-soluille spesifistä vasta-ainetta.

F. Valitaan (esim. rajaavalla laimennuksella) ja kloonataan hybridomat, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta.

Kun haluttu hybridoma on valittu ja kloonattu, muodostuvaa vasta-ainetta voidaan tuottaa eri tavoin. Puhtainta monoklonaalista vasta-ainetta saadaan viljelemällä haluttua hybridomaa in vitro sopivassa väliaineessa sopivan pituisen ajan, minkä jälkeen haluttu vasta-aine otetaan talteen pintanesteestä. Sopiva väliaine ja viljelyäjän pituus ovat tunnettuja tai ne voidaan helposti määrittää. Tämä in

II

75364 vitro-menetelmä tuottaa käytännöllisesti katsoen monospe-sifistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia spesifisiä immunoglobuliineja. Muita immunoglobuliineja on mukana pieni määrä, koska väliaine sisältää ksenogeenistä seerumia (esim. vasikan sikiöseerumia). Tällä in vitro-menetelmällä ei kuitenkaan saada tiettyihin tarkoituksiin riittävää vasta-ainemäärää tai riittävän suurta vasta-ainepitoisuutta, koska monokloonisen vasta-aineen pitoisuus on vain noin 50 yum/ml.

Haluttaessa valmistaa paljon suurempia pitoisuuksia hieman epäpuhtaampaa monoklonaalista vasta-ainetta haluttu hybridoma voidaan ruiskuttaa hiiriin, edullisesti syngeeni-siin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen hiiriin sopivan inkubaatioajan kuluttua, mikä johtaa halutun vasta-aineen pitoisuuden kohoamiseen hiiren veressä (noin 5-20 mg/1) ja peritoneaalisessa tulehdusnesteessä (vesivatsa). Vaikka näiden hiirten veressä ja vesivatsassa on myös tavallisia vasta-aineita, näiden pitoisuus on vain noin 5 % mono-klonaalisen vasta-aineen pitoisuudesta. Koska sitä paitsi nämä tavalliset vasta-aineet eivät ole ihmisen vastaisia spesifisyydeltään, eristetyistä vesivatsoista ja seerumista saatu monoklonaalinen vasta-aine ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan kontaminoivia ihmisen vastaisia immunoglobuliine ja . Tämän monoklonaalisen vasta-aineen tiitteri on korkea (aktiivinen laimennuksissa 1:50 000 ja myös suuremmissa laimennuksissa), ja sen spesifisen ja ei-spesifisen immunoglobuliinin suhde on korkea (noin 1/20). Sellaiset muodostuneet immunoglobuliinit, joiden rakenteessa on kevyitä K-myeloomaketjuja, ovat ei-spesifisiä, ei-vaikuttavia peptidejä, jotka pelkästään laimentavat monokloonista vasta-ainetta vaikuttamatta haitallisesti sen spesifisyyteen.

12 75364

Esimerkki 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus A. Immunointi ja somaattinen solujen hybridisointi

Naaraspuolisia CAF-hiiriä (Jackson Laboratories, hiirien ikä 6-8 viikkoa) immunoitiin intraperitoneaalisesti 2 x 107 E-positiivisella puhdistetulla T-solulla 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein. Neljän päivän kuluttua kolmannesta immunisointikerrasta hiiristä poistettiin pernat, ja näistä valmistettiin yhtä solu-laatua sisältävä suspensio puristamalla kudos ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan lävitse.

Solujen yhdistäminen suoritettiin Kohlerin ja

O

Milsteinin kehittämällä menetelmällä. 1 x 10 splenosyyttiä yhdistettiin 0,5 ml:ssa yhdistämisväliainetta, joka koostui 35 %:sta polyetyleeniglykolia (PEG 1000) ja 2 %:sta dimetyy-lisulfoksidia RPMI-1640-väliaineessa (Gibco, Grand Island, NY), 2 x 107 P3X63Ag8Ul-myeloomasoluun, jotka toimitti tohtori M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Nämä myeloomasolut erittävät IgG^:n K-kevyitä ketjuja.

B. Hybridoman valinta ja kasvatus

Kun solut oli yhdistetty, niitä viljeltiin HAT-väli-aineessa (sisälsi hypoksantiinia, aminipteriiniä ja tymidii-niä) 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä kosteassa atmosfäärissä. Useita viikkoja myöhemmin 40-100 ^il viljelmien hybridomapitoista pintaliuosta siirrettiin alustalle, joka sisälsi 10^ perifeeristä lymfosyyttiä, jotka oli jaettu E-rosettipositiivisiin (E+) ja E-rosettinegatiivisiin (E“) populaatioihin, nämä oli valmistettu terveiden luovuttajien verestä Mendesin kuvaamalla menetelmällä (J. Immunol. Ill (1973) 860). Näihin soluihin sitoutuneet hiiren hybridoman tuottamat vasta-aineet todettiin epäsuoralla immunofluore-senssimenetelmällä. Viljelmien pintaliuoksissa inkuboidut solut värjättiin fluoresiinilla käsitellyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA F/p =2,5) ja fluoresoivat vasta-aineella värjätyt solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograafilla

II

75364 FC200/4800A (Ortho Instruments, Westwood, MA) esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Hybridomaviljelmät, jotka sisälsivät spesifisesti E+-lymfosyyttien (T-solujen) kanssa reagoivia vasta-aineita, valittiin ja kloonattiin kahdesti rajäävillä laimennusmenetelmillä syöjäsolujen läsnäollessa.

Sen jälkeen kloonit siirrettiin intraperitoneaalises- 7 ti ruiskuttamalla 1 x 10 tietyn kloonin solua (0,2 ml:n tilavuudessa) CAF-^-hiiriin, jotka oli esikäsitelty 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaanilla, jota toimittaa Aldrich Chemical Company kauppanimellä "Pristine". Näiden hiirien pahanlaatuisia vesivatsoja käytettiin sen jälkeen lymfosyyttien karakterisoimiseen esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Hybri-divasta-aineen OKT5 todettiin standardimenetelmillä kuuluvan IgG-^-alaluokkaan.

Esimerkki 2 0KT5-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen

Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointimene-telmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Pisvataway, NH) Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotet tiin pinta-Ig+ (B)“) ja pinta-Ig- (T- ja nollasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2-pylväs-kromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974) 1113. T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig"-kanta 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Ro-setoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clilla

O

(10 ml 10 solu kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2 %:isesti EAC-rosettipositiivinen ja >95 %:isesti E-ro-settipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig“ (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio 14 75364 oli <5 % risesti E-positiivinen ja <2 % risesti slg-positii-vinen. Pinta-Ig+ (B)-populaatio erotettiin Sepahdex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95 %risesti pinta-Ig-positiivinen ja <5 %risesti E-positiivinen.

Normaalit ihmisen makrofagit erotettiin yksitumaisesta populaatiosta kiinnittämällä ne polystyreeniin. Tällöin yksitumaiset solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen vil-jelyväliaineeseen (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES £4-(2-hydroksi-etyyli)-l-piperatsiinipropaanisulfonihappo7-puskuria, 200 mM L-glutamiinia ja penisilliinistreptomysiiniä sekä 20 % kuumentamalla inaktivoitua ihmisen AB-seerumia) solujen määrän ollessa 2 x 10® solua, ja niitä inkuboitiin muovisissa petrimaljoissa (100 x 20 mm) (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon, Exnard, CA) 37°Crssa yön yli. Petrimaljat pestiin huolellisesti kiinnittymättömien solujen poistamiseksi, ja muoviin kiinnittynyt populaatio irrotettiin pesemällä voimakkaasti kylmällä 2,5 mM EDTArta sisältävällä liuoksella, jossa ei ollut seerumia, ja silloin tällöin raapimalla petrimal jaa kertakäyttöisen injektioruiskun kumikärjellä.

Yli 85 % solukannasta pystyi käyttämään ravinnokseen lateksihiukkasia, ja Wright-Giemsa-värjäyksellä niillä havaittiin morfologisesti olevan monosyyttien tunnusmerkit.

B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gib-co)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiöseerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla, ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi solut sen-trifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%risesti elinkykyisiä ja >90-%risesti E-rosettipositii-visia.

15 75364 C. Solulinja

Terveestä yksilöstä saatu Epstein-Barr-viruksella (EBV) transformoitu B-solulinja (Laz 156) saatiin tohtori H.Lazarukselta, Sidney Farber Institute, Boston, MA.

Esimerkki 3

Solufluorograafinen analyysi ja solujen erotus

Kaikkien solupopulaatioiden ja monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiotuotteiden solufluorograafinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetel-mällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG: llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories) , analyysiin käytettiin solufluorograaf ia FC200/ 4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1-2 x 106 solua käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograafilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssikorkeusanaly-saattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:11a suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsa-nestettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuot-tavalla hybridikloonilla immunoidusta CAF^-hiirestä. Lymfoidipopulaatioiden reaktiivisuus hevosen anti-TH2:n ja hevosen normaalin IgG:n kanssa määritettiin edellä esitetyllä tavalla (Reinherz et ai.).

Kokeissa, joiden tarkoituksena oli erottaa T-solu- g jen alaryhmät toisistaan, 100 x 10 fraktioimatonta T-so-lua merkittiin 4 ml:11a suhteessa 1:500 laimennettua vasta-ainetta 0KT4 tai OKT5 ja kehitettiin G/M FITC:llä. OKT4:n oli aikaisemmin havaittu reagoivan spesifisesti 55-60 %:n kanssa perifeerisiä veren T-lymfosyyttejä, mikä ryhmä edus- 16 75364 taa ihmisen auttaja-T-soluja. Käyttämällä fluoresenssi-aktivaatioon perustuvaa solulajittelijaa (FACS-1) (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) samasta yksilöstä saadut T-solut jaettiin 0KT4+ - ja 0KT4 -populaatioiksi sekä 0KT5+-ja 0KT5 -populaatioiksi. Lajien elinkykyisyys oli >95 % Trypan-sinisellä määritettynä kaikissa tapauksissa. Kaikkien erotettujen populaatioiden puhtausaste oli ^95 %.

Esimerkki 4 T-solujen alaryhmien analysoiminen hevosen anti- TH2:lla

Esimerkin 3 mukaisesti hevosen anti-TH9:ta käytet-tiin erottamaan TH2 - ja TH2 -solut toisistaan FACSrilla, jolloin 60 x 10^ fraktioimatonta T-solua merkittiin 0,12 ml:11a hevosen anti-TH2 ja 0,1 ml:11a R/H FITC (Cappel Laboratories, Downington, PA) Reinherzin et ai. kuvaamalla tavalla. Lajiteltujen solujen puhtaus ja elinky-kyisyys oli samanlainen kuin edellä kuvattujen lajiteltujen populaatioiden. FACS:illa lajiteltuja T-solujakeita, jotka oli eristetty hevosen anti~TH2:11a, OKT4:llä tai OKT5:llä, viljeltiin 48 tuntia 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02, väliaineessa RPMI 1640, joka sisälsi 20 % ihmisen AB-seerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-pusku-ria (Microbiological Associates) ja 0,5 % nariumbikarbo- naattia. Tämän jälkeen solut analysoitiin solufluoro-graafilla edellä kuvatulla tavalla. Taustavärjäys määritettiin korvaamalla spesifinen vasta-aine normaalilla hevosen IgG:llä ja suorittamalla värjäys edellä kuvatulla tavalla.

Esimerkki 5

Solujen toiminnan tutkiminen A. Proliferatiiviset tutkimukset

Fraktioimattomien ja FACS:illa fraktioitujen T-lym-fosyyttien (10^ kappaletta) mitogeenista vastetta tutkittiin mikroviljelmässä optimaalisilla annoksilla Concanavalin A:ta (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) ja fytohemaglu-tiinia (PHA) (Burroughs-Wellcome Company, Greenville, NC).

17 75364

Alloantigeeninen proliferatiivinen vaste määritettiin samanaikaisesti näille samoille populaatioille käyttäen stimulanttina mitomysiinillä käsiteltyä Laz 156:a, EBV:llä transformoitua ihmisen N-lymfoblastoidisolulin-jaa. Profiliferaatio tetanus-toksoidin (Massachusetts Department of Public Health Biological Labroratories, Boston, MA) ja sikotautiantigeenin (Microbiological Associates) läsnäollessa testattiin käyttämällä tetanus-toksoi-dille loppukonsentraatiota 10 yug/ml ja sikotautiantigee-nille laimennusta 1:20.5 % edellä kuvatulla menetelmällä saatuja makrofageja lisättiin kaikkiin populaatioihin aloitettaessa kasvattaa in vitro-viljelmiä. Mitogeenilla stimuloituja viljelmiä käsiteltiin neljän päivän kuluttua 3 0,2 juCirlla H-tymidiinia (3H-TdR) (ominaisaktiivisuus 1,9 Ci/mM) (Schwarz-Mann Division of Becton-Dickinson,

Orangeburg, NY) ja tuotteet erotettiin 18 tunnin kuluttua MASH II-laitteistolla (Microbiological Associates, Bethes-3 da, MD). H-tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin Pac-kard-tuikelaskurilla (Packard Instrument Company, Downers's Grove, IL). Taustan ^H-tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin korvaamalla mitogeeni väliaineella. Liukoisella antigeenillä ja solun pinta-alloantigeenillä stimuloidut viljelmät käsiteltiin viiden päivän kuluttua ^H-tymi-diinillä 18 tunnin ajan, tuotteet erotettiin ja aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla.

B. Solumyrkyllisyyttä koskevat tutkimukset Soluvälitteiselle lymfolyysille herkistetyt viljelyt suoritettiin lisäämällä mikrotitrauslevyn syvennyksiin fraktioimattomia T-soluja sekä mitomysiinillä käsiteltyjä stimulaattorisoluja eri solulajien pitoisuuden ollessa 2 x 10^ solua/ml. Viiden päivän kuluttua fraktioimattomat T-solut fraktioitiin OKT5+- ja OKT5 -T-solujakeiksi 51 FACSsilla. Nämä T-solujakeet lisättiin sitten Na2 CrO^:lla merkittyihin kohdesoluihin, ja soluja inkuboitiin kuuden tunnin ajan, minkä jälkeen spesifinen solumyrkyllisyys määritettiin. Solymyrkyllisyys prosentteina laskettiin seuraavan kaavan avulla: 18 75364

Kokeessa vapautunut ^Cr-spontaanisti vapautunut ^Cr ——--n- x 100

Pakastus/sulatuskäsittelyssä vapautunut χ0γ- spontaanisti vapautunut 51cr Määritykset suoritettiin kolmesta rinnakkaisnäyt-teestä, ja tulokset ilmoitettiin näiden keskiarvona.

C. Heikentäjä-solujen aktivointi Con A:11a ja MLC;n heikentäminen

Fraktioimattomat T-solut aktivoitiin lisäämällä 20 yUg Concanavalin A:ta (Con A) (Calbiochem) 10** solua kohti. Näitä Con A:11a käsiteltyjä soluja viljeltiin 2 kudosviljelypulloissa, joiden pinta-ala oli 25 cm (Falcon, Oxnard, CA), väliaineessa RPMI 1640 (Grand Island Biological Company), joka sisälsi 20 % ihmisen AB-seerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glu-tamiinia, 25 mM HEPES-puskuria (Microbiological Associates) ja 0,5 % natriumbikarbonaattia, 48 tuntia 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CC^. Käsittelemättömiä vertailu-T-soluja viljeltiin samalla tavalla, mutta ilman Con A:ta. Sen jälkeen solut sentrifugoitiin, pestiin viidesti ja lisättiin tuoreisiin autologisiin responderisoluihin yksisuuntaisesti sekoitettuun lymfosyytti viljelmään (MLC) edellä kuvatulla tavalla.

MLC:n heikentämisen määrityksessä viljely suoritettiin pyöreäpohjäisillä mikrotitrauslevyillä (Linbro Chemical Company, New Haven, CT) kolmessa syvennyksessä, joista kukin sisälsi 0,05 x 10° responderilymfosyyttiä (kaikki mononukleaarisia) , 0,05 x 10** joko akti voimattomia tai Con A:11a aktivoituja autologisia fraktioimattomia tai fraktioituja T-soluja ja 0,1 x 10** mitomysiinillä käsiteltyjä stimuloituja soluja (Laz 156) . Viiden päivän kuluttua viljelmät käsiteltiin 0,2 ^uCi:llä ^H-TdR, ja tästä 18 tunnin kuluttua solut kerättiin. MLC:n proliferation estokyky (%) laskettiin sitten seuraavaa kaavaa käyttämällä: 19 75364

Estokyky (%) = (1 - Cpm Con._^_ ) x 10o cpm 2 jossa cpm Con A merkitsee tuloksia, jotka on saatu käsiteltäessä MLC:tä 3H-TdR:llä lisättäessä Con A:11a aktivoituja autologisia T-soluja tai T-solujakeita, ja cpm merkitsee tuloksia, jotka on saatu lisättäessä akti-voimattomia autologisia T-soluja.

Kuviossa 1 ylärivissä on esitetty solufluorograafis-ta saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen perifeerisille T-soluille, B-soluille, nollasoluille ja makro-fageille, joiden on annettu reagoida 0KT5:n (laimennus 1:1000) ja G/M FITCrn kanssa. Vertailun vuoksi tulokset, jotka on saatu käyttämällä hevosen anti-TH2:ta, on esitetty alarivissä.

Kuviossa 2 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri ihmisen tymosyyteille, joiden on annettu reagoida OKT5:n ja G/M FITC:n kanssa (A) sekä hevosen anti-TH2:n kanssa (B) .

Kuviossa 3 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri hevosen anti-TH2:lla fraktioiduille T-solujakeille, joiden on annettu reagoida OKT5:n kanssa.

Kuviossa 4 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri OKT4:llä fraktioiduille T-solujakeille joiden on annettu reagoida OKT5:n kanssa.

Kuviossa 5 on esitetty fraktioimattomien T-solu-jen ja OKT5:llä fraktioitujen MLC:ssä alloherkistettyjen T-solujakeiden teho solumyrkkynä.

Hybridoma ja sen tuottama monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin ja karakterisoitiin edellä esittyjen esimerkkien mukaan. Vaikka suuri määrä kyseistä vasta-ainetta valmistettiin ruiskuttamalla kyseistä hybridomaa intraperi* toneaalisesti hiiriin ja erottamalla eläimistä pahanlaatuiset vesivatsat, on selvästi mahdollista, että hybridomaa 75364 20 voidaan viljellä myös alalla hyvin tunnetuilla in vitro-menetelmillä, jolloin vasta-aine eristetään viljelmien pin-tanesteestä.

Kuten kuvion 1 ylärivistä ilmenee, noin 20 % normaalin yksilön perifeerisistä T-verisoluista reagoi OKT5:n kanssa, mutta samasta yksilöstä eristetyt B-solut, nollaso-lut ja makrofagit eivät reagoi lainkaan OKT5:n kanssa. Myös hevosen anti-TH2 reagoi 24 %:n kanssa perifeerisiä T-solu-ja, mutta se ei myöskään reagoi B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa. Monoklonaaliselle vasta-aineelle on siten tunnusomaista, että se reagoi pinta-antigeenin kanssa, joka on löydetty 20 %:ilta ihmisen terveitä perifeerisiä T-soluja, mutta se ei reagoi kolmen muun mainitun solutyypin minkään pinta-antigeenin kanssa. Kuten myöhemmin mainitaan, OKT5-positiivinen osa ihmisen perifeerisistä T-soluista kuuluu sytotoksisiin ja heikentäjä-T-soluihin. Tätä reaktiivi-suuseroa voidaan käyttää kyseisen vasta-aineen OKT5 toteamiseen ja erottamaan se muista vasta-aineista.

Kuviosta 2 ilmenee, että noin 80 % kuuden kuukauden ikäisen lapsen normaaleista tymosyyteistä reagoi OKT5:n kanssa. Samanlaisia tuloksia (80 % aktiivisuus) saatiin käytettäessä kuutta muuta kateenkorvanäytettä, jotka oli saatu normaaleista yksilöistä, joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 19 vuoteen. Sama arvo saatiin hevosen anti-Tl·^:Ile. Kuvion 2 reaktiivisuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta kyseinen vasta-aine OKT5 ja erottaa se muista vasta-aineista .

Kuviosta 3 ilmenee, että OKT5-vasta-aine reagoi TH2+“ T-solujen, mutta ei TH2~-T-solujen kanssa. Noin 5...10 % TH2+-jakeesta ei reagoinut OKT5:n kanssa. Kuvion 3 reaktiivisuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta OKT5-vasta-aine ja erottaa se muista vasta-aineista.

Kuviosta 4 ilmenee, että 0KT4+-T-solujae ei reagoi lainkaan OKT5:n kanssa. Sitä vastoin OKT4“-T-solujae on suurimmaksi osaksi 0KT5-positiivinen (10 000 tutkitusta solusta 6800 on 0KT5-positiivisia). Nämä tulokset osoittavat,

II

21 75364 että T-solujen OKT5+-jae sekä aikaisemmin määritelty TH2+-jae ovat OKT4+-jakeelle vastakkaisia. OKT4+-jae sisältää auttaja-T-soluja, kun taas 0KT5+-jae (kuten myös TH2+-jae) sisältää sytotoksisia ja heikentäjä-T-soluja. Tämän kuvion 4 mukaisen reaktiivisuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta 0KT5 ja erottaa se muista vasta-aineista.

Kuviosta 5 ilmenee, että 0KT5+-T-solujae vaikuttaa CML:ään. Tämän populaation aiheuttama hajoamisaste on suurempi kuin fraktioimattoman T-solupopulaation. Sitä vastoin 0KT5“-T-solupopulaation aiheuttama hajoaminen on erittäin vähäistä. Fraktioimattomat T-solut aktivoitiin MLC:ssä Laz 156 vastaan, ja sen jälkeen ne fraktioitiin 0KT5+- ja 0KT5~-jakeiksi. Sekä fraktioimattomat että fraktioidut T-solut analysoitiin CMLrssä ^Cr:lla merkittyjen Laz 156-kohteiden suhteen käyttämällä erilaisia efektori/kohde-suhteita (E:T). 0KT5+-T-solujakeet sisälsivät efektoripopulaation soluvälitteisessä lymfolyysissä. E:T-suhteiden ollessa 5:1, 10:1 ja 20:1 OKT5+-T-solupopulaation spesifinen hajoittava vaikutus oli 40-, 58- ja 77-prosenttinen. Eristetyn OKT5+-jakeen ha-jotusteho oli huomattavasti suurempi kuin fraktioimattoman T-solupopulaation. Lisäksi OKT5”-T-solupopulaation hajottava vaikutus oli merkittävästi pienempi kaikilla tutkituilla E:T-suhteilla. Otettaessa huomioon aikaisempi havainto, jonka mukaan TH2+-T-solujae ihmisessä vaikutti CML:ään, nyt tehty havainto tukisi sitä olettamusta, että TH2+- ja OKT5--T-solupopulaatiot määrittelivät samoja toiminnallisesti aktiivisia T-lymfosyyttipopulaatioita. Tämän erilaisen syto-toksisen tehon avulla on myös mahdollista identifioida OKT5-vasta-aine ja erottaa se muista vasta-aineista.

Toiminnalliset tutkimukset suoritettiin lymfoidipopu-laatioilla, jotka oli fraktioitu fluoresenssiaktivointiin perustuvalla solulajittelijalla (FACS). Tulokset on esitetty taulukoissa I...III, ja ne tukevat edelleen esitettyjä monoklonaalisen vasta-aineen OKT5 karakterisointimenetelmiä.

Näissä tutkimuksissa fraktioimaton T-solupopulaatio käsiteltiin OKT5:llä (laimennus 1:500) ja G/M FITC:llä ja 22 75364 fraktioitiin FACS silla OKT5+- ja OKT5--jakeiksi. Näihin fraktioituihin populaatioihin lisättiin 5 % makrofageja (populaatioiden puhtausaste, joka oli yhtä suuri tai suurempi kuin 95 %, otettiin huomioon) ennen in vitro-vilje-lyä. Fraktioimattomat T-solupopulaatiot ja eristetyt 0KT5+-ja 0TK5-T-solujakeet stimuloitiin PHAslla, Con A:11a, liukoisilla antigeeneillä ja alloantigeeneilla populaatioiden proliferatiivisen vasteen määrittämiseksi in vitro-olosuh-teissa.

Fraktioimattomien T-solupopulaatioiden proliferatii-vinen vaste PHAsn ja Con A:n läsnäollessa ilmenee taulukosta I. Fraktioimattoman T-solupopulaation proliferatiivinen vaste on maksimaalinen käytetyssä 1 ^ug PHAsta 10® solua kohti, käytettäessä 0,5 /ug tai 0,1 yug PHAsta 10^ solua kohti vaste heikkeni. Käsiteltäessä fraktioimattomia T-soluja OKT5sllä ja vuohessa valmistetulla hiiren FITCsllä proliferatiivinen vaste pysyi samana. Eristetyt OKT5+- ja OKT5~-T-solujakeet käyttäytyivät sen sijaan PHAsn läsnäollessa eri tavalla. OKT5~-solupopulaatio käyttäytyi kaikilla käytetyillä PHAsn annoksilla samalla tavalla kuin fraktioimaton T-solupopulaatio. OKT5+-solujen proliferatiivinen vaste oli sen sijaan huomattavasti pienempi kaikilla tutkituilla PHAsn annoksilla. Lisäksi havaittiin, että PHAsn annoksen ollessa 0,1 yug 10® solua kohti OKT5+-T-solut eivät lisääntyneet lainkaan, kun taas OKT5~-T-solujae ja fraktioimattomat solut vielä lisääntyivät. Toisaalta näiden jakeiden proliferatiivinen vaste Con Asn läsnäollessa oli samanlainen, joten tällöin näitä kahta solujaetta ei pystytty erottamaan toisistaan tai fraktioimattomasta T-solupopulaatiosta.

Seuraavaksi tutkittiin vastetta alloantigeenin läsnäollessa MLCsssä sekä liukoisten antigeenien läsnäollessa. Taulukosta II ilmenee, että Laz 156:n läsnäollessa MLCissä fraktioimattoman T-solupopulaation, OKT5:llä ja G/M FITCrllä käsitellyn fraktioimattoman T-solupopulaation ja sekä OKT5 -että OKT5--T-solujakeiden vaste oli samanlainen. Nämä kaksi solujaetta erosivat kuitenkin selvimmin toisistaan tutkit- 23 75 3 6 4 taessa niiden proliferatiivista vastetta liukoisten antigeenien läsnäollessa. Kaikissa tutkituissa tapauksissa 0KT5+-T-solujae lisääntyi erittäin vähän liukoisten antigeenien, tetanus-toksoidin ja sikotautiantigeenin läsnäollessa, kun taas 0KT5“-T-solujae lisääntyi hyvin.

Aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että T-lymfosyyt-tien TH2+-populaatio yhdessä Con A:n kanssa aiheuttaisi au-tologisten lymfosyyttien lisääntymisen heikkenemisen MLC:ssä. Jotta saataisiin selville 0KT5+-T-solujakeen mahdollinen samanlainen heikentävä vaikutus, T-soluja aktivoitiin 48 tunnin ajan Con A:11a ja sen jälkeen ne lajiteltiin monoklonaalisilla vasta-aineilla 0KT5 ja 0KT4 eri T-soluja-keiksi. Sen jälkeen nämä fraktioidut T-solujakeet lisättiin autologisiin responderilymfosyytteihin MLC:n aloittamiseksi. Taulukosta III ilmenee, että fraktioimattomat Con A:11a aktivoidut T-solut heikensivät autologisten solujen prolife-raatiota MLC:ssa. Käsiteltäessä T-soluja monoklonaalisella vasta-aineella ja G/M FITCrllä tulos oli sama. Vaikka sekä 0KT4+- että 0KT5+-T-solut lisääntyivät Con A:11a aktivoituina, ainoastaan 0KT5+-T-soluilla oli Con A:11a aktivoituina heikentävä vaikutus. 0KT4+-jakeella ei ollut heikentävää vaikutusta. Lisäksi 0KT4+- ja OKT4”-TH2~-jakeet sisältävän 0KT5-populaation heikentävä vaikutus oli erittäin vähäinen verrattuna voimakkaasti heikentävään 0KT5+-populaatioon.

Taulukosta IV ilmenee perifeeristen T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuuksien suhde eri tautitiloihin. Näitä suhteita voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin silloin kun tauti aiheutuu jonkin T-solujakeen ylimäärästä (esim. tyyppiä I oleva agammaglobulinemia). Terapeuttiseen tarkoitukseen potilaalle, jolla on ylimäärin tiettyä T-solu-jaetta, annetaan sopivaa monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin ylimäärä saadaan vähenemään tai kokonaan poistetuksi. Taulukossa IV esitettyjen suhteiden avulla 0KT5-vasta-aine voidaan myös todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Muita samojen hakijoiden valmistamia monoklonaalista vasta-ainetta tuottavia hybridomeja (0KT1, 0KT3 ja 0KT4) ja 24 7 5 3 6 4 menetelmiä näiden hybridomien ja vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 800846, 801342 ja 801343.

Kyseisen vasta-aineen OKT5 havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG-^, IgG2a, IgG2b tai IgG3 tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Hoidettaessa sellaisia tautitiloja, jotka aiheutuvat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, potilaalle voidaan antaa terapeuttisesti vaikuttava määrä 0KT5-vasta-ainetta. Reagoimalla selektiivisesti heikentäjä-T-soluantigeenin kanssa vaikuttava määrä OKT5-vasta-ainetta vähentää heikentäjä-T-solujen ylimäärää ja täten parantaa heikentäjä-T-solujen ylimäärästä aiheutuvia vaikutuksia. Vasta-ainetta 0KT5 voidaan sisällyttää terapeuttisiin koostumuksiin, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKT5-vasta-ainetta ja farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista.

Il 25 75364

I I

H

Q) 00 r-Η CM in 00 VO

M CM H OO ι-H VO VO

(0 CM 00 P- rH CM VO

•o -P <N

3 3rovDiNr^rrr-irv) g g +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 j I m oo vo σ ρ- H p-

En I σ vo σ vo o m cm

LDVOOVVOtNlDOrH

§ y oo -H vn oo σν o •nomincMoooo^ 3

-H

•s

fä I— Ο Ή O CM

P m m oo oo ή σ o vo i-h σ

+> 00 CM

m 3 σ >h rH oo oo <h

Fh rH

K g +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 I σ I—I σι oo σ co vo ro + iH es m io o co co >h m -vr oo oo o r~ oo r-t

'φ y rH P' Tf P- VO

φ Ο ή σ ro oo -2 :n3

W rH

TO rH

> j-

ro O

i—I Eh ιΗΗΡοιησοονοοο (Utiovovoooinr^ tn^omootNOP' h -h 2 σι

r-l \ h m σ f-h n· fN

O ro vo SZ ro _ , +I-H +i +i +i +i +i a c ro +

30to σ iH >h σ n· m rH

η η κι m p~o oo σ (n o m

g^dJEn 'S’rH VO 00 O VO -H

as q r—ί Sf*

Eh C <H O n- p~ rH pr p» cm Q0'-' in^r cm oo η· s ro to o $ δ c

•Ο -H

3c ιησΡ'ΓΟΓοσ rHflj CO σ I— σ rH vo

O <D CM VO rH VO P- rH

w σ jo vo m cm cm cm m p- "3 +1 +1 +1 +l +1 +1 +1 Φ 3σιη^τΗοΓ'ΓΗ H >, H t* CO in P* VO P~ 00 EÄg η σ p- p- n* m +> j? J rH 00 σ rH 00

4-1 to H VO n· rH O CO

"i \ \ .l •h c vo \ σ σ \ in 5 1.¾ 3 Ϊ > $ (ηι-ηε+ι 3 m ro ro m rocM ro o ro >i 2 \ 'SrHgcMgrHgvngma •P (Π Ο Ή ·» rH rH ,w' rH s“" rH r+ m :8¾ b* 8°8<c8<c8<8'rtg u5-h < rH < vo < vo G vo G vo G vo zj '3 3¾ sssslsasesösgl 26 75 364 η ττ σ'»

, Ή LT) O f- O VO

4-J Oi—I LO oo O f-~

G 3 CO U0 rH rH

jJ H n cn n rH

ό O in r~ ro i—i H « +l +i +1 +1 S i m ^ +i +i +i +i

Μ VO ΟΊ 00 TT

•O I CO O -H 00 VO Γ'· tt -H

o I vomm m tt m vo

G yi -Ho VO

h En in cti -h O & O (N (N 00 (Τι Γ'

ϋ) O -H CTi VO CO

H

S

•n d oo ro o »h

•P O 00 Γ'· O (N

*H -U Γ- (N 00 (N

0 d •Hra Ή LO O Γ*- S 8 ? +,+,+, ^ -M +l +, +, H EH oo cn m in cn oo MH H ,l n oi m m cn r··' cn in Q + oo Ti ro Γ' oo <Ti ro id :¾ in ro

H C Fh VO TT rH

-H 3 » rH -H -H

$ 3 8 ^ 1 s is 3

to $ -H

ra tr ··

+J U rH

nj G M 0 <N -H oo h H ra H h o in vo ^ ro r- vo

M -H O pL| (Ti -H 00 0 CN VO H

ra -H G n-vom " vo

9 . S rH d O CN

^ id™ u8 <n cn ro cn tth r- 3 S !l , « +)+|+|+| 8+1 +1 +1 +1 r-j ra -n -f- ^ 3 S-H _ O’ (N O r- rH vo (N (Ti id 0 G in -H oo ον ro cn t'' rs r~-

fcH H <D M h LO r—I r^r^cN

Q 9 ö iHLOTj* CN Γ- 00

^ ^ ^ (Tl (N CN CTtVDiH

id -d s

Se OO VO rH

•n li ro in vo oo οι as 3 -P vo vo r-~ en TT m h w r» m σι

Q -H (N ro H TT ,-H

öi O -H ro CN Γ' H H

H P _p +1 +1 +1 +1 +1 +1 +| +|

SH 3 [ VO O VO COOOrHTT

rH TT O O 0O CN (N (Ti VO

•g jH g m rs, CO rH voroin q >r J vo -H o ro m vo

-P H O CN CN CTiVOrH

m h il u I ί ί 1¾ 3§ 1 . Is S J s P I s a | dl S q -S1 th S o ti -h 27 75364 df> Ό I—I σι ia οι h -Μ I r~— t— Γ" cn 10 w

§ O

H ro Ν' vo m m n PC ininr^ r-ino QJ o m r~- oo vo σ>

SoconcN o oo

,¾ ^ *H iH '—I

^ ^+1+1 4*1 +1 +1 +1

fl) -H

r P cn oo ro Η σι in >. cn oo σι r-t cm ro g .(Jr-ir-ro Γ" vo ro to ± cn uo oo m n o ro oo cn Ή iH oo t *w

r-H

H C

H

os 2 ^ o j? roro Hmm

S t0 ^ I C-- CO 0O I r-H

^ 'B m

S W

c t£ oo vo oo vo cn cn cn H oo ro oo ro d ·η σ r- cn r^· oo

O -H N* iH CN I—I N> LD

:nj Q ^ +l +l +l +l +l +i :m · · P n> lti ro r—I Ν’ oo 4j CRr-voo oo m m 4j -Prooo r- cn ·Η rH 8 i oo -η σ n> σ r-'

:ctJ ί*ί ro cn cn iHr-'VO

>

S

•n I

d ή H 0

8 ip +j +j i I

^ ft % IBs, +1 :<5 § e < «3 <

^ q 1¾ o? o5h® B

|*i :8 § 33 3 ,3 1 3 J* Ίη+<α· Sn ϋ 3 Is fs Is

g8 5 S S

28 75364

Taulukko IV

Perifeeristen T-solujen pitoisuudet eri tautitiloissa T-solujen pitoisuudet

Tautitila 0KT3+ 0KT4+ 0KT5+ ____ ____^^

Primäärinen maksa- N + - kirroosi (2)

Multippeliskleroosi - N - (pitkälle edennyt) (8)

Myasthenia Gravis (ei- 000 hoidettu varhaisessa vaiheessa) (3)

Akuutti elinsiirto (3) 0 tai - 0

Agammaglobulinemia

Tyyppi I +

Tyyppi II O

Hyper-IgE (4) - N O tai -

Akuutti tarttuva meno- + O tai — ++ nukleoosi (4) x)

Hodgkinsin tauti

Vaiheet I & II N N N

Vaiheet III & IV — N N

N = normaali pitoisuus 0 = puuttuu kokonaan + = normaalia suurempi ++ = huomattavasti normaalia suurempi - = normaalia pienempi — = huomattavasti normaalia pienempi x) nämä pitoisuudet muuttuvat normaaleiksi noin yhtä viikkoa aikaisemmin kuin kliiniset oireet häviävät "Suluissa olevat arvot ilmaisevat tutkittujen potilaiden lukumäärän".

Il

Claims (2)

29 75364

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi yli 90 %:n kanssa sytotoksisia ja hei-kentäjä-TH2+-T-soluja (joita on noin 20-30 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista), mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) ei reagoi TH2~-T-solujen eikä OKT4+-T-solujen kanssa, mutta reagoi noin 68 %:n kanssa OKT4~-T~soluja, d) määrittelee T-solupopulaation (OKT5+), joka on voimakkaasti sytotoksinen ja jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä, normaaleina pitoisuuksina kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja normaalia suurempina pitoisuuksina tyyppiä I olevassa agamma-globulinemiassa ja akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridocma ATCC CRL 8016 i) immunoimalla hiiriä normaaleilla ihmisen tymo-syyteillä, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren mye-loomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennyksien hybridocnapitoinen pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivi-sille puhdistetuille T-soluille spesifistä vasta-ainetta, vi) valikoimalla ja kloonamalla hybridocma ATCC CRL 3016, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi yli 30 7 5 3 6 4 90. kanssa ihmisen sytotoksisia ja heikentäjä-TH2+-T-soluja, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) viljelemällä hybridcana ATCC CRL 8016 sopivassa väliaineessa, ja viii) ottamalla talteen vasta-aine mainitun hyb-ridoanan pintanesteestä.

2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi yli 90 %:n kanssa sytotoksisia ja hei-kentäjä-TH2+-soluja (joita on noin 20-30 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista), mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyytte j ä, c) ei reagoi TH2~-T-solujen eikä OKT4+-T-solujen kanssa, mutta reagoi noin 68 %:n kanssa 0KT4“-T-soluja, d) määrittelee T-solupopulaation (OKT5+), joka on voimakkaasti sytotoksinen ja jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä, normaaleina pitoisuuksina kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja normaalia suurempina pitoisuuksina tyyppiä I olevassa agammaglobulinemiassa ja akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8016 i) immunoimalla hiiriä normaaleilla ihmisen tymo-syyteillä, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren myeloomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, II 3i 75 36 4 iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennyksien hybridoomapitoi-nen pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosenttiposi-tiivisille puhdistetuille T-soluille spesifistä vasta-ainetta, vi) valikoimalla ja kloonamalla hybridooma ATCC CRL 8016, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi yli 90 %:n kanssa ihmisen sytotoksisia ja heikentäjä-TH2+-T-soluja, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) siirtämällä hybridooma ATCC CRL 8016 intra-peritoneaalisesti hiiriin, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen hiirien pahanlaatuisesta vesivatsasta tai seerumista. 32 . v .v 75364