FI75231C - Diagnostiskt foerfarande vid vilket anvaends en monoklonal antikropp specifik mot maenniskans cytotoxiska och supressor-t-celler. - Google Patents

Description

1 75231

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään ihmisen sytotok-sisille ja heikentäjä-T-soluille spesifistä monoklonaa-lista vasta-ainetta 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 802917

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään heikentä jä-T-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisellä. Menetelmässä käytetään hyväksi monoklonaalista, 10 ihmisen normaalien sytotoksisten ja heikentäjä-T-solujen pinnalta löydetylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla. Tätä diagnostista menetelmää voidaan soveltaa esim. akuutin mononukleoosi-infektion toteamiseen.

15 Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren mye- loomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin (Nature 256 (1975) 495-497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi.

20 Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81 - "Lymphosyte Hybrido-25 mas", toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner,

Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et al., Cell 14 (toukokuuta 1978) 9-20? P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experiment Immunology, 3. painos, 30 volyymi 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybrido-35 mistä monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy 2 75231 paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata/ että yritettäessä valmistaa haluttua hybri-domaa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hyb-ridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella 5 vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hybridoman eristyksessä käytetystä selektiotekniikasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa 10 vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topic in Microbiology and Immunology, volyymi 81, 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin 15 valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigee-neihin. Mikään näistä hybridomista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimin-20 töihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluis-ta. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta 25 ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imu- kudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunolo-gisesti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioi-30 hin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvät hylkiminen) . Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyytti-ryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat 35 immuunijärjestelmän tominnoissa säätelevästä. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

75231

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden eri-5 laistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabri-cius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujenarvellaan erilaistuvan luu-ytimessä.

10 T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-so-luiksi, nämä suhteellisesti ottaen joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien eli-15 mistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232, ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentia-20 tion Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immuno biology", toimittaja O. Stutman, Plenum Press 1977, volyymi 7, 363-379.

Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregula-25 tooristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvain-muotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää pys-30 tytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Ai- senberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lyhmphomas" tornittajät S. Thier-felder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Bel-35 pomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, 4 75231 pahanlaatuisissa kasvaimissa ja agammaglobulinemiassa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "hei-5 kentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobulinemiassa tiettyjä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin.

10 Tietyissä leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitys vaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan. Katso esimerkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human 15 Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", volyymi 20, Sprin-ger-Verlag 1977, 17-23 ja julkaisun sisältämät viitteet.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immunoglo-buliinia ei muodostu lainkaan, kuuluu ainakin kaksi eri-20 laista tautimuotoa. Muodossa I ylimäärin esiintyvät "heikentä jä"-T-solut estävät immunoglobuliinin muodostumisen, kun taas muodossa II sama häiriötila aiheutuu siitä, että "auttaja"-T-soluista on puutetta. Molemmissa tautimuodoissa potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vas-25 ta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta; B-solujen toiminta on kuitenkin heikentynyt tai "sitä ei auteta", minkä vuoksi immunoglobuliinituotanto vähenee huomattavasti tai loppuu kokonaan. Potilaan agammaglobulinemiatyyppi voidaan 30 täten saada selville kokeilla, joissa määritetään, onko heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa ylimäärin esiintyvälle T-solujen alaryhmälle spesifisiä 35 vasta-aineita autoimmuunisia tai pahanlaatuisia sairauksia poteville potilaille nämä vaikuttavat sairauden ke- 75231 hitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-solusyöpää (tiettyjä ihoimukudoskasvaimia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa aut-taja-T-solujen antigeenille spesifisellä vasta-aineella.

5 Autoimmuunisia sairauksia, jotka ovat aiheutuneet ylimää rin esiintyvistä T-soluista, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Heikentäjä-T-solujen ylimäärästä aiheutuvia tauteja (esim. pahanlaatuisia tauteja tai tyyppiä I olevaa agammaglobulinemiaa) voidaan hoitaa antamalla potilaalle 10 heikentäjä-T-solujen antigeenin vasta-ainetta.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG), ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu 15 elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimis-prosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized 20 Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring" Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja auto-25 vasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä anti- seerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologi-silla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poista-30 miseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden anti-seerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, 35 että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheut- 6 75231 taa vasta-aineiden muodostumisen, jotka vaikuttavat useisiin antigeenilajeihin, joita on löydetty kaikista immu-nointiin käytetyistä ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifis-5 tä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10°.

10 Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen anti-seerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-ai-15 neen etuja.

Erästä tunnetuilla antiseerumeilla identifioitua T-solujen alaryhmää nimitetään TH2+-alaryhmäksi, ja sen on havaittu sisältävän sekä soluvälitteisessä lymfolyysissä tarvittavia sytotoksisia efektorisoluja että immunoregu-20 latorisia heikentäjä-T-soluja, jotka heikentävät sekä T-solujen että B-solujen toimintaa. Tämä alaryhmä sisältää noin 20...30 % ihmisen perifeerisistä T-soluista. Katso esim. E.L. Reinherz, et ai., V. Immunol. 123 (1979) 83 ja New Engl. V. Med. 300 (1979) 1061.

25 Nyt on keksitty uusi hybridoma (nimeltään 0KT5), jo ka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen ihmisen normaaleista perifeerisistä sytotoksisista ja heikentäjä-TH2+-T-soluista (noin 20 % ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista) löydetyl-30 le pinta-antigeenille. Näin muodostunut vasta-aine on mo-nospesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien sytotok-sisten ja heikentäjä-TH2+-solujen pinta-antigeenidetermi-nantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin 35 vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka 75231 reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen sytotok-sien tai heikentäjä-T-solun antigeenille). Lisäksi tätä 5 hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet 10 välttämättömiä.

Sen esillä olevaa hybridomaa että muodostunutta vasta-ainetta nimitetään tästä lähtien "OKT5":ksi; asiayhteydestä selviää, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan.

Esillä oleva hybridoma OKT5 on talletettu laitokseen 15 "The American Type Culture Collection", 1201 Parklawn

Drive, Rockville, Maryland 20852, 18.09.1979 ja 28.09.1979, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8013 ja CRK 8016.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus 20 on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 802917.

Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että potilaasta otetun T-solunäyt-teen annetaan reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän 25 kanssa luokkaan IgG kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainet ta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8013 tai 8016, joka on valmistettu yhdistämällä hiiren myeloomasolulinjän soluja ihmisen tymosyyteillä immunoidun hiiren pernasoluihin, ja joka vasta-aine 30 a) reagoi yli 90 %:n kanssa sytotoksisia ja heiken- täjä-TH2+-soluja (joita on 20-30 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista), mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, 35 b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja ty- mosyyttejä, 8 75231 c) ei reagoi -T-solujen eikä 0KT4+-T-solujen kanssa, mutta reagoi 68 %:n kanssa 0KT4 -T-soluja, d) määrittelee T-solupopulaation (0KT5+), joka on voimakkaasti sytotoksinen ja jota esiintyy normaalia pie- 5 nempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä, normaaleina pitoisuuksina kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja normaalia suurempina pitoisuuksina tyyppiä I olevassa agam-maglobulinemiassa ja akuutissa mononukleoosi-infektiossa, 10 ja määritetään, kuinka suuri osa koko perifeerisestä T-solupopulaatiosta reagoi vasta-aineen kanssa.

Esimerkki 1 OKT5-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen 15 Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15- 40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointi-menetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Pisvataway, NH) Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 20 21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-Ig+ (B) ) ja pinta-IG (T- ja nol-lasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2~pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974) 25 1113. T-olut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig -kanta 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypa-que-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Cl:lla (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu 30 T-solupopulaatio oli <2 %:isesti EAC-rosettipositiivinen ja >95 %:isesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig (nol-lasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5 %:isesti E-positiivinen 35 ja ¢2 %:isesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+ (B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaali!- 9 75231 lä ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95 % risesti pinta-Ig-positii-vinen ja <5 % risesti E-positiivinen.

Normaalit ihmisen makrofagit erotettiin yksitumaises-5 ta populaatiosta kiinnittämällä ne polystyreeniin. Tällöin yksitumaiset solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen viljelyväliaineeseen (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES /4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinipropaanisulfonihappa?-puskuria, 200 mM L-glutamiinia ja penisilliinistreptomysiiniä 10 sekä 20 % kuumentamalla inaktivoitua ihmisen AB-seerumia) solujen määrän ollessa 2 x 10^ solua, ja niitä inkuboitiin muovisissa petrimaljoissa (100 x 20 mm) (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon, Exnard, CA) 37°Crssa yön yli. Petrimal-jat pestiin huolellisesti kiinnittymättömien solujen 15 poistamiseksi, ja muoviin kiinnittynyt populaatio irrotettiin pesemällä voimakkaasti kylmällä 2,5 mM EDTArta sisältävällä liuoksella, jossa ei ollut seerumia, ja silloin tällöin raapimalla petrimaljaa kertakäyttöisen injektio-ruiskun kumikärjellä.

20 Yli 85 % solukannasta pystyi käyttämään ravinnokseen lateksihiukkasia, ja Wright-Giemsa-värjäyksellä niillä havaittiin morfologisesti olevan monosyyttien tunnusmerkit.

B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin poti-25 lailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiö-seerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja sak-30 sillä, ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraa-vaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymo-syytit olivat >95-%risesti elinkykyisiä ja ^90-%risesti 35 E-rosettipositiivisia.

75231 10 C. Solulinja

Terveestä yksilöstä saatu Epstein-Barr-viruksella (EBV) transformoitu B-solulinja (Laz 156) saatiin tohtori H.Lazarukselta, Sidney Farber Institute, Boston, MA.

5 Esimerkki 2

Solufluorograafinen analyysi ja solujen erotus

Kaikkien solupopulaatioiden ja monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiotuotteiden solufluorograafinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetel-10 mällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG: llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories) , analyysiin käytettiin solufluorograafia FC200/ 4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1-2 x 106 solua käsiteltiin 0,15 ml:lla vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 15 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen 20 solufluorograafilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluo resenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssikorkeusanaly-saattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritet-25 tiin 0,15 ml:11a suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsa— nestettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuot-tavalla hybridikloonilla immunoidusta CAF^-hiirestä. Lymfoidipopulaatioiden reaktiivisuus hevosen anti-TI^in ja hevosen normaalin IgG:n kanssa määritettiin edellä 30 esitetyllä tavalla (Reinherz et ai.).

Kokeissa, joiden tarkoituksena oli erottaa T-solu- g jen alaryhmät toisistaan, 100 x 10 fraktioimatonta T-so-lua merkittiin 4 ml:11a suhteessa 1:500 laimennettua vasta-ainetta OKT4 tai OKT5 ja kehitettiin G/M FITC:llä. OKT4:n 35 oli aikaisemmin havaittu reagoivan spesifisesti 55-60 %:n kanssa perifeerisiä veren T-lymfosyyttejä, mikä ryhmä edus- 11 75231 taa ihmisen auttaja-T-soluja. Käyttämällä fluoresenssi-aktivaatioon perustuvaa solulajittelijaa (FACS-1) (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) samasta yksilöstä saadut T-solut jaettiin 0KT4+ - ja 0KT4 -populaatioiksi sekä 0KT5+-5 ja OKT5 -populaatioiksi. Lajien elinkykyisyys oli >95 % Trypan-sinisellä määritettynä kaikissa tapauksissa. Kaikkien erotettujen populaatioiden puhtausaste oli ^95 %.

Esimerkki 3' T-solujen alaryhmien analysoiminen hevosen anti-10 TH2:lla

Esimerkin 2 mukaisesti hevosen anti-TH9:ta käytet-tiin erottamaan TH2 - ia TH2 -solut toisistaan FACSiilla, jolloin 60 x 10^ fraktioimatonta T-solua merkittiin 0,12 ml:lla hevosen anti-TH2 ja 0,1 ml:11a R/H FITC (Cappel 15 Laboratories, Downington, PA) Reinherzin et ai. kuvaamalla tavalla. Lajiteltujen solujen puhtaus ja elinkykyisyys oli samanlainen kuin edellä kuvattujen lajiteltujen populaatioiden. FACSrilla lajiteltuja T-solujakeita, jotka oli eristetty hevosen anti-TH2:11a, OKT4:llä tai 20 0KT5:llä, viljeltiin 48 tuntia 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02, väliaineessa RPMI 1640, joka sisälsi 20 % ihmisen AB-s-erumia, 1 % penisilliini- streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-pusku-ria (Microbiological Associates) ja 0,5 % nariumbikarbo- 25 naattia. Tämän jälkeen solut analysoitiin solufluoro-graafilla edellä kuvatulla tavalla. Taustavärjäys määritettiin korvaamalla spesifinen vasta-aine normaalilla hevosen IgG:llä ja suorittamalla värjäys edellä kuvatulla tavalla.

30 Esimerkki 4

Solujen toiminnan tutkiminen A. Proliferatiiviset tutkimukset

Fraktioimattomien ja FACSrilla fraktioitujen T-lym-fosyyttien (10^ kappaletta) mitogeenista vastetta tutkittiin 35 mikroviljelmässä optimaalisilla annoksilla Concanavalin A:ta (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) ja fytohemaglu-tiinia (PHA) (Burroughs-Wellcome Company, Greenville, NC).

75231 12

Alloantigeeninen proliferatiivinen vaste määritettiin samanaikaisesti näille samoille populaatioille käyttäen stimulanttina mitomysiinillä käsiteltyä Laz 156:a, EBV:llä transformoitua ihmisen N-lymfoblastoidisolulin-5 jaa. Profiliferaatio tetanus-toksoidin (Massachusetts Department of Public Health Biological Labroratories, Boston, MA) ja sikotautiantigeenin (Microbiological Associates) läsnäollessa testattiin käyttämällä tetanus-toksoi-dille loppukonsentraatiota 10 yug/ml ja sikotautiantigee-10 nille laimennusta 1:20.5 % edellä kuvatulla menetelmällä saatuja makrofageja lisättiin kaikkiin populaatioihin aloitettaessa kasvattaa in vitro-viljelmiä. Mitogeenilla stimuloituja viljelmiä käsiteltiin neljän päivän kuluttua 3 0,2 ^uCi:lla H-tymidiinia (3H-TdR) (ominaisaktiivisuus 15 1,9 Ci/mM) (Schwarz-Mann Division of Becton-Dickinson,

Orangeburg, NY) ja tuotteet erotettiin 18 tunnin kuluttua MASH II-laitteistolla (Microbiological Associates, Bethes- 3 ...

da, MD). H-tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin Pac- kard-tuikelaskurilla (Packard Instrument Company, Dow-20 ners's Grove, IL). Taustan ^H-tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin korvaamalla mitogeeni väliaineella. Liukoisella antigeenillä ja solun pinta-alloantigeenillä stimu- 3 loidut viljelmät käsiteltiin viiden päivän kuluttua H-tymi- diinillä 18 tunnin ajan, tuotteet erotettiin ja aktiivi- 25 suus mitattiin edellä kuvatulla tavalla.

B. Solumyrkyllisyyttä koskevat tutkimukset

Soluvälitteiselle lymfolyysille herkistetyt viljelyt suoritettiin lisäämällä mikrotitrauslevyn syvennyksiin fraktioimattomia T-soluja sekä mitomysiinillä käsiteltyjä 30 stimulaattorisoluja eri solulajien pitoisuuden ollessa 2 x 10b solua/ml. Viiden päivän kuluttua fraktioimattomat T-solut fraktioitiin OKT5+- ja OKT5 -T-solujakeiksi 51 FACSrilla. Nämä T-solujakeet lisättiin sitten Na2 CrO^illa merkittyihin kohdesoluihin, ja soluja inkuboitiin kuuden 35 tunnin ajan, minkä jälkeen spesifinen solumyrkyllisyys määritettiin. Solymyrkyllisyys prosentteina laskettiin seuraavan kaavan avulla: 13 75231

Kokeessa vapautunut ^Cr-spontaanisti vapautunut 51Cr -- x 100

Pakastus/sulatuskäsittelyssä vapautunut xCr-spontaanisti vapautunut 51cr ^ Määritykset suoritettiin kolmesta rinnakkaisnäyt- teestä, ja tulokset ilmoitettiin näiden keskiarvona.

C. Heikentäjä-solujen aktivointi Con A:11a ja MLC:n heikentäminen

Fraktioimattomat T-solut aktivoitiin lisäämällä 10 20 yUg Concanavalin A:ta (Con A) (Calbiochem) 10^ solua kohti. Näitä Con A:11a käsiteltyjä soluja viljeltiin 2 kudosviljelypulloissa, joiden pinta-ala oli 25 cm (Falcon, Oxnard, CA), väliaineessa RPMI 1640 (Grand Island Biological Company), joka sisälsi 20 % ihmisen AB-15 seerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glu- tamiinia, 25 mM HEPES-puskuria (Microbiological Associates) ja 0,5 % natriumbikarbonaattia, 48 tuntia 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CC^. Käsittelemättömiä vertailu-T-soluja viljeltiin samalla tavalla, 20 mutta ilman Con A:ta. Sen jälkeen solut sentrifugoitiin, pestiin viidesti ja lisättiin tuoreisiin autologisiin responderisoluihin yksisuuntaisesti sekoitettuun lymfo-syyttiviljelmään (MLC) edellä kuvatulla tavalla.

MLC:n heikentämisen määrityksessä viljely suoritettiin 25 pyöreäpohjaisilla mikrotitrauslevyillä (Linbro Chemical Company, New Haven, CT) kolmessa syvennyksessä, joista r kukin sisälsi 0,05 x 10 responderilymfosyyttiä (kaikki mononukleaarisia), 0,05 x 106 joko aktivoimattomia tai Con A:lla aktivoituja autologisia fraktioimattomia tai 30 fraktioituja T-soluja ja 0,1 x 10^ mitomysiinillä käsiteltyjä stimuloituja soluja (Laz 156). Viiden päivän kuluttua viljelmät käsiteltiin 0,2 ^uCiillä ^H-TdR, ja tästä 18 tunnin kuluttua solut kerättiin. MLC:n proliferation estokyky (%) laskettiin sitten seuraavaa kaavaa käyt-35 tämällä: 75231 14

Estokyky (%) = (1 - cPm Con_fi_+ } χ 100 cpm ^ 2 jossa cpm Con A merkitsee tuloksia, jotka on saatu kä- 3 siteltäessä MLC:tä H-TdR:llä lisättäessä Con A:11a aktivoituja autologisia T-soluja tai T-solujakeita, ja cpm merkitsee tuloksia, jotka on saatu lisättäessä akti-10 voimattomia autologisia T-soluja.

Kuviossa 1 ylärivissä on esitetty solufluorograafis-ta saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen perifeerisille T-soluille, B-soluille, nollasoluille ja makro-fageille, joiden on annettu reagoida OKT5:n (laimennus 15 1:1000) ja G/M FITC:n kanssa. Vertailun vuoksi tulokset, jotka on saatu käyttämällä hevosen anti-TI^ta, on esitetty alarivissä.

Kuviossa 2 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri ihmisen tymosyyteille, joi-20 den on annettu reagoida OKT5:n ja G/M FITC:n kanssa (A) sekä hevosen anti-T^tn kanssa (B) .

Kuviossa 3 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri hevosen anti-Tl^illa fraktioiduille T-solujakeille, joiden on annettu reagoida OKT5:n kanssa. 25 Kuviossa 4 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri OKT4:llä fraktioiduille T-solujakeille joiden on annettu reagoida 0KT5:n kanssa.

Kuviossa 5 on esitetty fraktioimattomien T-solu-jen ja OKT5:llä fraktioitujen MLC:ssä alloherkistettyjen 30 T-solujakeiden teho solumyrkkynä.

Kuten kuvion 1 ylärivistä ilmenee, noin 20 % normaalin yksilön perifeerisistä T-verisoluista reagoi OKT5:n kanssa, mutta samasta yksilöstä eristetyt B-solut, nollaso-lut ja makrofagit eivät reagoi lainkaan OKT5:n kanssa. Myös 35 hevosen anti-Ti^ reagoi 24 %.n kanssa perifeerisiä T-soluja, mutta se ei myöskään reagoi B-solujen, nollasolujen 15 75231 eikä makrofagien kanssa. Monoklonaaliselle vasta-aineelle on siten tunnusomaista, että se reagoi pinta-antigeenin kanssa, joka on löydetty 20 %:ilta ihmisen terveitä perifeerisiä T-soluja, mutta se ei reagoi kolmen muun mai-5 nitun solutyypin minkään pinta-antigeenin kanssa. Kuten myöhemmin mainitaan, OKT5-positiivinen osa ihmisen perifeerisistä T-soluista kuuluu sytotoksisiin ja heikentäjä-T-soluihin. Tätä reaktiivisuuseroa voidaan käyttää kyseisen vasta-aineen OKT5 toteamiseen ja erottamaan se 10 muista vasta-aineista.

Kuviosta 2 ilmenee, että noin 80 % kuuden kuukauden ikäisen lapsen normaaleista tymosyyteistä reagoi OKT5:n kanssa. Samanlaisia tuloksia (80 % aktiivisuus) saatiin käytettäessä kuutta muuta kateenkorvanäytettä, 15 jotka oli saatu normaaleista yksilöistä, joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 19 vuoteen. Sama arvo saatiin hevosen anti-TH2:He. Kuvion 2 reaktiivisuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta kyseinen vasta-aine OKT5 ja erottaa se muista vasta-aineista.

20 Kuviosta 3 ilmenee, että OKT5-vasta-aine reagoi TH2+-T-solujen, mutta ei TH2 -T-solujen kanssa. Noin 5...10 % TH2+-jakeesta ei reagoinut OKT5:n kanssa. Kuvion 3 reaktiivisuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta OKT5-vasta-aine ja erottaa se muista vasta-aineis-25 ta.

Kuviosta 4 ilmenee, että OKT4 -T-solujae ei reagoi lainkaan 0KT5:n kanssa. Sitä vastoin 0KT4-T-solujae on suurimmaksi osaksi OKT5-positiivinen (10 000 tutkitusta solusta 6800 on OKT5-positiivisia). Nämä tulokset osoit-30 tavat, että T-solujen 0KT5+-jae sekä aikaisemmin määritel ty TH2+-jae ovat OKT4+-jakeelle vastakkaisia. OKT4+-jae isältää auttaja-T-soluja, kun taas OKT5 -jae (kuten myös TH2+-jae) sisältää sytotoksisia ja heikentäjä-T-soluja. Tämän kuvion 4 mukaisen reaktiivisuuskaavan avulla on 35 myös mahdollista todeta OKT5 ja erottaa se muista vasta-aineista.

75231 16

Kuviosta 5 ilmenee, että OKT5+-T-solujae vaikuttaa CML:ään. Tämän populaation aiheuttama hajoamisaste on suurempi kuin fraktioimattoman T-solupopulaation. Sitä vastoin 0KT5 -T-solupopulaation aiheuttama hajoaminen on erit-5 täin vähäistä. Fraktioimattomat T-solut aktivoitiin MLC:ssä Laz 156 vastaan, ja sen jälkeen ne fraktioitiin 0KT5 -ja 0KT5 -jakeiksi. Sekä fraktioimattomat että fraktioidut T-solut analysoitiin CML:ssä 5^Cr:lla merkittyjen Laz 156-kohteiden suhteen käyttämällä erilaisia efektori/-10 kohde-suhteita (E:T). OKT5+-T-solujakeet sisälsivät efek-toripopulaation soluvälitteisessä lymfolyysissä. E:T-suh-teiden ollessa 5:1, 10:1 ja 20:1 OKT5+-T-solupopulaation spesifinen hajoittava vaikutus oli 40-, 58- ja 77-prosent-tinen. Eristetyn OKT5+-jakeen hajotusteho oli huomattavasti 15 suurempi kuin fraktioimattoman T-solupopulaation. Lisäksi 0KT5 -T-solupopulaation hajottava vaikutus oli merkittävästi pienempi kaikilla tutkituilla E:T-suhteilla. Otettaessa huomioon aikaisempi havainto, jonka mukaan TH2+-T-solujae ihmisessä vaikutti CMLiään, nyt tehty havainto tu-20 kisi sitä olettamusta, että TI^*- ja 0KT5 -T-solupopulaa-tiot määrittelivät samoja toiminnallisesti aktiivisia T-lymfosyyttipopulaatioita. Tämän erilaisen sytotoksisen tehon avulla on myös mahdollista identifioida OKT5-vasta-aine ja erottaa se musita vasta-aineista.

25 Toiminnalliset tutkimukset suoritettiin lymfoidi- populaatioilla, jotka oli fraktioitu fluoresenssiaktivoin-tiin perustuvalla solulajittelijalla (FACS). Tulokset on esitetty taulukoissa I...III, ja ne tukevat edelleen esitettyjä monoklonaalisen vasta-aineen OKT5 karakterisointi-30 menetelmiä.

Näissä tutkimuksissa fraktioimaton T-solupopulaatio käsiteltiin OKT5:llä (laimennus 1:500) ja G/M FITC:llä ja fraktioitiin FACS:illa OKT5+- ja OKT5 -jakeiksi. Näihin fraktioituihin populaatioihin lisättiin 5 % makrofageja 35 (populaatioiden puhtausaste, joka oli yhtä suuri tai suurempi kuin 95 %, otettiin huomioon) ennen in vitro-vilje- 75231 17 lyä. Fraktioimattomat T-solupopulaatiot ja eristetyt OKT5+- ja OKT5-T-solujakeet stimuloitiin PHA:lla,

Con A:11a, liukoisilla antigeeneillä ja alloantigeeneil-la populaatioiden proliferatiivisen vasteen määrittämi-5 seksi in vitro-olosuhteissa.

Fraktioimattomien T-solupopulaatioiden prolifera-tiivinen vaste PHA:n ja Con A:n läsnäollessa ilmenee taulukosta I. Fraktioimattoman T-solupopulaation prolifera-tiivinen vaste on maksimaalinen käytettäessä 1 ^ug PHA:ta 10 10^ solua kohti, käytettäessä 0,5 pg tai 0,1 yug PHA:ta 10^ solua kohti vaste heikkeni. Käsiteltäessä fraktiomat-tomia T-soluja OKT5:llä ja vuohessa valmistetulla hiiren FITC:llä proliferatiivinen vaste pysyi samana. Eristetyt 0KT5+- ja OKT5 -T-solujakeet käyttäytyivät sen sijaan PHA:n 15 läsnäollessa eri tavalla. OKT5 -solupopulaatio käyttäytyi kaikilla käytetyillä PHA:n annoksilla samalla tavalla kuin fraktioimaton T-solupopulaatio. OKT5+-solujen proliferatiivinen vaste oli sen sijaan huomattavasti pienempi kaikilla tutkituilla PHA:n annoksilla. Lisäksi havaittiin, että 20 PHA:n annoksen ollessa 0,1 ^ig 10^ solua kohti OKT5+-T-so-lut eivät lisääntyneet lainkaan, kun taas OKT5 -T-solujae ja fraktioimattomat solut vielä lisääntyivät. Toisaalta näiden jakeiden proliferatiivinen vaste Con A:n läsnäol-25 lessa oli samanlainen, joten tällöin näitä kahta solujaet-ta ei pystytty erottamaan toisistaan tai fraktioimattomas-ta T-solupopulaatiosta.

Seuraavaksi tutkittiin vastetta alloantigeenin läsnäollessa MLC:ssä sekä liukoisten antigeenien läsnäolles-30 sa. Taulukosta II ilmenee, että Laz 156:n läsnäollessa MLC:ssä fraktioimattoman T-solupopulaation, OKT5:llä ja G/M FITC:llä käsitellyn fraktioimattoman T-solupopulaation 2 - ja sekä OKT5 - että OKT5 -T-solujakeiden vaste oli samanlainen. Nämä kaksi solujaetta erosivat kuitenkin selvimmin 35 toisistaan tutkittaessa niiden proliferatiivista vastetta liukoisten antigeenien läsnäollessa. Kaikissa tutkituissa tapauksissa 0KT5+-T-solujae lisääntyi erittäin vähän liu- 75231 18 koisten antigeenien, tetanus-toksoidin ja sikotautianti-geenin läsnäollessa, kun taas 0KT5~-T-solujae lisääntyi hyvin.

Aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että T-lym-5 fosyyttien TH2+-populaatio yhdessä Con A:n kanssa aiheuttaisi autologisten lymfosyyttien lisääntymisen heikkenemisen MLC:ssä. Jotta saataisiin selville 0KT5+-T-solujakeen mahdollinen samanlainen heikentävä vaikutus, T-soluja aktivoitiin 48 tunnin ajan Con A:11a ja sen jäl-10 keen ne lajiteltiin monoklonaalisilla vasta-aineilla OKT5 ja OKT4 eri T-solujakeiksi. Sen jälkeen nämä fraktioidut T-solujakeet lisättiin autologisiin responderilymfo-syytteihin MLC:n aloittamiseksi. Taulukosta III ilmenee, että fraktioimattomat Con A:11a aktivoidut T-solut heiken-15 sivät autologisten solujen proliferaatiota MLC:ssa. Käsiteltäessä T-soluja monoklonaalisella vasta-aineella ja G/M FITCrllä tulos oli sama. Vaikka sekä OKT4+- että OKT5+-T-solut lisääntyivät Con A:11a aktivoituina, ainoastaan OKT5+-T-soluilla oli Con A:11a aktivoituina heikentävä vaikutus.

20 OKT4+-jakeella ei ollut heikentävää vaikutusta. Lisäksi OKT4+- ja OKT4 -Ti^ -jakeet sisältävän OKT5-populaation heikentävä vaikutus oli erittäin vähäinen verrattuna voimakkaasti heikentävään OKT5+-populaatioon.

Taulukosta IV ilmenee perifeeristen T-solujen ja 25 T-solujakeiden pitoisuuksien suhde eri tautitiloihin. Näitä suhteita voidaan käyttää diagnostisiin tarkoituksiin (esim. akuutin tarttuvan mononukleoosin toteamiseen) , jolloin otetaan verinäyte henkilöstä, jonka epäillään sairastavan jotakin näistä taudeista ja määritetään verinäyt-30 teestä T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuus. Taulukossa esitettyjen suhteiden avulla 0KT5-vasta-aine voidaan myös todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Diagnostisia menetelmiä, joissa käytetään muita samojen hakijoiden valmistamia monoklonaalista vasta-ai-35 netta tuottavia hybridomeja (OKT1, OKT3 ja OKT4), on kuvattu seuraavissa FI-patenttihakemuksissa 844703, 844704 ja 844705.

75231 19

Kyseisen vasta-aineen 0KT5 havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietyl-5 le antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua 10 alaluokkiin IgG^, IgG2a, IhG2b tai IgG^ tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimer-15 kiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää syto-toksisten tai heikentäjä-T-solujen ylimäärän toteamiseen antamalla potilaasta otetun T-solunäytteen reagoida OKT5-vasta-aineen kanssa. Sytotoksisia tai heikentäjä-T-soluja 20 esiintyy ylimäärin, jos yli 20...30 % perifeeristen T-so-lujen kokonaispopulaatiosta reagoi 0KT5:n kanssa. Tässä diagnostisessa menetelmässä OKT5-vasta-ainetta voidaan käyttää sellaisenaan tai voidaan käyttää OKT5:n ja muiden vasta-aineiden yhdistelmää (esim. 0KT3 ja OKT4), kuten 25 taulukossa IV on esitetty. Tällaisten eri vasta-aineiden ja T-solujen tai T-solujakeiden välisten reaktiivisuus-kaavojen avulla tietyt tautitilat voidaan todeta tarkemmin kuin aikaisempia diagnostisia menetelmiä käyttäen.

Vasta-ainetta OKT5 voidaan sisällyttää diagnostisiin 30 koostumuksiin, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKT5-vasta-ainetta ja dianostisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista .

| 75231 20 *H * 01 oo rH cn m oo vo •X <N r—I 00 i—i vo vo

<0 CN CO rH 04 VO

"D £* „ CN

^ Smvomr^^rrHoj 0 0 +l +1 +1 +1 +1 +l +1

1 I m m vo ctv fH

E-ι I σι vo σν vo o in ovi £>νοσ»νο(ΝΐηοιΗ δ S co r—I m oo σ o •ηθιηιηο400Γ0*3·

•H

0

H

•P

Tt) r-~ o r-ι o <n

Ih m r- m oo oo y-ι σ> o vo >h σν

4J oo CN

in ^ σι rH ι-H CO Γ0 I—I

ä? Q +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

O W

I <T\ »H CT\ CO <T\ CO \£) TO -f rH CM O') VO O CO Γ0 rHLn^roocoor^oo.—1

"φ ^ Ή O' O' VO

¢) Ο Ή σ\ ro ro

•S

cd ro 4J :<d

tfl rH

fij pH

> S g m h . ro in σ oo vo ro

Qjtjovovooomo' tn_orococNor' h -h S en _ ! \ r-H ro σ r—i t}· 04 O (0 vo

-¾ ro -H +1 +1 -H +1 +1 -H

"do σι rH rH <n -vr tn pH

i—li—ΐιηΓ'Οοοσ cno m 3 Λί i vo oo σ> vo r-t rro Q 56

EnCO^r^p-ir^r^fN

g'-'un'vrcNoo·'»^' ro ro c dl ro 3 m σν r» ro ro en i—l ro σν t" σν H vo

0 CN VO I-H VO Γ" I—I

tn ^ votncNCNCNinp'

„ Φ -M +1 +1 -H +1 -H -H

3 4-> 4-> d) tn 3 σνιη «a* pH o r- «h -h ro ή 'a· ro m Γ' vo r-~ oo g > O i—i ov r- ro ·*τ m 4-i e J i—t oo σ> ph oo 4-l®fH VO'S· rH o h< ro 1 .3 -1 £

O S \ \ -H

•r| φ I vo \ Co tji \ 3 4-Ιζτ>0·Ηθ CP \ 3 3 m p

X Q H 4 rH 3 tr, \ \3 H

l5 4) +J O \ \ 3 \ Φ U -H m 4J Dl — \ — o -—- in —- — > tistd-P 3 mtd (dmtdcNtdord MS \ ^ 3 rH 3 in 3 rH 3in 3 Φ _ CD td O < I ' rH '—' |—| '— rH '—' rH 3 ro

44 H rH — — Q O O O O 0 H C

h 3 '—ro in'— tn<tn<tni<tnro5i pH h ^ Ή Q) Q-H < rH *£ VO < VO e VO C VO 3 VO *—I 3 fi 4-> ΚΟΚΟ ΚΟΟΟΟΟΟΟ’Λ-Η (S 0) OitOCUrHlirHOrHOrHOrH^ro 75231 21 n «sr τ I ITI O Γ" o vo M o i—i m oo o

C 2 ro IT> !—I H

JD rH n (N ΓΟ I—1

'O o m l" ro M

•h tn +1 +1 +1 +1 Φ I +1 +1 +1 +1 .V En VO T 00 'S·

f0 I ro O I—I CO VO Γ~ ^ΐ· rH

•n l vo m tn mainio 3 in i—l o vo r*H E-ι m σ\ h O o m m co m r-' ω O ή eri id m § ί -m 0)

2 m Γ" oo n o (H

-P r—i o oo r~ o m •HO -P m m oo cm 0 :ra 2 'a*

H C rH in O Γ' ·νΓ T

-P W Q rH

M :td tn -H +1 +1 +1 +1 +1 -H

p rH I „ +1 H eh com m m m oo ip c l m τ τ τ m r-· m in Φ + oo τ m γ» co t rn nJ -h m m

i—I C E"* ID O’ i—I

i—I Φ rH i—I rH

Φ Φ ö M rH

1 s '3 t! 1 ta 0 :<ΰ

-P rH rH

O) rH rH

(0 (0 ·· > — rtJ U r-l nJ -n H m i—i oo h rH MO o tn vo _ m r" vo

M rH C tl·· T rH 00 OmiOrH

Φ Φ „ C. n- vo in " vd O tn -h 2 rH C o m Λί -h c \ Φ m m m m ri> ·η m 3 s| i. « -H +1 +1 +1 8+1+1 +i +i 2 C-h1 h· m o r- «H vd m τ to o +> in rH ao <t m m n- m r~ M rHc Eh τ η- m rH r~n-m -¾ to * O O ιΗίηττ m t~~ co

^ g ^ Tm m t vd rH

ta -h m O

S -H 00 VD rH

•r~irH m m vo oo t τ 2 vd vo M t ^ in •h ai r~ m t

0 -P mm rH TT rH

tn tn ι-n m mt^-rHrH

^ > +l +l +1 +i +1 +| +| +i CC 2 r'- vo o vo moorH·^· Φ Φ ·η h1 o o oo mm τ vd •H c 0 inmmrH vd m in c *H tn Q > j vo rH τ m m vo -P-HH omm τ vo m

r -H rH

1 *

O φ I -H II

S a s u s -s a jj 5B -g . ϋ g £ a jh jo i 4J ’3 φ V "-P φ « 9 3# 1 9 3 5

H i S O -S' -H S o S -H

o-h u +» ji+iM y+j λφμ s iä ^ tn § ^ g tn tn ^ 22 s 75231 Ό rH (Τι 00 <N ιΗ

-MIC— t— Γ- (VI

Ui

H

(N

O

" ro ># vo m m c m m r- r" m o o in t" oo io tr gi -h O e o oo cn o oo

« -rl rH rH

[d +1 +1 +1 +i +1 +1 SE CT\ 00 ro rH (n in

>1 (Tl 00 CTi rH (M CO

4-> r-l r-~ CO Γ' VO ro ® <Ti m oo σι o CO 00 (N I—I I—I 00 r~ *r-l ϋ H c

H

o y £ i jj -¾ 20 M roro i—I (N m

(O Ui Q I f« lO 00 | rH

H .8 $ .S " β < 00 VO 00 VO (N (Tl

CN rH 00 CO 00 CO

e -h σν r~ r~ (ΝΓ'-οο O -H r—I (N rl <f in :g O ^ +l +l +l +l +l +t :m "E O' m ro i tj> oo •P C&r^voo oo m m

-P -P CO O O Γ~~ (Tl rH

•h a> i .H OK oo rH σι -vr <ti r-

•(0 M ro Γ' (N CM rl ID

i> s

•n I

3 -rl

rH O

0 -H I

Ui -P -P P Q I

^ S ä < IS!, + 1 :(0 in -*-» e -H '—' <<<

m tn -P 5 -P c O

§ * £„ 1° II!* ί § S S

Sv S 8 S3 i3l|-°0n+, 'm öä äS *8 «S8?£ E S s S8 £g bb fiiSSB *ää 23

Taulukko IV 75231

Perifeeristen T-solujen pitoisuudet eri tautitiloissa T-solujen pitoisuudet__ 5 Tautitila 0KT3+ 0KT4+ 0KT5+ . .... .............^^

Primäärinen maksa- N + - kirroosi (2)

Multippeliskleroosi - N - (pitkälle edennyt)(8) 10 Myasthemia Gravis (ei- 000 hoidettu varhaisessa vaiheessa) (3)

Akuutti elinsiirto (3) 0 tai - - 0

Agammaglobulinemia

Tyyppi I + 15 Tyyppi ii o

Hyper-IgE (4) - N O tai -

Akuutti tarttuva mono- + 0 tai — ++ nukleoosi (4) x)

Hodgkinsin tauti

20 Vaiheet I & II N N N

Vaiheet III & IV — N N

N = normaali pitoisuus 0 = puuttuu kokonaan 25 + = normaalia suurempi ++ = huomattavasti normaalia suurempi - = normaalia pienempi — = huomattavasti normaalia pienempi 30 x) nämä pitoisuudet muuttuvat normaaleiksi noin yhtä viikkoa aikaisemmin kuin kliiniset oireet häviävät "Suluissa olevat arvot ilmaisevat tutkittujen potilaiden lukumäärän".

Claims (2)

24 Patenttivaatimukset 7 5 2 31

1. Diagnostinen menetelmä heikentäjä-T-soluj.en puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisellä, t u n -5 n e t t u siitä, että potilaasta otetun T-solunäytteen annetaan reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa luokkaan IgG kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8013 tai 8016, joka on valmistettu yhdistämällä 10 hiiren myeloomasolulinjän soluja ihmisen tymosyyteillä immunoidun hiiren pernasoluihin, ja joka vasta-aine a) reagoi yli 90 %:n kanssa sytotoksisia ja hei-kentäjä-TH2+-T-soluja (joita on 20-30 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista) , mutta ei reagoi ih- 15 misen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) ei reagoi -T-solujen eikä 0KT4+-T-solujen 20 kanssa, mutta reagoi 68 %:n kanssa OKT4 -T-soluja, d) määrittelee T-solupopulaation (0KT5+), joka on voimakkaasti sytotoksinen ja jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä, normaaleina pi- 25 toisuuksina kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja normaalia suurempina pitoisuuksina tyyppiä I olevassa agam-maglobulinemiassa ja akuutissa mononukleoosi-infektiossa, ja määritetään, kuinka suuri osa koko perifeerisestä T-solupopulaatiosta reagoi vasta-aineen kanssa.

2. Diagnostinen menetelmä akuutin mononukleoosi- infektion toteamiseksi ihmisessä, tunnettu siitä, että potilaasta otetun T-solunäytteen annetaan reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa ainakin yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, joka on OKT3, OKT4 tai 35 OKT5, ja määritetään, kuinka suuri osa koko perifeerisestä T-solupopulaatiosta reagoi vasta-aineen kanssa.