FI75366C - Foerfarande foer framstaellning av en komplement-fixerande monoklonal antikropp mot maenskliga supressor-t-celler medelst en hybridcellinje. - Google Patents

Description

1 75366

Menetelmä komplementin sitovan monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen heikentäjä-T-soluille yhden hybridisolulinjan avulla 5 Keksintö kohdistuu menetelmään komplementin sito van monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen heikentäjä-T-soluille. Menetelmässä käytetään hyväksi uutta hybridisolulinjaa, jonka avulla voidaan valmistaa komplementin sitova monoklonaalinen vasta-aine ihmisen 10 normaaleista heikentäjä-T-soluista löydetylle pinta-antigeenille. Tätä vasta-ainetta voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiilin ren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin ^Nature 256 (1975), ss. 495 - 497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns. monoklonaalisen) vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen 20 (ns. hybridomien) valmistusta on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta on yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön /ks. esim. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toim. F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, 25 Springer-Verlag 1978 sekä sen sisältämät kirjallisuusviitteet; C. J. Barnstable et al., Cell 14 (toukokuu 1978), ss. 9 - 20; P. Parham ja W. F. Bodmer, Nature 276 (1978), ss. 397 - 399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2 (1978), kappale 25, toim. D. M. Wier; ja 30 Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979), ss. 15 - Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybri-domeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistus-35 menetelmä periaatteessa tunnetaankin hyvin, vaikeuksia 2 75366 esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hyb-ridomaa, siinä onnistutaan, ja että onnistuttaessa hybri-doma tuottaa vasta-ainetta, tai että näin muodostuneella 5 vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riip puu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hyb-ridoman eristysmenetelmästä.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa 10 vain harvoissa tapauksissa /ks. esim. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 (1978), ss. 66 - 69 ja 164 - 169}. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastioidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin 15 valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeenei-hin. Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut ihmisen lym-fosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Xskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvattu 20 sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jotka tuottavat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta ^cs. esim. E. L. Reinherz et ai., J. Immunol. 123 (1979), ss. 1312 - 1317; E. L. Reinherz et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 76 (1979), ss. 4061 - 4065; ja P. C. Rung et ai., 25 Science, 206 (1979), ss. 347 - 349^.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu, eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista.

30 Erilaistuneita soluja nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja 35 osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka T-solut 3 75366 eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immunologi-5 sissa järjestelmissä säätelevästi. Tämän solujen yhteis toimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin, eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista 10 kantasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä. 15 T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja-", "heikentäjä-" ja "tappaja-" T-soluiksi, nämä joko hidastavat tai nopeuttavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta 20 äskettäin on kuvattu niiden toimintaa ihmisen elimistössä /ks. esim. R. L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977), ss. 221 - 232; ja L. Chess ja S. F. Schlossmann, "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens"-25 niminen artikkeli teoksessa "Contemporary Topics in Immunology", toim. 0. Stutman, Plenum Press 1977, vol 7, ss.

363 - 379).

Eri T-solulajien ja -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregula-30 toristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskas-vainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- vai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa nämä kaksi lymfosyyttiryhmää täytyy pystyä erot- S* 35 tamaan toisistaan £ks. esim. A. C. Aisenberg ja J. C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975), s. 300; D. Bel-pomme et ai., artikkeli teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", toim. S. Thierfelder et al., 75366

Springer, Heidelberg 1977, ss. 33 - 45; ja D. Belpomme et ai., British Journal of Haematology 38 (1978), s. 85^.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa tautitiloissa ja agammaglobuline-5 miassa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon.

On mahdollista, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agam-maglobulinemiassa tiettyjä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy 10 ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Pahanlaatuisiin tauteihin liittyy yleensä "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä. Joissakin leukemiamuodoissa tietyssä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epä-15 tasapaino tai ylimäärä havaitsemaan tai määrittämään se, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin £ks. esim. J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses"-niminen artikkeli teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20, Sprin-20 ger-Verlag 1977, ss. 17-23, ja sen sisältämät viitteet; sekä E. L. Reinberg et ai., J. Clin. Invest. 64 (1979), ss. 392 - 397).

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immuno-globuliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä. 25 Tyypissä I ei muodostu immunoglobuliinia, koska "heiken-täjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu "auttaja"-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin 30 normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan näiden B-solujen toimintaa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobuliinin tuotantoa tai keskeyttää sen kokonaan. Agammaglobuline-miatyyppi voidaan siten määrittää sen perusteella, esiin-35 tyykö "heikentäjä"-T-soluja ylimääärin vai onko "auttaja"-T-soluista puutetta.

Il 75 3 6 6

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa autoimmuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin esiintyville T-solulajeille, vasta-aineet voi-5 vat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi "auttaja"-T-solusyöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvai-mia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemia-muotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle "auttaja"-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista 10 tautia, joka aiheutuu "auttaja"-T-solujen ylimäärästä, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja (esim. pahanlaatuisia tautitiloja tai tyyppiä I olevaa agammaglobulinemiaa), jotka aiheutuvat "heikentäjä"-T-so-lujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle 15 vasta-ainetta, joka on spesifinen "heikentäjä"-T-soluanti- geenille.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns» ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini, eli ATG), ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoi-20 siksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elin tensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia 25 ^Ics. esim. Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976), ss. 155 - 163 ja julkaisun sisältämät viitteet^.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifioimi-30 seen ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi (esimerkiksi) auto-35 logisilla ei-allogeenisillä B-soluilla niiden vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-haluttu selektiivisyys. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheessa. Adsorboidut ja 6 75366 puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-aine-molekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi im-5 munointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen useita antigeenejä vastaan, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen 10 vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10°.

Tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteelli-15 suuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja on kuvattu mm. Chess'in ja Schlossmann'in edellä mainitussa artikkelissa (sivulta 365 alkaen) sekä edellä mainitussa artikkelissa "The Chemical and Engineering News"-lehdessä.

Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT8), joka pys-20 tyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta pinta-antigeenille, jota on löydetty ihmisen normaaleista "hei-kentäjä"-T-soluista (noin 30 % ihmisen normaaleista perifeerisistä soluista) ja noin 80 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei B-soluista eikä nollasoluista ja 25 alle 2 %:lta luuydinsoluja. Lisäksi monoklonaalinen vasta-aine OKT8 sitoo komplementin. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle pinta-antigeeni-determinantille, jota esiintyy noin 30 %:lla ihmisen normaaleja T-soluja, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen 30 lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka ei-35 vät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen "heikentä-jä"-T-solujen antigeenille). Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä antigeenin tuottamiseksi, jolloin eläinten 7 5 3 6 6 käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä, eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistus-vaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

5 Sekä esillä olevasta hybridomasta, että sen tuotta masta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKT8", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Tämä hybridoma on tallennettu 18.09.1979 laitokseen The American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn 10 Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., tallennusnumerol-la ATCC CRL 8014.

Monoklonaaliselle vasta-aineelle OKT8 on tunnusomaista, että se a) reagoi heikentäjä-T-solujen kanssa (noin 30 % 15 ihmisen normaaleista T-soluista), alle 2 %:n kanssa ihmisen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan B-solujen eikä nollasolujen kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 20 c) reagoi noin 34 %:n kanssa käsittelemättömiä pe rifeerisiä T-soluja, 95 %:n kanssa perifeerisiä T-soluja, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, ei lainkaan perifeeristen T-solujen 25 kanssa, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 75 %:n kanssa käsittelemättömiä tymosyyttejä, 55 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla 30 valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 90 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8001 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, eikä lainkaan tymosyyttien kanssa, jotka on etukäteen käsi-35 telty hybridisolulinjän ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 8 75366 d) reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen Thy 3, Thy 4 tai Thy 4-6 tavallisiin tymosyyttei-hin tai vaiheen Thy 8 myöhäisiin tymosyytteihin, mutta ei reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen 5 I tymosyytteihin tai vaiheen Thy 3-4 tavallisiin tymosyytteihin, e) reagoi solulinjojen CEM- ja MOLT-4 kanssa, mutta ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja f) määrittelee T-solupopulaation (0KT8+), jota 10 esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirrosissa ja multippeliskleroosissa, puuttuu kokonaan tai esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina akuutissa elinsiirtoreaktiossa, huomattavasti normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa tarttuvassa mononukleoo-15 sissa, puuttuu täysin myasthenia graviksessa ja esiintyy normaaleina pitoisuuksina kaikissa Hodkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa,

Monoklonaalisen vasta-aineen OKT8 valmistus hybri-doman ATCC CRL 8014 avulla on kuvattu patenttivaatimuksis-20 sa 1 ja 2.

Hybridoma valmistettiin pääpiirteittäin Milsteinin ja Kohlerin esittämällä menetelmällä. Tässä immunisoitiin ensin hiiriä normaaleilla ihmisen tymosyyteillä ja sen jälkeen immunisoitujen hiirien pernasolut yhdistettiin hiiren 25 myeloomasolulinjän soluihin, ja viljelmän pintanesteestä seulottiin ne hybridomat, jotka tuottivat ihmisen terveisiin E-rosettipositiivisiin T-soluihin ja/tai tymosyytteihin selektiivisesti sitoutuvaa vasta-ainetta. Halutut hybridomat kloonattiin ja karakterisoitiin. Tulokseksi saatiin 30 hybridoma, joka tuottaa vasta-ainetta (OKT8) ihmisen normaalien heikentäjä-T-solujen (noin 30 % ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista) pinta-antigeenille. Tämä vasta-aine reagoi noin 30 %:n kanssa ihmisen normaaleja T-so-luja, sen lisäksi se reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen 35 normaaleja tymosyyttejä, alle 2 %:n kanssa luuydinsoluja, eikä lainkaan B-solujen eikä nollasolujen kanssa.

li 9 75 3 6 6

Ottaen huomioon tähän asti esiintyneet vaikeudet ja huonot tulokset käytettäessä pahanlaatuisten tautien solulinjoja antigeeninä, on yllättävää, että esillä olevalla menetelmällä saatiin aikaan haluttu hybridoma. On ko-5 rostettava, että hybridisolujen valmistuksessa esiintyvien arvaamattomien tekijöiden vuoksi ei pystytä tietyllä anti-geeni/solu-yhdistelmällä saatujen tulosten perusteella ennustamaan jonkin muun antigeeni/solu-yhdistelmän käyttäytymistä. On nimittäin havaittu, että käytettäessä antigee-10 nina pahanlaatuisen taudin T-solulinjoja tai solun pinnalta eristettyjä puhdistettuja antigeenejä, ei yleensä ole saatu onnistuneita tuloksia.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus ja karakterisointi on tarkemmin selostettu keksinnön ku-15 vauksessa ja esimerkeissä.

Hybridoman valmistusmenetelmä koostuu pääpiirteittäin seuraavista vaiheista: A. Hiiriä immunisoidaan normaaleilla ihmisen tymo-syyteillä. Yleensä naaraspuoliset CAF^-hiiret on havaittu 20 tähän parhaiten soveltuviksi, mutta myös muiden hiirikan-tojen käyttöä voidaan ajatella. Immunisointiaikataulun ja tymosyyttipitoisuuden pitäisi olla sellainen, että saadaan käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä splenosyyt-tejä. Kolme immunisointia 2 x 10 solulla/hiiri/ruiske 25 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta, 14 päivän välein on havaittu tehokkaaksi.

B. Pernat poistetaan immunisoiduista hiiristä, ja valmistetaan pernasuspensio sopivaan väliaineeseen. Sopiva väliainemäärä on noin 1 ml pernaa kohti. Nämä koemenetel- 30 mät ovat sinänsä tunnettuja.

C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään sopivasta solulinjasta saatuihin hiiren myeloomasoluihin sopivan yh-distämiskatalysaattorin avulla. Edullinen suhde on noin 5 g pernasolua yhtä myeloomasolua kohti. Noin 10 splenolyytil-35 le sopivan yhdistämiseen käytetyn väliaineen kokonaistilavuus on noin 0,5 - 1,0 ml. Monet hiiren myeloomasolulinjät ovat tunnettuja ja saatavissa yleensä akateemisista tutkimuslaitoksista tai erilaisista talletuspankeista, esimerk- 10 75366 kinä mainittakoon The Salk Insitute Cell Distribution Center, La Jolla, California, U.S.A. Käytetyn solulinjan pitäisi edullisesti kuulua ns. lääkeaineille vastustuskykyiseen lajiin, jotta myeloomasolut eivät eläisi selek-5 tiivisessä väliaineeessa, jossa hybridisolut puolestaan elävät. Yleisimpään lajiin kuuluvat 8-atsaguaniinille vastustuskykyiset solulinjat, joista puuttuu hypoksantii-niguaniinifosforibosyyli-transferaasientsyymi, ja täten tämä laji ei elä HAT-väliaineessa (sisältää hypoksantii-10 nia, aminopteriiniä ja tymidiiniä). On myös yleensä edul lista, että käytetty myeloomasolulinja kuuluisi ns. "ei-erittävään" lajiin, jolloin se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, mutta myös vasta-aineita tuottavia lajeja voidaan käyttää. Kuitenkin eräissä tapauksissa vasta-aineita 15 tuottavat myeloomasolulinjät voivat olla edullisia. Edul linen solujen yhdistämiseen käytettävä katalysaattori on polyetyleeniglykoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 1 000 - 4 000 (kaupallisesti saatavissa nimikkeellä PEG jne.), mutta myös muita sinänsä tunnettuja yhdistämis-20 katalysaattoreita voidaan käyttää.

D. Vapaiden pernasolujen, vapaiden myeloomasolujen ja yhdistettyjen solujen seos laimennetaan, ja laimennuksia viljellään erillisillä alustoilla selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut kuolevat noin 1 25 viikossa. Laimennus voi olla ns. rajaava laimennus, jossa laimennukseen käytetyn nesteen tilavuus on tilastollisesti laskettu niin, että pystytään eristämään haluttu määrä soluja (esim. 1 - 4), kullekin erilliselle alustalle (esim. mikrotitrauslevyn kuhunkin syvennykseen). Väliai-30 neena käytetään esim. HAT-väliainetta, jossa lääkeaineil le (esim. 8-atsaguaniinille) vastustuskykyinen vapaa myeloomasolulinja tuhoutuu. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niiden lisääntymiskyky on rajattu. Täten tietyn ajan kuluttua (noin viikossa) vapaiden perna-35 solujen lisääntyminen lakkaa. Yhdistetyt solut sen sijaan lisääntyvät jatkuvasti, koska ne ovat toisaalta peräisin myeloomasoluista, jotka on eristetty pahanlaatuisesta kasvaimesta, ja toisaalta pernasoluista.* jotka pystyvät elämään selektiivisessä väliaineessa.

11 75366 E. Tarkastetaan, löytyykö eri kasvatusalustojen pin-tanesteestä, joka sisältää hybridoman, E-rosettipositiivisil-le puhdistetuille ihmisen T-soluille tai tymosyyteille spesifistä vasta-ainetta.

5 F. Valikoidaan (esim. rajaavalla laimennuksella) ja kloonataan hybridomat, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta .

Kun haluttu hybridoma on eristetty ja kloonattu, muodostuvaa vasta-ainetta voidaan tuottaa eri tavoin. Puh-10 tainta monoklonaalista vasta-ainetta saadaan viljelemällä haluttua hybridomaa in vitro sopivassa väliaineessa sopivan pituisen ajan, minkä jälkeen haluttu vasta-aine otetaan talteen pintanesteestä. Sopiva väliaine ja viljelyäjän pituus ovat tunnettuja tai ne voidaan helposti määrittää. Tämä in vitro 15 -menetelmä tuottaa käytännöllisesti katsoen monospesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia spesifisiä immunoglobuliineja. Muita immunoglobuliineja on mukana pieni määrä, koska väliaine sisältää ksenogeenistä seerumia 20 (esim. vasikan sikiöseerumia). Tällä in vitro -menetelmällä ei kuitenkaan saada tiettyihin tarkoituksiin riittävää vasta-ainemäärää tai riittävän suurta vasta-ainepitoisuutta, koska monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuus on vain noin 50 pg/ml.

25 Haluttaessa valmistaa paljon suurempia pitoisuuksia hieman epäpuhtaampaa monoklonaalista vasta-ainetta, haluttu hybridoma voidaan ruiskuttaa hiiriin, edullisesti syn-geenisiin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen hiiriin 30 sopivan inkubaatioajan kuluttua, mikä johtaa halutun vasta-aineen pitoisuuden kohoamiseen hiiren veressä (noin 5-20 mg/1) ja peritoneaalisessa tulehdusnesteessä (vesivatsa). Vaikka näiden hiirten veressä ja vesivatsassa on myös 12 75366 tavallisia vasta-aineita, näiden pitoisuus on vain noin 5 % monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuudesta. Koska sitäpaitsi nämä. tavalliset vasta-aineet eivät, ole ihmisen vastaisia spesifisyydeltään, eristetyistä vesivatsoista ja seerumista 5 saatu monoklonaalinen vasta-aine ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan kontaminoivia ihmisen vastaisia immuno-globuliineja. Tämän monoklonaalisen vasta-aineen tiitteri on korkea (aktiivinen laimennuksissa 1:50 000 ja myös suuremmissa laimennuksissa), ja sen spesifisen ja ei-spesifi-10 sen immunoglobuliinin suhde on korkea (noin 1/20) . Sellaiset muodostuneet immunoglobuliinit, joiden rakenteessa on kevyitä K-myeloomaketjuja, ovat ei-spesifisiä, ei-vaikutta-via peptidejä, jotka pelkästään laimentavat monoklonaalis-ta vasta-ainetta vaikuttamatta haitallisesti sen spesifi-15 syyteen.

Esimerkki 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus A. Immunisointi ja somaattinen solujen hybridisointi Naaraspuolisiin CAF^-hiiriin (Jackson Laboratories, 20 hiirien ikä 6-8 viikkoa) ruiskutettiin intraperitoneaalises- 7 ti 2 x 10 ihmisen tymosyyttiä 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein. Neljän päivän kuluttua kolmannesta immunisointikerrasta hiiristä poistettiin pernat, ja näistä valmistettiin yhtä solulaatua 25 sisältävä suspensio puristamalla kudos ruostumattomasta teräksestä valmistetun seulan lävitse.

Solujen yhdistäminen suoritettiin Kohlerin ja g

Milsteinin kehittämällä menetelmällä. 1 x 10 splenosyyttiä yhdistettiin 0,5 ml:ssa yhdistämisväliainetta, joka koos-30 tui 35 %:sta polyetyleeniglykolia (PEG 1000) ja 2 %:sta dimetyylisulfoksidia RPMI-1640 -väliaineessa (Gibco, Grand Island, NY), 2 x 10^ P3X63Ag8Ui-myeloomasoluun, jotka toimitti tohtori M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Nämä myeloomasolut erittävät IgG^:n K-kevyitä 35 ketjuja.

Il 13 75366 B. Hybridoman eristys ja kasvatus

Kun solut oli yhdistetty, niitä viljeltiin HAT-väli-aineessa (sisälsi hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidii-niä) 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä kosteassa 5 atmosfäärissä. Useita viikkoja myöhemmin 40-100 jal viljelmien hybridomapitoista pintaliuosta siirrettiin pellettiin, joka sisälsi 10° perifeeristä lymfosyyttiä, jotka oli jaettu E-rosettipositiivisiin (E+) ja E-rosettinegatiivisiin (E ) populaatioihin, nämä oli valmistettu terveiden ihmisten ve-10 restä Mendesin kuvaamalla menetelmällä /J. Immunol. Ill (1973) 860.7. Näihin soluihin sitoutuneet hiiren hybridoman tuottamat vasta-aineet todettiin epäsuoralla immunofluore-senssimenetelmällä. Viljelmien pintaliuoksissa inkuboidut solut värjättiin fluoresiinilla käsitellyllä vuohessa val-15 mistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA, F/p =2,5) ja fluoresoivat vasta-aineella värjätyt solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla FC200/4800A (Ortho Instruments, Westwood, MA) esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Hybridomaviljelmät, jotka sisälsivät 20 spesifisesti E+-lymfosyyttien (T-solujen) ja/tai tymosyyt-tien kanssa reagoivia vasta-aineita, valikoitiin ja kloonattiin kahdesti rajaavalla laimennusmenetelmällä syöttösolujen läsnäollessa. Sen jälkeen kloonit siirrettiin intraperito- 7 neaalisesti ruiskuttamalla 1 x 10 tietyn kloonin solua 25 (0,2 ml:n tilavuudessa) CAF^-hiireen, joka oli esikäsitel- ty 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaanilla, jota toimittaa Aldrich Chemical Company kauppanimellä "Pristine". Näiden hiirien pahanlaatuisia vesivatsoja käytettiin sen jälkeen lymfosyyttien karakterisoimiseen esimerkissä 2 esitetyllä 30 tavalla. Hybridivasta-aineen OKT8 todettiin standardimenetelmillä kuuluvan IgG -alaluokkaan.

2a 1A 75366 14

Esimerkki 2 0KT8-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A, Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen

Terveiden vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 5 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumai set verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoin-timenetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH) Boym'in esittämällä tavalla ^Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (suppl. 97) (1968), s. 11). Fraktioimattomat yksitumai-10 set solut erotettiin pinta-Ig+ (B-) ja pinta-Ig” (T- ja nollasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab1) 2~pylväskromatografiaa, menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974). T-solut erotettiin talteen E-rosetoimalla Ig -populaatio 5 %:lla 15 lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentri-fugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m

O

NH^Clrlla (10 ml 10 solua kohti). Näin saatu T-solupopu-laatio oli <2-%:isesti EAC-rosettipositiivinen ja 20 >95-%:isesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig (nolla-solu) -populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5-%:isesti E-positiivinen ja *2-%risesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-kanta ero-25 tettiin Sephadex G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%risesti pinta-Ig-positiivinen ja <5-%risesti E-positiivinen.

Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin terveiden 30 vapaaehtoisten luovuttajien taaemmasta suoliluuharjusta punktiomenetelmällä.

B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja 35 joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiö-

II

15 7 5 3 6 6 seerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraa-vaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa 5 ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymo- syytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja -90-%risesti E-rosettipositiivisia.

C. T-solulinja ja T-solujen akuutin lymfoblastileu-kemian solut 10 T-solulinjat CEM, HSB-2 ja MOLT-4 toimitti tohtori H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukemiasolut saatiin 25:Itä T-solujen akuuttia lymfoblas-tileukemiaa sairastavalta potilaalta. Nämä yksittäiset kasvaimet oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu 15 kuuluvan T-solukasvaimiin, koska kasvainsolut muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (>20 % E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten hetero-antiseerumien, anti-HTL (B.K.)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten edellä on kuvattu. Kasvainpopulaatioita kylmä-20 säilytettiin -196°C:ssa nestemäisessä typessä 10-%:isessa dimetyylisulfoksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumis-sa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat >90-%risesti blasteja sytosentrifugivalm·» steiden Wright-Giemsa-morfologialtaan. 25 Esimerkki 3

Solufluoroqrafinen analyysi ja solujen erotus Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solu-populaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetel-30 mällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solufluorografia FC200/4800A (Otho Instruments). Tällöin 10 x 106 solua käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ol-35 lessa 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 min ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 min, reaktio- 16 75 366 tuote sentrifugoitiin ja pestiin 3 kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuusmalli oli sa-5 manlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 mlrlla suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä, joka oli saatu intraperito-neaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidus— ta CAFj-hiirestä.

Kokeissa, joissa tutkittiin vasta-aine- ja komp-lementtivälitteistä lymfolyysiä, tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja viljeltiin yön yli, minkä jälkeen seurasi selektiivinen hajotus ja sen jälkeen solut analysoitiin 15 solufluorografilla.

Esimerkki A

Lymfoidipopulaatioiden hajotus monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla 40 x 10^ perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä 20 lisättiin 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). So-lupelletteihin lisättiin 0,8 ml vasta-ainetta OKT3, OKT4 tai OKT8 tai tavallista vesivatsanestettä (vertailuaine), jotka oli laimennettu suhteessa 1:200 PBS:llä, seokset suspendoitiin ja inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuutin ajan.

25 Sen jälkeen vasta-aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, seos suspendoitiin ja sitä inkuboitiin edelleen 37°C:ssa 60 min vesihauteessa, joka oli liitetty ravistelijaan. Inkuboin-nin päätyttyä solut sentrifugoitiin ja elinkykyiset solut 30 määritettiin Trypan-sinisellä. Solut laskettiin, pestiin 2 x 5-%:isella FCS:llä ja asetettiin lopulliseen väliaineeseen RPMI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY), joka sisälsi 20 % ihmisen AB+-seerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM 35 HEPES-puskuria ja 0,5 % natriumkarbonaattia, ja seosta inkuboitiin yön yli 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CC^.

Il 17 75366

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille, joiden on annettu reagoida OTK^rn ja muiden monolonaalis-ten vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kans-5 sa. Taustafluoresenssivärjäys määritettiin lisäämällä ku hunkin populaatioon suhteessa 1:500 laimennettua vesivat-sanestettä hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuottavaa kloonia, ja inkuboimalla seosta.

Kuviossa 2 on esitetty tymosyyttien erilaistumi-10 nen kateenkorvassa.

Hybridooma valmistettiin, ja monoklonaalinen vas-ta-aiue valmistettiin ja karakterisoitiin edellä olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla. Vaikkakin suuria määriä esillä olevaa vasta-ainetta valmistettiin injektoimalla 15 esillä olevaa vasta-ainetta intraperitoneaalisesti hii riin ja erottamalla hiiristä pahanlaatuiset vesivatsat, on selvää, että hybridomaa voidaan viljellä myös alalla hyvin tunnetuilla in vitro-menetelmillä, jolloin vasta-aine erotetaan viljelmien pintanesteestä.

20 Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-ainei den OKT6, OKT8, OKT9 ja OKT10 reaktiivisuus ihmisen eri lymfoidisolupopulaatioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine OKT8 reagoi noin 30 %:n kanssa ihmisen normaaleja T-soluja, noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyytte-25 jä, alle 2 %:n kanssa luuydinsoluja eikä lainkaan B-solu-jen eikä nollasolujen kanssa. Muun muassa tämän reaktiivi-suuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT8 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu 30 fluoresenssispektri ihmisen normaaleista tymosyyteistä koostuvalle suspensiolle, jonka on annettu reagoida vasta-aineiden OKT3, OKT4, 0KT5, OKT6, OKT8, OKT9 ja OKT10 (kaikkien laimennussuhde 1:500), sekä G/M FITC:n kanssa. Samanlaiset reaktiivisuuskaavat saatiin 12 muulle tutkitul-35 le ihmisen normaalille tymosyyttipopulaatiolle. Kuviosta ilmenee, että reaktiivisuusprosentissa ja fluoresenssi-intensiteetissä on merkittäviä eroja kaikkien tutkittujen is 75366 monoklonaalisten vasta-aineiden välillä. Esimerkiksi OKT9 reagoi noin 10 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa heikko, kun taas OKT5, OKT6, 0KT8 ja OKT10 reagoivat noin 70 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresens-5 si-intensiteetin ollessa voimakkaampi. OKT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyttejä, sijoittuu fluoresenssi-intensiteetin suhteen OKT9:n ja sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden väliin, joiden fluoresenssi-intensiteetti on voimakkaampi .

10 Lisäksi kuviosta 1 ilmenee, että noin 15 % tymo- syyteistä voidaan todeta OKT3:lla käyttämällä epäsuoraa immunofluoresenssimenetelmää. 0KT1, joka reagoi tymosyyt-tien kanssa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla kuin OKT3, ei tällöin tule esiin. Myös kuviossa 1 esitetyn reak-15 tiivisuuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT8 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Taulukosta 2 ilmenee erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemien antigeenien jakaantuminen ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja lymfosyytteihin; ja-20 kaantuminen on määritetty sarjalla hajotuskokeita esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Koska ainoastaan OKT3, OKT4 ja OKT8 olivat komplementin sitovia monoklonaalisia vasta-aineita, näitä kolmea käytettiin määrityksessä.

Taulukosta 2A ilmenee, että koko T-solupopulaatio 25 reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, OKT5 ja OKT8 reagoivat 60 %:n, 25 %:n ja 34 %:n kanssa T-soluja. Hajotus OKT4:llä ja komplementilla vähensi solujen kokonaislukumäärää 62 %:lla ja tuhosi spesifisesti OKT4 -populaation. Lisäksi OKT5+- ja OKT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, 30 mutta 0KT5+- ja OKT8+-solujen kokonaismäärä ei muuttunut.

Tästä kokeesta voitiin päätellä, että OKT4+-populaatio ero-+ + si OKT5 - ja OKT8 -populaatioista. Lisaa tukea tälle olettamukselle saatiin kokeesta, jossa T-soluja hajotettiin OKT8:lla ja komplementilla. Tällöin 0KT4 - T-solujen pro-35 sentuaalinen osuus kasvoi, kokonaislukumäärä pysyi samana, ja OKT8+- ja OKT5+-populaatiot tuhoutuivat. Lisäksi nämä kokeet osoittivat, että OKT8+-populaatio oli vastakkainen OKT4+-populaatiolle sisältäen koko OKT5 -T-solujakeen.

Il 19 75366

Samanlaiset ihmisen tymosyyteillä suoritetut kokeet antoivat erilaisia tuloksia. Taulukosta 2B ilmenee, että noin 75 % tymosyyteistä oli 0KT4-positiivisia tai 0KT8-po-sitiivisia. Sitä paitsi hajotettaessa soluja 0KT4:llä tai 5 0KT8:lla ainoastaan 25 % tymosyyteistä jäi jäljelle. Suurin osa jäljelle jääneistä tymosyyteistä reagoi 0KT3:n kanssa, kun taas pieni osa niistä reagoi 0KT6:n kanssa. Nämä havainnot osoittavat, että suurimmalla osalla ihmisen tymosyyteistä on 0KT4-, 0KT5-, 0KT6- ja 0KT8-pinta-anti-10 geenit samassa solussa. Lisäksi taulukosta 2 ilmenee, että käsiteltäessä soluja 0KT8:lla ja OKT4:llä OKT3-antigee-nin sisältävien kypsien tymosyyttien määrä kasvaa huomattavasti. Täten suurin osa OKT3:n kanssa reagoivista tymosyyteistä on jo erottunut OKT4+- ja 0KT8+-jakeiksi, koska suu-15 rin osa soluista, jotka eivät reagoineet 0KT4:n ja 0KT8:n kanssa, olivat 0KT3-positiivisia. Jos 0KT3+-alapopulaatio olisi sekä OKT4-positiivinen että OKT8-positiivinen, hajotus jonunalla kummalla monoklonaalisella vasta-aineella olisi tuhonnut 0KT3:n kanssa reagoivat tymosyytit.

20 Jotta saataisiin edelleen selville OKT3:n kanssa reagoivien tymosyyttialapopulaatioiden suhde muiden mono-klonaalisten vasta-aineiden määrittelemiin tymosyyttifraktioihin, käsiteltiin tymosyyttejä OKT3:lla ja komplementilla ja käsittelyssä jäljelle jääneitä soluja verrattiin sit-25 ten käsittelemättömiin tymosyyttipopulaatioihin. Taulukosta 2B ilmenee, että 0KT3 ja komplementti poisti 25 % tymosyyteistä. Sen sijaan OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-vasta-aineiden kanssa reagoivat populaatiot pysyivät käytännöllisesti katsoen muuttumattomina. Näistä havainnoista voidaan 30 päätellä, että suurin osa OKT6-markkerin sisältävistä tymosyyteistä kuuluu OKT3 -populaatioon. Lisäksi tuloksista voidaan päätellä, että tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät OKT4:n, 0KT5:n ja OKT8:n määrittelemät antigeenit, rajoittuvat samalla tavalla OKT3 -populaatioon. On 35 myös huomattava, että OKT9:n kanssa reagoiva tymosyytti-populaatio ei vähentynyt käsiteltäessä fraktioimattomia tymosyyttejä OKT3:lla ja komplementilla, mikä osoittaa, että OKT9+-alapopulaatio rajoittuu suurimmaksi osaksi OKT3 -tymosyyttipopulaatioon.

20 7 5 3 6 6 Näiden tulosten pohjalta on ollut mahdollista määrittää ihmisen tymosyyttien kehitysvaiheet kateenkorvassa.

Kuviosta 2 ilmenee, että käytännöllisesti katsoen kaikissa tymosyyteissä on OKTlO-markkeri. Lisäksi tymosyy-5 tit saavat varhaisessa vaiheessa OKT9-antigeenin (Thyl ja Thy2). Tämä vaihe käsittää vain pienen osan tymosyyteistä, ja siihen kuuluu noin 10 % ei-fraktioidusta populaatiosta.

Sen jälkeen ihmisen tymosyytit saavat OKT6:n määrittelemän tymosyyttiantigeenin ja samanaikaisesti ne 10 ilmentävät OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n (Thy4). Jälkimmäinen alapopulaatio edustaa valtaosaa tymosyyteistä, ja siihen kuuluu yli 70-80 % tymosyyttipopulaatiosta. Tymosyyttien edelleen kypsyessä niiden OKT6-reaktiivisuus häviää, ne tulevat reaktiivisiksi OKT3:n (ja 0KTl:n) kanssa 15 ja erottuvat OKT4+- ja OKT5+/OKT8+-jakeiksi (Thy7 ja Thy8). Näyttää siltä, että viimeisessä vaiheessa tymosyyttien irrotessa kateenkorvasta perifeeristen T-solujen joukkoon, niiden OKTlO-markkeri häviää, sillä tämä antigeeni puuttuu käytännöllisesti katsoen kaikilta perifeerisiltä T-lymfo-20 syyteiltä. Näiden kolmen pääkehitysvaiheen välisiä mahdollisia siirtymävaiheita on merkitty kuviossa 2 Thy3:lla, Thy5:llä ja Thy6:lla.

Koska akuutin T-solujen lymfoblastileukemian on arveltu johtuvan epäkypsistä tymosyyteistä, määritettiin 25 T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyjen kas-vainsolujen ja mainittujen oletettujen tymosyyttien kehitysvaiheiden välinen suhde. Määrityksessä käytettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyä 25 kasvain-solupopulaatiota ja kolmea T-solulinjaa, jotka oli etukä-30 teen tutkittu tavanomaisilla anti-T-solureagensseilla ja E-rosetoinnilla. Taulukosta 3 ilmenee, että suurin osa T-ALL-leukemiasoluista reagoi joko pelkän OKT10:n tai 0KT9:n ja OKT10:n kanssa, mutta solut eivät reagoineet muiden mo-noklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Täten 15/25 tutkituis-35 ta tapauksista näytti sisältävän varhaisen tymosyyttivai-heen antigeenejä (vaihe 1).

Sitä vastoin 5/25 tapauksista reagoi OKT6:n kanssa, mistä voidaan vetää se johtopäätös, että ne ovat peräisin 2i 7 5 3 6 6 kypsenunästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 2) . Tämä T-ALL-ryhmä reagoi eri tavoin 0KT4:n, 0KT8:n ja 0KT9:n kanssa, kuten taulukosta 3 ilmenee. Kahdella viidesosalla potilaista oli sellaisia kasvainsoluja, jotka sisälsivät suurimman 5 osan tavallisista tymosyyttiantigeeneista, mukaan lukien 0KT4, 0KT6 ja 0KT8. On huomattava, että 0KT5 ei esiinny yhdessäkään näistä viidestä vaiheen 2 kasvaimesta, vaikkakin 0KT8-reaktiivisuutta havaittiin. Tästä jälkimmäisestä tuloksesta voidaan selvästi vetää se johtopäätös, että 0KT5 10 ja OKT8 määrittelevät eri antigeenejä tai eri determinantteja samassa antigeenissä. Lopuksi 1/25:11a potilaista oli sellaisia kasvaimia, jotka olivat peräisin kypsästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 3) OKT3-reaktiivisuuden perusteella määritettynä. Tämän henkilön kasvain oli lisäksi 15 reaktiivinen OKT5:n, OKT8:n ja OKT10:n kanssa. Tutkituista 25 leukemiapopulaatiosta ainoastaan neljä oli sellaista, joita ei voitu selvästi luokitella. Näistä kolme oli OKT4- ja 0KT8-positiivisia, mutta ne eivät reagoineet OKT3:n eikä OKT6:n kanssa, jolloin ne olivat todennäköisimmin 20 Thy4:n ja Thy7, 8:n välisiä siirtymävaiheita. Yksi 25 tapauksesta osoittautui olevan Thy3:n ja Thy4:n välinen siirtymävaihe, sillä se oli reaktiivinen OKT8:n ja OKTIOrn kanssa.

Myös T-ALL-kasvainpopulaatioista peräisin olevissa 25 T-solulinjoissa oli soluja, jotka edustivat tiettyä tymo- syyttien kehitysvaihetta. Taulukosta 4 ilmenee, että HSB-2 reagoi yksinomaan OKT9:n ja OKTlO:n kanssa, ja täten se määrittelee vaiheesta 1 peräisin olevan kasvainpopulaation. Sitä vastoin CEM-T-solulinja reagoi OKT4:n, OKT6:n, OKT9:n 30 ja OKTIOin kanssa ja se osoittautui olevan peräisin vaiheen 2 tymosyyteistä. Lopuksi solulinja MOLT-4 on ilmeisesti HSB-2:n ja CEM:in välillä oleva leukemiatransformaatio, sillä se ekspressoi OKT6:n, OKT8"n, OKT9:n ja OKTIOrn.

Koska myöhempien vaiheiden (esim. vaiheen II) T-so-35 lujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien henkilöiden on todettu parantuvan täydellisemmin kuin vaiheen I ALL-leukemiaa sairastavien, OKT8-vasta-aineen avulla voidaan vetää johtopäätöksiä T-solujen ALL-leukemiaa sairastavan henkilön prognoosista.

22 75366

Taulukosta 5 ilmenee perifeeristen T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuuksien ja eri tautitilojen välinen suhde. Näitä suhteita voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin tautitilojen aiheutuessa jonkin T-solujakeen 5 kohonneesta pitoisuudesta (esim. tyyppiä I oleva agamma globulinemia) . Tällöin potilaalle, jolla esiintyy ylimäärin jotakin T-solujaetta, annetaan sopivaa monoklonaalis-ta vasta-ainetta, jolloin ylimäärä saadaan vähenemään tai kokonaan poistetuksi.

10 Myös taulukoissa 2-5 esitettyjen suhteiden avulla OKT8-vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Muita monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hybridomeja (OKT1, OKT3, 15 0KT4 ja OKT5) on kuvattu seuraavissa FI-patenttihakemuk-sissa 800846, 801343, 801342 ja 802917. Näiden lisäksi muita monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hybridomeja (OKT6, OKT9 ja OKT10) on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 803755, 803756 ja 803757. 20 Kyseisen vasta-aineen OKT8 havaittiin kuuluvan

IgG2a-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. 25 "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesta samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG^ - IgG2a» I9G2b ^a·* tai luokkiin IgM tai IgA tai 30 muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyy-teen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa. Vaikka käsillä 35 oleva vasta-aine kuuluu spesifisesti IgG2a~alaluokkaan, edellä kuvatulla tavalla reagoivat vasta-aineet on tarkoitettu kuuluviksi käsillä olevan keksinnön suojapiiriin n 23 7 5 3 6 6 riippumatta siitä, mihin immunoglobuliiniluokkaan tai -alaluokkaan ne kuuluvat.

Esillä olevaa vasta-ainetta 0KT8 voidaan käyttää tymosyyttien erilaistumisen toteamiseen ja tutkimiseen, 5 kuten kuviossa 2 on esitetty.

Tautitiloja (esim. akuuttia tarttuvaa mononukleoosia tai pahanlaatuisia tauteja, kuten vaiheen II ALL-leukemiaa), jotka aiheutuvat 0KT8+-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle terapeuttisesti vai-10 kuttava määrä OKT8-vasta-ainetta. Reagoimalla selektiivisesti OKT8+-antigeenin kanssa, vaikuttava määrä OKT8-vasta-ainetta vähentää ylimäärin esiintyviä OKT8+-soluja vaikuttaen täten taudin kulkuun edullisesti. Vasta-ainetta OKT8 voidaan sisällyttää terapeuttisiin koostumuksiin, 15 jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKT8-vasta-ainetta ja farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista.

Taulukko 1 20 Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus ihmisen lym-foidipopulaatioiden kanssa

Monoklonaalinen Perifeerinen Luuydin Kateenkorva vasta-aine_veri_(6J_(22) E+ E_ 25 OKT6 0 % 0% 0 % 70 % 0KT8 30 % 0 % <2 % 80 % OKT9 0 % 0 % 0 % <10 % OKT10 <5 % 10 % <20 % 95 % 30 Suluissa olevat luvut merkitsevät tutkittujen näytteiden määrää.

%-arvot ovat keskiarvoja.

24 Λ 75366

M

α> ft G öp (D — co o

•H (0 (0 i-H

e g to eh 5 o III <n m m vo c H j5° σι oo oo :nj 4J 3 JS $ ** 0 -P σι ~ P -X G Eh ;S V?| ω 5,¾ o III oo ιο in cm x H 2 S ° - ^ -rt 1 G G oo α °

t! ^ El -vino m m o o CC

3 '5» « «ησν t-ιησν <d 5

<0 H rt p S

V n -U e 5 td to to vo J § •t-» 5 Eh O o o m o m (n -uo G S > O vo.-..·.* ο·ο <U Ό G £2 rt -rt 0 tu G 0) +> m .

91 Gto Eh tn o o o m o o 4J<u iji itd H o " ^ Γ'οοοο 3 " S i S i

~ * -o g 2°2 £ = 1 S J

0 C JSo'0"'''»'0 „ S· O

X d» -m O Z 7 *

M -H G II ' M

3 6 »ti 0 σ> ^ ω 5 rHO G> H Eh 00 m m o o m o « £! 3 » O ^ ^ ^ ro 00 00 >ι·3 r I ij (y 7 -P rt rt G tn ^

71 g .£ G ” 4J

.-.¾ ” g 3 2 .2 g rt <U I <U 6 ai Ij λ g 4J w» -n 3 P rt 5 >1 rt 3 * vo vo vo vo vo vo vo rtln G >1 -n -H 3 OOO OOOO ,H 3 aito 0 Ή H h H >—I r—I r-H fH fl) -rt Ό 0 0) ta M ärt m f. ^rt'rt XXX X X X X td o ^ ¢) >1 H G Id ij o ti G -P <D (1) G o ΓΜ m o o m o ^ •H ·η Ό o VV. v .-π . ro n -td tn td td h ·η K in in σ, .2 '2 5 l -n -d Q) O ή m -uun «S , « >· 2

td to -P ~ Z H

> a .2-2 ft <l) · G -h -P O x) X/ ft-Hw tuo td -rid

+| " « l * >1 rt rt -H -H

ft^2 2 e ·* £

G rt 0 (U-P 4J '2 2rtS

GtO ft C0-H+. -P -rt 1 S J

G to -H -H tn - - .rt tn - - - -rt m 01 o.H 3 p*uo,j:guuo i Ϊ * i OP «S «2c + +£c + + + oiSi § s r -a a s s 8 a s s ε 2! S*

S Ή Pl 01-Η«« > -H X 14 £ -rt ft ^ M

ftMOOEHlHOOO S g ί 11 . . rt o te - < a ^ “

II

75 3 6 6 25 O -H (/>

V +> 0 I

3 I W (A :3

3 v-3 Ο ·Η I—I

w -J · a 3 >, •H < P rH -U ^ 3 13 0 x: e

c Eh Λί -C Ο 3 -H

•H 3^ „ 4-> O

E C ^ in 3(/)(/) O 0 CN +J -H 3 3

3 -n C _ H >i 3 -H

-/-* 3 0 n r^co , * 0-u x>w c 4-/+/ 00 ηηγμ,η +h ,h > -h tn

H 4-/ (/] C I fN (/) o»>C

& ή m o M 3 0 >i O (/) ή 4J ft n ui 3 3m 3 C M u •rj Eh 4-1 -U 0 0 E -Η ·Η 3

O O H »H

·* O i-i 4-1 Ο Ή 3 I *H + C · 0 ·Η Eh + * ·Η -H :3 3 + + + + . . , 30 (/)4-1(/1

3 C H c ·Η -H

(/) 4J *H 14 Q Ii4 q

3 (/) <7i 3 0 U) -H -H

-J 3 Eh > -/-> 0(/)(/)

•0 > :4 1+ , (f) M Vh O C

0 O +111 I 3 3 0 a 0 ^ C >H 3 (/1 a E 0 3 rH (/) Λ >1 4J 00 3 λ: Uh (/) 3 0 <H (/) fn -U O (/) -H u: li ..,, 3C C *r~i 3 303 £ Ό C + 0 'τ! '[“V 3 ή -H U)

3 3 c VO ;3 -H u_| I C

3^0 Eh -Π c -h '-r -H

Eh O rH M I I ... Ή (/)3 (/1 M O + + + + I 03 OC> JO —(/) O. 0 (/) ^ c W (/1 C 3 0 in m 0 ή v* •H E Eh *0 1 (/) > S a a g 11 i'll + e- 5 3 3(/) "3 4J (/) 3 3 W *H ·Η «* nj fl) ·* tfl C +r 34-· —-Cnw 3·Η3Εη ή (/) + m v ~ 3* g ' ' ++1. I I if ~ = £ C Ή C ^ ' C H *n o 4J 0 · <N 0 rH >-|

Cin CO :3 3 3 -Η Eh Ή 5C C ·Η > Ή 0 0 K || .... H O > (/) 3 OKCO llll + (0 · O h 3 2

2 0 -¾ ^ -H -H 3 W

3 +4-) 2 > 4-/ (/) 3 '2 — (/) 5 rH 3 ·Η -H 3 5 Ή 3 £·_*(/>>+) 5 >ι(Λ-η 2 5^0 ·Η

3 ~ Ή +. V ^ ^ Q. -H C

rj c-tr^jj ’ ’H Ή AJ ro 0 w jc >, ^w^-hh:3

+H H tj >3 -H 4-J rH 3 E

0 H q . < 0 H o 0 3 •U ij *s> H I >H ti I i

(/) 4J 2 "H Eh -H > (/) 4J

S ^ C 5, e 5 .* 3 3 ο

3 >ι ·Η 4J ζ 5 > ^ (3 3 Γ-1 H

§H (/)4-1 *H >, +» (0 <l) O >, C ^ H 3 +1 C H + E>,-v S i « ^ Ή >1 ΙΛ (M c 3 rH 0 Hi -H rH 4-*

0) •H4JO>,(N -ri +>04JV4-HrH4J

Η ^ -u -H 0 4J 0 >,

rH **0fi$OW

V ·Η H > £ ? ? M if 0 >,03>, )-> 3 · · 33/5555^8^ 3 e ή x: ds a a.

w ><ffl > 5 C tl t: tl ^ Eh rH 4-) Eh + 26

Taulukko 4 V 5 3 6 6

Solulinjojen reaktiivisuus monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa

Solulinja 0KT3 0KT4 0KT5 0KT6 0KT8 0KT9 OKTIO

5 HSB-2 -X - - - - + + CEM - + - + + + + MO LT-4 --- + + + + xKriteerit {-)- ja (+)-reaktiivisuudelle olivat samat kuin taulukossa 3.

\\ 27

Taulukko 5 - 75366

Perifeeristen T-solujen pitoisuudet eri tautitiloissa 5 Tautitila T-solujen pitoisuudet 0KT2+ PKT 4T PKT 5+ CKT8+ 0KT_6 +

Primäärinen maksa- kirroosi (2) N +

Multippeliskleroosi 1C (pitkälle edennyt) (8) “ N - - „

Myasthenia Gravis (ei hoidettu varhaisessa 0 0 O O 0 vaiheessa) (3)

Akuutti elinsiirto (3) o ···- - « .

o + +· 15

Agammaglobulinemia

Tyyppi I +

Tyyppi li o 20 Hyper IgE (4) - n o-..- 0··* -

Akuutti mononukleoosi-

. _ , . . + 0··· — ++ ++ Q

infektio (4)*

Hodgkinsin tauti

Vaiheet τ r. tt m m 25 J.&II N N N N 0

Vaiheet III & IV — N N N O

Psoriasis (3/5) N +...++ n N o 30 N = normaali pitoisuus O = puuttuu + = normaalia suurempi ++ = huomattavasti normaalia suurempi - = normaalia pienempi 35 — =* huomattavasti normaalia pienempi *) Nämä pitoisuudet palaavat normaaleiksi noin viikkoa aikaisemmin kuin kliiniset oireet häviävät

Suluissa olevat luvut ilmaisevat tutkittujen potilaiden lukumäärän

Claims (4)

1. Menetelmä IgG-luokkaan kuuluvan komplementin sitovan monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka 5 vasta-aine a) reagoi heikentäjä-T-solujen kanssa (noin 30 % ihmisen normaaleista T-soluista), alle 2 %:n kanssa ihmisen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan B-solujen eikä nollasolujen kanssa, 10 b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) reagoi noin 34 %:n kanssa käsittelemättömiä perifeerisiä T-soluja, 95 %:n kanssa perifeerisiä T-soluja, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 15 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, ei lainkaan perifeeristen T-solujen kanssa, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 75 %:n kanssa käsittelemät-20 tömiä tymosyyttejä, 55 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 90 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8001 avulla valmiste-25 tulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, eikä lainkaan tymosyyttien kanssa, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, d) reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuuluvat 30 vaiheen Thy 3, Thy 4 tai Thy 4-6 tavallisiin tymosyyttei-hin tai vaiheen Thy 8 myöhäisiin tymosyytteihin, mutta ei reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen I tymosyytteihin tai vaiheen Thy 3-4 tavallisiin tymosyyttei-hin, 35 e) reagoi solulinjojen CEM- ja MOLT-4 kanssa, mutta ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja f) määrittelee T-solupopulaation (0KT8+), jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa ja multippeliskleroosissa, puuttuu koko- 11 75366 naan tai esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina hyper-IgEissä,normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elin-siirtoreaktiossa, huomattavsti normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa, puuttuu 5 täysin myasthenia graviksessa ja esiintyy normaaleina pitoisuuksina kaikissa Hodkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat 10 vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8014 i) immunisoimalla hiiriä ihmisen tymosyyteillä, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, 15 iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren mye- loomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, 20 v) arvioimalla eri syvennyksien hybridoomapitoinen pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivi-sille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille spesifistä vasta-ainetta, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC 25 CRL 8014, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien heikentäjä-T-solujen kanssa, alle 2 %:n kanssa ihmisen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen eikä nollasolujen kanssa, ja

30 B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) viljelemällä hybridoomaa ATCC CRL 8014 sopivassa väliaineessa, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen mainitun hybri-dooman pintanesteestä. 7 5 3 6 6

2. Menetelmä IgG-luokkaan kuuluvan komplementin sitovan monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine a) reagoi heikentäjä-T-solujen kanssa (noin 30 % 5 ihmisen normaaleista T-soluista), alle 2 %:n kanssa ihmisen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan B-solujen eikä nollasolujen kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 10 c) reagoi noin 34 %:n kanssa käsittelemättömiä pe rifeerisiä T-soluja, 95 %:n kanssa perifeerisiä T-soluja, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, ei lainkaan perifeeristen T-solujen 15 kanssa, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 75 %:n kanssa käsittelemättömiä tymosyyttejä, 55 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjan ATCC CRL 8002 avulla 20 valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 90 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjan ATCC CRL 8001 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, eikä lainkaan tymosyyttien kanssa, jotka on etukäteen käsi- 25 telty hybridisolulinjan ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, d) reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen Thy 3, Thy 4 tai Thy 4-6 tavallisiin tymosyyttei-hin tai vaiheen Thy 8 myöhäisiin tymosyytteihin, mutta ei 30 reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen I tymosyytteihin tai vaiheen Thy 3-4 tavallisiin tymosyytteihin, e) reagoi solulinjojen CEM- ja MOLT-4 kanssa, mutta ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja 35 f) määrittelee T-solupopulaation (OKT8+), jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa ja multippeliskleroosissa, puuttuu koko- II 75366 naan tai esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina hyper-IgE:ssä,normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elin-siirtoreaktiossa, huomattavsti normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa, puuttuu 5 täysin myasthenia graviksessa ja esiintyy normaaleina pitoisuuksina kaikissa Hodkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet:

10 A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8014 i) immunisoimalla hiiriä ihmisen tymosyyteillä, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren mye-15 loomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennyksien hybridoomapitoinen 20 pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivi- sille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille spesifistä vasta-ainetta, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8014, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi käytän- 25 nöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien heikentäjä-T-solujen kanssa, alle 2 %:n kanssa ihmisen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen eikä nollasolujen kanssa, ja B) valmistetaan raonoklonaalinen vasta-aine 30 vii) siirtämällä hybridooma ATCC CRL 8014 intraperironeaalisesti hiiriin, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen hiirien pahanlaatuisesta vesivatsasta tai seerumista. 75366