FI75434C - Diagnostiskt foerfarande, vid vilket man anvaender en monoklonal antikropp specifik mot maenninskans tidiga tymocytantigen och i foerfarandet anvaendbar komposition. - Google Patents

Description

1 75434

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään ihmisen varhaistymo-syytti-antigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta ja menetelmässä käyttökelpoinen ainekoostumus 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 803756

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään OKT9+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä sekä menetelmässä käyttökelpoiseen diagnostiseen ainekoostumuk-10 seen. Menetelmässä käytetään hyväksi monoklonaalista vasta-ainetta antigeenille, jota on löydetty varhaistymosyyteistä (noin 10 % normaaleista ihmisen tymosyyteistä). Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla.

Köhler'in ja Milstein'in 1975 esittämä /Tiature 256, 15 495-497 (1975)_7 hiiren myeloomasolujen yhdistäminen immunoi- tujen hiirien pernasoluihin osoitti ensimmäisen kerran, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja, joka tuottaa homogeenista (ns. "monoklonaalista") vasta-ainetta. Tämän alkutyön jälkeen paljon ponnisteluja on suunnattu erilaisten 20 hybridisolujen (joita nimitetään "hybridomiksi") tuottamiseen ja näiden hybridomien avulla valmistettujen vasta-aineiden käyttöön erilaisia tieteellisiä tutkimuksia varten. Ks. esimerkiksi Current Topics in Microbiology and Immunology, nide 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Pot-25 ter ja N. Warner, toimittaja, Springer-Verlag, 1978 sekä siinä olevat viitteet; C.J. Barnstable, et ai., Cell, 14, 9-20 (toukokuu, 1978); P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (marraskuu, 1978); Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, nide 2, D.M. Wier, toimittaja, Blackwell, 30 1978, luku 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1, 1979, 15-17. Näissä viitteissä on kuvattu samanaikaisesti saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka yleinen menetelmä on teoriassa hyvin ymmärretty, kohdataan 35 monia vaikeuksia ja kussakin erikoistapauksessa vaaditaan modifikaatioita. Itseasiassa ei ole minkäänlaista varmuutta, 2 75434 ennen tietyn hybridoman valmistusta, että haluttu hybridoma saadaan, ja että siinä onnistuttaessa se tuottaa vasta-ainetta, tai että näin valmistetulla vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistumiseen vaikuttaa pääasiallisesti 5 käytetty antigeenityyppi ja käytetty selektiotekniikka halutun hybridoman eristämiseksi.

Yrityksiä valmistaa monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen lymfosyyttisolujen, pinta-antigeeneille on kuvattu vain muutamissa harvoissa tapauksissa. Ks. esimerkiksi 10 Current Topics in Microbiology and Immunology, edellä sivut 66-69 ja 164-169. Näissä kuvatuissa kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemian ja ihmisen kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet saadut hybridomat näyttivät tuottavan vasta-ainetta kaikis-15 sa ihmissoluissa esiintyville erilaisille antigeeneille. Mikään hybridoraista ei tuottanut vasta-ainetta tiettyä ihmisen lymfosyyttiluokkaa vastaan.

Äskettäin esillä olevan hakemuksen hakijat ja muut ovat julkaisseet artikkeleita, joissa on kuvattu hybrido-20 mien, jotka muodostavat vasta-ainetta tietyille T-solu-anti-geeneille, valmistusta ja testausta. Ks. esimerkiksi Rein-herz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Rein-herz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 76, 4061-4065 (1979); ja Rung, P.C., et ai., Science, 206, 347-349 (1979). 25 On olemassa kaksi lymfosyyttien pääluokkaa, jotka osallistuvat ihmisten ja eläinten immuunisysteemin. Ensimmäinen näistä (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-so-lu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluis-ta. Erilaistuvien solujen vielä ollessa kateenkorvassa nii-30 tä nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut poistuvat kateenkorvasta ja kiertävät kudosten, imukudosten ja veren-kiertosysteemin välillä. Nämä T-solut muodostavat suuren osan kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunolo-gisesti spesifisiä ja ovat suoraan osallisina soluvälittei-35 sissä immuunireaktioissa (kuten siirrettyjen elinten hylkimisessä) efektorisoluina. Vaikka T-solut eivät eritä vasta- 75434 aineita elimistön nesteisiin, niitä tarvitsee myöhemmin käsitettävä toinen lymfosyytti luokka näiden vasta-aineiden erittämistä varten. T-solujen joillakin tyypeillä on sääte-lytoimintoja immuunisysteemin muissa toiminnoissa. Tämän 5 soluyhteistoimintaprosessin mekanismia ei vielä ole täysin ymmärretty.

Lymfosyyttien toisen luokan (luuytimestä peräisin olevat solut tai B-solut) muodostavat ne, jotka erittävät vasta-ainetta. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantaso-10 luista, mutta kateenkorva ei määrää niiden erilaistumista. Linnuissa ne erilaistuvat elimessä, joka on analoginen ka-teenkorvan kanssa ja josta käytetään nimitystä "Bursa of Fabricius". Nisäkkäillä ei kuitenkaan vastaavaa elintä ole löydetty ja on ajateltu, että nämä B-solut erilaistuvat luu-15 ytimessä.

Nyt on todettu, että T-solut jakautuvat ainakin useisiin alatyyppeihin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentä-jä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, joiden toimintana on (vastaavasti) edistää reaktiota, heikentää reaktiota tai tappaa 20 (liuottaa) vieraita soluja. Nämä alaluokat ymmärretään hyvin hiirien elimistössä, mutta niitä on vasta viime aikoina kuvattu ihmisen elimistölle. Ks. esimerkiksi R.L. Evans, et ai., Journal of Experimental Medicine, nide 145, 221-232, 1977; ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis 25 of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", julkaisussa "Contemporary Topics in Immunobiology", O. Stutman, toimittaja, Plenum Press, 1977, nide 7, 363-379.

Kyky tunnistaa tai heikentää T-solujen luokkia tai 30 alaluokkia on tärkeä erilaisten immunoregulatoristen sairauksien tai tilojen diagnoosia tai hoitoa varten.

Esimerkiksi tietyillä leukemioilla ja imukudoskasvai-milla on erilainen prognoosi riippuen siitä, ovatko ne lähtöisin B-soluista vai T-soluista. Siten sairauden prognoo-35 sin arviointi riippuu siitä, miten nämä kaksi lymfosyytti-luokkaa pystytään erottamaan toisistaan. Ks. esimerkiksi 4 75434 A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (maaliskuu 1975); D. Belpomme, et ai., julkaisussa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, et ai., toimittaja. Springer, Heidelberg, 5 1977, 33-45; ja D. Belpomme, et al., Britich Journal of

Haematology, 1978, 38, 85.

Tiettyihin sairaustiloihin (esim. nuoruusiän nivelreuma, pahanlaatuiset taudit ja agammaglobulinemia) liittyy T-solujen alaluokkien epätasapainoon. On otaksuttu, että 10 antoimmuuneihin sairauksiin yleensä liittyy "auttaja"-T- solujen ylimäärä tai tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen puute, kun taas agammaglobulinemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä tai "auttaja"-T-solujen puute. Pahanlaatuisiin tauteihin liittyy yleensä "heikentäjä"-T-solujen 15 ylimäärä.

Tietyissä leukemioissa syntyy liikaa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja. Diagnoosi voi siten riippua kyvystä havaita tämä epätasapaino tai ylimäärä ja määrittää mitä kehitysvaihetta on ylimäärin. Ks. esimerkiksi 20 J. Kersey, et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" julkaisussa Haematology and Blood Transfusion, nide 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 sekä siinä esitetyt viitteet; ja E.L. Reinherz, et ai., J. Clin. Invest., 64, 392-397 (1979).

25 Agammaglobulinemia, sairaustila, jossa immunoglobu- liinia ei muodostu ollenkaan, käsittää ainakin kaksi selvästi toisistaan erottuvaa tyyppiä. Tyypissä I immunoglobulii-nia ei muodostu heikentäjä-I-solujen ylimäärästä johtuen, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puut-30 teestä. Kummassakaan tyypissä ei näytä olevan mitään puutetta tai vajausta potilaan B-soluissa, lymfosyyteissä, jotka ovat vastuussa vasta-aineen varsinaisesta erityksestä; nämä B-solut ovat kuitenkin joko heikennettyjä tai "niitä ei ole autettu", mistä on seurauksena suuresti alentunut tai 35 puuttuva immunoglobuliinin tuotanto. Agammaglobuliinemia-tyyppi voidaan siten määrittää testaamalla heikentäjä-T-so-lujen ylimäärä tai auttaja-T-solujen puute.

5 75434

Terapeuttisella puolella on ehdotettu, mitä vielä ei ole varmasti todistettu, että vasta-aineiden antaminen ylimäärin esiintyvää T-solun alatyyppiä vastaan voi olla terapeuttisesti edullista autoimmuunisairauksissa tai pahanlaa-5 tuisissa taudeissa. Esimerkiksi auttaja-T-solu-syöpää (tiettyjä ihon T-solu-imukudoskasvaimia ja tiettyjä akuuttia T-solujen lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa vasta-aineella auttaja-T-solu-antigeenille. Autoimmuunisairauksien, jotka ovat aiheutuneet auttajasolujen ylimäärästä, 10 hoito voidaan myös toteuttaa samalla tavalla. Sairauksia (esim. pahanlaatuisia tauteja tai tyypin I agammaglobuli-nemiaa), jotka aiheuttavat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla vasta-ainetta heikentäjä-T-solu-antigeenille.

15 Ihmisen koko T-solujen luokkaa vastaan vaikuttavien vastaseerumien (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG) on esitetty olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia potilailla, joille on tehty elinsiirtoja. Koska soluvälitteinen immuunireaktio (mekanismi, jolla siirrettyjä elimiä 20 torjutaan) riippuu T-soluista, vasta-aineen antaminen T-so-luille estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Ks. esimerkiksi Cosimi, et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40: 155-163 (1976) sekä siinä esitetyt 25 viitteet.

Ihmisen T-soluluokkien ja -alaluokkien tunnistaminen ja heikentäminen on aikaisemmin suoritettu käyttäen spontaaneja autovasta-aineita tai selektiivisiä antiseerumeja ihmisen T-soluille, joita seerumeja saadaan immunoimalla 30 eläimiä ihmisen T-soluilla, juoksuttamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla vastaseerumi (esimerkiksi) autologisilla, mutta ei-allogeenisillä B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus .

35 Näiden antiseerumien valmistaminen on äärimmäisen vai keata, erityisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Jopa 6 75434 adsorboidut ja puhdistetut antiseerumit sisältävät monia epäpuhtauksia halutun vasta-aineen lisäksi, monista syistä. Ensinnäkin seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheut-5 taa vasta-aineiden muodostumisen erilaisia antigeenejä vastaan, joita löytyy kaikista injektoiduista ihmisen T-soluis-ta. Yksittäiset antigeeniä vastaan ei tapahdu mitään selektiivistä vasta-aineen tuotantoa. Kolmanneksi tällaisilla menetelmillä saadun spesifisen vasta-aineen tiitteri on 10 tavallisesti melko alhainen (esim. inaktiivinen laimennuksissa, jotka ovat suurempia kuin 1:100) ja spesifisen vasta-aineen suhde ei-spesifiseen vasta-aineeseen on pienempi kuin 1/106.

Ks. esimerkiksi Chess'in ja Schlossman'in artikkelia, 15 johon edellä viitattiin (sivulta 365 eteenpäin) sekä Chemical and Engineering News'in artikkelia, johon edellä viitattiin, joissa alan aikaisempien antiseerumien puutteet ja monoklonaalisen vasta-aineen edut on kuvattu.

Nyt on löydetty uusi hybridoma (nimeltään OKT9), joka 20 pystyy tuottamaan uutta monokloonista vasta-ainetta antigeeniä vastaan, jota esiintyy noin 10 %:lla normaaleista ihmisen tymosyyteistä, mutta ei normaaleissa ihmisen perifeerisissä lymfosyyteissä (T-soluissa, B-soluissa tai nollaso-luissa) tai luuydinsoluissa. Näitä tymosyyttejä, joiden kans-25 sa OKT9 on reaktiivinen, nimitetään "varhais-tymosyyteiksi".

Näin tuotettu vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle determinantille, jota esiintyy noin 10 %:lla ihmisen normaaleista tymosyyteistä ja ei pääasiallisesti sisällä mitään muuta ihmisen vastaista immunoglobuliinia vasta-30 kohtana alan aikaisemmille antiseerumeille (jotka sisältävät luonnostaan epäuhtauksina vasta-ainetta, joka on reaktiivinen lukuisten ihmisen antigeenien suhteen) ja alan aikaisemmille monoklonaalisille vasta-aineille (jotka eivät ole mo-nospesifisiä ihmisen tymosyyttiantigeenille). Lisäksi tätä 35 hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen valmistamiseksi tarvitsematta immunoida ja tappaa eläimiä, mitä seuraa työ- 75434 läät adsorptio- ja puhdistus-vaiheet, jotka ovat tarpeen jopa alan aikaisempien epäpuhtaiden antiseerumien saamiseksi .

Sekä esillä olevasta hybridomasta että sillä tuote-5 tusta vasta-aineesta käytetään nimitystä "0KT9", jolloin asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Hybridoma talletettiin 21.11.1979 kokoelman American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 ja sille annettiin ATCC-talletusnumero CRL 8021. 10 Tämän hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen val mistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 803756.

Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että saatetaan tästä yksilöstä otettu ΤΙ 5 solu- tai tymosyyttikoostumus reagoimaan diagnostisesti tehokkaan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8021, ja joka vasta-aine reagoi noin 10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien 20 perifeeristen T-solujen, B-solujen, nollasolujen eikä luu-ydinsolujen kanssa, ja määritetään, kuinka suuri osa perifeeristen T-solujen ja tymosyyttien kokonaispopulaatiosta reagoi mainitun vasta-aineen kanssa.

Esimerkki 1 25 OKT9-reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen Ihmisen perifeeristä yksitumaisia verisoluja eristettiin terveiltä vapaehtoisilta luovuttajilta (iältään 15-40) Ficoll-"Hypaque"-tiheysgradienttisentrifugointimenetelmällä 30 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) seuraten Boyum'in menetelmää, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97): 77, 1968. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-Ig+(B)- ja Ig“(T+nolla)-populaatioiksi Sephadex G-200 anti-F(ab')2“Pylv^skromatografisesti kuten aikaisemmin on 35 kuvannut Chess, et ai., J. Immunol. 113: 1113 (1974). T-so-lut otettiin talteen E-"rosetoimalla" Ig“-populaatio 5 %:lla 75434 lampaan erytrosyyttejä (Microbiological Associates, Bet-hesda, MD). "Rosetoitu" seos kerrostettiin Ficoll-"Hypaque1lie" ja talteenotettua E+-pellettiä käsiteltiin 0,155M NH^Cl:lla (10 ml/108 solua). Näin saatu T-solupopu-5 laatio alle 2-%:sesti EAC-"rosetti"-positiivinen ja yli 95-%:sesti E-"rosetti"-positiivinen määritettynä standardi-menetelmin. Lisäksi ei-"rosetoiva" Ig- (nollasolu)-populaatio otettiin talteen Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli alle 5-%:sesti E+ ja < 2 % slg+. Pinta-Ig+ 10 (B)-populaatio saatiin Sephadex G-200-pylväästä eluoinnin jälkeen normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla kuten edellä kuvattiin. Tämä populaatio oli yli 95-%:isesti pinta-Ig+ ja alle 5-%:isesti E+.

Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin normaaleilta 15 vapaaehtoisilta luovuttajilta taaemmasta suoliluun harjusta punktiomenetelmällä.

B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, jotka olivat iältään 2 kuukaudesta 14 vuoteen ja jotka 20 olivat joutuneet korjaavaan sydänleikkaukseen. Vastasaadut kateenorvarauhasen osat pantiin välittömästi 5-%:iseen vasikan sikiöseerumiin väliaineessa 199 (Gibco), hienonnettiin pihdeillä ja saksilla ja tehtiin sen jälkeen yhtä solulajia sisältäväksi suspensoiksi puristamalla metallilankaverkon 25 läpi. Solut kerrostettiin seuraavaksi Ficoll-"Hypaque'lie" ja sentrifugoitiin ja pestiin kuten edellä kuvattiin osassa A. Näin saadut tymosyytit olivat yli 95-%:isesti elinvoimaisia ja »90-%:sesti E-"rosetti"-positiivisia.

C. T-solujen solulinjat ja akuutin T-solujen lymfo-30 blastileukemian solut T-solulinjat CEM , HSB-2 ja MOLT-4 toimitti Dr. H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leu-kemiasoluja saatiin 25 potilaalta, joiden diagnoosi oli T-solu-ALL. Näiden yksittäisten kasvainten oli aikaisemmin 35 määritetty olevan peräisin T-soluista, koska ne muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan erytrosyyttien kanssa 75434 (>20 % E+) ja olivat reaktiivisia T-soluille spesifisten he-teroantiseerumi-anti-HTL (B.K.) ja A99 kanssa, kuten edellä kuvattiin. Kasvainpopulaatioita kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa DMSOrssa ja 20 5 %:isessa AB-ihmisseerumissa pintakarakterisointiin asti.

Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat yli 90-%:isesti blasteja solusentrifugivalmisteiden Wright-Giemsa-morfolo-gian mukaan.

Esimerkki 2 10 Solufluoroqrafinen analyysi ja solujen erotus

Monoklonaalisten vasta-aineiden solufluorografinen analyysi kaikilla solupopulaatioilla suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssilla fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Labora-15 tories) käyttäen solufluorografi-FC200/4800A-laitetta (Ortho Instruments). Lyhyesti esitettynä 1 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml:lla vasta-ainetta OKT5 laimennuksessa 1:500, inku-boitiin 4°C:ssa 30 minuuttia ja pestiin kahdesti. Solut saatettiin sitten reagoimaan 0,15 ml:n kanssa G/M FITC:n 1:40-20 laimennosta 4°C:ssa 30 minuutin ajaksi, sentrifugoitiin ja pestiin kolmasti. Solut analysoitiin sitten solufluorografi-laitteella ja fluoresenssin voimakkuus solua kohti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Samanlainen reaktii-visuusmalli havaittiin laimennuksessa 1:10000, mutta lisä-25 laimentaminen aiheutti reaktiivisuuden häviämisen. Tausta-värjäys saatiin käyttämällä 0,15 ml suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä, joka oli saatu CAF^-hiirestä, johon oli vatsaontelon sisäisesti injektoitu ei-tuottavaa hybridikloonia.

30 Kokeissa, jotka käsittävät vasta-aine- ja komplement- tivälitteisen lymfosyytin, viljeltiin tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja yli yön, mitä seurasi selektiivinen hajotus, ja sen jälkeen ne analysoitiin solufluorografilaitteel-la.

10 75434

Esimerkki 3

Lymfoidi-populaatioiden hajotus monoklonaalisen vasta-aineen ja komplementin kanssa 40 x 10® perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä pantiin 5 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). Solupellettejä inkuboitiin 0,8 ml:n kanssa vasta-ainetta OKT3, OKT4 tai OKT8 tai normaalia vesivatsavertailunäyttöä, jotka oli laimennettu suhteeseen 1:200 PBS:ssä, suspendoitiin uudelleen ja inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuuttia. Sen jälkeen vasta-10 aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, suspendoitiin uudelleen ja inkuboitiin edelleen 37°C:ssa ravistelijalla varustetulla vesi-hauteella 60 minuuttia. Tämän ajan päätyttyä solut sentri-fugoitiin ja elinvoimaiset solut määritettiin Trypan-sini-15 sellä. Laskemisen jälkeen solut pestiin kaksi lisäkertaa 5-%:isessa FCS:ssa ja pantiin lopulliseen väliaineeseen RMPI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY), joka sisälsi 20 % AB+-ihmisseerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-puskuria 20 ja 0,5 % natriumkarbonaattia ja inkuboitiin yli yön kosteassa atmosfäärissä, jossa oli 5 % CC>2, 37°C:ssa.

Kuva 1 esittää fluoresenssispektriä, joka on saatu solufluorografilaitteella sen jälkeen kun normaalit ihmisen tymosyytit on saatettu reagoimaan vasta-aineen OKT9 sekä 25 muiden monokloonisten vasta-aineiden kanssa laimennussuhteessa 1:500 sekä G/M FITC:n kanssa. Taustat fluoresenssi-värjäys saatiin inkuboimalla kutakin populaatioita vesivat-sanesteessä, joka oli saatu hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuotettavaa kloonia, 1:500-laimenoksena.

30 Kuva 2 esittää tymosyyttien erilaistumista ihmisen kateenkorvassa.

Taulukko 1 esittä vasta-aineiden OKT6, 0KT8, OKT9 ja OKT10 reaktiivisuuden erilaisten ihmisen lymfoidisolupopulaa-tioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine OKT9 on reaktio-35 kykyinen noin 10 %:n kanssa normaaleista ihmisen tymosyy- teistä eikä minkään muiden testattujen lymfoidisolujen kans- 11 75434 sa. Tämä reaktiivisuusmalli on yksi testi, jolla esillä oleva vasta-aine 0KT9 voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.

Kuva 1 esittää edustavaa fluoresenssimallia, joka on 5 saatu solufluorografilaitteella sen jälkeen kun normaaleja ihmisen tymosyyttisuspensioita on saatettu reagoimaan 0KT3:n, 0KT4:n, 0KT5:n, 0KT6:n, 0KT8:n, 0KT9:n OKTIOin ja G/M FITCtn 1:500-laimennosten kanssa. Samanlaisia reaktiivi-suusmalleja saatiin 12 muulla testatulla normaalilla ihmi-10 sen tymosyyttipopulaatiolla. Kuten havaitaan, esiintyy merkittäviä eroja sekä reaktiivisuusprosentissa että fluorsens-sin voimakkuudessa jokaisella näistä monokloonaalisista vasta-aineista. Esimerkiksi OKT9 reagoi noin 10 %:n kanssa ty-mosyyteistä alhaisella fluoresenssivoimakkuudella, kun taas 15 0KT5, OKT6, OKT8 ja OKTIO reagoivat noin 70 %:n kanssa tymo- syyteistä suuremmalla fluoresenssivoimakkuudella. OKT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyteistä, on reaktiivisuudeltaan vasta-aineen OKT9 ja sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden välillä, joilla on korkeampi fluoresenssivoimakkuus.

20 Lisäksi kuva 1 osoittaa, että noin 15 % tymosyyteistä todetaan OKT3:lla epäsuoralla immunofluoresenssilla. Kuvassa ei näy vasta-ainetta OKTl, jonka reaktiivisuusmalli on itseasiassa samanlainen kuin OKT3:lla tymosyyteille. Reaktiivisuusmalli kuvassa 1 on toinen testi, jolla esillä oleva vas-25 ta-aine 0KT9 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista .

Taulukko 2 esittää erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemien antigeenien jakaatumisen ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja tymosyytteihin, jakautuminen 30 on määritettyä sarjalla hajotuskokeita, jotka on kuvattu esimerkissä 3. Koska ainoastaan OKT3, OKT4 ja OKT8 olivat komplementin sitovia monoklonaalisia vasta-aineita, näitä kolmea käytettiin.

Kuten taulukossa 2A on esitetty, koko T-solupopulaa-35 tio reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, 0KT5 ja OKT8 reagoivat vastaavasti 60 %:n 25 %:n ja 34 %:n kanssa T-soluista.

12 75434

Hajotus 0KT4:llä ja komplementilla pienensi kokonaismäärää 62 %:lla ja poisti spesifisesti 0KT4+-populaation. Lisäksi 0KT5+- ja 0KT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi eikä mitään vaikutusta ollut 0KT5+- ja 0KT8+-T-solujen absoluut-5 tiseen lukumäärään. Nämä kokeet osoittivat, että 0KT4+ oli selvästi erillinen 0KT5+- ja 0KT8+-populaatioista. Lisätukea tälle johtopäätökselle saatiin hajottamalla T-soluja 0KT8:n ja komplementin kanssa. Tässä tapauksessa 0KT4+-T-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, absoluuttinen lukumää-10 rä pysyi samana ja OKT8+- ja OKT5+-populaatiot poistuivat. Lisäksi nämä tulokset osoittivat, että OKT8+-populaatio oli käänteinen OKT4+-populaatiolle ja sisälsi koko OKT8+-T-so-lujen alaryhmän.

Samanlaiset kokeet ihmisen tymosyyttipopulaatioilla 15 antoivat erilaisia tuloksia. Kuten taulukossa 2B on esitetty, noin 75 % tymosyyteistä oli OKT4+ tai OKT8+. Lisäksi hajotuksen jälkeen joko OKT4:llä tai OKT8:lla ainoastaan 25 % tymosyyteistä jäi jäljelle. Pääosa jäljellejääneistä tymosyyteistä oli reaktiokykyinen OKT3:n kanssa, kun taas ai-20 noastaan pieni osa oli reaktiokykyinen OKT6:n kanssa. Nämä havainnot osoittavat, että ihmisen tymosyyttien pääpopulaa-tiolla on OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-pinta-antigeenit samassa solussa. Lisäksi taulukko 2 osoittaa, että käsittelyn jälkeen OKT8:lla tai OKT4:llä kypsissä tymosyyteissä, joil-25 la on OKT3-antigeeni, tapahtuu merkittävä lisäys. Siten pääosa OKT3-reaktiivisista tymosyyteistä on jo erottunut 0KT4+-tai OKT8+-alaryhmiksi, koska pääosa jäljellejääneistä soluista 0KT4- tai OKT8-hajotuksen jälkeen on 0KT3+. Jos OKT3+-alapopulaatio olisi sekä 0KT4+ että 0KT8+, silloin hajotus 30 jommallakummalla monokloonisella vasta-aineella olisi poistanut OKT3-reaktiiviset tymosyytit.

OKT3-reaktiivisten tymosyytti-alapopulaatioiden suhteen edelleen määrittämiseksi muihin monoklonaalisen vasta-aineen määrittelemiin tymosyyttijakeisiin, tymosyyttejä kä-35 siteltiin 0KT3:lla ja komplementilla ja jäljellejääneitä soluja verrattiin sitten käsittelemättömiin tymosyyttipopu- 13 75434 laatioihin. Kuten taulukossa 2B on esitetty, poistivat 0KT3 ja komplementti 25 % tymosyyteistä. Lisäksi ei tapahtunut 0KT4-, 0KT5-, 0KT6- tai 0KT8-reaktiivisten populaatioiden suurempaa häviötä. Näistä havainnoista voidaan vetää se joh-5 topäätös, että suurin osa tymosyyteistä, joilla on 0KT6-markkeri, sisältyvät 0KT3”-populaatioon. Lisäksi tästä voidaan päätellä, että tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät 0KT4:n, 0KT5:n ja 0KT8:n määrittelemiä antigeenejä, ovat samalla tavoin rajoittuneet 0KT3“-populaatioon. Olisi 10 myös huomattava, että tymosyyttien OKT9-reaktiivinen populaatio ei pienentynyt fraktioimattomien tymosyyttien OKT3-ja komplementti-käsittelyn jälkeen, osoittaen siten, että OKT9+-alapopulaatio on laajalti rajoittunut OKT3“-tymosyyt-tipopulaatioon.

15 Näiden tulosten perusteella on ollut mahdollista kuva ta ihmisen tymosyyttien kateenkorvansisäisen kehityksen vaiheita. Kuten kuvassa 2 on esitetty, on itseasiassa kaikissa tymosyyteissä OKTlO-markkeri. Lisäksi tymosyytit saavat aikaisessa vaiheessa OKT9-markkerin (Thyl ja vastaavas-20 ti Thy2). Tämä vaihe määrittelee tymosyyttien vähemmistön ja muodostaa noin 10 % fraktioimattomasta populaatiosta.

Sen jälkeen ihmisen tymosyytit saavat ainutlaatuisen OKT6:n määrittelevän tymosyyttiantigeenin ja ilmentävät samanaikaisesti OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n (Thy4). Tämä jälkimmäinen 25 alapopulaatio edustaa tymosyyttien pääosaa ja muodostaa 70-80-%:sesti kateenkorva-populaation. Edelleen kypsyessään tymosyytit menettävät OKT6-reaktiivisuuden, saavat OKT3-(ja OKT1-) reaktiivisuuden ja erottuvat OKT4+- ja OKT5+/OKT8+-alaryhmiksi (Thy7 ja Thy8). Lopuksi näyttää siltä, että kun 30 tymosyytti joutuu perifeerisiin T-soluihin, se menettää OKTIO-markkerin, koska tämä antigeeni puuttuu itseasiassa kaikilta perifeerisiltä T-lymfosyyteiltä. Mahdollisia välimuotoja näiden kolmen kateenkorvansisäisen pääkehitysvaiheen välissä merkitään Thy3:lla, Thy5:llä ja Thy6:lla kuvassa 2.

35 Koska T-soluista peräisen olevan äkillinen lymfoblas- tileukemian ajatellaan olevan peräisin epäkypsistä tymosyy- 14 75434 teistä, määritettiin suhde yksilöiden, joilla oli T-ALL, kasvainsolujen ja näiden kateenkorvansisäisten ehdotettujen erilaistumisvaiheiden välillä. 25 kasvainsolupopulaatiota yksilöistä, joilla oli T-ALL, ja kolme T-solulinjaa, joita 5 aikaisemmin oli tutkittu tavanomaisilla anti-T-solureagens-seilla ja E-"rosetoinnilla", tutkittiin. Kuten taulukossa III on esitetty, oli pääosa T-ALL-leukemiasoluista reaktio-kykyinen jok vasta-aineen OKTIO kanssa yksinään tai 0KT9:n ja OKTIO:n kanssa, eikä pystynyt reagoimaan muiden monoklo-10 naalisten vasta-aineiden kanssa. Siten 15/25 tapauksella tutkituista näytti olevan varhaistymosyyttiantigeenejä (vaihe I). Sensijaan 5/25 tapausta oli reaktiivisia OKT6:n kanssa, mistä voidaan päätellä, että alkuperänä on kypsempi kateenkorvapopulaatio (vaihe II). Tämä T-ALL-ryhmä oli itse 15 heterogeeninen 0KT4:n, OKT8:n ja vastaavasti OKT9:n suhteen, kuten taulukossa 3 on esitetty. Soluissa 2/5-osalla potilaista on suurin osa tymosyyttiantigeeneistä, kuten OKT4, 0KT6 ja OKT8. On huomattava, että OKT5 ei ole läsnä yhdessäkään näistä viidestä vaiheen II kasvaimesta, vaikka OKT8-20 reaktiivisuus havaittiinkin. Tämä jälkimmäinen tulos viittaa selvästi siihen, että OKT5 ja 0KT8 määrittelevät eri antigeenejä tai eri determinantteja samassa antigeenissä. Lopuksi yhden potilaan kasvaimet 25:stä tutkitusta olivat peräisin kypsästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe III) määritet-25 tynä sen reaktiivisuudella OKT3:n kanssa. Tämän yksilön kasvain oli lisäksi reaktiokykyinen OKT5:n, OKT8:n ja OKTIO:n kanssa. 25:stä analysoidusta leukemiapopulaatiosta ainoastaan neljää kasvainta ei voitu selvästi luokitella. Kolme oli positiivisia OKT4:n ja OKT8:n kanssa, mutta ei OKT3:n 30 ja 0KT6:n kanssa ja todennäköisimmin ne edustivat välimuotoja Thy4:stä ja Thy7,8:sta. Yksi 25 tapauksesta näytti olevan välimuoto Thy3:n ja Thy4:n välillä, koska se oli reaktiivinen 0KT8:n ja OKTIO:n kanssa.

T-solulinjät, jotka olivat peräisin T-ALL-kasvainpo-35 pulaatioista, edustivat myös soluja, jotka kuuluivat johonkin spesifiseen kateenkorvansisäiseen erilaistumisvaiheeseen.

15 75434

Kuten taulukossa 4 on esitetty, HSB oli reaktiivinen yksinomaan 0KT9:n ja OKTlO:n kanssa ja määrittelisi siten kasvain-populaation, joka on peräisin vaiheesta I. Sitävastoin CEM oli reaktiivinen 0KT4:n, 0KT6:n, 0KT8:n, 0KT9:n ja OKTIOtn 5 kanssa ja näytti olevan peräisin vaiheen II tymosyytistä. Lopuksi MOLT-4 näyttää edustavan leukemiamuunnosta HSB-2:n ja CEM:n välissä, koska se ilmensi OKT6:n, OKT8:n, 0KT9:n ja OKTlO:n.

Koska potilailla, joilla on akuutin T-solujen lymfo-10 blastileukemian myöhempiä vaiheita (esim. vaihe II), on osoitettu olevan paremmat eloonjäämismahdollisuudet kuin potilaalla, jolla on vaiheen I ALL, OKT9-vasta-aineen avulla voidaan tehdä johtopäätöksiä tietyn potilaan, jolla on T-solu-ALL, prognoosista.

15 Taulukoissa 2-4 esitetyt suhteet muodostavat vielä erään lisätavan, jolla OKT9-vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.

On havaittu, että 30-50 % perifeerisistä T-soluista tuli OKT9-positiiviseksi mitogeeni-stimuloinnin jälkeen.

20 Tämä ominaisuus tarjoaa käytettäväksi erään lisätavan, jolla OKT9-vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista .

Diagnostisia menetelmiä, joissa käytetään muita mono-kloonisia vasta-aineita tuottavia hybridomoja (OKT1, OKT3, 25 0KT4 ja OKT5 sekä OKT6, OKT8 ja OKTIO) on kuvattu FI-patent-tihakemuksissa 844 703, 844 705, 844 704 ja 844 706 sekä 844 707, 850 062 ja 850 061.

16 75434

Taulukko 1

Monokloonisten vasta-aineiden reaktiivisuus ihmisen lymfoidipopulaatioiden suhteen 5 Monoklooninen Perifeerinen Luuydin Kateenkorva (22) vasta-aine veri (30)*) (6) _E+ E~_ % % % % 0KT6 00 0 70 10 0KT8 30 0 2 80 OKT9 00 0 10 OKT10 5 10 20 95 *) Suluissa olevat luvut edustavat testattujen näytteiden 15 lukumäärää; %-arvot ovat keskiarvoja 17 g 75434

ε S

5 dp K e\i tn m to H i Oili en r~ oo oo jj

3 en O

m 3 -h 3 3 ^ +4 (U tn 2 ns e tfl -H (0 ^ 3 0) •h > m o i i i oo to tn cn 1-1 e

6 *H W i—I 10 -H

3 -H 3 CU 4-1 * 4-1 -p 3 O -H 3

3 X X 00 d M 4J

3 3 Ph 3 -P

M (uefc^LDO m tn o o 4J d O

(0 j_i 3 O m en m en >, tn O

•o Ό 1-11-¾

·Η «H *H

C(D 0) <D W VD

3 -n C tp 4-1

-H 3 -rl {H -H · -P

e -H 3 Ä ° ° ° B 2 2 CO 3 3 3 3 ΟΙυ tDi-if—IOO :3 tn >

Cl) tn 3 X 3 Ό tn 4-1 Q) 4-1 H 3 tn 3 3 3 4J 3 3 £ Ή 4J 3 5 'p > S tn o o o tn o o 'llnm 3 -H O tN Γ- r^OO 00 -H 03 3 3 -P tn 3 3 3 3 >i 4-> 3 :3 4-1 3 rH 3 H :3 3 -rt. 6 3 3 6 T-i-H Fh 3 3 Λ! 3 CKOOtN enoino -H30 Ή 3 3 o O t" to vo d Ή 3 *H »—I O 6 3 3

4J 40 -H r4 O 3 EH

4-1 -H 3 X 3 " ° § S ° * «j g

o 6 >1 4J 3 -H

X tn 3 3 3

X 3 O :3 -X

3 3 g -X 3 3 rH Ό *—13 3 3 -H 4-> 3 3 d 3 3 d -P 3

Eh 3 3 3 4-J

-rl M-1 - 3 -H

3 3 3 1—1 3 1 3 3 -H -H 3 3 -H Ora 44 O 3 44 -3 2 0 O 44 -rl 2 "rt +4 to to to VO to O JJ n< 33 30 000 oovoo > rH -ΡΛί rH rH rH rHrHOrH 333 o o rH 3 3 λ;

33 G 3 XXX XXX rH-H

m 1 0 3 _ X _ 3-> (ä°

{H J 3 ·η O ΓΗ (N OO O

44Eh 4433 HT -tfrHLnm R'm.o 3 HH v m tn - O 4J tn

•rl e 3 0 3 rH eN en d -P

3 -H En 3 Ή 3 O -H 44 44

O 3 ij :3 O -H

rH-Η H g P rH -H

X m rHr-> :0 30-P

O -H OK — 44 44 3 P 2 3 X 4J4J33 03‘jjijj jj :3 33 3 833 :3 :3 633 8 443446 g 3 rH -H 3

44 -h H 3 :ö ·· :q Ή rH 6 rH

PMd-H4J -H 44 303 d “ & | i 1 ί . I! . . . S s I s >9 MH i—I O O 3rHUCJO 3>3 H *H 3 0 3 ·(* ,_j ,_i n O P-P + + 64J + + +

MH 3 4J 5, 44 rn 3 rH

6 BiHVOOflHVCOn J < :l § § m I § § ^ x * ie 75434 3

rH

*Η (Ο I Ρ 4) Ρ .

Ρ Ο) i

X > -H

. b <0 (ΰ O

I :ro +j tn

i-4 ;jg to tn S

d g ~ _ Λ! 3 's 3 LO X ro > I Λ! in C 4J tn H II Γ" 00 i—li—I (N i—1 iH |i—I Q1 rtj H tN « ,H Λί 3 »rH tn »/rt β» g Ö tn 5 iU *n (D C t/l m ph s S S'ö h "S .2 £ ^

3 P -H O + + + + + + + -H 0-P

in tn -m 'Tl 3 a •H <D O S H 2 fl eh a " tp 5 G σ\ •h jH tn c ta § i s . + +. . . . * y | « h "2 G <0 „ m tn a) a > I m &3 ,3 g 8 . . + + . + + H 05 .¾ o JS I H 5 tn tn <#> , l(j O «rj C C g 5 o a> ^ § o S , Td ta •H OÖII + + + + I > ·Η4->

O £ »H «H -M

<D X <3 >< 3

J4 O ^ c S

3 3 G in m -S -H

Ή 0) O H -P -H > 3 H 6 S S . . · > > + 3 33

E-ι c tn tn § ^ "H

a» 3 C rH -h Hj tn 3 td __ M tu -h tn 2 -r! -3 ö -U Ή B -M # rrg

S ^ £ o ι i + + ι i i cj c T

ti -HO) & QJ -H w

•H *H ^ rH jj CO

x -P -h jut, «PflcS 3>|s eaj-ng .3 > . 3 g

>1 PS <0 O I I tili + H (B (N tn -H

rH O .H -H H

> Π g > -P

- +i 3 ·Η (0 S -rt rC [0 -H tri

Q) ω o > ρ <D

.s * ~ «-g 1 -¾c

M - % s BS

Ή >1 ‘H -r| 1h ?3 +J P P

M £ p P — >·Η P + „ : 3 ? I I s 1¾¾ :i.

§ s II I S j sli si IL! 1 if i lii

tu p gi -H <N S HP1 :rö -H ω -H "o S

a tn H S 3 P « ^ Cd h In '"^S i ^.»P' 0 h h $ 5 & <y h ? A i ti) ijij aj ρ oh f £ > < « Is HEE £ £ * * ^ is 75434

Taulukko 4

Reaktiivisuus monokloonisten vasta-aineiden kanssa Solu- OKT3 0KT4 0KT5 0KT6 0KT8 0KT9 OKTIO

5 linla_ HSB-2 -*)---- + + CEM - + - + + + + MOLT-4 ---++++ 10 *) Kriteeti (-)- ja (+)-reaktiivisuudelle oli sama kuin taulukossa 3.

Esillä oleva vasta-aine OKT9 kuuluu alaluokkaan IgG-^, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immuno-globuliini G:n alaluokat poikkeavat toisistaan niinsanotuil-15 la "kiinteillä" alueilla, vaikka vasta-aineella jollekin spesifiselle antigeenille on ns. "muuttuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immu-noglobuliinin G alaluokkaan se kuuluu. Ts. monoklooninen vasta-aine, jolla on tässä kuvatut ominaisuudet, voi kuulua 20 alaluokkaan IgGj, IgG2a/ IgG2b tai I9G3/ tai luokkiin IgM,

IgA tai muihin tunnettuihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien väliset erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiomallin selektiivisyyteen, mutta saattavat vaikuttaa vasta-aineen jatkoreaktioon muiden aineiden, kuten (esimer-25 kiksi) komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Vasta-ainetta OKT9 voidaan käyttää kateenkorvansisäi-sen erilaistumisen havaitsemiseen ja tutkimiseen kuten on pääkohdittain esitetty kuvassa 2. Poikkeavuuksia vaiheen I erilaistumisessa osoittaisi poikkeama noin 10 %:sta OKT9+-30 tymosyyttejä. Lisäksi vasta-ainetta voidaan käyttää tautitilojen, joihin liittyy OKT9+-solujen vähentymistä tai lisääntymistä, diagnoosiin. Näitä menetelmiä voidaan soveltaa käyttäen OKT9-vasta-ainetta yksinään tai yhdessä muiden vasta-aineiden (esim. OKT3-OKT10) kanssa. Reaktiivisuusmallit 35 ryhmällä vasta-aineita T-soluille ja T-solujen alaryhmille sallivat tiettyjen sairaustilojen tarkemman toteamisen kuin on mahdollista käyttäen alan aikaisempia diagnoosimenetelmiä.

20 75434

Diagnostiset yhdistelmät, jotka sisältävät vaikuttavia määriä OKT9-vasta-ainetta sekoitettuna diagnostisesti hyväksyttävien kantajien kanssa, sisällytetään myös tämän keksinnön piiriin.

Claims (2)

21 75434

1. Diagnostinen menetelmä 0KT9+-solujen puutteen tai ylimäärän havaitsemiseksi jossakin yksilössä, t u n -5 n e t t u siitä, että saatetaan tästä yksilöstä otettu T-solu- tai tymosyyttikoostumus reagoimaan diagnostisesti tehokkaan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletus-numero on CRL 8021, ja joka vasta-aine reagoi noin 10 %:n 10 kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nollaso-lujen eikä luuydinsolujen kanssa, ja määritetään, kuinka suuri osa perifeeristen T-solujen ja tymosyyttien kokonais-populaatiosta reagoi mainitun vasta-aineen kanssa.

2. Diagnostinen aineyhdistelmä OKT9+-solujen puut teen tai ylimäärän havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää seoksena diagnostisesti hyväksyttävän kantajan kanssa 0KT9+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi tarvittavan määrän hiiren monoklonaalista vas-20 ta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-tal-letusnumero on CRL 8021, ja joka vasta-aine reagoi noin 10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nollasolujen eikä luuydinsolujen kanssa.