FI75599C - Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en tidig tymocyt antigen av maenniskan medelst en ny hybridcellinje. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en tidig tymocyt antigen av maenniskan medelst en ny hybridcellinje. Download PDFInfo
- Publication number
- FI75599C FI75599C FI803756A FI803756A FI75599C FI 75599 C FI75599 C FI 75599C FI 803756 A FI803756 A FI 803756A FI 803756 A FI803756 A FI 803756A FI 75599 C FI75599 C FI 75599C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cells
- thymocytes
- thy
- antibody
- cell
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 81
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 54
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 18
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 67
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 40
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 12
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 12
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 208000017414 Precursor T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 3
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 210000004287 null lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 claims 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 claims 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 19
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 16
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 description 14
- 201000006491 bone marrow cancer Diseases 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 5
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 5
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 102100032985 CCR4-NOT transcription complex subunit 7 Human genes 0.000 description 3
- 108050006912 CCR4-NOT transcription complex subunit 7 Proteins 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 3
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038602 Chromatin assembly factor 1 subunit A Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001669 bursa of fabricius Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007193 modulation by symbiont of host erythrocyte aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001254 nonsecretory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
Description
1 75599
Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen varhaistymosyytti-antigeenille uuden hybridi-solulinjan avulla 5 Keksinnön kohteena on menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi antigeenille, jota on löydetty varhais-tymosyyteiltä (noin 10 % normaaleista ihmisen tymosyyteistä), käyttäen uutta hybridisolulin-jaa. Vasta-ainetta voidaan käyttää terapeuttisiin tar-10 koituksiin.
Köhler'in ja Milstein'in 1975 esittämä /Nature 256, 495-497 (1975)_7 hiiren myeloomasolujen yhdistäminen immunoitujen hiirien pernasoluihin osoitti ensimmäisen kerran, että oli mahdollista valmistaa jatkuva 15 solulinja, joka tuottaa homogeenista (ns. "monoklonaa-lista") vasta-ainetta. Tämän alkutyön jälkeen paljon ponnisteluja on suunnattu erilaisten hybridisolujen (joita nimitetään "hybridomiksi") tuottamiseen ja näiden hybridomien avulla valmistettujen vasta-aineiden 20 käyttöön erilaisia tieteellisiä tutkimuksia varten.
Ks. esimerkiksi Current Topics in Microbiology and Immunology, nide 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melc-hers, M. Potter ja N. Warner, toimittaja, Springer-Verlag, 1978 sekä siinä olevat viitteet; C.J. Barnstab-25 le, et ai., Cell 14, 9-20 (toukokuu, 1978); P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (marraskuu, 1978); Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, nide 2, D.M. Wier, toimittaja, Blacwell, 1978, luku 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1, 1979, 15-17.
30 Näissä viitteissä on kuvattu samanaikaisesti saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka yleinen menetelmä on teoriassa hyvin ymmärretty, kohdataan monia vaikeuksia ja kussakin erikoistapauksessa vaadi-35 taan modifikaatioita. Itse asiassa ei ole minkäänlaista varmuutta, 2 75599 ennen tietyn hybridoman valmistusta, että haluttu hybridoma saadaan, ja että siinä onnistuttaessa se tuottaa vasta-ainetta, tai että näin valmistetulla vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistumiseen vaikuttaa pääasiallisesti 5 käytetty antigeenityyppi ja käytetty selektiotekniikka halutun hybridoman eristämiseksi.
Yrityksiä valmistaa monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen lymfosyyttisolujen pinta-antigeeneille on kuvattu vain muutamissa harvoissa tapauksissa. Ks. esimerkiksi 10 Current Topics in Microbiology and Immunology, edellä sivut 66-69 ja 164-169. Näissä kuvatuissa kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemian ja ihmisen kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet saadut hybridomat näyttivät tuottavan vasta-ainetta kaikis-15 sa ihmissoluissa esiintyville erilaisille antigeeneille. Mikään hybridoraista ei tuottanut vasta-ainetta tiettyä ihmisen lymfosyyttiluokkaa vastaan.
Äskettäin esillä olevan hakemuksen hakijat ja muut ovat julkaisseet artikkeleita, joissa on kuvattu hybrido-20 mien, jotka muodostavat vasta-ainetta tietyille T-solu-anti-geeneille, valmistusta ja testausta. Ks. esimerkiksi Rein-herz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Rein-herz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 76, 4061-4065 (1979); ja Kung, P.C., et ai., Science, 206, 347-349 (1979). 25 On olemassa kaksi lymfosyyttien pääluokkaa, jotka osallistuvat ihmisten ja eläinten immuunisysteemin. Ensimmäinen näistä (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-so-lu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluis-ta. Erilaistuvien solujen vielä ollessa kateenkorvassa nii-30 tä nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut poistuvat kateenkorvasta ja kiertävät kudosten, imukudosten ja veren-kiertosysteemin välillä. Nämä T-solut muodostavat suuren osan kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunolo-gisesti spesifisiä ja ovat suoraan osallisina soluvälittei-35 sissä immuunireaktioissa (kuten siirrettyjen elinten hylkimisessä) efektorisoluina. Vaikka T-solut eivät eritä vasta-
II
75599 aineita elimistön nesteisiin, niitä tarvitsee myöhemmin käsitettävä toinen lymfosyyttiluokka näiden vasta-aineiden erittämistä varten. T-solujen joillakin tyypeillä on sääte-lytoimintoja immuunisysteemin muissa toiminnoissa. Tämän 5 soluyhteistoimintaprosessin mekanismia ei vielä ole täysin ymmärretty.
Lymfosyyttien toisen luokan (luuytimestä peräisin olevat solut tai B-solut) muodostavat ne, jotka erittävät vasta-ainetta. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantaso-10 luista, mutta kateenkorva ei määrää niiden erilaistumista. Linnuissa ne erilaistuvat elimessä, joka on analoginen ka-teenkorvan kanssa ja josta käytetään nimitystä "Bursa of Fabricius". Nisäkkäillä ei kuitenkaan vastaavaa elintä ole löydetty ja on ajateltu, että nämä B-solut erilaistuvat luu-15 ytimessä.
Nyt on todettu, että T-solut jakautuvat useisiin alatyyppeihin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentä-jä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, joiden toimintana on (vastaavasti) edistää reaktiota, heikentää reaktiota tai tappaa 20 (liuottaa) vieraita soluja. Nämä alaluokat ymmärretään hyvin hiirien elimistössä, mutta niitä on vasta viime aikoina kuvattu ihmisen elimistölle. Ks. esimerkiksi R.L. Evans, et ai., Journal of Experimental Medicine, nide 145, 221-232, 1977; ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis 25 of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", julkaisussa "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, toimittaja, Plenum Press, 1977, nide 7, 363-379.
Kyky tunnistaa tai heikentää T-solujen luokkia tai 30 alaluokkia on tärkeä erilaisten immunoregulatoristen sairauksien tai tilojen diagnoosia tai hoitoa varten.
Esimerkiksi tietyillä leukemioilla ja imukudoskasvai-milla on erilainen prognoosi riippuen siitä, ovatko ne lähtöisin B-soluista vai T-soluista. Siten sairauden prognoo-35 sin arviointi riippuu siitä, miten nämä kaksi lymfosyytti-luokkaa pystytään erottamaan toisistaan. Ks. esimerkiksi 4 75599 A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (maaliskuu 1975); D. Belpomme, et ai., julkaisussa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, et ai., toimittaja, Springer, Heidelberg, 5 1977, 33-45; ja D. Belpomme, et al., Britich Journal of
Haematology, 1978, 38, 85.
Tiettyihin sairaustiloihin (esim. nuoruusiän nivelreuma, pahanlaatuiset taudit ja agammaglobulinemia) liittyy T-solujen alaluokkien epätasapaino. On otaksuttu, että 10 autoimmuuneihin sairauksiin yleensä liittyy "auttaja"-T- solujen ylimäärä tai tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen puute, kun taas agammaglobulinemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä tai "auttaja"-T-solujen puute. Pahanlaatuisiin tauteihin liittyy yleensä "heikentäjä"-T-solujen 15 ylimäärä.
Tietyissä leukemioissa syntyy liikaa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja. Diagnoosi voi siten riippua kyvystä havaita tämä epätasapaino tai ylimäärä ja määrittää mitä kehitysvaihetta on ylimäärin. Ks. esimerkiksi 20 J. Kersey, et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" julkaisussa Haematology and Blood Transfusion, nide 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 sekä siinä esitetyt viitteet; ja E.L. Reinherz, et ai., J. Clin. Invest., 64, 392-397 (1979).
25 Agammaglobulinemia, sairaustila, jossa immunoglobu- liinia ei muodostu ollenkaan, käsittää ainakin kaksi selvästi toisistaan erottuvaa tyyppiä. Tyypissä I immunoglobulii-nia ei muodostu heikentäjä-T-solujen ylimäärästä johtuen, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puut-30 teestä. Kummassakaan tyypissä ei näytä olevan mitään puutetta tai vajausta potilaan B-soluissa, lymfosyyteissä, jotka ovat vastuussa vasta-aineen varsinaisesta erityksestä; nämä B-solut ovat kuitenkin joko heikennettyjä tai "niitä ei ole autettu", mistä on seurauksena suuresti alentunut tai 35 puuttuva immunoglobuliinin tuotanto. Agammaglobulinemia- tyyppi voidaan siten määrittää testaamalla heikentäjä-T-solujen ylimäärä tai auttaja-T-solujen puute.
Il 5 75599
Terapeuttisella puolella on ehdotettu, mitä vielä ei ole varmasti todistettu, että vasta-aineiden antaminen ylimäärin esiintyvää T-solun alatyyppiä vastaan voi olla terapeuttisesti edullista autoimmuunisairauksissa tai pahanlaa-5 tuisissa taudeissa. Esimerkiksi auttaja-T-solu-syöpää (tiettyjä ihon T-solu-imukudoskasvaimia ja tiettyjä akuuttia T-solujen lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa vasta-aineella auttaja-T-solu-antigeenille. Autoimmuunisairauksien, jotka ovat aiheutuneet auttajasolujen ylimäärästä, 10 hoito voidaan myös toteuttaa samalla tavalla. Sairauksia (esim. pahanlaatuisia tauteja tai tyypin I agammaglobuli-nemiaa), jotka aiheuttavat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla vasta-ainetta heikentäjä-T-solu-antigeenille.
15 Ihmisen koko T-solujen luokkaa vastaan vaikuttavien vastaseerumien (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG) on esitetty olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia potilailla, joille on tehty elinsiirtoja. Koska soluvälitteinen immuunireaktio (mekanismi, jolla siirrettyjä elimiä 20 torjutaan) riippuu T-soluista, vasta-aineen antaminen T-so-luille estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Ks. esimerkiksi Cosimi, et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40: 155-163 (1976) sekä siinä esitetyt 25 viitteet.
Ihmisen T-soluluokkien ja -alaluokkien tunnistaminen ja heikentäminen on aikaisemmin suoritettu käyttäen spontaaneja autovasta-aineita tai selektiivisiä antiseerumeja ihmisen T-soluille, joita seerumeja saadaan immunoimalla 30 eläimiä ihmisen T-soluilla, juoksuttamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla vastaseerumi (esimerkiksi) autologisilla, mutta ei-allogeenisillä B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus .
35 Näiden antiseerumien valmistaminen on äärimmäisen vai keata, erityisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Jopa 6 75599 adsorboidut ja puhdistetut antiseerumit sisältävät monia epäpuhtauksia halutun vasta-aineen lisäksi, monista syistä. Ensinnäkin seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheut-5 taa vasta-aineiden muodostumisen erilaisia antigeenejä vastaan, joita löytyy kaikista injektoiduista ihmisen T-soluis-ta. Yksittäistä antigeeniä vastaan ei tapahdu mitään selektiivistä vasta-aineen tuotantoa. Kolmanneksi tällaisilla menetelmillä saadun spesifisen vasta-aineen tiitteri on 10 tavallisesti melko alhainen (esim. inaktiivinen laimennuksissa, jotka ovat suurempia kuin 1:100) ja spesifisen vasta-aineen suhde ei-spesifiseen vasta-aineeseen on pienempi kuin 1/106.
Ks. esimerkiksi Chess'in ja Schlossman'in artikkelia, 15 johon edellä viitattiin (sivulta 365 eteenpäin) sekä Chemical and Engineering News'in artikkelia, johon edellä viitattiin, joissa alan aikaisempien antiseerumien puutteet ja monoklonaalisen vasta-aineen edut on kuvattu.
Nyt on löydetty uusi hybridoma (nimeltään OKT9), joka 20 pystyy tuottamaan uutta monokloonista vasta-ainetta antigeeniä vastaan, jota esiintyy noin 10 %:lla normaaleista ihmisen tymosyyteistä, mutta ei normaaleissa ihmisen perifeerisissä lymfosyyteissä (T-soluissa, B-soluissa tai nollaso-luissa) tai luuydinsoluissa. Näitä tymosyyttejä, joiden kans-25 sa OKT9 on reaktiivinen, nimitetään "varhais-tymosyyteiksi".
Näin tuotettu vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle determinantille, jota esiintyy noin 10 %:lla ihmisen normaaleista tymosyyteistä ja ei pääasiallisesti sisällä mitään muuta ihmisen vastaista immunoglobuliinia vasta-30 kohtana alan aikaisemmille antiseerumeille (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-ainetta, joka on reaktiivinen lukuisten ihmisen antigeenien suhteen) ja alan aikaisemmille monoklonaalisille vasta-aineille (jotka eivät ole mo-nospesifisiä ihmisen tymosyyttiantigeenille). Lisäksi tätä 35 hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen valmistamiseksi tarvitsematta immunoida ja tappaa eläimiä, mitä seuraa työ-
II
t 7 75599 läät adsorptio- ja puhdistus-vaiheet, jotka ovat tarpeen jopa alan aikaisempien epäpuhtaiden antiseerumien saamiseksi.
Sekä esillä olevasta hybridomasta että sillä tuote-5 tusta vasta-aineesta käytetään nimitystä "0KT9", jolloin asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Hybridoma talletettiin 21.11.1979 kokoelman American Type Culture Collection, 12301 Park-lawn Drive Rockville, Maryland 20852 ja sille annettiin ATCC-talletusnumero CRL 8021. 10 Vasta-aineelle OKT9 on tunnusomaista, että se a) reagoi noin 10 %:n kanssa ihmisen normaaleja ty-mosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen tai luuydin-solujen kanssa, 15 b) reagoi 8 %:n kanssa käsittelemättömiä tymosyyt- tejä, 6 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 12 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty 20 hybridisolulinjän ATCC CRL 8001 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, ja 5 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka etukäteen käsitelty hybridisolu-linjan ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 25 c) reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuulu vat vaiheen I varhaisiin tymosyytteihin Thy 2 tai vaiheen II tavallisiin tymosyytteihin Thy 3, mutta ei ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen I-esitymosyyttei-hin Thy 1, vaiheen II tavallisiin tymosyytteihin Thy 4, 30 Thy 3-4 tai Thy 4-6 vaiheen III myöhäisiin tymosyytteihin Thy 8, d) reagoi HSB-2-, CEM- ja M0LT-4-solulinjojen kanssa ; ja e) määrittelee T-solu-antigeenin, jota esiintyy 35 30-50 %:lla perifeerisiä T-soluja mitogeeni-stimulaation jälkeen .
8 75599
Vasta-aineen 0KT9 valmistus hybridisolulinjän ATCC CRL 8021 avulla on kuvattu patenttivaatimuksissa 1 ja 2.
Hybridoma valmistettiin seuraten Milstein'in ja Kohler 1 in menetelmää. Hiiriä immunoitiin leukemiasoluilla, 5 jotka oli saatu potilaasta, jolla oli T-solujen akuutti lymfoblastileukemia, minkä jälkeen immunoitujen hiirien pernasolut yhdistettiin hiiren luuydinkasvainlinjän soluihin ja saaduista hybridomista seulottiin ne, joiden super-natantti sisälsi vasta-ainetta, joka sitoutui selektiivi-10 sesti normaaleihin E-"rosetti"-positiivisiin ihmisen T-so-luihin ja/tai tymosyytteihin. Halutut hybridomat kloonattiin tämän jälkeen ja karakterisoitiin. Tuloksena saatiin hybridoma, joka tuottaa vasta-ainetta (merkitty 0KT9:ksi) antigeeniä vastaan, jota esiintyy noin 10 %:lla normaaleis-15 ta ihmisen tymosyyteistä. Tämä vasta-aine ei reagoi ainoastaan noin 10 %:n kanssa normaaleista ihmisen tymosyyteistä, vaan se ei myöskään reagoi veren normaalien perifeeristen lymfoidisolujen tai luuydinsolujen kanssa.
Ottaen huomioon alalla aikaisemmin esiintyneet vai-20 keudet ja negatiiviset tulokset käytettäessä pahanlaatuisia solulinjoja antigeeninä, oli yllättävää, että tällä menetelmällä saatiin haluttu hybridoma. On korostettava, että hyb-ridisolujen valmistuksen ennalta arvaamattoman luonteen vuoksi ei ole mahdollista ekstrapoloida yhdestä antigeeni-25 tai solujärjestelmästä toiseen. Itseasiassa esillä olevan hakemuksen keksijät ovat havainneet, että käytettäessä antigeenejä, jotka oli erotettu solun pinnalta, ei yleensä saatu onnistuneita tuloksia.
Hybridoman OKT9 ja siitä saatavan vasta-aineen val-30 mistus ja karakterisointi tulee paremmin ymmärrettäväksi seuraavan selostuksen ja esimerkkien avulla.
Hybridoman valmistusmenetelmä käsittää yleensä seu-raavat vaiheet: A. Hiiriä immunoidaan leukemiasoluilla ihmisestä, 35 jolla oli T-solu-ALL. Samalla on havaittu, että naaraspuoliset CAF^-hiiret ovat edullisia, myös muiden hiirikantojen
II
75599 käyttöä voidaan ajatella. Immunointiaikataulun ja tymosyyt-tipitoisuuden tulisi olla sellaiset, että saadaan käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä splenosyyttejä.
7
Kolme immunointia 14 päivän välein 2 x 10 solulla/hiiri/ 5 ruiske 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta on havaittu tehokkaaksi.
B. Inununoiduilta hiiriltä poistetaan pernat ja valmistetaan pernasolususpensio sopivaan väliaineeseen. Noin 1 ml väliainetta pernaa kohti on riittävä. Nämä koemene-10 telmät ovat hyvin tunnettuja.
C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään sopivasta so-lulinjasta saatuihin hiiren luuydinkasvainsoluihin käyttäen sopivaa yhdistämistä edistävää ainetta. Edullinen suhde on noin 5 pernasolua luuydinkasvainsolua kohti. Noin 0,5-1,0 15 ml:n kokonaistilavuus yhdistämisväliainetta on sopiva noin g 10 splenosyytille. Monia hiiren luuydinkasvainsolulinjoja tunnetaan ja niitä on saatavissa, yleensä akateemisten yhteisöjen jäseniltä ja eri talletuspankeilta, kuten laitoksesta Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA.
20 Käytetyn solulinjan tulisi edullisesti olla ns. "lääkkeen-kestävää" tyyppiä, niin että vapaat luuydinkasvainsolut eivät jää eloon selektiivisessä väliaineessa, kun taas hybridit jäävät eloon. Tavallisin luokka on 8-atsaguaniinia kestävät solulinjat, joilta puuttuu entsyymi hypoksantiinigua-25 niinifosforibosyylitransferaasi, ja jotka eivät siten kasva HAT-väliaineessa (sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä). On myös yleensä edullista, että käytetty luuydinkasvainsolulin ja on ns. "ei-erittävää" tyyppiä, sikäli että se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, joskin myös 30 erittäviä tyyppejä voidaan käyttää. Tietyissä tapauksissa erittävät myelomalinjät saattavat kuitenkin olla edullisia. Samalla kun edullinen yhdistymistä edistävä aine on poly-etyleeniglykoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 35 noin 1000-4000 (kaupallisesti saatavana PEG 1000:na, jne), voidaan käyttää myös muita alalla tunnettuja yhdistymistä edistäviä aineita.
10 75599 D. Laimennetaan ja viljellään erillisissä astioissa vapaiden pernasolujen, vapaiden luuydinkasvainsolujen ja yhdistyneiden solujen seosta selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat luuydinkasvainsolut eivät kasva, riittävän 5 pitkä aika, jotta vapaat solut kuolevat (noin 1 viikko). Laimennus voi olla rajattua tyyppiä, jossa laimennusaineen tilavuus lasketaan tilastollisesti niin, että saadaan eristetyksi tietty määrä soluja (esim. 1-4) jokaiseen erilliseen astiaan (esim. mikrotiitterilevyn jokaiseen syvennyk-10 seen). Väliaine on sellainen (esim. HAT-väliaine) , jossa lääkkeenkestävä (esim. 8-atsaguaniinia kestävä) vapaa luu-ydinkasvainsolulinja ei kasva. Täten luuydinkasvainsolut tuhoutuvat. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niillä on ainoastaan rajallinen määrä sukupolvia. Siten tie-15 tyn ajan (noin 1 viikon kuluttua) nämä vapaat pernasolut eivät pysty lisääntymään. Toisaalta yhdistyneet solut lisääntyvät edelleen, koska niillä on luuydinkasvaimesta peräisin oleva pahanlaatuinen luonne ja pernasoluista peräisin oleva kyky kasvaa selektiivisessä väliaineessa.
20 E. Arvioidaan kunkin hybridomapitoisen säiliön (sy vennyksen) supernatantti sen suhteen, sisältääkö se vasta-ainetta E-"rosetti"-positiivisille puhdistetuille ihmisen T-soluille tai tymosyyteille.
F. Valitaan (esim. rajoittavalla laimennuksella) ja 25 kloonataan hybridomat, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta.
Kun haluttu hybridoma on valittu ja klonattu, voidaan syntyvää vasta-ainetta tuottaa kahdella eri tavalla. Puhtain monoklooninen vasta-aine tuotetaan viljelemällä ha-30 luttua hybridomaa in vitro sopivassa väliaineessa sopivan pituinen aika, mitä seuraa halutun vasta-aineen talteenotto sakan päällä olevasta nesteestä. Sopiva väliaine ja sopiva viljelyajan pituus ovat tunnettuja tai helposti määritettävissä. Tämä in vitro-menetelmä tuottaa pääasiallisesti mo-35 nospesifistä monokloonista vasta-ainetta, joka on pääasiallisesti vapaa muusta spesifisestä ihmisen vastaisesta immu- 11 11 75599 noglobuliinista. Läsnä on pieni määrä muuta immunoglobulii-nia, koska väliaine sisältää ksenogeenistä seerumia (esim. vasikan sikiöseerumia). Tämä in vitro-menetelmä ei kuitenkaan tuota riittävää määrää vasta-ainetta tai sen pitoi-5 suutta joihinkin tarkoituksiin, koska monokloonisen vasta-aineen pitoisuus on ainoastaan noin 50 jug/ml.
Haluttaessa valmistaa paljon suurempia pitoisuuksia hieman vähemmän puhdasta monokloonista vasta-ainetta haluttua hybridomaa injektoidaan hiiriin, edullisesti syngeeni-10 siin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma saa aikaan vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen sopivan inkubointiajän jälkeen, mistä on tuloksena halutun vasta-aineen suuri pitoisuus (noin 5-20 mg/ml) isäntähiiren verestä ja peritoneaalisessa tulehdusnesteessä (vesivatsa).
15 Vaikka näillä isäntähiirillä myös on normaaleja vasta-aineita veressään ja vesivatsassaan, on näiden normaalien vasta-aineiden pitoisuus ainoastaan noin 5 % monokloonisen vasta-aineen pitoisuudesta. Lisäksi, koska nämä normaalit vasta-aineet eivät ole ihmisen vastaisia spesifisyydeltään, 20 on monoklooninen vasta-aine, joka on saatu talteenotetusta vesivatsasta tai seerumista, pääasiallisesti vapaa kaikesta kontaminoivasta ihmisen vastaisesta immunoglobuliinista. Tällä monokloonisella vasta-aineella on korkea tiitteri (aktiivinen laimennuksissa 1:50 000 tai suuremmissakin) ja 25 spesifisen immunoglobuliinin suhde ei-spesifiseen immuno-globuliiniin on suuri (noin 1/20). Immunoglobuliinit, jotka sisältävät kevyitä luuydinkasvainketjuja, ovat ei-spesi-fisiä, ei-vaikuttavia peptidejä, jotka pelkästään laimentavat monokloonista vasta-ainetta vähentämättä sen spesifi-30 syyttä.
Esimerkki 1
Monokloonisten vasta-aineiden tuottaminen A. Immunointi ja somaattinen soluhybridisointi
Naaraspuolisia CAF^-hiiriä (Jackson Laboratories; 35 6-8 viikon ikäisiä) immunoitiin vatsaontelon sisäisesti 2 x 10^ T-ALL-leukemia-solulla (potilas J.F.) 0,2 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein.
12 755 99 4 päivää kolmannen immunoinnin jälkeen pernat poistettiin hiiristä ja tehtiin yksinkertainen solususpensio puristamalla kudos ruostumattomasta teräksestä tehdyn verkkokudok-sen läpi.
5 Solujen yhdistäminen suoritettiin Kohlerin ja Mil- g stein1in kehittämän menetelmän mukaisesti. 1 x 10 spleno-syyttiä yhdistettiin 0,5 ml:ssa yhdistämisväliainetta, joka sisälsi 35 % polyetyleeniglykolia (PEG 1000) ja 5 % dime-tyylisulfoksidia RPMI 1640-väliaineessa (Gibco, Grand Is- 7 10 land, NY), 2 x 10 P3X63Ag8Ul-luuydinkasvainsolun kanssa, joita toimittaa tohtori M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Nämä luuydinkasvainsolut erittävät kevyitä IgG^-ketjuja.
B. Hybridoman valinta ja kasvatus 15 Solujen yhdistämisen jälkeen soluja viljeltiin HAT- väliaineessa (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini) 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CC^. Useita viikoja myöhemmin 40-100 ^ul sakan päällä olevaa nestettä hybridomapitoisista viljelmistä lisättiin pellettiin, 20 jossa oli 10° perifeeristä lymfosyyttiä jaettuina E-"roset-ti"-positiivisiin (E+) ja E-"rosetti"-negatiivisiin (E ) populaatioihin, jotka valmistettiin terveiden luovuttajien verestä Mendesin kuvaamalla tavalla (J. Immunol. Ill: 860, 1973). Näihin soluihin sitoutuneiden hiirien hybridomavasta-25 aineiden toteaminen suoritettiin epäsuoralla immunofluore-senssilla. Soluja, joita oli inkuboitu viljelmien pintanes-teiden kanssa, värjättiin fluoresinoidulla vuohi-anti-hiiri-IgG:lla (G/M FITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA; F/p =2,5) ja fluoresoivat vasta-aineella päällystetyt so-30 lut analysoitiin senjälkeen solufluorografi FC200/4800A- laitteella (Ortho Instruments, Westwood, MA), kuten on kuvattu esimerkissä 3. Hybridomaviljelmät, jotka sisälsivät vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti E+-lymfosyyt-tien (T-solujen) ja/tai tymosyyttien kanssa, valittiin ja 35 kloonattiin kahdesti rajoittavilla laimennusmenetelmillä syöttösolujen läsnäollessa. Sen jälkeen kloonit siirrettiin
II
13 755 99 vatsaontelon sisäisesti injektoimalla tietyn kloonin 7 1 x 10 solua (0,2 ml:n tilavuus) CAF^-hiiriin, joita oli esikäsitelty 2,6,10,14-tetrametyylipentadekaanilla, jota myy Aldrich Chemical Company kauppanimellä "Pristine". Pa-5 hanlaatuisia vesivatsoja näistä hiiristä käytettiin sitten lymfosyyttien karakterisointiin kuten seuraavassa esimerkissä 2 on kuvattu. Esillä olevan hybridi-vasta-aineen 0KT9 osoitettiin standardimenetelmin kuuluvan IgG^alaluok-kaan.
10 Esimerkki 2 OKT9-reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen Ihmisen perifeerisiä yksitumaisia verisoluja eeistet-tiin terveiltä vapaaehtoisilta luovuttajilta (iältään 15-40 15 vuotta) Ficoll-"Hypaque"-tiheysgradienttisentrifugointimene-telmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) seuraten Boyum'in menetelmää, Scand. J. Clin. lab. Invest. 21 (Suppl. 97):77, 1968. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-IgT(B)- ja Ig (T+nolla)-populaatioiksi Sephdadex G-200 20 anti-F(ab')2-Pylv^skromatografisesti kuten aikaisemmin on kuvannut Chess, et ai., J. Immunol. 113: 1113 (1974). T-solut otettiin talteen E-"rosetoimalla" Ig -populaatio 5 %:lla lampaan erytrosyyttejä (Microbiological Associates, Bet-hesda, MD). "Rosetoitu" seos kerrostettiin Ficoll-25 "Hypaque1 lie" ja talteenotettua E+-pellettiä käsiteltiin 0,155M NH^Cl^la (10 ml/108 solua). Näin saatu T-solupopu^ laatio oli alle 2-% : sesti EAC-"rosetti"-positiivinen ja yli 95-%:sesti E-"rosetti"-positiivinen määritettynä standardi-menetelmin. Lisäksi ei-"rosetoiva" Ig” (nollasolu)-populaa-30 tio otettiin talteen Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli alle 5-%:sesti E+ ja < 2 % slg+. Pinta-Ig+ (B)-populaatio saatiin Sephadex G-200-pylväästä eluoinnin jälkeen normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla kuten edellä kuvattiin. Tämä populaatio oli yli 95-%:isesti pinta-Ig+ ja 35 alle 5-%:isesti E+.
Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin normaaleilta 14 755 9 9 vapaaehtoisilta luovuttajilta taaemmasta suoliluun harjusta punktiomenetelmällä.
B. Tymosyyttien eristäminen
Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilail-5 ta, jotka olivat iältään 2 kuukaudesta 14 vuoteen ja jotka olivat joutuneet korjaavaan sydänleikkaukseen. Vastasaadut kateenkorvarauhasen osat pantiin välittömästi 5-%:iseen vasikan sikiöseerumiin väliaineessa 199 (Gibco), hienonnettiin pihdeillä ja saksilla ja tehtiin sen jälkeen yhtä solulajia 10 sisältäväksi suspensioksi puristamalla metallilankaverkon läpi. Solut kerrostettiin seuraavaksi Ficoll-"Hypaque1 lie" ja sentrifugoitiin ja pestiin kuten edellä kuvattiin osassa A. Näin saadut tymosyytit olivat yli 95-%:isesti elinvoimaisia ja >90-%:sesti E-”rosetti"-positiivisia.
15 C. T-solujen solulinjat ja akuutin T-solujen lymfo- blastileukemian solut T-solulinjat CEM , HSB-2 ja MOLT-4 toimitti Dr. H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leu-kemiasoluja saatiin 25 potilaalta, joiden diagnoosi oli T-20 solu-ALL. Näiden yksittäisten kasvainten oli aikaisemmin määritetty olevan peräisin T-soluista, koska ne muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan erytrosyyttien kanssa (>20 % E+) ja olivat reaktiivisia T-soluille spesifisten he-teroantiseerumien anti-HTL (B.K..) ja A99 kanssa, kuten edellä 25 kuvattiin. Kasvainpopulaatioita kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa DMSO:ssa ja 20 %:isessa AB-ihmisseerumissa pintakarakterisointiin asti. Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat yli 90-%risesti blasteja solusentrifugivalmisteiden Wright-Giemsa-morfolo-30 gian mukaan.
Esimerkki 3
Solufluorografinen analyysi ja solujen erotus
Monoklonaalisten vasta-aineiden solufluorografinen analyysi kaikilla solupopulaatioilla suoritettiin epäsuoral-35 la immunofluoresenssilla fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Labora-
II
is 7 5 5 9 9 tories) käyttäen solufluorografi-FC200/4800A-laitetta (Ortho Instruments). Lyhyesti esitettynä 1 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml:lla vasta-ainetta OKT5 laimennuksessa 1:500, inku-boitiin 4°C:ssa 30 minuuttia ja pestiin kahdesti. Solut saa-5 tettiin sitten reagoimaan 0,15 ml:n kanssa G/M FITC:n 1:40-laimennosta 4°C:ssa 30 minuutin ajaksi, sentrifugoitiin ja pestiin kolmasti. Solut analysoitiin sitten solufluorografi-laitteella ja fluoresenssin voimakkuus solua kohti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Samanlainen reaktii-10 visuusmalli havaittiin laimennuksessa 1:10000, mutta lisä-laimentaminen aiheutti reaktiivisuuden häviämisen. Tausta-värjäys saatiin käyttämällä 0,15 ml suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä, joka oli saatu CAF^-hiirestä, johon oli vatsaontelon sisäisesti injektoitu ei-tuottavaa 15 hybridikloonia.
Kokeissa, jotka käsittävät vasta-aine- ja komplement-tivälitteisen lymfosyytin, viljeltiin tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja yli yön, mitä seurasi selektiivinen hajotus, ja sen jälkeen ne analysoitiin solufluorografilaitteel-20 la.
Esimerkki 4
Lymfoidi-populaatioiden hajotus monoklonaalisen vasta-aineen ja komplementin kanssa 40 x 10^ perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä pantiin 25 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). Solupellettejä inkuboitiin 0,8 ml:n kanssa vasta-ainetta OKT3, OKT4 tai 0KT8 tai normaalia vesivatsavertailunäytettä, jotka oli laimennettu suhteeseen 1:200 PBS:ssä, suspendoitiin uudelleen ja inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuuttia. Sen jälkeen vasta-30 aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, suspendoitiin uudelleen ja inkuboitiin edelleen 37°C:ssa ravistelijalla varustetulla vesi-hauteella 60 minuuttia. Tämän ajan päätyttyä solut sentrifugoitiin ja elinvoimaiset solut määritettiin Trypan-sini-35 sellä. Laskemisen jälkeen solut pestiin kaksi lisäkertaa 5-%:isessa FCS:ssa ja pantiin lopulliseen väliaineeseen ie 75599 RMPI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY) , joka sisälsi 20 % AB+-ihmisseerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-puskuria ja 0,5 % natriumkarbonaattia ja inkuboitiin yli yön kosteas-5 sa atmosfäärissä, jossa oli 5 % C02, 37°C:ssa.
Kuva 1 esittää fluoresenssispektriä, joka on saatu solufluorografilaitteella sen jälkeen kun normaalit ihmisen tymosyytit on saatettu reagoimaan vasta-aineen OKT9 sekä muiden monokloonisten vasta-aineiden kanssa laimennussuh-10 teessä 1:500 sekä G/M FITC:n kanssa. Taustat fluoresenssi-värjäykseen saatiin inkuboimalla kutakin populaatiota ve-sivatsanesteessä, joka oli saatu hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuotettavaa kloonia, 1:500-laimenoksena.
Kuva 2 esittää tymosyyttien erilaistumista ihmisen 15 kateenkorvassa.
Hybridoman valmistus ja syntyvän monoklonaalisen vasta-aineen valmistus ja karakterisointi suoritettiin kuten edellisissä esimerkeissä kuvattiin. Vaikka suuria määriä esillä olevaa vasta-ainetta valmistettiin ruiskuttamalla 20 hybridomaa vatsaontelon sisäisesti hiiriin ja ottamalla talteen pahanlaatuiset vesivatsat, hybridomaa voidaan viljellä myös in vitro alalla hyvin tunnetuin menetelmin ja vasta-aine ottaa talteen viljelmän pintanesteestä.
Taulukko I esittää vasta-aineiden 0KT6, 0KT8, 0KT9 ja 25 OKT10 reaktiivisuuden erilaisten ihmisen lymfoidisolupopu-laatioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine 0KT9 on reak-tiokykyinen noin 10%:n kanssa normaaleista ihmisen tymosyy-teistä eikä minkään muiden testattujen lymfoidisolujen kanssa. Tämä reaktiivisuusmalli on yksi testi, jolla esillä 30 oleva vasta-aine 0KT9 voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.
Kuva 1 esittää edustavaa fluoresenssimallia, joka on saatu solufluorografilaitteella sen jälkeen kun normaaleja ihmisen tymosyyttisuspensioita on saatettu reagoimaan 35 OKT3:n, OKT4:n, OKT5:n, OKT6:n, OKT8:n, OKT9:n, OKTIOrnja G/M FITC:n 1:500-laimennosten kanssa. Samanlaisia reaktiivi-
II
17 75599 suusmalleja saatiin 12 muulla testatulla normaalilla ihmisen tymosyyttipopulaatiolla. Kuten havaitaan, esiintyy merkittäviä eroja sekä reaktiivisuusprosentissa että fluoresenssin voimakkuudessa jokaisella näistä monokloonaalisista vas-5 ta-aineista. Esimerkiksi 0KT9 reagoi noin 10 %:n kanssa ty-mosyyteistä alhaisella fluoresenssivoimakkuudella, kun taas OKT5, OKT6, OKT8 ja OKTIO reagoivat noin 70 %:n kanssa tymo-syyteistä suuremmalla fluoresenssivoimakkuudella. OKT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyteistä, on reaktiivisuudeltaan 10 vasta-aineen OKT9 ja sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden välillä, joilla on korkeampi fluoresenssivoimakkuus. Lisäksi kuva 1 osoittaa, että noin 15 % tymosyyteistä todetaan OKT3:lla epäsuoralla immunofluoresenssilla. Kuvassa ei näy vasta-ainetta OKT1, jonka reaktiivisuusmalli on itse-15 asiassa samanlainen kuin OKT3:lla tymosyyteille. Reaktiivisuusmalli kuvassa 1 on toinen testi, jolla esillä oleva vasta-aine OKT9 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista .
Taulukko 2 esittää erilaisten monoklonaalisten vasta-20 aineiden määrittelemien antigeenien jakaatumisen ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja tymosyytteihin, jakautuminen on määritettyä sarjalla hajotuskokeita, jotka on kuvattu esimerkissä 3. Koska ainoastaan 0KT3, 0KT4 ja OKT8 olivat komplementin sitovia monoklonaalisia vasta-aineita, näitä 25 kolmea käytettiin.
Kuten taulukossa 2A on esitetty, koko T-solupopulaa-tio reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, OKT5 ja OKT8 reagoivat vastaavasti 60 %:n 25 %:n ja 34 %:n kanssa T-soluista. Hajotus OKT4:llä ja komplementillä pienensi kokonaismäärää 30 62 %:lla ja poisti spesifisesti OKT4+-populaation. Lisäksi OKT5+- ja OKT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi eikä mitään vaikutusta ollut OKT5+- ja OKT8+-T-solujen absoluuttiseen lukumäärään. Nämä kokeet osoittivat, että OKT4+ oli selvästi erillinen OKT5+- ja OKT8+-populaatioista. Lisätu-35 kea tälle johtopäätökselle saatiin hajottamalla T-soluja OKT8:n ja komplementin kanssa. Tässä tapauksessa OKT4+-T- 18 755 9 9 solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, absoluuttinen lukumäärä pysyi samana ja 0KT8+- ja 0KT5+-populaatiot poistuivat. Lisäksi nämä tulokset osoittivat, että 0KT8+-populaatio oli käänteinen 0KT4+-populaatiolle ja sisälsi koko OKT8+-T-so-5 lujen alaryhmän.
Samanlaiset kokeet ihmisen tymosyyttipopulaatioilla antoivat erilaisia tuloksia. Kuten taulukossa 2B on esitetty, noin 75 % tymosyyteistä oli 0KT4+ tai 0KT8+. Lisäksi hajotuksen jälkeen joko 0KT4:llä tai 0KT8:lla ainoastaan 25 % 10 tymosyyteistä jäi jäljelle. Pääosa jäljelle jääneistä tymosyyteistä oli reaktiokykyinen OKT3:n kanssa, kun taas ainoastaan pieni osa oli reaktiokykyinen OKT6:n kanssa. Nämä havainnot osoittavat, että ihmisen tymosyyttien pääpopulaa-tiolla on OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-pinta-antigeenit sa-15 massa solussa. Lisäksi taulukko 2 osoittaa, että käsittelyn jälkeen OKT8:lla tai 0KT4:llä kypsissä tymosyyteissä, joilla on OKT3-antigeeni, tapahtuu merkittävä lisäys. Siten pääosa OKT3-reaktiivisista tymosyyteistä on jo erottunut OKT4+-tai OKT8+-alaryhmiksi, koska pääosa jäljelle jääneistä so·· 20 luista OKT4- tai OKT8-hajotuksen jälkeen on OKT3+. Jos OKT3''’-alapopulaatio olisi sekä 0KT4+ että OKT8+, silloin hajotus jommallakummalla monokloonisella vasta-aineella olisi poistanut OKT3-reaktiiviset tymosyytit.
OKT3-reaktiivisten tymosyytti-alapopulaatioiden suh-25 teen edelleen määrittämiseksi muihin monoklonaalisen vasta-aineen määrittelemiin tymosyyttijakeisiin, tymosyyttejä käsiteltiin OKT3:lla ja komplementilla ja jäljellejääneitä soluja verrattiin sitten käsittelemättömiin tymosyyttipopu-laatioihin. Kuten taulukossa 2B on esitetty, poistivat OKT3 30 ja komplementti 25 % tymosyyteistä. Lisäksi ei tapahtunut OKT4-, OKT5-, OKT6- tai OKT8-reaktiivisten populaatioiden suurempaa häviötä. Näistä havainnoista voidaan vetää se johtopäätös, että suurin osa tymosyyteistä, joilla on 0KT6-markkeri, sisältyvät OKT3“-populaatioon. Lisäksi tästä voi-35 daan päätellä, että tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät OKT4:n, OKT5:n ja 0KT8:n määrittelemiä antigeenejä,
II
19 75599 ovat samalla tavoin rajoittuneet 0KT3“-populaatioon. Olisi myös huomattava, että tymosyyttien 0KT9-reaktiivinen populaatio ei pienentynyt fraktioimattomien tymosyyttien 0KT3-ja komplementti-käsittelyn jälkeen, osoittaen siten, että 5 0KT9+-alapopulaatio on laajalti rajoittunut 0KT3_-tymosyyt-tipopulaatioon.
Näiden tulosten perusteella on ollut mahdollista kuvata ihmisen tymosyyttien kateenkorvansisäisen kehityksen vaiheita. Kuten kuvassa 2 on esitetty, on itseasiassa kai-10 kissa tymosyyteissä OKTIO-markkeri. Lisäksi tymosyytit saavat aikaisessa vaiheessa OKT9-markkerin (Thyl ja vastaavasti Thy2). Tämä vaihe määrittelee tymosyyttien vähemmistön ja muodostaa noin 10 % fraktioimattomasta populaatiosta.
Sen jälkeen ihmisen tymosyytit saavat ainutlaatuisen OKT6:n 15 määrittelevän tymosyyttiantigeenin ja ilmentävät samanaikaisesti OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n (Thy4). Tämä jälkimmäinen alapopulaatio edustaa tymosyyttien pääosaa ja muodostaa 70-80-%:sesti kateenkorva-populaation. Edelleen kypsyessään tymosyytit menettävät 0KT6-reaktiivisuuden, saavat 0KT3-20 (ja OKT1-) reaktiivisuuden ja erottuvat OKT4+- ja OKT5+/OKT8+-alaryhmiksi (Thy7 ja Thy8). Lopuksi näyttää siltä, että kun tymosyytti joutuu perifeerisiin T-soluihin, se menettää OKTlO-markkerin, koska tämä antigeeni puuttuu itseasiassa kaikilta perifeerisiltä T-lymfosyyteiltä. Mahdollisia väli-25 muotoja näiden kolmen kateenkorvansisäisen pääkehitysvaiheen välissä merkitään Thy3:lla, Thy5:llä ja Thy6:lla kuvassa 2.
Koska T-soluista peräisin olevan äkillinen lymfoblas-tileukemian ajatellaan olevan peräisin epäkypsistä tymosyy-teistä, määritettiin suhde yksilöiden, joilla oli T-ALL, 30 kasvainsolujen, ja näiden kateenkorvansisäisten ehdotettujen erilaistumisvaiheiden välillä. 25 kasvainsolupopulaatiota yksilöistä, joilla oli T-ALL, ja kolme T-solulinjaa, joita aikaisemmin oli tutkittu tavanomaisilla anti-T-solureagens-seilla ja E-"rosetoinnilla", tutkittiin. Kuten taulukossa 35 III on esitetty, oli pääosa T-ALL-leukemiasoluista reaktio-kykyinen joko vasta-aineen OKT10 kanssa yksinään tai OKT9:n 20 75599 ja OKTlOzn kanssa, eikä pystynyt reagoimaan muiden monoklo-naalisten vasta-aineiden kanssa. Siten 15/25 tapauksella tutkituista näytti olevan varhaistymosyyttiantigeenejä (vaihe I). Sensijaan 5/25 tapausta oli reaktiivisia OKT6:n 5 kanssa, mistä voidaan päätellä, että alkuperänä on kypsempi kateenkorvapopulaatio (vaihe II). Tämä T-ALL-ryhmä oli itse heterogeeninen 0KT4:n, 0KT8:n ja vastaavasti 0KT9:n suhteen, kuten taulukossa 3 on esitetty. Soluissa 2/5-osalla potilaista on suurin osa tymosyyttiantigeeneistä, kuten OKT4, 10 OKT6 ja OKT8. On huomattava, että OKT5 ei ole läsnä yhdessäkään näistä viidestä vaiheen II kasvaimesta, vaikka OKT8-reaktiivisuus havaittiinkin. Tämä jälkimmäinen tulos viittaa selvästi siihen, että OKT5 ja OKT8 määrittelevät eri antigeenejä tai eri determinantteja samassa antigeenissä. Lopuk-15 si yhden potilaan kasvaimet 25:stä tutkitusta olivat peräisin kypsästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe III) määritettynä sen reaktiivisuudella OKT3:n kanssa. Tämän yksilön kasvain oli lisäksi reaktiokykyinen OKT5:n, OKT8:n ja OKTlOzn kanssa. 25zstä analysoidusta leukemiapopulaatiosta ainoas-20 taan neljää kasvainta ei voitu selvästi luokitella. Kolme oli positiivisia OKT4zn ja OKT8zn kanssa, mutta ei OKT3zn ja OKT6zn kanssa ja todennäköisimmin ne edustivat välimuotoja Thy4zstä ja Thy7,8zsta. Yksi 25 tapauksesta näytti olevan välimuoto Thy3zn ja Thy4zn välillä, koska se oli reak-25 tiivinen OKT8zn ja OKTlOzn kanssa.
T-solulinjat, jotka olivat peräisin T-ALL-kasvainpo-pulaatioista, edustivat myös soluja, jotka kuuluivat johonkin spesifiseen kateenkorvansisäiseen erilaistumisvaiheeseen. Kuten taulukossa 4 on esitetty, HSB oli reaktiivinen yksin-30 omaan OKT9zn ja OKTlOzn kanssa ja määrittelisi siten kasvain-populaation, joka on peräisin vaiheesta I. Sitävastoin CEM oli reaktiivinen OKT4zn, ΟΚΤβζη, OKT8zn, OKT9zn ja OKTlOzn kanssa ja näytti olevan peräisin vaiheen II tymosyytistä. Lopuksi MOLT-4 näyttää edustavan leukemiamuunnosta HSB-2zn 35 ja CEMzn välissä, koska se ilmensi ΟΚΤβζη, OKT8zn, OKT9zn ja OKTlOzn.
Il 21 75599
Koska potilailla, joilla on akuutin T-solujen lymfo-blastileukemian myöhempiä vaiheita (esim. vaihe II), on osoitettu olevan paremmat eloonjäämismahdollisuudet kuin potilaalla, jolla on vaiheen I ALL, 0KT9-vasta-aineen avulla 5 voidaan tehdä johtopäätöksiä tietyn potilaan, jolla on T-solu-ALL, prognoosista.
Taulukoissa 2-4 esitetyt suhteet muodostavat vielä erään lisätavan, jolla 0KT9-vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.
10 On havaittu, että 30-50 % perifeerisistä T-soluista tuli OKT9-positiivisiksi mitogeeni-stimuloinnin jälkeen.
Tämä ominaisuus tarjoaa käytettäväksi erään lisätavan, jolla OKT9-vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista .
15 Muita monokloonisia vasta-aineita tuottavia hybrido- meja (OKT1, OKT3, OKT4 ja OKT5 sekä OKT6, OKT8 ja OKT10) sekä menetelmiä näiden vasta-aineiden ja hybridomien valmistamiseksi on kuvattu FI-patent.tihakemuksissa 800846, 801343, 801342 ja 802917 sekä 803755, 803758 ja 803757.
20 Taulukko 1
Monokloonisten vasta-aineiden reaktiivisuus ihmisen lymfoidipopulaatioiden suhteen
Monoklooninen Perifeerinen Luuydin Kateenkorva (22) vasta-aine veri (30)1) (6)
Zd _E+ E~_ % % % % OKT6 00 0 70 OKT8 30 0 2 80 30 OKT9 0 0 0 10 OKT10 5 10 20 95
Suluissa olevat luvut edustavat testattujen näytteiden lukumäärää; %-arvot ovat keskiarvoja 5 22 75599 tn 'ä ° 6 . r4 X! h •H <#> * og in m to l Olli en r~ oo co
(0 in O
ω 3 H
tn 3 4-i ro tn 2 ro a tn -Η te g ro oi
d > M ö I I I 03 ίο m (N <-t C
£ -h in r—i 3 -h 3 Ή G ft ιμ ·
+J -P A O -H (O
3 ^ oo Oi tn 44 to to Fh φ 44 M tucEö^Ttno m m o o 4J ft Hl
to ρ φ O m σ> r-~ tn σο >, in O
•η Ό ι-Η I X
G *H r—I -H
G Φ φ Q) tq to <U -n C 10 4-1 H G -H H -rl *4-1 G ^(ögooo tn ro ro Φ OIU VDr-lr-IOO :ro tn > a) tn ro x tn g O' 44 a) 4-) •h g tn to to tn *j ¢) Id S I—I 4J o G ^^^ιλοο o m o o '"J ^ ro -HOcNt''· r- oo 00 -H O Φ tl) G 4-1 tn
G G tl) G >, 4J
Φ :<Ö 44 Q) H tl) h :<o tn e ro tn g *i 1 *H En tl) G Λί 0) C»oocn ιηοίπσ i—i ro o rHGtUOO'X I" 140143 & r—| (U -H 1—I O g G 3 4J ,C r—I r—I O Φ Eh 4J -H <D X 0) H 0) ·γ~> O no r-t ro :ro+J -roo^00^^ oomo •ro'cjtn
Se^isi00'0'0' ^0000 ^ S
O E >1 4-J 3 -h tn tn G tn CO :ro Λί
3 (D H X G G
-π Ό >1 -h ro ro 2 -h 4J φ ro a g φ a -n ro
t-1 ero tn -P
•r4 T-I - ro -H
ro ero ·γί tn ro 1 G Φ -h h tn ro -h "jr* to -G o tn
44 G 3 § O 44 -H
id 44 4i 10 to ie to to to Tj - ^ ^ 3 Q) O OOO ΟΟΌΟ ^ *Ή -H nH rH »H rH iH r—j Π3 [/) Π3 O o , rH ro ι/i ^ C Cfl SS NXX ^ X .. X 1—ί*Η
Si Φ T-| O (M (N OO O
GEh 44 g G ^ - t» h m tn Λ ro tn 1—1 ,—1 m in - O-um -r4 C ro O G r-4 04 (Ti O, 44 e -h E-1 tn ή Φ O -H 44 44 O tn 44 :ro O -h
•“J ‘•"t G E >4 Ή -H
M tn 'd'H :θ φ O 4J
O ·Η _ O 4J 4J
Sm-HJ2 * 44 44 e G
Q ^ 44 fn 44 44 :ro φ φ φ
E ro ro :ro :133 E ro e E
ή ro 4) e e ro ή -ι-t φ 4J · h φ :Q ·· :0 j __i p _i
Rmä-nS -h 44 rooro a
^^aSiro 4J:ro 44 e E
WaOlSgrH >|E 44 44 φ o
•Η φ φ - -H :rö 4i£ X
'S ^-HUUtnMuuu tn > g
Μ-Μ4* + εΗ + + 4- :r0 -h *h II
tS44 + + l,44 + + + « a> ^
Cu-H^rcoEH-Htroono
tn Eh Eh tn Eh Eh Eh U
tl 23 75599
G
G
H
-P
TO
I -P
tu u .
P Q) 3
=<0 λ; > rH
>h d m o
I :ra G -P W
H :2 fO tn H
e — _ m g a < D m v to > I ϋ in C -P ui
E-ι D H n* CO H H Γ\| H ήΗΟ) TO
Ή im 3 -H ^
G -p U) -P
<u c 2 tn J3 ιΰ τι Φ CU) •H 3 Ό *<T3 c' Ή m -p -h g -2 «-¾ ti ti JS ^ ^ >i o [>
G 10 Ή fcö X? p TO
G I* Ή O + + + + + + + -p O-P
tn u) -P h c uj •Ή 0) ° $ H 3
Π3 EH & 1/3 M JS
G (Tv .
H Eh U) G (0
Siä « 3 to
0 «J ° 1 + +111 I C-P
[Ο-p M P O
+* tn m -h p G itJ „ m tn o u > | λ s. 3
« «Oli ++I+ + -H W -H
'H o) tn c o O-P 32 ·· >
1/5 w ? -P
c c g q ° ω on (Ö O % 2 (0 -H O O I I + + + + I > -H 4-) O S Ή Ή -p Λί (U Λί JO > 2 "p ti 2 i—I CU)
3 o c in O -ti -H
1—I (1) O £h -P -h >
G Ή £ Ui Si . -H -P -H
(¾ rn O I I I I I I + Λί >—I -H
£h g u) tn S ££ 0) G G -H ϋ T3 tn g to p o» p tn Λί S Ti :2 ^ +> -p ö ti · :2 p > 2 o 1 1 ++II I QC £| (0 -P O iid! -P- ·“I Ή Ό H n U) Λ -P -P O J, λ; ro H TO £ £ c>|-2 εω-ρ^ 3 . 5 >
>1 K tö O I I I I I I + -P p CN U) -P
H O .O -p -p
— -P TO -P TO
g -p JP to -p rp 2 0) O > -P δ tn <+1 _ ^ p x c •p ~ to q ,γ to * H % TO 2¾
'H >ι H -H ip d +7 -P -p -P
* 5 ~ | H 8» 3 ~S
g Tj d 8 « £ * >, * » * «5
Sm ί | g £ Jj c !3 to Jh
•H -H >1 >i >i U) 3.J G U) -P -P
*f0 P 0 3 Ή Ή *~H O
3 nm r- £ £ 2 ^ ^ ^ ® I 3« S H ff :TO -S S -P O § G -P M n -fi ^ ip γ S' MM :π° I ΗΟ,Ι ti ,2 2 8 5 lp (UH ? ro ir tu :io rH έ1 O h 3 S H 5 ~ a £ £ £ £ 5-S 2PhS>,U) 1 H «3 · $ rt s ~
H W ><ffl >Eh >2 K H+M
24
Taulukko 4 75599
Reaktiivisuus monokloonisten vasta-aineiden kanssa
Solu- 0KT3 0KT4 0KT5 0KT6 0KT8 0KT9 OKTIO 5 linia_ HSB-2 -*) ---- + + CEM - + - + + + + MOLT-4 --- + + + + 10 *) Kriteeri (-)- ja (+)-reaktiivisuudelle oli sama kuin taulukossa 3.
Esillä oleva vasta-aine OKT9 kuuluu alaluokkaan IgG-^, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immuno-globuliini G:n alaluokat poikkeavat toisistaan niinsanotuil-15 la "kiinteillä" alueilla, vaikka vasta-aineella jollekin spesifiselle antigeenille on ns. "muuttuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immu-noglobuliinin G alaluokkaan se kuuluu. Ts. monoklooninen vasta-aine, jolla on tässä kuvatut ominaisuudet, voi kuulua 20 alaluokkaan IgGlf IgG2a, IgG2b tai Ι9^3, tai luokkiin IgM, IgA tai muihin tunnettuihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien väliset erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiomallin selektiivisyyteen, mutta saattavat vaikuttaa vasta-aineen jatkoreaktioon muiden aineiden, kuten (esimer-25 kiksi) komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.
Vasta-ainetta OKT9 voidaan käyttää kateenkorvansisäi-sen erilaistumisen havaitsemiseen ja tutkimiseen kuten on pääkohdittain esitetty kuvassa 2. Poikkeavuuksia vaiheen I erilaistumisessa osoittaisi poikkeama noin 10 %:sta OKT9+-30 tymosyyttejä. .
Sairaustiloja (esim. pahanlaatuisia tauteja, kuten tiettyjä vaiheen I tai IT ~ALL-tapauksia), joissa esiintyy ylimäärin OKT9 -soluja, voidaan hoitaa antamalla terapeuttisesti vaikuttava määrä OKT9-vasta-ainetta tällaisen hoidon 35 tarpeessa olevalle yksilölle. Selektiivisellä reaktiolla 0KT9+-antigeenin kanssa vaikuttava määrä OKT9-vasta-ainet-
II
25 75599 ta alentaa 0KT9+-solujen ylimäärää, parantaen siten ylimäärän vaikutukset. Vasta-ainetta 0KT9 voidaan sisällyttää terapeuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät vaikuttavia määriä 0KT9-vasta-ainetta sekoitettuna farmaseutti-5 sesti hyväksyttävien kantajien kanssa.
Claims (5)
- 75599
- 1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka 5 a) reagoi noin 10 %:n kanssa ihmisen normaaleja ty- mosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen tai luuydin-solujen kanssa, b) reagoi 8 %:n kanssa käsittelemättömiä tymosyyt-10 tejä, 6 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjan ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 12 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjan ATCC CRL 8001 avulla valmistetulla mo-15 noklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, ja 5 %:n kanssa tymosyyttejä,jotka etukäteen käsitelty hybridisolulinjan ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, c) reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuulu-20 vat vaiheen I varhaisiin tymosyytteihin Thy 2 tai vaiheen II tavallisiin tymosyytteihin Thy 3, mutta ei ALL-T-solu-vaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen I-esitymosyyttei-hin Thy 1, vaiheen II tavallisiin tymosyytteihin Thy 4, Thy 3-4 tai Thy 4-6 vaiheen III myöhäisiin tymosyyttei-25 hin Thy 8, d) reagoi HSB-2-, CEM- ja MOLT-4-solulinjojen kanssa; ja e) määrittelee T-solu-antigeenin, jota esiintyy 30-50 %:lla perifeerisiä T-soluja mitogeeni-stimulaation 30 jälkeen, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8021 i) immunoimalla hiiriä ihmisen T-ALL-leukemia-soluilla, 35 ii) poistamalla näiltä hiiriltä pernat ja valmista malla pernasolususpensio, 75599 iii) yhdistämällä nämä pernasolut hiiren myelooma-soluihin yhdistämistä edistävän aineen läsnäollessa, iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat 5 myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla pintaneste jokaisessa hybridoonan sisältävässä syvennyksessä sen suhteen, sisältääkö se vasta-ainetta E-rosetti-positiivisille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille, 10 vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8021, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi noin 10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen tai luuydin-solujen kanssa; ja
- 15 B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) viljelemällä hybridoomaa ATCC CRL 8021 sopivassa väliaineessa, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen mainitun hybri-dooman pintanesteestä.
- 2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmis tamiseksi , a) joka reagoi noin 10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen tai luuydin-so- 25 lujen kanssa, b) reagoi 8 %:n kanssa käsittelemättömiä tymosyytte jä, 6 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, 30 12 %;n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjan ATCC CRL 8001 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla ja 5 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjan ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklo- 35 naalisella vasta-aineella ja komplementilla, c) reagoi ALL-T-soluvaiheiden kanssa, jotka kuulu- 28 7 5 5 9 9 vat vaiheen I varhaisiin tymosyytteihin Thy 2 tai vaiheen II tavallisiin tymosyytteihin Thy 3, mutta ei ALL-T-solu-vaiheiden kanssa, jotka kuuluvat vaiheen I esitymosyyttei-hin Thy 1, vaiheen II tavallisiin tymosyyttehin Thy 4,
- 5 Thy 3-4 tai Thy 4-6 tai vaiheen III myöhäisiin tymosyytteihin Thy 8, d) reagoi HSB-2-, CEM- ja M0LT-4-solulinjojen kanssa, ja e) määrittelee T-solu-antigeenin, jota esiintyy 10 30-50 %:lla perifeerisiä T-soluja mitogeeni-stimulaation jälkeen, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8021 i) immunoimalla hiiriä ihmisen T-ALL-leukemiaso- 15 luilla, ii) poistamalla näistä hiiristä pernat ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä pernasolut hiiren myeloomasolui-hin yhdistämistä edistävän aineen läsnäollessa, 20 iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myelooma-solut eivät kasva, v) arvioimalla pintaneste jokaisessa hybridooman sisältävässä syvennyksessä sen suhteen, sisältääkö se 25 vasta-ainettaE-rosetti-positiivisille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8021, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi noin 10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei 30 ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen tai luuydinsolujen kanssa; ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) siirtämällä hybridooma ATCC CRL 8021 intra-peritoneaalisesti hiiriin, ja 35 viii) ottamalla vasta-aine talteen hiirien pahan laatuisesta vesivatsasta tai seerumista. Il 75599
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI850063A FI75434C (fi) | 1979-12-04 | 1985-01-07 | Diagnostiskt foerfarande, vid vilket man anvaender en monoklonal antikropp specifik mot maenninskans tidiga tymocytantigen och i foerfarandet anvaendbar komposition. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10007179 | 1979-12-04 | ||
| US06/100,071 US4364934A (en) | 1979-12-04 | 1979-12-04 | Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI803756L FI803756L (fi) | 1981-06-05 |
| FI75599B FI75599B (fi) | 1988-03-31 |
| FI75599C true FI75599C (fi) | 1988-07-11 |
Family
ID=22277970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI803756A FI75599C (fi) | 1979-12-04 | 1980-12-03 | Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en tidig tymocyt antigen av maenniskan medelst en ny hybridcellinje. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4364934A (fi) |
| EP (1) | EP0030814B1 (fi) |
| JP (2) | JPS5695122A (fi) |
| AT (1) | ATE13693T1 (fi) |
| AU (1) | AU545181B2 (fi) |
| CA (1) | CA1175367A (fi) |
| DE (2) | DE30814T1 (fi) |
| DK (1) | DK153891C (fi) |
| ES (1) | ES497424A0 (fi) |
| FI (1) | FI75599C (fi) |
| HK (1) | HK24186A (fi) |
| IE (1) | IE50724B1 (fi) |
| IL (1) | IL61621A (fi) |
| MY (1) | MY8600518A (fi) |
| NO (1) | NO159887C (fi) |
| NZ (1) | NZ195648A (fi) |
| PH (1) | PH17490A (fi) |
| PT (1) | PT72145B (fi) |
| YU (1) | YU45077B (fi) |
| ZA (1) | ZA807562B (fi) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4691010A (en) * | 1979-12-04 | 1987-09-01 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen, antibody, and methods |
| US4624925A (en) * | 1979-12-04 | 1986-11-25 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocyte antigens, antibody, and methods |
| US4434156A (en) | 1981-10-26 | 1984-02-28 | The Salk Institute For Biological Studies | Monoclonal antibodies specific for the human transferrin receptor glycoprotein |
| USRE32011E (en) * | 1981-12-14 | 1985-10-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
| JPS60231699A (ja) * | 1983-11-09 | 1985-11-18 | Aichiken | 正常及び悪性ヒト造血器細胞に対するモノクローナル抗体 |
| FR2560212B1 (fr) * | 1984-02-24 | 1989-12-29 | Unicet | Anticorps monoclonaux contre l'interferon a2 et hybridomes produisant de tels anticorps |
| US4562003A (en) * | 1984-10-26 | 1985-12-31 | California Biotechnology, Inc. | Monoclonal antibodies against alveolar surfactant protein |
| US5431897A (en) * | 1985-04-19 | 1995-07-11 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method of imaging colorectal carcinoma lesion and composition for use therein |
| US4970299A (en) * | 1986-07-03 | 1990-11-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies selective for prostate cancer |
| US5100777A (en) * | 1987-04-27 | 1992-03-31 | Tanox Biosystems, Inc. | Antibody matrix device and method for evaluating immune status |
| US5085985A (en) * | 1987-11-12 | 1992-02-04 | Becton Dickinson & Co. | Monoclonal antibodies and their use in a method for monitoring subsets of activated T cells |
| US5601819A (en) * | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
| US5252711A (en) * | 1989-06-01 | 1993-10-12 | The Gillette Company | Monoclonal antibodies useful in deodorizing skin and antibody fragments thereof |
| SE503225C2 (sv) * | 1991-10-30 | 1996-04-22 | Leif Lindholm Konsult Ab | Virus-antikroppskomplex för införing av virus i mammalieceller |
| CZ43098A3 (cs) | 1995-08-16 | 1998-05-13 | Zeneca Limited | Konjugáty obsahující mutovanou formu enzymu karboxypeptidázy B, způsob jejich přípravy a jejich použití |
| EP1034003A4 (en) | 1997-11-24 | 2004-07-14 | Johnson T Wong | METHODS FOR TREATING HIV OR OTHER INFECTIONS USING A T CELL ACTIVATOR OR A VIRAL ACTIVATOR AND ANTIRETROVIRAL COMBINATION THERAPY |
| US7653260B2 (en) | 2004-06-17 | 2010-01-26 | Carl Zeis MicroImaging GmbH | System and method of registering field of view |
| US8582924B2 (en) | 2004-06-30 | 2013-11-12 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Data structure of an image storage and retrieval system |
| DK3292149T3 (da) | 2015-05-04 | 2022-02-28 | Cytomx Therapeutics Inc | Aktiverbare anti-cd71-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4196265A (en) * | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
| US4172124A (en) * | 1978-04-28 | 1979-10-23 | The Wistar Institute | Method of producing tumor antibodies |
| US4284412A (en) * | 1979-07-13 | 1981-08-18 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method and apparatus for automated identification and enumeration of specified blood cell subclasses |
-
1979
- 1979-12-04 US US06/100,071 patent/US4364934A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-11-21 CA CA000365176A patent/CA1175367A/en not_active Expired
- 1980-11-25 NZ NZ195648A patent/NZ195648A/en unknown
- 1980-12-02 AU AU64961/80A patent/AU545181B2/en not_active Expired
- 1980-12-03 IL IL61621A patent/IL61621A/xx not_active IP Right Cessation
- 1980-12-03 DK DK517280A patent/DK153891C/da active
- 1980-12-03 DE DE198080304349T patent/DE30814T1/de active Pending
- 1980-12-03 FI FI803756A patent/FI75599C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-12-03 ES ES497424A patent/ES497424A0/es active Granted
- 1980-12-03 IE IE2510/80A patent/IE50724B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-12-03 EP EP80304349A patent/EP0030814B1/en not_active Expired
- 1980-12-03 ZA ZA00807562A patent/ZA807562B/xx unknown
- 1980-12-03 YU YU3064/80A patent/YU45077B/xx unknown
- 1980-12-03 PT PT72145A patent/PT72145B/pt unknown
- 1980-12-03 NO NO803660A patent/NO159887C/no not_active IP Right Cessation
- 1980-12-03 PH PH24939A patent/PH17490A/en unknown
- 1980-12-03 AT AT80304349T patent/ATE13693T1/de active
- 1980-12-03 DE DE8080304349T patent/DE3070745D1/de not_active Expired
- 1980-12-04 JP JP17032680A patent/JPS5695122A/ja active Granted
-
1986
- 1986-04-03 HK HK241/86A patent/HK24186A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-12-30 MY MY518/86A patent/MY8600518A/xx unknown
-
1988
- 1988-05-17 JP JP63118391A patent/JPS6463376A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK153891C (da) | 1989-02-20 |
| FI803756L (fi) | 1981-06-05 |
| EP0030814B1 (en) | 1985-06-05 |
| NO159887C (no) | 1989-02-15 |
| YU45077B (en) | 1992-03-10 |
| NZ195648A (en) | 1984-07-06 |
| DE30814T1 (de) | 1984-07-19 |
| MY8600518A (en) | 1986-12-31 |
| ATE13693T1 (de) | 1985-06-15 |
| CA1175367A (en) | 1984-10-02 |
| IE50724B1 (en) | 1986-06-25 |
| YU306480A (en) | 1984-04-30 |
| JPS5695122A (en) | 1981-08-01 |
| HK24186A (en) | 1986-04-11 |
| PT72145B (en) | 1982-07-05 |
| PH17490A (en) | 1984-09-04 |
| AU6496180A (en) | 1981-06-11 |
| AU545181B2 (en) | 1985-07-04 |
| FI75599B (fi) | 1988-03-31 |
| DK153891B (da) | 1988-09-19 |
| JPS6363557B2 (fi) | 1988-12-07 |
| IL61621A (en) | 1984-07-31 |
| DK517280A (da) | 1981-06-05 |
| ZA807562B (en) | 1982-07-28 |
| DE3070745D1 (en) | 1985-07-11 |
| JPS6463376A (en) | 1989-03-09 |
| ES8301636A1 (es) | 1983-01-01 |
| EP0030814A3 (en) | 1981-12-30 |
| US4364934A (en) | 1982-12-21 |
| JPH0159869B2 (fi) | 1989-12-20 |
| ES497424A0 (es) | 1983-01-01 |
| IE802510L (en) | 1981-06-04 |
| NO803660L (no) | 1981-06-05 |
| EP0030814A2 (en) | 1981-06-24 |
| PT72145A (en) | 1981-01-01 |
| NO159887B (no) | 1988-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI75365C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av monoklonal antikropp till maensklig protymocytantigen medelst deras hybridcellinje. | |
| FI75599C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en tidig tymocyt antigen av maenniskan medelst en ny hybridcellinje. | |
| FI75183C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en komplement-bindande monoklonal antikropp mot maenniskans t-celler genom anvaendning av en ny hybridcellinje. | |
| FI75366C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en komplement-fixerande monoklonal antikropp mot maenskliga supressor-t-celler medelst en hybridcellinje. | |
| FI75184B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot maenskliga t-cellers antigener med en ny hybridcellinje. | |
| FI75600B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en maensklig monocytantigen medelst en ny hybridcellinje. | |
| FI75598C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en maensklig tymocytantigen medelst en ny hybridcellinje. | |
| US4624925A (en) | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocyte antigens, antibody, and methods | |
| FI75434C (fi) | Diagnostiskt foerfarande, vid vilket man anvaender en monoklonal antikropp specifik mot maenninskans tidiga tymocytantigen och i foerfarandet anvaendbar komposition. | |
| FI75232B (fi) | Diagnostiskt foerfarande foer paovisande av underskott eller oeverskott pao en specifik t-cellpopulation under anvaendning av en monoklonal antikropp specifik mot maenniskans tymocytantigen. | |
| US4691010A (en) | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen, antibody, and methods | |
| US4806349A (en) | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human prothymocyte antigen, antibody, and methods | |
| FI75433C (fi) | Diagnostiskt foerfarande, i vilket anvaends en specifik monoklonal antikropp till maensklig protymocyt antigen och i foerfarandet anvaendbar komposition. | |
| HRP940824A2 (en) | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human prothymocyte antigen, antibody, and methods | |
| HRP940823A2 (en) | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocite antigen, antibody and method of preparation of this antibody | |
| HRP940822A2 (en) | Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to a human supressor t cells, antibody and methods | |
| HRP940790A2 (en) | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human thymocyte antigen, antibody and method of preparation thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |
Owner name: ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION |