FI75433C - Diagnostiskt foerfarande, i vilket anvaends en specifik monoklonal antikropp till maensklig protymocyt antigen och i foerfarandet anvaendbar komposition. - Google Patents

Description

1 75433

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään ihmisen esitymo-syyttiantigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta ja menetelmässä käyttökelpoinen ainekoostumus 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 803757

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään OKT10+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä sekä menetelmässä käyttökelpoiseen ainekoostumukseen. 10 Menetelmässä käytetään hyväksi ihmisen esitymosyyttianti-geenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin 15 /Nature 256 (1975) 495-4977/ jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solu-linja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin 20 ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi:

Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 -"Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M.

Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun 25 sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et ai., Cell 14 (toukokuu 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering 30 News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hyb-ridomeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia 35 esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua 2 75433 hybridomaa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja 5 halutun hybridoman eristämisessä käytetystä selektiotek-niikasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current 10 Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81/ 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikut-15 ti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeenei-hin. Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Äskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvattu sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jot-20 ka tuottavat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta. Katso esim. Reinherz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 4061-4065 (1979); ja Kung, P.C. et ai., Science, 206, 347-349 (1979).

25 Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toi mintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopieettisista kantasoluista. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "ty-30 mosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imuku-dokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesta spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suo-35 raan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä 3 75433 hylkiminen). Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyt-tiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat 5 toisissa immunologisissa järjestelmissä säätelevästä. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät 10 vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kan-tasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elin-15 tä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä 20 alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232 ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct 25 Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja 0. Stutman, Plenum Press 1977, vol.

7, 363-379.

Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai 30 niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregu-latoristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskas-vainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudinprognoosia 35 arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryh-mää pystytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: 4 75433 A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300? D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymhomas", toimittajat S. Thierfelder et al., Springer, Heidelberg 5 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of

Haematology 38 (1978) 85.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa tautitiloissa ja tietyissä leu-kemiamuodoissa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epä-10 tasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobulinemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä tai "auttaja"-T-solujen puute. Pahanlaa-15 tuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin. Joissakin leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan 20 tai määrittämään, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin. Katso esimerkiksi: J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20. Springer-Verlag 1977, 17-23 ja julkaisun sisältämät 25 viitteet sekä E.L. Reinberg et al., J. Clin. Invest. 64 (1979) 392-397.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immuno-globuliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä. Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu, koska hei-30 kentäjä-T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan 35 näiden B-solujen toimintaa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobulii- 5 75433 nin tuotantoa tai keskeyttää tuotannon kokonaan. Agamma-globulinemiatyyppi voidaan siten määrittää sen perusteella, esiintyykö heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

5 On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa autoimmuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-laineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin esiintyvälle T-solulajille, vasta-aineet voivat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi 10 auttaja-T-solusyöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvai-mia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemia-muotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle auttaja-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista tautia, joka aiheutuu auttaja-solujen ylimäärästä, voi-15 daan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja (esim. pahanlaatuisia tautitiloja tai tyyppiä I olevaa agamma-globulinemiaa), jotka aiheutuvat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle vasta-ainetta, joka on spesifinen heikentäjä-T-soluantigeenille. 20 Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyvttiglobuliini eli ATG), on osoittautunut terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityk-25 sellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimis-prosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: 30 Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektii-35 visiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen t-soluilla, poistamalla eläimistä veri 6 75433 seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-haluttu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa eri-5 koisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-aine-molekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi im-10 munointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen useita antigeenejä vastaan, joita on löydetty kaikissa injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesi-15 fisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifi-sen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/106.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä 20 mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News" -lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

25 Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT 10), joka pys tyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta antigeenille, jota on löydetty noin 95 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 5 %:lta ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:lta perifeerisiä mononukleaari-30 siä E“-soluja (B-solut ja nollasolut) sekä 10-20 %:lta luuydinsoluja. Näin muodostunut vasta-aine on mono-spesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien T-solu-jen pinta-antigeenideterminantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastai-35 siä immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epä- 75433 puhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen tymosyytin antigeenille). Li-5 säksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmene-10 telmissä ovat olleet välttämättömiä.

Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuottamasta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKTIO", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on talletettu 15 21.10.1979 laitokseen "the American Type Culture Collec tion", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8022.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 803757.

20 Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että annetaan potilaasta otetun T-solu- tai tymosyyttinäytteen reagoida diagnostisesta vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista 25 vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8022, ja joka vasta-aine reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyt-tejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä mononukleaarisia 30 E“-soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n kanssa luuydinsoluja,. ja määritetään mainitun vasta-aineen kanssa reagoivien perifeeristen T-solujen ja tymosyyttien prosentuaalinen osuus näiden kokonaismäärästä.

Esimerkki 1 35 OKTIO-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 8 75433 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque -tiheysgradienttisentri-fugointimenetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH), Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J.Clin. Lab.

5 Invest. 21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yk situmaiset solut erotettiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig-(T- ja nollasolu)-populaatiiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2~pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immu-10 nol. 113 (1974) . T-solut otettiin talteen E-rosetoimal-la Ig“-populatio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque -sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clrlla 15 (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2-%:isesti EAC-rosenttipositiivinen ja >95-%:isesti E-rosenttipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig“ (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkim-20 mäinen populaatio oli <5-%risesti E-positiivinen ja <2-%:isesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%:isesti pinta-Ig-25 positiivinen ja <5-%:isesti E-positiivinen.

Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin terveiden vapaaehtoisten luovuttajien taaemmasta suoliluun-harjusta punktiomenetelmällä.

B. Tymosyyttien eristäminen 30 Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin poti lailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan 35 sikiöseerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solula-jia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan 75433 läpi. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja >90-%:isesti E-rosenttipositiivisia.

5 C. T-solulinjat ja T-solujen akuutin lymfoblas- tileukemian solut T-solulinjat CEM, HSB-2 ja MOLT-4 toimitti tohtori H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukemiasolut saatiin 25:Itä T-solujen akuuttia 10 lymfoblastileukemiaa sairastavalta potilaalta. Nämä

yksittäiset kasvaimet oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu olevan T-solukasvaimia, koska kasvainso-lut muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa ( > 20 % E+) ja koska ne reagoivat T-15 soluille spesifisten heteroantiseerumien, anti-HTL

(B.K)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten edellä on kuvattu. Kasvainpopulaatioita kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa dimetyyli-sulfoksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumissa, kun-20 nes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat >90-%:isesti blasteja syto-sentrifugivalmisteiden Wright-Giemsa -morfologialtaan.

Esimerkki 2

Solufluorografinen analyysi ja solujen erotus 25 Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solupopulaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografi-nen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresens-simenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M 30 FITC) Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solu-fluorografia FC200/4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen 35 annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/m FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reak- 10 75433 tiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluorenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivi-5 suusmalli oli samanlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:lla suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanes-tettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuotta-10 valla hybridikloonilla immunisoidusta CAF-^-hiirestä.

Kokeissa, joissa tutkittiin vasta-aine- ja komple-menttivälitteistä lymfolyysiä, tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja viljeltiin yön yli, minkä jälkeen seurasi selektiivinen hajotus, ja sen jälkeen solut analysoitiin 15 solufluorografilla.

Esimerkki 3

Lymfoidipopulaatioiden hajotus monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla.

40 x 10® perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä 20 lisättiin 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). Solupelletteihin lisättiin 0,8 ml vasta-ainetta OKT3, OKT4 tai OKT8 tai tavallista vesivatsanestettä (vertailuaine) , jotka oli laimennettu suhteessa 1:200 PBS:llä, seokset suspendoitiin ja inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuu-25 tin ajan. Sen jälkeen vasta-aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, seos suspendoitiin ja sitä inkuboitiin edelleen 37°C:ssa 60 minuutin ajan vesihauteessa, joka oli liitetty ravistelijaan. Inkuboinnin päätyttyä solut 30 sentrifugoitiin ja elinkykyiset solut määritettiin

Trypan-sinisellä. Solut laskettiin, pestiin kaksi kertaa 5-%:lla FCS:llä ja asetettiin lopulliseen väliaineeseen RPMI 1640 (Grand Island Biological Company,

Grand Island, NY), joka sisälsi 20 % ihmisen AB+-see-35 rumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glu-tamiinia, 25 mM HEPES-puskuria ja 0,5 % natriumkarbo- 11 75433 naattia ja seosta inkuboitiin yön yli 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille, 5 joiden on annettu reagoida OKT10:n ja muiden monoklonaa-listen vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Taustafluoresenssivärjäys määritettiin lisäämällä kuhunkin populaatioon suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä hiirestä, johon oli injektoitu ei-10 tuottavaa kloonia, ja inkuboimalla seosta.

Kuviossa 2 on esitetty tymosyyttien erilaistuminen kateenkorvassa.

Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-aineiden OKT6, OKT8, 0KT9 ja OKT10 reaktiivisuus ihmisen eri 15 lymfoidisolupopulaatioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine OKT10 reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä mononukleaa-risia E~-soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n 20 kanssa luuydinsoluja. Muun muassa tämän reaktiivisuus-kaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT10 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri ihmisen normaaleista tymosyyteistä 25 koostuvalle suspensiolle, jonka on annettu reagoida vasta-aineiden OKT3, OKT4, OKT5, OKT6, OKT8, OKT9 ja OKT10 (kaikkien laimennussuhde 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Samanlaiset reaktiivisuuskaavat saatiin 12 muulle tutkitulle ihmisen normaalille tymosyyttipopulaatiol-30 le. Kuviosta ilmenee, että reaktiivisuusprosentissa ja fluoresenssi-intensiteetissä on merkittäviä eroja kaikkien tutkittujen monoklonaalisten vasta-aineiden välillä. Esimerkiksi OKT9 reagoi noin 10 %:n kanssa tymo-syyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa heikko, 35 kun taas 0KT5, OKT6, 0KT8 ja OKT10 reagoivat noin 70 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intentensitee- 12 75433 tin ollessa voimakkaampi. 0KT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyttejä, sijoittuu fluoresenssi-intensiteetin suhteen 0KT9:n ja sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden väliin, joiden fluoresenssi-intensiteetti on voi-5 makkaampi. Lisäksi kuviosta 1 ilmenee, että noin 15 % tymosyyteistä voidaan todeta 0KT3:lla käyttämällä epäsuoraa immunofluoresenssimenetelmää. 0KT1, joka reagoi tymosyyttien kanssa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla kuin 0KT3, ei tällöin tule esiin. Myös kuviossa 10 1 esitetyn reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva vas ta-aine OKTIO voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Taulukosta 2 ilmenee erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemien antigeenien jakaantuminen 15 ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja tymosyytteihin, jakaantuminen on määritetty sarjalla hajotuskokeita esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Koska ainoastaan OKT3, OKT4 ja 0KT8 olivat komplementin sitovia monoklonaa-lisia vasta-aineita, näitä kolmea käytettiin määrityk-20 sessä.

Taulukosta 2A ilmenee, että koko T-solupopulaatio reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, OKT5 ja OKT8 reagoivat 60 %:N, 25 %:N ja 34 %:n kanssa T-soluja. Hajotus 0KT4:llä ja komplementilla vähensi solujen koko-25 naislukumäärää 62 %:lla ja tuhosi spesifisesti OKT4+-populaation. Lisäksi OKT5+- ja OKT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, mutta 0KT5+- ja OKT8+-T-solujen kokonaismäärä ei muuttunut. Tästä kokeesta voitiin vetää se johtopäätös, että OKT4+-populaatio erosi OKT5+-30 ja OKT8+-populaatioista. Lisää tukea tälle olettamukselle saatiin kokeesta, jossa T-soluja hajotettiin OKT8:lla ja komplementilla. Tällöin OKT4+-T-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, kokonaislukumäärä pysyi samana ja OKT8+- ja OKT5+-populaatiot tuhoutuivat. Li-35 säksi nämä kokeet osoittivat, että OKT8+-populaatio oli vastakkainen OKT4+-populaatiolle sisältäen koko OKT5+-T-solujakeen.

13 75433

Samanlaiset ihmisen tymosyyteillä suoritetut kokeet antoivat erilaisia tuloksia. Taulukosta 2B ilmenee, että noin 75 % tymosyyteistä oli 0KT4-positiivisia tai 0KT8-positiivisia. Sitä paitsi hajotettaessa soluja 5 0KT4:llä tai 0KT8:lla ainoastaan 25 % tymosyyteistä jäi jäljelle. Suurin osa jäljelle jääneistä tymosyyteistä reagoi 0KT3:n kanssa, kun taas niistä pieni osa reagoi OKT6:n kanssa. Nämä havainnot osoittavat, että suurimmalla osalla ihmisen tymosyyteistä on 0KT4-, 0KT5-, 0KT6-10 ja OKT8-pinta-antigeenit samassa solussa. Lisäksi taulukosta 2 ilmenee, että käsiteltäessä soluja OKT8:lla ja 0KT4:llä OKT3-antigeenin sisältävien kypsien tymo-syyttien määrä kasvaa huomattavasti. Täten suurin osa 0KT3:n kanssa reagoivista tymosyyteistä on jo erottu-15 nut OKT4+- ja OKT8+-jakeiksi, koska suurin osa soluista, jotka eivät reagoineet OKT4:n ja OKT8:n kanssa, olivat OKT3-positiivisia. Jos OKT3+-alapopulaatio olisi sekä 0KT4-positiivinen että 0KT8-positiviinen, hajotus jommalla kummalla monoklonaalisella vasta-aineella oli-20 si tuhonnut OKT3:n kanssa reagoivat tymosyytit.

Jotta saataisiin edelleen selville OKT3:n kanssa reagoivien tymosyyttialapopulaatioiden suhde muiden monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemiin tymo-syyttifraktioihin, tymosyyttejä käsiteltiin 0KT3:lla 25 ja komplementilla ja käsittelyssä jäljelle jääneitä soluja verrattiin sitten käsittelemättömiin tymosyyt-tipopulaatioihin. Taulukosta 2B ilmenee, että 0KT3 ja komplementti poisti 25 % tymosyyteistä. Sen sijaan OKT4-, OKT5-, 0KT6- ja OKT8-vasta-aineiden kanssa 30 reagoivat populaatiot pysyivät käytännöllisesti katsoen muuttumattomina. Näistä havainnoista voidaan vetää se johtopäätös, että suurin osa OKT6-markkerin sisältävistä tymosyyteistä kuuluu OKT3“-populaatioon.

Lisäksi tuloksista voidaan vetää se johtopäätös, että 35 tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n määrittelemät antigeenit, rajoittuvat 14 75433 samalla tavalla 0KT3“-populaatioon. On myös huomattava, että OKT9:n kanssa reagoiva tymosyyttipopulaatio ei vähentynyt käsiteltäessä fraktioimattomia tymosyyttejä 0KT3slla ja komplementilla, mikä osoittaa, että 0KT9+-5 alapopulaatio rajoittuu suurimmaksi osaksi 0KT3~-tymo-syyttipopulaatioon.

Näiden tulosten pohjalta on ollut mahdollista määrittää ihmisen tymosyyttien kehitysvaiheet kateenkorvas-sa. Kuviosta 2 ilmenee, että käytännöllisesti katsoen 10 kaikissa tymosyyteissä on OKTIO-markkeri. Lisäksi tymo-syytit saavat varhaisessa vaiheessa OKT9-antigeenin (Thyl ja Thy2). Tämä vaihe käsittää pienen osan tymo-syyteistä, ja siihen kuuluu noin 10 % ei-fraktioidusta populaatiosta.

15 Sen jälkeen ihmisen tymosyytti saavat OKT6:n mää rittelemän tymosyyttiantigeenin ja samanaikaisesti ne ilmentävät OKT4:n, OKT5;n ja OKT8:n (Thy4). Jälkimmäinen alapopulaatio edustaa valtaosaa tymosyyteistä, ja siihen kuuluu yli 70-80 % tymosyyttipopulaatiosta. Tymo-20 syyttien edelleen kypsyessä niiden OKT6-reaktiivisuus häviää, ne tulevat reaktiivisksi OKT3:n (ja 0KTl:n) kanssa ja erottuvat OKT4+- ja OKT 5 +/0KT8+-jakeiksi (1hy7 ja Thy8). Näyttää siltä, että viimeisessä vaiheessa tymosyyttien irrotessa kateenkorvasata perifeeristen T-solu-25 jen joukkoon, niiden OKTIO-markkeri häviää, sillä tämä antigeeni puuttuu käytännöllisesti katsoen kaikilta perifeerisiltä T-lymfosyyteiltä. Näiden kolmen pääkehi-tysvaiheen välisiä mahdollisia siirtymävaiheita on merkitty kuviossa 2 Thy3:lla, Thy5:llä ja Thy6:lla.

30 Koska akuutin T-solujen lymfoblastileukemian on arveltu johtuvan epäkypsistä tymosyyteistä, määritettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyjen kasvainsolujen ja mainittujen oletettujen tymosyyttien kehitysvaiheiden välinen suhde. Määritykses-35 sä käytettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyä 25 kasvainsolupopulaatiota ja kolmea T-solu-linjaa, jotka oli etukäteen tutkittu tavanomaisilla an- 15 7 54 33 ti-T-solureagensseilla ja E-rosetoinnilla. Taulukosta 3 ilmenee, että suurin osa T-ALL-leukemiasoluista reagoi joko pelkän OKTIOrn tai 0KT9:n ja OKTIOrn kanssa, mutta solut eivät reagoineet muiden monoklonaalisten vasta-5 aineiden kanssa. Täten 15/25 tutkituista tapauksista näytti sisältävän varhaisen tymosyyttivaiheen antigeenejä (vaihe 1).

Sitä vastoin 5/25 tapauksista reagoi 0KT6:n kanssa, mistä voidaan vetää se johtopäätös, että ne ovat peräisin 10 kypsemmästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 2). Tämä T-ALL-ryhmä reagoi eri tavoin OKT4:n, OKT8:n ja OKT9:n kanssa, kuten taulukosta 3 ilmenee. Kahdella viidesosalla potilaista oli sellaisia kasvainsoluja, jotka sisälsivät suurimman osan tavallisista tymosyyttiantigeeneista, mukaan 15 lukien OKT4, OKT6 ja OKT8. On huomattava, että OKT5 ei esiinny yhdessäkään näistä viidestä vaiheen 2 kasvaimesta, vaikkakin OKT8-reaktiivisuutta havaittiin. Tästä jälkimmäisestä tuloksesta voidaan selvästi vetää se johtopäätös, että OKT5 ja OKT8 määrittelevät eri antigeenejä tai 20 eri determinantteja samassa antigeenissä. Lopuksi l/25:lla potilaista oli sellaisia kasvaimia, jotka olivat peräisin kypsästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 3) OKT3-reaktii-visuuden perusteella määritettynä. Tämän henkilön kasvain oli lisäksi reaktiivinen OKT5:n, OKT8:n ja OKT10:n kanssa. 25 Tutkituista 25 leukemiapopulaatiosta ainoastaan neljä oli sellaista, joita ei voitu selvästi luokitella. Näistä kolme oli OKT4- ja OKT8-positiivisia, mutta ne eivät reagoineet OKT3:n eikä OKT6:N kanssa, jolloin ne olivat todennäköisimmin Thy4:n ja Thy7, 8:n välisiä siirtymä-30 vaiheita. Yksi 25 tapauksesta osoittautui olevan Thy3:n ja Thy4:n välinen siirtymävaihe, sillä se oli reaktiivinen 0KT8:n ja OKTlO:n kanssa.

Myös T-ALL-kasvainpopulaatioista peräisin olevissa T-solulinjoissa oli soluja, jota edustivat tiettyä 35 tymosyyttien kehitysvaihetta. Taulukosta 4 ilmenee, että HSB-2 reagoi yksinomaan 0KT9:n ja OKTIOrn kanssa, ja täten se määrittelee vaiheesta 1 peräisin olevan kasvain- 16 754 3 3 populaation. Sitä vastoin CEM-T-solulinja reagoi 0KT4:n, 0KT6:n, OKT9:n ja OKTlOtn kanssa ja se osoittautui olevan peräisin vaiheen 2 tymosyyteistä. Lopuksi solulinja MOLT-4 on ilmeisesti HSB-2:n ja CEMiin välillä oleva 5 leukemiatransformaatio, sillä se ekspressoi OKT6:n, 0KT8:n, OKT9:n ja OKT10:n.

Koska kaikilla tutkituilla T-solujen akuuttia lym-foblastileukemiaa sairastavilla potilailla on osoittau-tuntu olevan OKT10+-soluja, OKTIO-vasta-ainetta voidaan 10 käyttää T-solujen ALL-leukemian diagnoosiin. Potilailla, jotka sairastivat nollasolujen ALL-leukemiaa, oli myös OKT10+-soluja.

Myös taulukoissa 2-4 esitettyjen tietojen avulla OKTlO-vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vas-15 ta-aineista.

Diagnostisia menetelmiä, jossa käytetään muita monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hybridomeja (0KT1, 0KT3, OKT4 ja OKT5:llä 0KT6, OKT8 ja OKT9) on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 20 844703, 844705, 844704 ja 844706 sekä 844707, 850062 ja 850063.

Kyseisen vasta-aineen OKT10 havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat 25 toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-30 aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG^- IgG2a, IgG2b tai IgG3 tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa 35 siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-ai-neiden kanssa.

17 75433

Esillä olevaa vasta-ainetta OKTIO voidaan käyttää tyraosyyttien erilaistumisen toteamiseen ja tutkimiseen, kuten kuviosssa 2 on esitetty. Lisäksi esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää sellaisten tautitilojen diag-5 noosiin, jotka aiheutuvat OKT10+-solujen puutteesta tai ylimäärästä. Tällöin voidaan käyttää OKTlO-vasta-ainet-ta sellaisenaan tai OKTIO:n ja muiden vasta-aineiden yhdistelmää (esim. OKT3 - OKTIO). Reaktiivuuskaavojen avulla, jotka on saatu annettaessa useiden eri vasta-10 aineiden reagoida T-solujen ja T-solujakeiden kanssa, tietyt tautitilat pystytään toteamaan tarkemmin kuin käytettäessä tunnettuja diagnostisia menetelmiä.

Diagnostiset koostumukset, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKTIO-vasta-ainetta ja diagnosis tisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista, kuuluvat myös esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

Taulukko 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus ihmisen lymfoidipopulaatioiden kanssa.

20 Monoklonaalinen Perifeerinen Luuydin (6) Kateenkorva (22) vasta-aine veri E+ E” OKT6 0% 0% 0% 70% OKT8 30 % 0 % <2 % 80 % 25 0KT9 0 % 0 % 0 % <10 % OKTIO <5 % 10 % <20 % 95 %

Suluissa olevat luvut merkitsevät tutkittujen näytteiden määrää; %-arvot ovat keskiarvoja.

18 75433 <#>

O

W rH Ε-» m 3« « III m m m vo c X ο» Ο <n r- oo oo :n} .zi -H to :ro op

g P

5 -Pro σν tn in

5 ·Ρ* Eh :<B

P « III oo vo m (N x ,i -X C O 1—I f-H ·Η 0 Ocu d) Ή Η <uo α o m V+H 00

3 d) Eh -ςτιηο m m o o CC

" C C « ro σ\ Γ'ΐη σ> rod)

c d)-P o ro C

1 '57 § I

b <H(0 vo -Pro 2 0+) Eh ooo m ο ro <n +j o 3 03«« VO rH rl 00 ο ·η 3 ro O P ro la c> «4= .3, Φ

° AC m >i C

nm h m o o omoo -m a> b ai+j « mn- Γ' oo co -pc

S3 C« O >1 -P

'2 :ro-H -p ip ro

3 :<0rH « -P -P

Si -nro -v >, « P

® ro EH oocn in o m ο α Φ Φ ? a)C «νοσνΓ'νονο Ch 0 'Π rH 0 O :ro « «

P I—IrH rH I

b d)« γη -h ro

°* *" -no ro -P hi -P

,« HC Eh oo m in oomo w +) X m -ro 0 « σ»σνσι ro oo oo >, · 3 3 -¾ O E O >,roc P i -M rH P λ; 3 m -ro row

rH rH « 3 c -H -U

Sp^crtm ro o ro ίβ -Μ ·Η Ό M I > eh -p qj -h -p to hj ro V ti £ 5 prop 3Γ1 .5 3 vo vo vo vo vo vo vo (0« :2 ;TO,8 OOO Ο Ο Ο Ο -H rH 3 g J® rH rH rH rHrHr-HrH Φ >1 Ό 6 2 ^ 8-p oh <u

« r, '2 XXX X X X X (OO

C >ι Φ p +j ςι, +j <2 P '“J b OCMCN oomo -P d) ^ . ^ 3,-2 p” - - rH - ro 0:tO« •H ro Φ[?5 mm cr\ -p +) ,*

Ϊ 'n 7^3 rH CSI PWO

C - ^ « ro -H rH

h ro ;ίβ o 3 ro >i 3 ro m K) « ή ,-h eh

' 5 P 3 rH

ro -π 3 o, m · p 3 rH o p ro “'b ox x CU -P « |p 0 to :ro :(0 « « > « o I >1 >1 :ro :ro -H -p

_ J -P EH rH rH -P y, W P

CcH+j <U qj 6-XP

3 _ (0 PP P :0 ro 3 c P:<0ro dip p prnrod)

WtflrH U) -P *. P-P P rH Ο, E

•ή « 3 ·ρ w - - ·ρ m - .-ro -ρ ro d) pp a p:rouup;roouu eppp ro«0 ω « >,« φ e a ro-ρ a, d) + + > + + + rH φ ro ε gp-p pc «e o E « o 0d) Ό -p ro -f co o ro »r oo ro P φ m .*

PO -p PEEhEhEEHEhEH P rH -P

•X P O φη«« >,-+««« -P & -X II

o -H l+| O4HOOEHHOOO «E-P

e p g :ro o ro - o ro £, . . « x * u S o* ,4 < m x *- 19 75433 P -h to

Φ P φ I

T3 m to

3 I O -H rH

3 X a (Ö >1

10 X · r-l P

•H E 0) X C

(0 I 3 X O <0 -H

C hil M P <1) •H 3 —» 3 to to £ G x m P -H 3 (0

O (D CM -Η >i (0 -H

ίΟ-r-iC X Ο P P « P 3 0) II O' OO rHr-IOJrH Hi Η > -H tfl

C P P I (N tfl <#> G

•H P tO 3 -H Ai (D

Λ Ή 3-1 φ >, O tO

λ; 3 ςο <υ — P cu m c M >h

(0 3 (0 POO

-H E-I P -H -H 3

£ O -H H i—I

a) -r-i p o p

Ai O c _ J

3 l rH + - -H -H :aS rO

φ -H Eh + O O W P to

iH 3 « ++ + + + + + PtO tOtOtO

-HIO C -H C -H -H

p (0 -H Η Φ MH O

to P (0 (1) tO -H -H

(Ö to O-i > P <u to to

rH (0 Eh (0 Ai SH Φ G

x > « i+ +iii i tora o λ φ o o Ai sh 3 to o^ PC (0 iH to ro £ φ φ Ai mh to 3 >1 P 00 P O to O X tn Eh 3C G -r-i 3

Ai -H «Il ++I++ 3(1) «UM

Ai G X O E Ό G - O

3 φ (tj -H -H to

•H ·(—i 3 :(0 -H P I C

3 3 C to -n C -H — -H

(0 X O Eh Ή 10 3 H O Ή « Il + + + + I O) (O <l)C>

10 Ai O G tfl Gj Φ tO

10 to to C (0

En C tO O -H Ai O tn :0 -n to > •H £ En >i O -H :t0

P « Il I I I I + E -r-l -H P

p to nj o »o P to 3 3 to -H -H * (0 Φ 3 3 to 3 P — O' tn a: ra c -ί rH to + φ Ai (0 -H fO Eh 3 Φ --- G >i -- > Ai « Il ++II I 3 P :<0 -HO Ai · G -H -n

C -H G · (N φ X SH

ΦΡΦ GtoGOttd ro Ai Ό oo -H « G -H >

3 nj -H Eh -H O > to G

X φ φ « Il till + tO· 0-H3P

O K G O A;ro-H-H3t0 to Φ 3 I > P to 3 (0 +P (0 X 3 X -H (0

•H — to Or a; to > P

£ H (0 (0 G O -H

φ >1 (0 -H P -H (0 Oi -H G

Ai X -H P I -H (0 P (0 3 Eh rO p X (0 P -H Ai (0

Φ ^ X >1 X -H P X (0 E

X Μ>ι <C φ -H O Φ (0

φ -H (0 10 -H I X -H >H P

P P> O PEH-H>tOP

to P £ P (03(00 (0 >i G >i >i G > :(0 3 -ro In to >ι-Η P >, -H >i P tO Φ

•H 10 P to -H (0 P G -H

£ O >i G O > rH P -H > (0 >,

3 £ >ι~ Φ £ (0 rH Φ Ai -H i—I P

p >1 in on e — ^ >, ρφρμ-ηγηρ tn rH P O >1 <N -H TJ- VD 00 P p p -H φ P Φ >1

H -H £ X X — I | -H -H 10 £ Ai X P

(0 Φ tO >iEh φ X oo oo h· φ :<0 ao Ai Ai Φ I (OOtO

rH PO >1 φ 3 >1 -h -h -h > x x x x -h ax 3 3 -h x « Cu λ H (0·· (0(0EhEhEhEh(0 >i Eh Eh rH P Eh + W > < ff) X + + 75433 20

Taulukko 4

Solulinjojen reaktiivisuus monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa

Solulinja OKT3 OKT4 OKT5 OKT6 OKT8 OKT9 OKTIO

5 HSB-2 -X - - - - + + CEM - + - + + + + MOLT-4 --- + + + + xKriteerit (-)- ja (+)-reaktiivisuudelle olivat samat kuin taulukossa 3.

Claims (2)

21 75433

1. Diagnostinen menetelmä OKT10+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisissä, tunnettu 5 siitä, että annetaan potilaasta otetun T-solu- tai tymo-syyttinäytteen reagoida diagnostisesta vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8022, ja joka vasta-aine reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen nor-10 maaleja tymosyyttejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä mononuk-leaarisia E -soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n kanssa luuydinsoluja, ja määritetään mainitun vasta-aineen kanssa reagoivien perifeeristen T-solujen ja tymosyyttien 15 prosentuaalinen osuus näiden kokonaismäärästä.

2. Diagnostinen ainekoostumus OKT10+-solujen ylimäärän tai puutteen toteamiseksi, tunnettu siitä, että se koostuu diagnostisesti hyväksyttävästä kantajasta ja OKT10+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseen tar- 20 vittavasta määrästä hiiren monoklonaalista vasta-aineta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8022, ja joka vasta-aine reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä 25 mononukleaarisia E -soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n kanssa luuydinsoluja.