FI75433C - Diagnostic method utilizing a specific monoclonal antigen call to human protymocyte antigen and in the method useful composition. - Google Patents

Diagnostic method utilizing a specific monoclonal antigen call to human protymocyte antigen and in the method useful composition. Download PDF

Info

Publication number
FI75433C
FI75433C FI850061A FI850061A FI75433C FI 75433 C FI75433 C FI 75433C FI 850061 A FI850061 A FI 850061A FI 850061 A FI850061 A FI 850061A FI 75433 C FI75433 C FI 75433C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
antibody
thymocytes
cell
human
Prior art date
Application number
FI850061A
Other languages
Finnish (fi)
Swedish (sv)
Other versions
FI75433B (en
FI850061L (en
FI850061A0 (en
Inventor
Patrick Chung-Shu Kung
Gideon Goldstein
Original Assignee
Ortho Pharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/100,072 external-priority patent/US4364935A/en
Application filed by Ortho Pharma Corp filed Critical Ortho Pharma Corp
Publication of FI850061L publication Critical patent/FI850061L/en
Publication of FI850061A0 publication Critical patent/FI850061A0/en
Publication of FI75433B publication Critical patent/FI75433B/en
Application granted granted Critical
Publication of FI75433C publication Critical patent/FI75433C/en

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

1 754331 75433

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään ihmisen esitymo-syyttiantigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta ja menetelmässä käyttökelpoinen ainekoostumus 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 803757Diagnostic method using a monoclonal antibody specific for a human presentation cytogen antigen and a composition of matter useful in the method 5 Divided by application 803757

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään OKT10+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä sekä menetelmässä käyttökelpoiseen ainekoostumukseen. 10 Menetelmässä käytetään hyväksi ihmisen esitymosyyttianti-geenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla.The invention relates to a diagnostic method for detecting a deficiency or excess of OKT10 + cells in humans and to a composition of matter useful in the method. The method utilizes a monoclonal antibody specific for the human presentation thymocyte antigen. The antibody is made using a new hybrid cell line.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin 15 /Nature 256 (1975) 495-4977/ jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solu-linja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin 20 ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi:In 1975, Kohler and Milstein combined mouse myeloma cells into the spleen cells of immunized mice (Nature 256 (1975) 495-4977), when it was first discovered that it was possible to prepare a continuous cell line to produce a homogeneous (so-called "monoclonal") antibody. Since then, many attempts have been made to prepare various hybrid cells (so-called hybridomas) and to try to apply the antibody produced by these hybridomas to scientific use. See for example:

Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 -"Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M.Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphosyte Hybridomas", edited by F. Melchers, M.

Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun 25 sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et ai., Cell 14 (toukokuu 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering 30 News, tammikuu 1 (1979) 15-17.Potter and N. Warner, Springer-Verlag 1978 and references in Publication 25; C.J. Barnstable et al., Cell 14 (May 1978) 9-20; P. Parham and W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3rd Edition, Vol. 2, edited by D.M. Wier, Blackwell 1978, paragraph 25; and Chemical and Engineering 30 News, January 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hyb-ridomeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia 35 esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua 2 75433 hybridomaa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja 5 halutun hybridoman eristämisessä käytetystä selektiotek-niikasta.These references show the results obtained and the difficulties encountered in trying to prepare a monoclonal antibody from hybridomas. Although the manufacturing method is in principle well known, there are many difficulties and each case is different. It cannot be guaranteed in advance that an attempt will be made to produce the desired 2,75433 hybridoma and that, if successful, the hybridoma will produce an antibody or that the antibody thus formed will have the desired specificity. Success depends mainly on the type of antigen used and the selection technique used to isolate the desired hybridoma.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current 10 Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81/ 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikut-15 ti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeenei-hin. Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.Attempts to produce a monoclonal antibody specific for human lymphocyte surface antigens have been made in only a few cases. See, e.g., Current 10 Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 / 66-69 and 164-169. The antigens used in these experiments were cultured human lymphoblastoid leukemia cell lines and chronic lymphocyte leukemia cell lines. Many hybridomas thus prepared produced an antibody that acted upon various surface antigens of all human cells. None of these hybridomas produced an antibody specific for a particular human lymphocyte species.

Äskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvattu sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jot-20 ka tuottavat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta. Katso esim. Reinherz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 4061-4065 (1979); ja Kung, P.C. et ai., Science, 206, 347-349 (1979).Recently, publications have been described describing the preparation and testing of hybridomas that produce an antibody specific for certain T cell antigens. See, e.g., Reinherz, E.L., et al., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 4061-4065 (1979); and Kung, P.C. et al., Science, 206, 347-349 (1979).

25 Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toi mintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopieettisista kantasoluista. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "ty-30 mosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imuku-dokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesta spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suo-35 raan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä 3 75433 hylkiminen). Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyt-tiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat 5 toisissa immunologisissa järjestelmissä säätelevästä. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.25 Two main groups of lymphocytes are involved in the immunological functions of the human and animal body. The second of these (a cell derived from the thymus, or T cell) is differentiated in the thymus from hematopoietic stem cells. The differentiating cells in the thymus are termed "ty-30 mosocytes." Mature T cells detach from the thymus and then enter the bloodstream, tissues, and lymphoid tissue. These T cells make up a large part of the small lymphocytes circulating in the body. They are immunologically specific and, as effector cells, are directly involved in cell-mediated immunological responses (e.g., 3,754,333 transplant rejection). Although T cells do not secrete antibodies into body fluids, another group of lymphocytes to be treated later will in some cases require T cells to be able to secrete antibodies themselves. Some T cell species function in 5 other immunological systems from the regulatory. The mechanism of this form of cell interaction is not yet fully understood.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät 10 vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kan-tasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elin-15 tä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.The second group of lymphocytes (cells derived from the bone marrow, or B cells) includes those that secrete 10 antibodies. They also develop from hematopoietic stem cells, but their differentiation is not regulated by the thymus. In birds, they differentiate in an organ analogous to the thymus, called the "Bursa of Fabricius." However, no similar organ-15 has been found in mammals, and thus B cells are thought to differentiate in the bone marrow.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä 20 alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232 ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct 25 Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja 0. Stutman, Plenum Press 1977, vol.T cells are divided into at least three subspecies, termed "helper", "attenuator", and "killer" T cells, which either accelerate or slow the reaction or kill (dissolve) foreign cells. These 20 subclasses are well known in the body of mice, but only recently have their functions been described in the human body. See, e.g., R.L. Evans et al., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232 and L. Chess and S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct 25 Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens", in "Contemporary Topics in Immunobiology", edited by 0. Stutman, Plenum Press 1977, vol.

7, 363-379.7, 363–379.

Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai 30 niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregu-latoristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.The identification or attenuation of different T cell species or subtypes is important in the diagnosis and treatment of various immunoregulatory disorders.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskas-vainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudinprognoosia 35 arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryh-mää pystytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: 4 75433 A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300? D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymhomas", toimittajat S. Thierfelder et al., Springer, Heidelberg 5 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal ofFor example, the prognosis of certain forms of leukemia and lymphoid tissue differs depending on whether they originate from B or T cells. Thus, in assessing disease prognosis 35, it is important to be able to distinguish between these two groups of lymphocytes. See, e.g., 4,75433 A.C. Aisenberg and J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300? D. Belpomme et al., In "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymhomas", edited by S. Thierfelder et al., Springer, Heidelberg 5 1977, 33-45; and D. Belpomme et al., British Journal of

Haematology 38 (1978) 85.Hematology 38 (1978) 85.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa tautitiloissa ja tietyissä leu-kemiamuodoissa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epä-10 tasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobulinemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä tai "auttaja"-T-solujen puute. Pahanlaa-15 tuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin. Joissakin leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan 20 tai määrittämään, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin. Katso esimerkiksi: J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20. Springer-Verlag 1977, 17-23 ja julkaisun sisältämät 25 viitteet sekä E.L. Reinberg et al., J. Clin. Invest. 64 (1979) 392-397.In certain disease states (e.g., juvenile rheumatoid arthritis, malignant disease states, and certain forms of Leu chemistry), T cell subsets have become unbalanced. It has been suggested that in autoimmune diseases, there is generally an excess of "helper" T cells and a deficiency of certain "attenuator" T cells, whereas agammaglobulinemia is associated with an excess of certain "attenuator" T cells or a lack of "helper" T cells. . In malignant-15 disease states, "attenuator" T cells are usually present in excess. In some forms of leukemia, stagnant T cells are formed in excess. The success of the diagnosis may thus depend on whether it is possible to detect this imbalance or excess or to determine which stage of development occurs in excess. See, e.g., J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses," in Hematology and Blood Transfusion, vol. 20. Springer-Verlag 1977, 17-23 and references 25 and E.L. Reinberg et al., J. Clin. Invest. 64 (1979) 392-397.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immuno-globuliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä. Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu, koska hei-30 kentäjä-T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan 35 näiden B-solujen toimintaa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobulii- 5 75433 nin tuotantoa tai keskeyttää tuotannon kokonaan. Agamma-globulinemiatyyppi voidaan siten määrittää sen perusteella, esiintyykö heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.Agammaglobulinemia, a disease state in which no immunoglobulin is formed, belongs to at least two different types. In type I, immunoglobulin is not formed because of the excess of hei-30 field T cells, whereas in type II this is due to the lack of helper T cells. In both types, the patient's B cells, or lymphocytes, which are responsible for the actual secretion of the antibody, are completely normal and deficient, whereas these B cells are either impaired or "not helped", significantly reducing immunoglobulin activity. production or suspend production altogether. The type of agamma globulinemia can thus be determined by the presence of an excess of attenuator T cells or a deficiency of helper T cells.

5 On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa autoimmuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-laineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin esiintyvälle T-solulajille, vasta-aineet voivat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi 10 auttaja-T-solusyöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvai-mia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemia-muotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle auttaja-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista tautia, joka aiheutuu auttaja-solujen ylimäärästä, voi-15 daan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja (esim. pahanlaatuisia tautitiloja tai tyyppiä I olevaa agamma-globulinemiaa), jotka aiheutuvat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle vasta-ainetta, joka on spesifinen heikentäjä-T-soluantigeenille. 20 Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyvttiglobuliini eli ATG), on osoittautunut terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityk-25 sellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimis-prosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: 30 Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.There are indications that when antibodies specific for the overexpressing T cell species are administered to patients with autoimmune disease or malignancies, the antibodies may have a beneficial effect on the development of the disease. For example, 10 helper T cell cancers (certain skin T cell lymphoma tumors and certain forms of acute T cell lymphoblastic leukemia) can be treated by administering to the patient an antibody specific for the helper T cell antigen. Autoimmune disease caused by an excess of helper cells can also be treated in the same manner. Diseases (e.g., malignancies or type I agamma globulinemia) caused by an excess of attenuating T cells can be treated by administering to the patient an antibody specific for the attenuating T cell antigen. 20 Antisera that affect all human T cells (so-called anti-human thymocytoglobulin, or ATG) have been shown to be therapeutically useful in the treatment of transplant patients. Because T cells affect cell-mediated immunological responses (transplant rejection mechanism), obtaining an antibody specific for T cells prevents or slows this rejection process. See, e.g., Cosimi et al., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: 30 Importance of T Cell Monitoring," Surgery 40 (1976) 155-163, and references therein.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektii-35 visiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen t-soluilla, poistamalla eläimistä veri 6 75433 seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-haluttu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa eri-5 koisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-aine-molekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi im-10 munointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen useita antigeenejä vastaan, joita on löydetty kaikissa injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesi-15 fisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifi-sen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/106.To date, spontaneous autoantibodies or antisera selective for human T cells, prepared by immunizing animals with human t cells, removing blood from animals to obtain 6,75433 serum, and adsorbing antiserum, have been used to identify and attenuate human T cell species and subspecies. with autologous non-allogeneic B cells to remove antibodies with undesired reactivity. The preparation of these antisera is very difficult, especially in the adsorption and purification steps. Adsorbed and purified antisera also contain many impurities in addition to the desired antibody for a number of reasons. One reason is that the serum contains millions of antibody molecules even before immunization with T cells. Second, immunization with im-10 causes the formation of antibodies against several antigens found in all injected human T cells. It is not possible to selectively produce an antibody specific for a particular antigen. Third, the titer of the specific antibody prepared by these methods is usually quite low (e.g., at dilutions greater than 1: 100, the antibody is inactive) and the ratio of specific to non-specific antibody is less than 1/106. .

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä 20 mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News" -lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.See, for example, the above-mentioned 20 articles by Chess and Schlossman (from page 365 onwards) and the above-mentioned article in the "Chemical and Engineering News", which describe the shortcomings of the antisera used so far and the advantages of the monoclonal antibody.

25 Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT 10), joka pys tyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta antigeenille, jota on löydetty noin 95 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 5 %:lta ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:lta perifeerisiä mononukleaari-30 siä E“-soluja (B-solut ja nollasolut) sekä 10-20 %:lta luuydinsoluja. Näin muodostunut vasta-aine on mono-spesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien T-solu-jen pinta-antigeenideterminantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastai-35 siä immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epä- 75433 puhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen tymosyytin antigeenille). Li-5 säksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmene-10 telmissä ovat olleet välttämättömiä.A new hybridoma (OKT 10) has now been discovered which is capable of producing a novel monoclonal antibody to an antigen found in approximately 95% of normal human thymocytes, 5% of normal human peripheral T cells, 10% of peripheral mononuclear E ”cells (B cells and null cells) and 10-20% bone marrow cells. The antibody thus formed is monospecific for a single surface antigenic determinant of normal human T cells and contains virtually no other anti-human immunoglobulins, in contrast to hitherto known antisera (which naturally contain 75433 in purity, antibodies that react well with many human antigens) and hitherto known monoclonal antibodies (which are not monospecific for a single human thymocyte antigen). In addition, this hybridoma can be cultured to produce an antibody, so that the use of animals to produce the antibody is not necessary, nor are the complex adsorption and purification steps required in previous methods for preparing crude antisera.

Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuottamasta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKTIO", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on talletettu 15 21.10.1979 laitokseen "the American Type Culture Collec tion", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8022.Both the present hybridoma and the antibody produced by it are referred to herein as "OKTIO", and the context indicates which is meant in each case. The present hybridoma was deposited on October 21, 1979 at the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, and has been assigned ATCC Deposit No. CRL 8022.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 803757.The preparation of the hybridoma and the antibody produced by it is described in FI patent application 803757.

20 Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että annetaan potilaasta otetun T-solu- tai tymosyyttinäytteen reagoida diagnostisesta vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista 25 vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8022, ja joka vasta-aine reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyt-tejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä mononukleaarisia 30 E“-soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n kanssa luuydinsoluja,. ja määritetään mainitun vasta-aineen kanssa reagoivien perifeeristen T-solujen ja tymosyyttien prosentuaalinen osuus näiden kokonaismäärästä.The diagnostic method of the invention using said hybridoma and antibody is characterized by reacting a T cell or thymocyte sample from a patient with a diagnostically effective amount of a murine monoclonal antibody produced by a hybrid cell line having an ATCC accession number of CRL 8022, and which antibody reacts with approximately 95% of normal human thymocytes, 5% of normal human peripheral T cells, 10% of peripheral mononuclear mononuclear cells (B cells and zero cells) and with 10-20% bone marrow cells ,. and determining the percentage of peripheral T cells and thymocytes that react with said antibody in the total number thereof.

Esimerkki 1 35 OKTIO-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 8 75433 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque -tiheysgradienttisentri-fugointimenetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH), Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J.Clin. Lab.Example 1 Characterization of OKTIO Antibody Reactivity A. Isolation of Lymphocyte Populations Peripheral mononuclear blood cells were isolated from the blood of normal volunteer blood donors (age 8,75433, 15-40 years) by the Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation method of Ficoll-Boypa, Chemicals, Pharmacia way, Scand. J. Clin. Lab.

5 Invest. 21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yk situmaiset solut erotettiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig-(T- ja nollasolu)-populaatiiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2~pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immu-10 nol. 113 (1974) . T-solut otettiin talteen E-rosetoimal-la Ig“-populatio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque -sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clrlla 15 (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2-%:isesti EAC-rosenttipositiivinen ja >95-%:isesti E-rosenttipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig“ (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkim-20 mäinen populaatio oli <5-%risesti E-positiivinen ja <2-%:isesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%:isesti pinta-Ig-25 positiivinen ja <5-%:isesti E-positiivinen.5 Invest. 21 (suppl. 97) (1968) 77. Unfractionated monocytes were separated into a surface Ig + (B) and surface Ig (T and zero cell) population using Sephadex G-200 anti-F (ab ') 2 ~ column chromatography by the method previously described by Chess et al., J. Immu-10 nol. 113 (1974). T cells were harvested by E-rosetting the Ig ”population with 5% sheep erythrocytes (Microbiological Associates, Bethesda, MD). The rosetted mixture was centrifuged in a Ficoll-Hypaque centrifuge and the recovered E + pellet was treated with 0.155 M NH 4 Cl 15 (10 mL per 10® cell). The T cell population thus obtained was <2% EAC-positive and> 95% E-positive as determined by standard methods. In addition, the non-rosette Ig ”(null cell) population was separated from the Ficoll interface. This latter population was <5% E-positive and <2% Slg-positive. The surface Ig + (B) population was separated from the Sephadex-G-200 column by elution with normal human gamma globulin as previously described. This population was> 95% surface Ig-25 positive and <5% E-positive.

Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin terveiden vapaaehtoisten luovuttajien taaemmasta suoliluun-harjusta punktiomenetelmällä.Normal human bone marrow cells were obtained from the posterior iliac crest of healthy volunteer donors by the puncture method.

B. Tymosyyttien eristäminen 30 Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin poti lailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan 35 sikiöseerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solula-jia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan 75433 läpi. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja >90-%:isesti E-rosenttipositiivisia.B. Isolation of Thymocytes 30 A normal human thyroid gland was obtained from a patient who had undergone corrective heart surgery and ranged in age from two months to 14 years. The thyroid gland was dissected, and the pieces were immediately placed in 199 (Gibco) medium containing 5% fetal calf serum, finely chopped with forceps and scissors, and then a suspension containing one cell was formed by squeezing the mixture through a steel sieve 75433. Next, the cells were centrifuged in a Ficoll-Hypaque centrifuge and washed as described in A. The thymocytes thus obtained were> 95% viable and> 90% E-rosent positive.

5 C. T-solulinjat ja T-solujen akuutin lymfoblas- tileukemian solut T-solulinjat CEM, HSB-2 ja MOLT-4 toimitti tohtori H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukemiasolut saatiin 25:Itä T-solujen akuuttia 10 lymfoblastileukemiaa sairastavalta potilaalta. Nämä5 C. T cell lines and T cell acute lymphoblastic leukemia cells T cell lines CEM, HSB-2 and MOLT-4 were supplied by Dr. H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukemia cells were obtained from 25 of 10 patients with acute T cell lymphoblastic leukemia. These

yksittäiset kasvaimet oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu olevan T-solukasvaimia, koska kasvainso-lut muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa ( > 20 % E+) ja koska ne reagoivat T-15 soluille spesifisten heteroantiseerumien, anti-HTLindividual tumors had been found to be T-cell tumors in previous experiments because tumor cells spontaneously formed rosettes with sheep erythrocytes (> 20% E +) and because they responded to T-15 cell-specific heteroant sera, anti-HTL

(B.K)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten edellä on kuvattu. Kasvainpopulaatioita kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa dimetyyli-sulfoksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumissa, kun-20 nes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat >90-%:isesti blasteja syto-sentrifugivalmisteiden Wright-Giemsa -morfologialtaan.(B.K) and A99 antisera as described above. Tumor populations were cryopreserved at -196 ° C in the liquid nitrogen vapor phase in 10% dimethyl sulfoxide and 20% human AB serum until they were characterized on their surface. All tumor populations analyzed were> 90% blasts in the Wright-Giemsa morphology of the cytocentrifuge preparations.

Esimerkki 2Example 2

Solufluorografinen analyysi ja solujen erotus 25 Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solupopulaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografi-nen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresens-simenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M 30 FITC) Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solu-fluorografia FC200/4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen 35 annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/m FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reak- 10 75433 tiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluorenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivi-5 suusmalli oli samanlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:lla suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanes-tettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuotta-10 valla hybridikloonilla immunisoidusta CAF-^-hiirestä.Cell Fluorographic Analysis and Cell Separation Cell fluorographic analysis of monoclonal antibodies and reaction products of all cell populations was performed by an indirect immunofluorescence method in which cells were stained with fluorescein-coupled goat anti-mouse IgG (G / M 30 FITC). -fluorography FC200 / 4800A (Ortho Instruments). In this case, 1 x 10 6 cells were treated with 0.15 ml of antibody at a 1: 500 dilution of OKT5, the cells were incubated at 4 ° C for 30 minutes and washed twice. Cells 35 were then reacted with 0.15 ml of G / m FITC (1:40 dilution) at 4 ° C for 30 minutes, the reaction product was centrifuged and washed three times. These cells were then analyzed with a cell fluorograph, in which the fluorescence intensity induced by each cell was recorded on a pulse height analyzer. The Reagent-5 oral model was similar at a dilution of 1: 10,000, but at higher dilutions the reaction did not occur. The intensity of background staining was determined with 0.15 ml of a 1: 500 dilution of aqueous humor obtained intraperitoneally from a CAF-^ mouse immunized with a non-productive hybrid clone.

Kokeissa, joissa tutkittiin vasta-aine- ja komple-menttivälitteistä lymfolyysiä, tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja viljeltiin yön yli, minkä jälkeen seurasi selektiivinen hajotus, ja sen jälkeen solut analysoitiin 15 solufluorografilla.In experiments investigating antibody- and complement-mediated lympholysis, thymocytes and peripheral T cells were cultured overnight, followed by selective lysis, and then the cells were analyzed with a 15-cell fluorograph.

Esimerkki 3Example 3

Lymfoidipopulaatioiden hajotus monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla.Degradation of lymphoid populations by monoclonal antibody and complement.

40 x 10® perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä 20 lisättiin 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). Solupelletteihin lisättiin 0,8 ml vasta-ainetta OKT3, OKT4 tai OKT8 tai tavallista vesivatsanestettä (vertailuaine) , jotka oli laimennettu suhteessa 1:200 PBS:llä, seokset suspendoitiin ja inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuu-25 tin ajan. Sen jälkeen vasta-aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, seos suspendoitiin ja sitä inkuboitiin edelleen 37°C:ssa 60 minuutin ajan vesihauteessa, joka oli liitetty ravistelijaan. Inkuboinnin päätyttyä solut 30 sentrifugoitiin ja elinkykyiset solut määritettiin40 x 10® peripheral T cells or thymocytes were added to a 15 ml plastic tube (Falcon, Oxnard, CA). To the cell pellets, 0.8 ml of OKT3, OKT4 or OKT8 antibody or ordinary aqueous humor (reference substance) diluted 1: 200 in PBS was added, the mixtures were suspended and incubated at 20 ° C for 60 minutes. Thereafter, 0.2 ml of fresh rabbit complement was added to the antibody-treated populations, the mixture was suspended and further incubated at 37 ° C for 60 minutes in a water bath connected to a shaker. At the end of the incubation, the cells were centrifuged and viable cells were determined

Trypan-sinisellä. Solut laskettiin, pestiin kaksi kertaa 5-%:lla FCS:llä ja asetettiin lopulliseen väliaineeseen RPMI 1640 (Grand Island Biological Company,Trypan-blue. Cells were counted, washed twice with 5% FCS and placed in final medium RPMI 1640 (Grand Island Biological Company,

Grand Island, NY), joka sisälsi 20 % ihmisen AB+-see-35 rumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glu-tamiinia, 25 mM HEPES-puskuria ja 0,5 % natriumkarbo- 11 75433 naattia ja seosta inkuboitiin yön yli 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % C02.Grand Island, NY) containing 20% human AB + -se-35 ug, 1% penicillin-streptomycin, 200 mM L-Glutamine, 25 mM HEPES buffer and 0.5% sodium carbonate 11,75433 and the mixture was incubated overnight at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille, 5 joiden on annettu reagoida OKT10:n ja muiden monoklonaa-listen vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Taustafluoresenssivärjäys määritettiin lisäämällä kuhunkin populaatioon suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä hiirestä, johon oli injektoitu ei-10 tuottavaa kloonia, ja inkuboimalla seosta.Figure 1 shows the fluorescence spectrum obtained from a cell fluorograph for normal human thymocytes reacted with OKT10 and other monoclonal antibodies (1: 500 dilution) and G / M FITC. Background fluorescence staining was determined by adding to each population a 1: 500 dilution of aqueous humor from a mouse injected with a non-producing clone and incubating the mixture.

Kuviossa 2 on esitetty tymosyyttien erilaistuminen kateenkorvassa.Figure 2 shows the differentiation of thymocytes in the thymus.

Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-aineiden OKT6, OKT8, 0KT9 ja OKT10 reaktiivisuus ihmisen eri 15 lymfoidisolupopulaatioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine OKT10 reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä mononukleaa-risia E~-soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n 20 kanssa luuydinsoluja. Muun muassa tämän reaktiivisuus-kaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT10 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.Table 1 shows the reactivity of the monoclonal antibodies OKT6, OKT8, 0KT9 and OKT10 with different human lymphoid cell populations. The monoclonal antibody OKT10 reacts with approximately 95% of normal human thymocytes, with 5% of normal human peripheral T cells, with 10% of peripheral mononuclear E ~ cells (B cells and null cells), and -20% with bone marrow cells. Among other things, this reactivity formula allows the present antibody OKT10 to be detected and distinguished from other antibodies.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri ihmisen normaaleista tymosyyteistä 25 koostuvalle suspensiolle, jonka on annettu reagoida vasta-aineiden OKT3, OKT4, OKT5, OKT6, OKT8, OKT9 ja OKT10 (kaikkien laimennussuhde 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Samanlaiset reaktiivisuuskaavat saatiin 12 muulle tutkitulle ihmisen normaalille tymosyyttipopulaatiol-30 le. Kuviosta ilmenee, että reaktiivisuusprosentissa ja fluoresenssi-intensiteetissä on merkittäviä eroja kaikkien tutkittujen monoklonaalisten vasta-aineiden välillä. Esimerkiksi OKT9 reagoi noin 10 %:n kanssa tymo-syyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa heikko, 35 kun taas 0KT5, OKT6, 0KT8 ja OKT10 reagoivat noin 70 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intentensitee- 12 75433 tin ollessa voimakkaampi. 0KT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyttejä, sijoittuu fluoresenssi-intensiteetin suhteen 0KT9:n ja sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden väliin, joiden fluoresenssi-intensiteetti on voi-5 makkaampi. Lisäksi kuviosta 1 ilmenee, että noin 15 % tymosyyteistä voidaan todeta 0KT3:lla käyttämällä epäsuoraa immunofluoresenssimenetelmää. 0KT1, joka reagoi tymosyyttien kanssa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla kuin 0KT3, ei tällöin tule esiin. Myös kuviossa 10 1 esitetyn reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva vas ta-aine OKTIO voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.Figure 1 shows the fluorescence spectrum obtained from a cell fluorograph for a suspension of normal human thymocytes reacted with antibodies OKT3, OKT4, OKT5, OKT6, OKT8, OKT9 and OKT10 (all at a dilution ratio of 1: 500) and G / M FITC. Similar reactivity formulas were obtained for the 12 other normal human thymocyte populations studied. The figure shows that there are significant differences in reactivity percentage and fluorescence intensity between all monoclonal antibodies studied. For example, OKT9 reacts with about 10% of thymocytes at a low fluorescence intensity, while 0KT5, OKT6, 0KT8, and OKT10 react with about 70% of thymocytes at a higher fluorescence intensity. 0KT4, which reacts with 75% of thymocytes, is located between 0KT9 and monoclonal antibodies with higher fluorescence intensity in terms of fluorescence intensity. In addition, Figure 1 shows that about 15% of thymocytes can be detected with 0KT3 using an indirect immunofluorescence method. 0KT1, which reacts with thymocytes in virtually the same way as 0KT3, does not appear. Also by the reactivity formula shown in Fig. 10 1, the present antibody OKTIO can be detected and distinguished from other antibodies.

Taulukosta 2 ilmenee erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemien antigeenien jakaantuminen 15 ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja tymosyytteihin, jakaantuminen on määritetty sarjalla hajotuskokeita esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Koska ainoastaan OKT3, OKT4 ja 0KT8 olivat komplementin sitovia monoklonaa-lisia vasta-aineita, näitä kolmea käytettiin määrityk-20 sessä.Table 2 shows the distribution of antigens determined by different monoclonal antibodies in 15 human peripheral T cells and thymocytes, the distribution being determined by a series of lysis experiments as described in Example 3. Because only OKT3, OKT4, and 0KT8 were complement-binding monoclonal antibodies, these three were used in the assay.

Taulukosta 2A ilmenee, että koko T-solupopulaatio reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, OKT5 ja OKT8 reagoivat 60 %:N, 25 %:N ja 34 %:n kanssa T-soluja. Hajotus 0KT4:llä ja komplementilla vähensi solujen koko-25 naislukumäärää 62 %:lla ja tuhosi spesifisesti OKT4+-populaation. Lisäksi OKT5+- ja OKT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, mutta 0KT5+- ja OKT8+-T-solujen kokonaismäärä ei muuttunut. Tästä kokeesta voitiin vetää se johtopäätös, että OKT4+-populaatio erosi OKT5+-30 ja OKT8+-populaatioista. Lisää tukea tälle olettamukselle saatiin kokeesta, jossa T-soluja hajotettiin OKT8:lla ja komplementilla. Tällöin OKT4+-T-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, kokonaislukumäärä pysyi samana ja OKT8+- ja OKT5+-populaatiot tuhoutuivat. Li-35 säksi nämä kokeet osoittivat, että OKT8+-populaatio oli vastakkainen OKT4+-populaatiolle sisältäen koko OKT5+-T-solujakeen.Table 2A shows that the entire T cell population reacted with OKT3, whereas OKT4, OKT5, and OKT8 reacted with 60%, 25%, and 34% of T cells. Lysis with 0KT4 and complement reduced the total number of cells by 62% and specifically destroyed the OKT4 + population. In addition, the percentage of OKT5 + and OKT8 + cells increased, but the total number of 0KT5 + and OKT8 + T cells did not change. From this experiment, it could be concluded that the OKT4 + population differed from the OKT5 + -30 and OKT8 + populations. Further support for this hypothesis was obtained from an experiment in which T cells were lysed with OKT8 and complement. At this time, the percentage of OKT4 + T cells increased, the total number remained the same, and the OKT8 + and OKT5 + populations were destroyed. Therefore, these experiments showed that the OKT8 + population was in contrast to the OKT4 + population containing the entire OKT5 + T cell fraction.

13 7543313 75433

Samanlaiset ihmisen tymosyyteillä suoritetut kokeet antoivat erilaisia tuloksia. Taulukosta 2B ilmenee, että noin 75 % tymosyyteistä oli 0KT4-positiivisia tai 0KT8-positiivisia. Sitä paitsi hajotettaessa soluja 5 0KT4:llä tai 0KT8:lla ainoastaan 25 % tymosyyteistä jäi jäljelle. Suurin osa jäljelle jääneistä tymosyyteistä reagoi 0KT3:n kanssa, kun taas niistä pieni osa reagoi OKT6:n kanssa. Nämä havainnot osoittavat, että suurimmalla osalla ihmisen tymosyyteistä on 0KT4-, 0KT5-, 0KT6-10 ja OKT8-pinta-antigeenit samassa solussa. Lisäksi taulukosta 2 ilmenee, että käsiteltäessä soluja OKT8:lla ja 0KT4:llä OKT3-antigeenin sisältävien kypsien tymo-syyttien määrä kasvaa huomattavasti. Täten suurin osa 0KT3:n kanssa reagoivista tymosyyteistä on jo erottu-15 nut OKT4+- ja OKT8+-jakeiksi, koska suurin osa soluista, jotka eivät reagoineet OKT4:n ja OKT8:n kanssa, olivat OKT3-positiivisia. Jos OKT3+-alapopulaatio olisi sekä 0KT4-positiivinen että 0KT8-positiviinen, hajotus jommalla kummalla monoklonaalisella vasta-aineella oli-20 si tuhonnut OKT3:n kanssa reagoivat tymosyytit.Similar experiments with human thymocytes gave different results. Table 2B shows that approximately 75% of thymocytes were 0KT4-positive or 0KT8-positive. Moreover, when cells were lysed with 0KT4 or 0KT8, only 25% of thymocytes remained. Most of the remaining thymocytes reacted with 0KT3, while a small proportion of them reacted with OKT6. These findings indicate that most human thymocytes have 0KT4, 0KT5, 0KT6-10, and OKT8 surface antigens in the same cell. In addition, Table 2 shows that treatment of cells with OKT8 and 0KT4 significantly increases the number of mature thymocytes containing OKT3 antigen. Thus, most of the thymocytes reacting with 0KT3 have already been separated into OKT4 + and OKT8 + fractions, as most of the cells that did not react with OKT4 and OKT8 were OKT3 positive. If the OKT3 + subpopulation were both 0KT4-positive and 0KT8-positive, digestion with either monoclonal antibody would have destroyed OKT3-reactive thymocytes.

Jotta saataisiin edelleen selville OKT3:n kanssa reagoivien tymosyyttialapopulaatioiden suhde muiden monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemiin tymo-syyttifraktioihin, tymosyyttejä käsiteltiin 0KT3:lla 25 ja komplementilla ja käsittelyssä jäljelle jääneitä soluja verrattiin sitten käsittelemättömiin tymosyyt-tipopulaatioihin. Taulukosta 2B ilmenee, että 0KT3 ja komplementti poisti 25 % tymosyyteistä. Sen sijaan OKT4-, OKT5-, 0KT6- ja OKT8-vasta-aineiden kanssa 30 reagoivat populaatiot pysyivät käytännöllisesti katsoen muuttumattomina. Näistä havainnoista voidaan vetää se johtopäätös, että suurin osa OKT6-markkerin sisältävistä tymosyyteistä kuuluu OKT3“-populaatioon.To further elucidate the relationship of OKT3-responsive thymocyte subpopulations to thymocyte fractions defined by other monoclonal antibodies, thymocytes were treated with 0KT3 and complement, and the cells remaining in the treatment were then compared to untreated thymocytes. Table 2B shows that 0KT3 and complement removed 25% of thymocytes. In contrast, populations reacting with OKT4, OKT5, 0KT6, and OKT8 antibodies remained virtually unchanged. From these findings, it can be concluded that the majority of thymocytes containing the OKT6 marker belong to the OKT3 “population.

Lisäksi tuloksista voidaan vetää se johtopäätös, että 35 tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n määrittelemät antigeenit, rajoittuvat 14 75433 samalla tavalla 0KT3“-populaatioon. On myös huomattava, että OKT9:n kanssa reagoiva tymosyyttipopulaatio ei vähentynyt käsiteltäessä fraktioimattomia tymosyyttejä 0KT3slla ja komplementilla, mikä osoittaa, että 0KT9+-5 alapopulaatio rajoittuu suurimmaksi osaksi 0KT3~-tymo-syyttipopulaatioon.In addition, it can be concluded from the results that 35 thymocytes co-expressing antigens defined by OKT4, OKT5, and OKT8 are similarly restricted to the 14,75433 0KT3 “population. It should also be noted that the OKT9-responsive thymocyte population did not decrease when unfractionated thymocytes were treated with 0KT3 and complement, indicating that the 0KT9 + -5 subpopulation is largely confined to the 0KT3 ~ -thymocyte population.

Näiden tulosten pohjalta on ollut mahdollista määrittää ihmisen tymosyyttien kehitysvaiheet kateenkorvas-sa. Kuviosta 2 ilmenee, että käytännöllisesti katsoen 10 kaikissa tymosyyteissä on OKTIO-markkeri. Lisäksi tymo-syytit saavat varhaisessa vaiheessa OKT9-antigeenin (Thyl ja Thy2). Tämä vaihe käsittää pienen osan tymo-syyteistä, ja siihen kuuluu noin 10 % ei-fraktioidusta populaatiosta.Based on these results, it has been possible to determine the developmental stages of human thymocytes in the thymus. Figure 2 shows that virtually all 10 thymocytes have the OKTIO marker. In addition, thymocytes receive the OKT9 antigen (Thyl and Thy2) at an early stage. This step comprises a small fraction of thymocytes and comprises about 10% of the unfractionated population.

15 Sen jälkeen ihmisen tymosyytti saavat OKT6:n mää rittelemän tymosyyttiantigeenin ja samanaikaisesti ne ilmentävät OKT4:n, OKT5;n ja OKT8:n (Thy4). Jälkimmäinen alapopulaatio edustaa valtaosaa tymosyyteistä, ja siihen kuuluu yli 70-80 % tymosyyttipopulaatiosta. Tymo-20 syyttien edelleen kypsyessä niiden OKT6-reaktiivisuus häviää, ne tulevat reaktiivisksi OKT3:n (ja 0KTl:n) kanssa ja erottuvat OKT4+- ja OKT 5 +/0KT8+-jakeiksi (1hy7 ja Thy8). Näyttää siltä, että viimeisessä vaiheessa tymosyyttien irrotessa kateenkorvasata perifeeristen T-solu-25 jen joukkoon, niiden OKTIO-markkeri häviää, sillä tämä antigeeni puuttuu käytännöllisesti katsoen kaikilta perifeerisiltä T-lymfosyyteiltä. Näiden kolmen pääkehi-tysvaiheen välisiä mahdollisia siirtymävaiheita on merkitty kuviossa 2 Thy3:lla, Thy5:llä ja Thy6:lla.The human thymocyte then receives the thymocyte antigen defined by OKT6 and simultaneously expresses OKT4, OKT5 and OKT8 (Thy4). The latter subpopulation represents the majority of thymocytes and comprises more than 70-80% of the thymocyte population. As Tymo-20 cytes continue to mature, their OKT6 reactivity disappears, they become reactive with OKT3 (and 0KT1), and separate into OKT4 + and OKT 5 + / 0KT8 + fractions (1hy7 and Thy8). It appears that in the final step, when thymocytes detach from the thymus among the peripheral T cells, their OKTIO marker disappears, as this antigen is absent from virtually all peripheral T lymphocytes. Possible transition steps between these three main development stages are denoted in Figure 2 by Thy3, Thy5 and Thy6.

30 Koska akuutin T-solujen lymfoblastileukemian on arveltu johtuvan epäkypsistä tymosyyteistä, määritettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyjen kasvainsolujen ja mainittujen oletettujen tymosyyttien kehitysvaiheiden välinen suhde. Määritykses-35 sä käytettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyä 25 kasvainsolupopulaatiota ja kolmea T-solu-linjaa, jotka oli etukäteen tutkittu tavanomaisilla an- 15 7 54 33 ti-T-solureagensseilla ja E-rosetoinnilla. Taulukosta 3 ilmenee, että suurin osa T-ALL-leukemiasoluista reagoi joko pelkän OKTIOrn tai 0KT9:n ja OKTIOrn kanssa, mutta solut eivät reagoineet muiden monoklonaalisten vasta-5 aineiden kanssa. Täten 15/25 tutkituista tapauksista näytti sisältävän varhaisen tymosyyttivaiheen antigeenejä (vaihe 1).30 Since acute T-cell lymphoblastic leukemia is thought to be due to immature thymocytes, the relationship between tumor cells isolated from individuals with T-ALL leukemia and the developmental stages of said putative thymocytes was determined. Assay 35 used 25 tumor cell populations isolated from individuals with T-ALL leukemia and three T cell lines pre-screened with standard anti-T 7 T cell reagents and E rosetting. Table 3 shows that most T-ALL leukemia cells reacted with either OKTIOr alone or 0KT9 and OKTIOrn, but the cells did not react with other monoclonal antibodies. Thus, 15/25 of the cases studied appeared to contain early thymocyte stage antigens (stage 1).

Sitä vastoin 5/25 tapauksista reagoi 0KT6:n kanssa, mistä voidaan vetää se johtopäätös, että ne ovat peräisin 10 kypsemmästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 2). Tämä T-ALL-ryhmä reagoi eri tavoin OKT4:n, OKT8:n ja OKT9:n kanssa, kuten taulukosta 3 ilmenee. Kahdella viidesosalla potilaista oli sellaisia kasvainsoluja, jotka sisälsivät suurimman osan tavallisista tymosyyttiantigeeneista, mukaan 15 lukien OKT4, OKT6 ja OKT8. On huomattava, että OKT5 ei esiinny yhdessäkään näistä viidestä vaiheen 2 kasvaimesta, vaikkakin OKT8-reaktiivisuutta havaittiin. Tästä jälkimmäisestä tuloksesta voidaan selvästi vetää se johtopäätös, että OKT5 ja OKT8 määrittelevät eri antigeenejä tai 20 eri determinantteja samassa antigeenissä. Lopuksi l/25:lla potilaista oli sellaisia kasvaimia, jotka olivat peräisin kypsästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 3) OKT3-reaktii-visuuden perusteella määritettynä. Tämän henkilön kasvain oli lisäksi reaktiivinen OKT5:n, OKT8:n ja OKT10:n kanssa. 25 Tutkituista 25 leukemiapopulaatiosta ainoastaan neljä oli sellaista, joita ei voitu selvästi luokitella. Näistä kolme oli OKT4- ja OKT8-positiivisia, mutta ne eivät reagoineet OKT3:n eikä OKT6:N kanssa, jolloin ne olivat todennäköisimmin Thy4:n ja Thy7, 8:n välisiä siirtymä-30 vaiheita. Yksi 25 tapauksesta osoittautui olevan Thy3:n ja Thy4:n välinen siirtymävaihe, sillä se oli reaktiivinen 0KT8:n ja OKTlO:n kanssa.In contrast, 5/25 of the cases reacted with 0KT6, from which it can be concluded that they are derived from 10 more mature thymocyte populations (step 2). This T-ALL group reacted differently with OKT4, OKT8, and OKT9, as shown in Table 3. Two-fifths of patients had tumor cells that contained most of the common thymocyte antigens, including OKT4, OKT6, and OKT8. It should be noted that OKT5 is not present in any of these five stage 2 tumors, although OKT8 reactivity was observed. From this latter result, it can be clearly concluded that OKT5 and OKT8 define different antigens or 20 different determinants in the same antigen. Finally, 1/25 of the patients had tumors from a mature thymocyte population (step 3) as determined by OKT3 reactivity. In addition, this person's tumor was reactive with OKT5, OKT8, and OKT10. Of the 25 leukemia populations studied, only four were those that could not be clearly classified. Three of these were OKT4- and OKT8-positive, but did not react with OKT3 or OKT6, making them most likely transition-30 stages between Thy4 and Thy7,8. One of the 25 cases turned out to be a transition phase between Thy3 and Thy4, as it was reactive with 0KT8 and OKT10.

Myös T-ALL-kasvainpopulaatioista peräisin olevissa T-solulinjoissa oli soluja, jota edustivat tiettyä 35 tymosyyttien kehitysvaihetta. Taulukosta 4 ilmenee, että HSB-2 reagoi yksinomaan 0KT9:n ja OKTIOrn kanssa, ja täten se määrittelee vaiheesta 1 peräisin olevan kasvain- 16 754 3 3 populaation. Sitä vastoin CEM-T-solulinja reagoi 0KT4:n, 0KT6:n, OKT9:n ja OKTlOtn kanssa ja se osoittautui olevan peräisin vaiheen 2 tymosyyteistä. Lopuksi solulinja MOLT-4 on ilmeisesti HSB-2:n ja CEMiin välillä oleva 5 leukemiatransformaatio, sillä se ekspressoi OKT6:n, 0KT8:n, OKT9:n ja OKT10:n.T cell lines derived from T-ALL tumor populations also contained cells representing a particular stage of 35 thymocyte development. Table 4 shows that HSB-2 reacts exclusively with 0KT9 and OKTIO, and thus defines the tumor population from step 1. In contrast, the CEM-T cell line reacted with 0KT4, 0KT6, OKT9, and OKT10 and was found to be derived from stage 2 thymocytes. Finally, the cell line MOLT-4 appears to be a leukemia transformation between HSB-2 and CEM, as it expresses OKT6, 0KT8, OKT9, and OKT10.

Koska kaikilla tutkituilla T-solujen akuuttia lym-foblastileukemiaa sairastavilla potilailla on osoittau-tuntu olevan OKT10+-soluja, OKTIO-vasta-ainetta voidaan 10 käyttää T-solujen ALL-leukemian diagnoosiin. Potilailla, jotka sairastivat nollasolujen ALL-leukemiaa, oli myös OKT10+-soluja.Because all of the T cell acute lymphoblastic leukemia patients studied have been shown to have OKT10 + cells, the OKTIO antibody can be used to diagnose T cell ALL leukemia. Patients with zero-cell ALL leukemia also had OKT10 + cells.

Myös taulukoissa 2-4 esitettyjen tietojen avulla OKTlO-vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vas-15 ta-aineista.Also, using the data in Tables 2-4, the OKT10 antibody can be detected and distinguished from other antibodies.

Diagnostisia menetelmiä, jossa käytetään muita monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hybridomeja (0KT1, 0KT3, OKT4 ja OKT5:llä 0KT6, OKT8 ja OKT9) on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 20 844703, 844705, 844704 ja 844706 sekä 844707, 850062 ja 850063.Diagnostic methods using other monoclonal antibody-producing hybridomas (0KT1, 0KT3, OKT4 and OKT5 with 0KT6, OKT8 and OKT9) produced by the same applicants are described in FI patent applications 20 844703, 844705, 844704 and 844706 and 844707, 8544. .

Kyseisen vasta-aineen OKT10 havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat 25 toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-30 aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG^- IgG2a, IgG2b tai IgG3 tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa 35 siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-ai-neiden kanssa.The OKT10 of this antibody was found to belong to the IgG1 subclass, which is one of the four subclasses of mouse IgG. These subclasses of immunoglobulin G differ by 25 so-called from their "fixed" regions, although the structure of an antibody specific for a particular antigen has a so-called a "variable" region that is functionally similar regardless of which immunoglobulin G subclass it belongs to. That is, a monoclonal antibody having the characteristics described above may belong to the subclasses IgG1 to IgG2a, IgG2b or IgG3, or to the classes IgM or IgA or other classes of Ig. Differences in these classes or subclasses do not affect the selectivity of antibody reactivity, but may affect how the antibody subsequently reacts with other agents, e.g., complement or anti-mouse antibodies.

17 7543317 75433

Esillä olevaa vasta-ainetta OKTIO voidaan käyttää tyraosyyttien erilaistumisen toteamiseen ja tutkimiseen, kuten kuviosssa 2 on esitetty. Lisäksi esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää sellaisten tautitilojen diag-5 noosiin, jotka aiheutuvat OKT10+-solujen puutteesta tai ylimäärästä. Tällöin voidaan käyttää OKTlO-vasta-ainet-ta sellaisenaan tai OKTIO:n ja muiden vasta-aineiden yhdistelmää (esim. OKT3 - OKTIO). Reaktiivuuskaavojen avulla, jotka on saatu annettaessa useiden eri vasta-10 aineiden reagoida T-solujen ja T-solujakeiden kanssa, tietyt tautitilat pystytään toteamaan tarkemmin kuin käytettäessä tunnettuja diagnostisia menetelmiä.The present antibody OKTIO can be used to detect and study the differentiation of thyrocytes, as shown in Figure 2. In addition, the present antibody can be used to diagnose disease states caused by a deficiency or excess of OKT10 + cells. In this case, OKT10 antibody as such or a combination of OKTIO and other antibodies (e.g., OKT3 to OKTIO) can be used. Reactivity formulas obtained by reacting several different antibodies with T cells and T cell fractions allow certain disease states to be determined more accurately than using known diagnostic methods.

Diagnostiset koostumukset, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKTIO-vasta-ainetta ja diagnosis tisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista, kuuluvat myös esillä olevan keksinnön suojapiiriin.Diagnostic compositions consisting of effective amounts of OKTIO antibody and diagnostically acceptable carriers are also within the scope of the present invention.

Taulukko 1table 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus ihmisen lymfoidipopulaatioiden kanssa.Reactivity of monoclonal antibodies with human lymphoid populations.

20 Monoklonaalinen Perifeerinen Luuydin (6) Kateenkorva (22) vasta-aine veri E+ E” OKT6 0% 0% 0% 70% OKT8 30 % 0 % <2 % 80 % 25 0KT9 0 % 0 % 0 % <10 % OKTIO <5 % 10 % <20 % 95 %20 Monoclonal Peripheral Bone marrow (6) Thymus (22) antibody blood E + E ”OKT6 0% 0% 0% 70% OKT8 30% 0% <2% 80% 25 0KT9 0% 0% 0% <10% OKTIO < 5% 10% <20% 95%

Suluissa olevat luvut merkitsevät tutkittujen näytteiden määrää; %-arvot ovat keskiarvoja.Figures in parentheses indicate the number of samples examined; % values are averages.

18 75433 <#>18 75433 <#>

OO

W rH Ε-» m 3« « III m m m vo c X ο» Ο <n r- oo oo :n} .zi -H to :ro opW rH Ε- »m 3« «III m m m vo c X ο» Ο <n r- oo oo: n} .zi -H to: ro op

g Pg P

5 -Pro σν tn in5 -Pro σν tn in

5 ·Ρ* Eh :<B5 · Ρ * Eh: <B

P « III oo vo m (N x ,i -X C O 1—I f-H ·Η 0 Ocu d) Ή Η <uo α o m V+H 00P «III oo vo m (N x, i -X C O 1 — I f-H · Η 0 Ocu d) Ή Η <uo α o m V + H 00

3 d) Eh -ςτιηο m m o o CC3 d) Eh -ςτιηο m m o o CC

" C C « ro σ\ Γ'ΐη σ> rod)"C C« ro σ \ Γ'ΐη σ> rod)

c d)-P o ro Cc d) -P o ro C

1 '57 § I1 '57 § I

b <H(0 vo -Pro 2 0+) Eh ooo m ο ro <n +j o 3 03«« VO rH rl 00 ο ·η 3 ro O P ro la c> «4= .3, Φb <H (0 vo -Pro 2 0+) Eh ooo m ο ro <n + j o 3 03 «« VO rH rl 00 ο · η 3 ro O P ro la c> «4 = .3, Φ

° AC m >i C° AC m> i C

nm h m o o omoo -m a> b ai+j « mn- Γ' oo co -pcnm h m o o omoo -m a> b ai + j «mn- Γ 'oo co -pc

S3 C« O >1 -PS3 C «O> 1 -P

'2 :ro-H -p ip ro'2: ro-H -p ip ro

3 :<0rH « -P -P3: <0rH «-P -P

Si -nro -v >, « PSi -nro -v>, «P

® ro EH oocn in o m ο α Φ Φ ? a)C «νοσνΓ'νονο Ch 0 'Π rH 0 O :ro « «® ro EH oocn in o m ο α Φ Φ? a) C «νοσνΓ'νονο Ch 0 'Π rH 0 O: ro« «

P I—IrH rH IP I — IrH rH I

b d)« γη -h rob d) «γη -h ro

°* *" -no ro -P hi -P° * * "-no ro -P hi -P

,« HC Eh oo m in oomo w +) X m -ro 0 « σ»σνσι ro oo oo >, · 3 3 -¾ O E O >,roc P i -M rH P λ; 3 m -ro row, «HC Eh oo m in oomo w +) X m -ro 0« σ »σνσι ro oo oo>, · 3 3 -¾ O E O>, roc P i -M rH P λ; 3 m -ro row

rH rH « 3 c -H -UrH rH «3 c -H -U

Sp^crtm ro o ro ίβ -Μ ·Η Ό M I > eh -p qj -h -p to hj ro V ti £ 5 prop 3Γ1 .5 3 vo vo vo vo vo vo vo (0« :2 ;TO,8 OOO Ο Ο Ο Ο -H rH 3 g J® rH rH rH rHrHr-HrH Φ >1 Ό 6 2 ^ 8-p oh <uSp ^ crtm ro o ro ίβ -Μ · Η Ό MI> eh -p qj -h -p to hj ro V ti £ 5 prop 3Γ1 .5 3 vo vo vo vo vo vo vo (0 «: 2; TO, 8 OOO Ο Ο Ο Ο -H rH 3 g J® rH rH rH rHrHr-HrH Φ> 1 Ό 6 2 ^ 8-p oh <u

« r, '2 XXX X X X X (OO«R, '2 XXX X X X X (OO

C >ι Φ p +j ςι, +j <2 P '“J b OCMCN oomo -P d) ^ . ^ 3,-2 p” - - rH - ro 0:tO« •H ro Φ[?5 mm cr\ -p +) ,*C> ι Φ p + j ςι, + j <2 P '“J b OCMCN oomo -P d) ^. ^ 3, -2 p ”- - rH - ro 0: tO« • H ro Φ [? 5 mm cr \ -p +), *

Ϊ 'n 7^3 rH CSI PWOΪ 'n 7 ^ 3 rH CSI PWO

C - ^ « ro -H rHC - ^ «ro -H rH

h ro ;ίβ o 3 ro >i 3 ro m K) « ή ,-h ehh ro; ίβ o 3 ro> i 3 ro m K) «ή, -h eh

' 5 P 3 rH'5 P 3 rH

ro -π 3 o, m · p 3 rH o p ro “'b ox x CU -P « |p 0 to :ro :(0 « « > « o I >1 >1 :ro :ro -H -pro -π 3 o, m · p 3 rH o p ro “'b ox x CU -P« | p 0 to: ro: (0 ««> «o I> 1> 1: ro: ro -H -p

_ J -P EH rH rH -P y, W P_ J -P EH rH rH -P y, W P

CcH+j <U qj 6-XPCcH + j <U qj 6-XP

3 _ (0 PP P :0 ro 3 c P:<0ro dip p prnrod)3 _ (0 PP P: 0 ro 3 c P: <0ro dip p prnrod)

WtflrH U) -P *. P-P P rH Ο, EWtflrH U) -P *. P-P P rH Ο, E

•ή « 3 ·ρ w - - ·ρ m - .-ro -ρ ro d) pp a p:rouup;roouu eppp ro«0 ω « >,« φ e a ro-ρ a, d) + + > + + + rH φ ro ε gp-p pc «e o E « o 0d) Ό -p ro -f co o ro »r oo ro P φ m .*• ή «3 · ρ w - - · ρ m -.-Ro -ρ ro d) pp ap: rouup; roouu eppp ro« 0 ω «>,« φ ea ro-ρ a, d) + +> + + + rH φ ro ε gp-p pc «eo E« o 0d) Ό -p ro -f co o ro »r oo ro P φ m. *

PO -p PEEhEhEEHEhEH P rH -PPO -p PEEHEHEEHEhEH P rH -P

•X P O φη«« >,-+««« -P & -X II• X P O φη ««>, - + «« «-P & -X II

o -H l+| O4HOOEHHOOO «E-Po -H 1 + | O4HOOEHHOOO «E-P

e p g :ro o ro - o ro £, . . « x * u S o* ,4 < m x *- 19 75433 P -h toe p g: ro o ro - o ro £,. . «X * u S o *, 4 <m x * - 19 75433 P -h to

Φ P φ IΦ P φ I

T3 m toT3 m to

3 I O -H rH3 I O -H rH

3 X a (Ö >13 X a (Ö> 1

10 X · r-l P10 X · r-l P

•H E 0) X C• H E 0) X C

(0 I 3 X O <0 -H(0 I 3 X O <0 -H

C hil M P <1) •H 3 —» 3 to to £ G x m P -H 3 (0C hil M P <1) • H 3 - »3 to to G G x m P -H 3 (0

O (D CM -Η >i (0 -HO (D CM -Η> i (0 -H

ίΟ-r-iC X Ο P P « P 3 0) II O' OO rHr-IOJrH Hi Η > -H tflίΟ-r-iC X Ο P P «P 3 0) II O 'OO rHr-IOJrH Hi Η> -H tfl

C P P I (N tfl <#> GC P P I (N tfl <#> G

•H P tO 3 -H Ai (D• H P tO 3 -H Ai (D

Λ Ή 3-1 φ >, O tOΛ Ή 3-1 φ>, O tO

λ; 3 ςο <υ — P cu m c M >hλ; 3 ςο <υ - P cu m c M> h

(0 3 (0 POO(0 3 (0 POO

-H E-I P -H -H 3-H E-I P -H -H 3

£ O -H H i—I£ O -H H i — I

a) -r-i p o pa) -r-i p o p

Ai O c _ JAi O c _ J

3 l rH + - -H -H :aS rO3 l rH + - -H -H: aS rO

φ -H Eh + O O W P toφ -H Eh + O O W P to

iH 3 « ++ + + + + + PtO tOtOtOiH 3 «++ + + + + + PtO tOtOtO

-HIO C -H C -H -H-HIO C -H C -H -H

p (0 -H Η Φ MH Op (0 -H Η Φ MH O

to P (0 (1) tO -H -Hto P (0 (1) tO -H -H

(Ö to O-i > P <u to to(Ö to O-i> P <u to to

rH (0 Eh (0 Ai SH Φ GrH (0 Eh (0 Ai SH Φ G

x > « i+ +iii i tora o λ φ o o Ai sh 3 to o^ PC (0 iH to ro £ φ φ Ai mh to 3 >1 P 00 P O to O X tn Eh 3C G -r-i 3x> «i + + iii i tora o λ φ o o Ai sh 3 to o ^ PC (0 iH to ro £ φ φ Ai mh to 3> 1 P 00 P O to O X tn Eh 3C G -r-i 3

Ai -H «Il ++I++ 3(1) «UMAi -H «Il ++ I ++ 3 (1)« UM

Ai G X O E Ό G - OAi G X O E Ό G - O

3 φ (tj -H -H to3 φ (tj -H -H to

•H ·(—i 3 :(0 -H P I C• H · (—i 3: (0 -H P I C

3 3 C to -n C -H — -H3 3 C to -n C -H - -H

(0 X O Eh Ή 10 3 H O Ή « Il + + + + I O) (O <l)C>(0 X O Eh Ή 10 3 H O Ή «Il + + + + I O) (O <l) C>

10 Ai O G tfl Gj Φ tO10 Ai O G tfl Gj Φ tO

10 to to C (010 to C (0

En C tO O -H Ai O tn :0 -n to > •H £ En >i O -H :t0En C tO O -H Ai O tn: 0 -n to> • H £ En> i O -H: t0

P « Il I I I I + E -r-l -H PP «Il I I I I + E -r-l -H P

p to nj o »o P to 3 3 to -H -H * (0 Φ 3 3 to 3 P — O' tn a: ra c -ί rH to + φ Ai (0 -H fO Eh 3 Φ --- G >i -- > Ai « Il ++II I 3 P :<0 -HO Ai · G -H -np to nj o »o P to 3 3 to -H -H * (0 Φ 3 3 to 3 P - O 'tn a: ra c -ί rH to + φ Ai (0 -H fO Eh 3 Φ --- G> i -> Ai «Il ++ II I 3 P: <0 -HO Ai · G -H -n

C -H G · (N φ X SHC -H G · (N φ X SH

ΦΡΦ GtoGOttd ro Ai Ό oo -H « G -H >ΦΡΦ GtoGOttd ro Ai Ό oo -H «G -H>

3 nj -H Eh -H O > to G3 nj -H Eh -H O> to G

X φ φ « Il till + tO· 0-H3PX φ φ «Il till + tO · 0-H3P

O K G O A;ro-H-H3t0 to Φ 3 I > P to 3 (0 +P (0 X 3 X -H (0O K G O A; ro-H-H3t0 to Φ 3 I> P to 3 (0 + P (0 X 3 X -H (0

•H — to Or a; to > P• H - to Or a; to> P

£ H (0 (0 G O -H£ H (0 (0 G O -H

φ >1 (0 -H P -H (0 Oi -H Gφ> 1 (0 -H P -H (0 Oi -H G

Ai X -H P I -H (0 P (0 3 Eh rO p X (0 P -H Ai (0Ai X -H P I -H (0 P (0 3 Eh rO p X (0 P -H Ai (0

Φ ^ X >1 X -H P X (0 EΦ ^ X> 1 X -H P X (0 E

X Μ>ι <C φ -H O Φ (0X Μ> ι <C φ -H O Φ (0

φ -H (0 10 -H I X -H >H Pφ -H (0 10 -H I X -H> H P

P P> O PEH-H>tOPP P> O PEH-H> tOP

to P £ P (03(00 (0 >i G >i >i G > :(0 3 -ro In to >ι-Η P >, -H >i P tO Φto P £ P (03 (00 (0> i G> i> i G>: (0 3 -ro In to> ι-Η P>, -H> i P tO Φ

•H 10 P to -H (0 P G -H• H 10 P to -H (0 P G -H

£ O >i G O > rH P -H > (0 >,£ O> i G O> rH P -H> (0>,

3 £ >ι~ Φ £ (0 rH Φ Ai -H i—I P3 £> ι ~ Φ £ (0 rH Φ Ai -H i — I P

p >1 in on e — ^ >, ρφρμ-ηγηρ tn rH P O >1 <N -H TJ- VD 00 P p p -H φ P Φ >1p> 1 in is e - ^>, ρφρμ-ηγηρ tn rH P O> 1 <N -H TJ- VD 00 P p p -H φ P Φ> 1

H -H £ X X — I | -H -H 10 £ Ai X PH -H £ X X - I | -H -H 10 £ Ai X P

(0 Φ tO >iEh φ X oo oo h· φ :<0 ao Ai Ai Φ I (OOtO(0 Φ tO> iEh φ X oo oo h · φ: <0 ao Ai Ai Φ I (OOtO

rH PO >1 φ 3 >1 -h -h -h > x x x x -h ax 3 3 -h x « Cu λ H (0·· (0(0EhEhEhEh(0 >i Eh Eh rH P Eh + W > < ff) X + + 75433 20rH PO> 1 φ 3> 1 -h -h -h> xxxx -h ax 3 3 -hx «Cu λ H (0 ·· (0 (0EhEhEhEh (0> i Eh Eh rH P Eh + W> <ff) X + + 75433 20

Taulukko 4Table 4

Solulinjojen reaktiivisuus monoklonaalisten vasta-aineiden kanssaReactivity of cell lines with monoclonal antibodies

Solulinja OKT3 OKT4 OKT5 OKT6 OKT8 OKT9 OKTIOCell line OKT3 OKT4 OKT5 OKT6 OKT8 OKT9 OKTIO

5 HSB-2 -X - - - - + + CEM - + - + + + + MOLT-4 --- + + + + xKriteerit (-)- ja (+)-reaktiivisuudelle olivat samat kuin taulukossa 3.5 HSB-2 -X - - - - + + CEM - + - + + + + MOLT-4 --- + + + + x The criteria for (-) and (+) reactivity were the same as in Table 3.

Claims (2)

21 7543321 75433 1. Diagnostinen menetelmä OKT10+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisissä, tunnettu 5 siitä, että annetaan potilaasta otetun T-solu- tai tymo-syyttinäytteen reagoida diagnostisesta vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8022, ja joka vasta-aine reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen nor-10 maaleja tymosyyttejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä mononuk-leaarisia E -soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n kanssa luuydinsoluja, ja määritetään mainitun vasta-aineen kanssa reagoivien perifeeristen T-solujen ja tymosyyttien 15 prosentuaalinen osuus näiden kokonaismäärästä.A diagnostic method for detecting a deficiency or excess of OKT10 + cells in humans, characterized in that a T cell or thymocyte sample taken from a patient is reacted with a diagnostically effective amount of a mouse monoclonal antibody produced by a hybrid cell line having an ATCC accession number of CRL. 8022, and which antibody reacts with about 95% of human normal 10 thymocytes, 5% of normal human peripheral T cells, 10% of peripheral mononuclear E cells (B cells and zero cells) and 10-20% bone marrow cells, and the 15% of total peripheral T cells and thymocytes reacting with said antibody are determined. 2. Diagnostinen ainekoostumus OKT10+-solujen ylimäärän tai puutteen toteamiseksi, tunnettu siitä, että se koostuu diagnostisesti hyväksyttävästä kantajasta ja OKT10+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseen tar- 20 vittavasta määrästä hiiren monoklonaalista vasta-aineta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8022, ja joka vasta-aine reagoi noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 5 %:n kanssa ihmisen normaaleja perifeerisiä T-soluja, 10 %:n kanssa perifeerisiä 25 mononukleaarisia E -soluja (B-solut ja nollasolut) ja 10-20 %:n kanssa luuydinsoluja.2. A diagnostic composition for detecting an excess or deficiency of OKT10 + cells, characterized in that it consists of a diagnostically acceptable carrier and an amount of a mouse monoclonal antibody required to detect an excess or excess of OKT10 + cells produced by a hybrid cell line having an ATCC accession number 8022, and which antibody reacts with approximately 95% of normal human thymocytes, 5% of normal human peripheral T cells, 10% of peripheral mononuclear E cells (B cells and null cells), and 10 -20% with bone marrow cells.
FI850061A 1979-12-04 1985-01-07 Diagnostic method utilizing a specific monoclonal antigen call to human protymocyte antigen and in the method useful composition. FI75433C (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10007279 1979-12-04
US06/100,072 US4364935A (en) 1979-12-04 1979-12-04 Monoclonal antibody to a human prothymocyte antigen and methods of preparing same
FI803757 1980-12-03
FI803757A FI75365C (en) 1979-12-04 1980-12-03 Method for producing monoclonal antibody to human pro-thymocyte antigen by their hybrid cell line.

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI850061L FI850061L (en) 1985-01-07
FI850061A0 FI850061A0 (en) 1985-01-07
FI75433B FI75433B (en) 1988-02-29
FI75433C true FI75433C (en) 1988-06-09

Family

ID=26157182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI850061A FI75433C (en) 1979-12-04 1985-01-07 Diagnostic method utilizing a specific monoclonal antigen call to human protymocyte antigen and in the method useful composition.

Country Status (1)

Country Link
FI (1) FI75433C (en)

Also Published As

Publication number Publication date
FI75433B (en) 1988-02-29
FI850061L (en) 1985-01-07
FI850061A0 (en) 1985-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI75365B (en) A FRUIT PROCESSING OF A MONOCLONAL ANTICROPP TO A MAJOR PROTYMOCYTANTIGEN BASED ON A HYBRID CELL.
EP0018795B2 (en) Monoclonal-antibody-producing hybrid cell line, antibody and method of preparing it, therapeutic composition containing it and its diagnostic and therapeutic uses
FI75184B (en) FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV EN MONOCLONAL ANTIKROPP MOT MAENSKLIGA T-CELLERS ANTIGENER MED EN NY HYBRIDCELLINJE.
FI75366C (en) A method of producing a complement-fixing monoclonal antibody against human supressor T cells by a hybrid cell line.
US4364934A (en) Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same
NZ195645A (en) Hybridoma for producing monoclonal antibody to human thymocytes;antibody;therapeutic compositions and diagnostic methods
FI75433C (en) Diagnostic method utilizing a specific monoclonal antigen call to human protymocyte antigen and in the method useful composition.
US4624925A (en) Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocyte antigens, antibody, and methods
FI75232B (en) Diagnostic method in order to observe specific T-cell population deficiency or surplus through the use of a specific monoclonal antibody for human thymocyte antigen
FI75434C (en) DIAGNOSTIC FOERFARANDE, VID VILKET MAN ANVAENDER EN MONOCLONAL ANTIKROPP SPECIFIK MOT MAENNINSKANS TIDIGA TYMOCYTANTIGEN OCH I FOERFARANDET ANVAENDBAR KOMPOSITION.
FI75058C (en) Diagnostic method for determining the proportion of T cells in circulating lymphocytes and for detecting cutaneous T cell lymphomas using a novel complement-binding monoclonal antibody.
FI75230C (en) DIAGNOSTIC FOERFARANDE, VID VILKET ANVAENDS EN NY MONOCLONAL ANTIKROPP SPECIFIK MOT MAENNISKANS HJAELPARE-T-CELLER OCH I FOERFARANDET ANVAENDBAR COMPOSITION.
US4806349A (en) Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human prothymocyte antigen, antibody, and methods
FI75435C (en) DIAGNOSTIC FOERFARANDE, VID VILKET MAN UTNYTTJAR EN NY MONOCLONAL ANTIKROPP SPECIFIK MOT MAENNISKANS T-CELLERS ANTIGEN OCH I FOERFARANDET ANVAENDBAR COMPOSITION.
US4691010A (en) Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen, antibody, and methods
FI75059B (en) DIAGNOSTIC FOERFARANDE, VID VILKET MAN ANVAENDER EN KOMPLEMENT-FIXERANDE MONOCLONAL ANTIKROPP SPECIFIK MOT MAENNISKANS SUPRESSOR-T-CELLER, OCH I FOERFARANDET ANVAENDBAR KOMPOSITION.
FI75229B (en) DIAGNOSTIC FOERFARANDE, VID VILKET MAN ANVAENDER EN NY MONOCLONAL ANTIKROPP SPECIFIK MOT MAENNISKANS T-CELLER.
FI75231C (en) Diagnostic method using a monoclonal antibody specific for human cytotoxic and supressor T cells.
HRP940824A2 (en) Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human prothymocyte antigen, antibody, and methods
HRP940823A2 (en) Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocite antigen, antibody and method of preparation of this antibody

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired

Owner name: ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION