FI75230C - Diagnostiskt foerfarande, vid vilket anvaends en ny monoklonal antikropp specifik mot maenniskans hjaelpare-t-celler och i foerfarandet anvaendbar komposition. - Google Patents

Description

1 75230

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään uutta ihmisen auttaja-T-soluille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, ja menetelmässä käyttökelpoinen ainekoostumus 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 801 343.

Keksinnön kohteena on diagnostinen menetelmä potilaan auttaja-T-solujen ylimäärän tai puutteen toteamiseksi, jossa käytetään monoklonaalista ihmisen kaikkien nor-10 maalien auttaja-T-solujen pinnalta löydetylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Keksintö koskee myös tätä vasta-ainetta sisältävää diagnostista koostumusta. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjan avulla.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren 15 myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin (Nature 256 (1975) 495-497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solu-linja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen 20 (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi:

Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, 25 M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet: C.J. Barnstable et al., Cell 14 (toukokuuta 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, volyymi 2, toimittaja D.M: Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and 30 Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybrido-meista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiin-35 tyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etu- 75230 käteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybri-domaa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hyb-ridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riip-5 puu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hybridoman eristämisessä käytetystä selektiotekniikasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current 10 Topics in Microbiology and Immunology, volyymi, 81, 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vai-15 kuttu kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigee-neihin. Mikään näistä hybridcmeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näis-20 tä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluis-ta. Kateenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imu-25 kudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immu-nologisesti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yteydessä esiin-30 tyvä hylkiminen). Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lym-fosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solu -lajit toimivat toisissa immunologisissa toiminnoissa 35 säätelevästi. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

75230

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisis-ta kantasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden eri-5 laistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltää "Bursa of Fabri-cius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvelleen erilaistuvan luu-ytimessä.

10 T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, nämä suhteellisesti ottaen joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hii-15 rien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L.

Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232, ja L. Chess ja S.F. Schlossman -"Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets 20 Bearing Unique Diffefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja 0. Stutman, Plenum Press 1977, volyymi 7, 363-379.

Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immuno-25 regulatooristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskas-vainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudinprognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyytti-30 ryhmää pystytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymhomas", toimittajat S. Thierfelder et al., Springer, Heidel-35 berg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

4 75230

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, tietyissä leukemiamuodoissa ja agammaglobuline-miassa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On mahdollista, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä 5 "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "hei- kentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobuli-nemiassa tiettyjä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy 10 ylimäärin.

Tietyissä leukemiamuodoissa muodostuu ylimäärin pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan. Katso esi-15 merkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define

Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", volyymi 20, Springer-Verlag 1977, 17-24 ja julkaisun sisältämät viitteet.

20 Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immunoglo- buliinia ei muodostu lainkaan, kuuluu ainakin kaksi erilaista tautimuotoa. Muodossa I ylimäärin esiintyvät "heikentäjä"-T-solut estävät immunoglobuliinin muodostus-tumisen, kun taas muodossa I sama häiriötila aiheutuu 25 siitä, että "auttaja"-T-soluista on puutetta. Molemmissa tautimuodoissa potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta; B-solujen toiminta on kuitenkin heikentynyt tai "sitä ei auteta", 30 minkä vuoksi immunoglobuliinituotanto vähenee huomattavasti tai loppuu kokonaan. Potilaan agammaglobulinemia-tyyppi voidaan täten saada selville kokeilla, joissa määritetään, onko heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

35 Terapeuttisella puolella on havaittu viitteitä siitä, että annettaessa ylimäärin esiintyvälle T-solujen 75230 alaryhmälle spesifisiä vasta-aineita autoimmuunisia tai pahanlaatuisia sairauksia poteville potilaille nämä vaikuttavat sairauden kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-solusyöpää (tiettyjä ihoimukudoskasvaimia ja 5 tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa auttaja-T-solujen antigeenisille spesifisellä vasta-aineella. Autoimmuunisia sairauksia, jotka ovat aiheutuneet ylimäärin esiintyvistä T-soluista, voidaan myös hoitaa samalla tavalla.

10 Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG), on osoittautunut terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityk-15 sellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylki-misprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft 20 Recipients: Importance of T Cell Monitoring" Surgeery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektii-25 visiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-haluttu reak-30 tiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistuvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää mil-35 joonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden 6 75230 muodostumisen useita antigeenilajeja vastaan, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista.

Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä me-5 netelmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10®.

10 Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen anti-seerumien puuttellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-15 aineen etuja.

Nyt on keksitty uusi hybridoma (nimeltään OKT4), joka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perfeerisistä auttaja-T-soluista 20 (noin 55 % ihmisen terveistä perifeerisistä T-soluista) löydetylle pinta-antigeenille. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle ihmisen nor-maaleiden T-solujen pinta-antigeenideterminantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita 25 ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päinvastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole 30 monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen T-solun antigeenille) . Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka 35 tähän astisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

75230

Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuottamasta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKT4", asianyhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on tallennettu 5 26.4.1979 laitokseen "the American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8002.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 801343.

10 Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään on tunnusomaista, että potilaan T-solunäytteen annetaan reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa monoklonaalista vasta-ainetta, jotka tuottaa hybridoma, 15 jonka talletusnumero on ATCC CRL 8002, ja joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, joita on noin 55 % kaikista ihmisen terveistä perifeerisistä T-soluista, mutta ei reagoi ihmisen normaalien 20 perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaalia tymosyyttejä, c) ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileu-25 kemiaa, B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa tai nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi ihmisen T-solulinjan CEM kanssa, mut-30 ta ei reagoi ihmisen T-solulinjojen HJD-1, Laz 191 eikä HM1 kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa, 35 f) reagoi noin 55 %:n kanssa Rhesus-apinan pe rifeerisiä T-soluja.

8 75230 g) sitoo komplementin, ja h) määrittelee T-solupopulaation (OKT4+), joka ei reagoi anti-TH2-seerumin kanssa ja jonka solumyrkyllisyys on erittäin vähäinen, 5 ja määritetään, kuinka suuri osa perifeeristen T-solujen kokonaispopulaatiosta reagoi mainitun vasta-aineen kanssa.

Esimerkki 1 OKT4-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen 10 Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradientti-sentrifugointimenetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH) Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J.

15 Clin. Lab. Invest. 21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioi- mattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-lg” (T- ja nollasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab1)2-pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Ches et ai., 20 J. Immunol. 113 (1974) 1113. T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig” -populaatio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaguw-sentri-fugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,115-m 25 NH^Clrlla (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupo-pulaatio oli 2-%risesti EAC-rosenttipositiivinen ja > 95-%risesti E-rosenttipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostumaton Ig- (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapin-30 naita. Tämä jälkimäinen populaatio oli < 5-%risesti E-positiivinen ja £ 2-%risesti SIg-positiinen. Pinta-Ig+ (B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammoglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli 95-%rises-35 ti pinta Ig-positiivinen ja < 5-%risesti E-positiivinen.

9 75230

Normaalit ihmisen makrofagit erotettiin yksitumaisesta populaatiosta kiinnittämällä ne polystyreeniin. Tällöin yksitumaiset solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen viljelyväliaineeseen (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES 5 ZJ4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinipropaanisulfonihappo/-puskuria, 200 mM L-glutamiinia ja penisilliinistreptomy-siiniä sekä 20 % kuumentamalla inaktivoitua ihmisen AB-seerumia) solujen määrän ollessa 2 x 10® solua, ja niitä inkuboitiin muovisissa petrimaljoissa (100 x 20 mm), 10 (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon, Exnard, CA) 37°C:ssa yön yli. Petrimaljät pestiin huolellisesti kiinnittymät-tömien solujen poistamiseksi, ja muoviin kiinnittynyt populaatio irrotettiin pesemällä voimakkaasti kylmällä 2,5 mM EDTA:ta sisältävällä liuoksella, jossa ei ollut 15 seerumia, ja silloin tällöin raapimalla petrimaljaa kertakäyttöisen injektioruiskun kumikärjellä. Yli 85 % solu-kannasta pystyi käyttämään ravinnokseen lateksihiukkasia, ja Wright-Giemsa-värjäyksellä niillä havaittiin morfolo-gisesti olevan monosyyttien tunnusmerkit.

20 B. Normaali kateenkorva

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin 25 heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan si-kiöseerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla, ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin Gicoll-Hypaque-sentri-30 fugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat > 95-%:isesti elinkykyisiä ja 90-%:isesti E-rosenttipositiivisia.

C. Solulinjat

Neljästä terveestä yksiköstä saatuja Epstein-Barr-35 viruksella (EBV) transformoituja B-solulinjoja (Laz 007, 75230 10

Laz 156, Laz 256 ja SB) valmistettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla ja T-solulinjat CEM, HJD-1 Laz 191 ja HM1, jotka oli saatu leukemiapotilaista, toimitti tohtori H. Lazarus, Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA.

5 D. T-solujen akuutin lymfobolastileukemian (T-ALL) solut ja T-solujen kroonisen lymfaattisen leukemian (T-CLL) solut

Leukemiasolut saatiin kahdeltatoista akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavalta potilaalta. Näillä 10 yksilöiden solujen oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu olevan T-soluja, koska ne muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (20 % E+) ja koske ne reagoivat T-soluille spesifisten hetero-antiseerumien, anti-HTL (anti-B.K.)- ja A99-antiseeru-15 min kanssa, kuten Schlossman et ai. ovat aikaisemmin kuvanneet, Proc. Nat. Acad. Sei. 73 (1976) 1288. Kolmen yksilön kasvainsolut reagoivat aktiivisesti (THp kaniinin ja/tai hevosen anti-Ti^in kanssa, mutta yhdeksän muun yksilön solut eivät näiden kanssa reagoi-20 neet. Käytettiin myös kahdesta TH^-T-CLL-leukemiaa sairastavasta potilaasta saatuja leukemiasoluja. Sekä akuutin että kroonisen T-solujen leukemian soluja kyl-mäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaa-sissa 10-%:isessa dimetyylisulfoksidissa ja 20-%:isessa 25 ihmisen AB-seerumissa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Analysoidut kasvainpopulaatiot olivat 90-%risesti blasteja Wright-Giemsa-morfologialtaan kaikissa tapauksissa .

Esimerkki 2 30 Solufluorograafinen analyysi ja solujen erotus

Kaikkien solupopulaatioiden solufluorograafinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssime-netelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiinin liitetyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä 35 (G/M FITC) (Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solufluorograafia FC200/4800A (Ortho Instruments). Täi- 11 75230 löin 1-2 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml:lla vasta-ainetta OKT4 laimennuksen ollessa 1:1 000, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC 5 (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograafilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssikorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuus oli saman-10 lainen laimennuksella 1:50 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:lla suhteessa 1:1 000 laimennettua vesivatsanestettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla 15 immunisoidusta Balb/cJ-hiirestä.

Kokeissa, joiden tarkoituksena oli erottaa 0KT4+- ja 0KT4“-solut toisistaan, 100 x 10^ fraktioi-matonta yksitumaista solua tai tymosyyttiä merkittiin 4 ml:11a suhteessa 1:1 000 laimennettua vasta-ainetta 20 OKT4 ja kehitettiin G/M FITC:llä. Samanlaista värjäys-menetelmää käytettiin ihmisen T-solujen preparaoinnissa, jotka oli eristetty esimerkissä IA kuvatulla tavalla. Käyttämällä fluoresenssiaktivointiin perustuvaa solu-lajittelijaa (FACS-1) (Becton-Dickinson, Mountain 25 view, CA) lymfosyytit erotettiin OKT4+- ja OKT4”-po-pulaatioiksi ja/tai T-solut fraktioitiin heikosti reagoiviksi OKTl+-T-soluiksi (fluoresenssi alle 20 %) ja voimakkaasti reagoiviksi OKTl"-T-soluiksi (fluorenssi yli 20 %). Lajien elinkykyisyys oli >95 %. Trypan-si-30 nisellä määritettynä kaikissa tapauksissa. Kaikkien erotettujen populaatioiden puhtausaste oli >95 %.

Esimerkki 3 FACS:lla fraktioitujen OKT4+- ja OKT4--jakeiden analysoimalla hevosen anti-Tl^slla 35 OKT4+-ja OKT4~-solut erotettiin toisistaan FACStlla, ja niitä viljeltiin väliaineessa RPMI 1640 (Grand Island 75230

Biological Company), joka sisälsi 20 % ihmisen AB-seeru-mia, 1 % penisilliinistreptomysiiniä, 200 mM L-glutamii-nia, 25 mM HEPES-puskuria (Microbiolgoical Associates) ja 0,5 % natrimbikarbonaattia, solujen pitoisuus viljel-5 mässä oli 2 x 106 solua/ml. 24 tunnin kuluttua 1-2 x f 10° solua kustakin populaatiosta saatettiin reagoimaan hevosen anti-TI^n kanssa 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, jonka hiilidioksidipitoisuus oli 5 %, ja solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä kaniinissa valmistetul-10 la anti-hevonen-IgG:llä (Cappel Laboratories, Downington, PA) Reinherzin ja Schlossmanin kuvaamalla menetelmällä, J. Immunol. 122 (1979) 1335-1341. Taustavärjäys suoritettiin korvaamalla spesifinen vasta-aine normaalilla hevosen IgG:llä, joka käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla. 15 Esimerkki 4

Solujen toiminnan tutkiminen A. Proliferatiiviset tutkimukset

Fraktioimattomien ja FACS:illa fraktioitujen lym-fasolujen jakaantumiskykyä tutkittiin mikroviljelmässä 20 optimaalisilla ja suboptimaalisilla annoksilla Concanavalin A:ta (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) ja fytohemaglu-tiinia (PHA) (Burroughs-Wellscome Company, Greenville, NC). Alloantigeeninen proliferatiivinen vaste määritettiin samanaikaisesti näille samoille populaatioille käyt-25 täen stimulaattina mitomysiini c:llä käsiteltyä Laz 156:a, EBV:llä transformoitua ihmisen B-lymfablastoidisolulinjaa. Proliferaatio tetanustoksoidin läsnäollessa (Massachusetts Department of Public Health Biological Laboratories,

Boston, MA) testattiin käyttämällä loppukonsentraatio-30 ta 10 yig/ml. Herpes-Zoster-antigeenin toimitti ystävällisesti tohtori John Zaia (Harvard Medical School, Boston, MA), ja sitä käytettiin laimennuksena 1:6. 5 % edellä kuvatulla menetelmällä saatuja makrofageja lisättiin kaikkiin populaatioihin aloitettaessa kasvattaa in vit-35 ro-viljelmiä. Mitogeenilla stimuloituja viljelmiä käsiteltiin neljän päivän kuluttua 0,2 |iCi:lla ^H-tymi- 13 75230 diinia (3H-TdR) (ominaisaktiivisuus 1,9 Ci/mM) (Schwarts-Mann Division of Becton-Dickinson, Orangeburg, NY) ja tuotteet erotettiin 18 tunnin kuluttua MASH II-laitteis-tolla (Microbiological Associates, Bethesda, MD). ^H-5 tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin Packard-tui-kelaskurilla (Packard Instrument Company, Downer's Grove, IL). Taustan ^H-tymidiiniyhdisteen aktiivisuus mitattiin korvaamalla mitogeeni väliaineella. Liukoisella antigeenillä ja allonatigeenilla stimuloidut viljel-

O

10 mät käsiteltiin viiden päivän kuluttua JH-tymidiinillä 18 tunnin ajan, tuotteet erotettiin, ja aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla.

B. Solumyrkyllisyyttä koskevat tutkimukset Soluvälitteiselle lymfolyysille herkistetyt 15 viljelyt suoritettiin lisäämällä mikrotitrauslevyn syvennyksiin fraktioimattomia T-soluja, FACS:illa frak-toituja OKT4+- ja 0KT4~-T-solujakeita tai uudelleen yhdistettyjä OKT4+- ja OKT4“-T-soluja eri suhteissa sekä mitomysiinillä käsiteltyjä stimulaattorisoluja 20 eri solulajien pitoisuuden ollessa 2 x 10^ solua/ml. Viiden päivän kuluttua ei-elinkykyiset solut poistettiin Ficoll-Hypaque-sentrifugoinnilla. Fraktioimatto-mat ja fraktioidut T-solupopulaatiot lisättiin sitten Na25‘*'Cr04:11a merkittyihin kohdesoluihin, ja soluja 25 inkuboitiin kuuden tunnin ajan, minkä jälkeen vapautunut kromi määritettiin. Muissa kokeissa fraktioimat-tomat T-solut herkistettiin mitomysiinillä käsitellyillä stimulaattorisoluilla edellä kuvatulla tavalla, ja soluja inkuboitiin viisi päivää MLCissä, minkä jälkeen 30 ne fraktioitiin FACS:lla OKT4+- ja OKT4--jakeiksi ja vapautunut kromi määritettiin. Solumyrkyllisyys prosentteina laskettiin seuraavan kaavan avulla: kokeessa vapautunut 5^Cr - spontaanisti vapautunut ^Cr kylmäkäsittelyssä vapautunut ^Cr - spontaanisti vapau-35 tunut "^Cr x 100 75230 14 Määritykset suoritettiin kolmesta rinnakkaisnäyt-teestä, ja tulokset ilmoitettiin näiden keskiarvona. Spontaanisti vapautunut ^Cr:n määrä oli kaikissa tapauksissa vähemmän kuin 20 % suurimmasta kokeissa havaitusta 5 vapautuneen kromin määrästä.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri ihmisen normaaleille perifeerisille T-soluille, joiden on annettu reagoida OKT4:n (laimennus 1:1 000) ja G/M FITC:n kanssa.

10 Vertailun vuoksi kuvioissa 1-5 on esitetty saman laisissa olosuhteissa monoklonaalisille vasta-aineille 0KT1 ja OKT3 saadut tulokset.

Kuviossa 2 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri ihmisen tymosyyteille, joiden on 15 annettu reagoida 0KT4:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 3 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri B-solujen kroonista lymfoblastileu-kemiaa sairastavista potilaista saaduille leukemiaso-luille, joiden on annettu reagoida OKT4:n ja G/M FITC:n 20 kanssa.

Kuviossa 4 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri . ihmisen T-solulinjalle HJD-1, jonka on annettu reagoida OKT4:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 5 on esitetty solufluorograafista 25 saatu fluoresenssispektri ihmisen T-solulinjalle CEM, jonka on annettu reagoida OKT4:N ja G/M FITC:N kanssa.

Kuviossa 6 on esitetty tulokset, jotka on saatu annettaessa T-solupopulaatioiden reagoida hevosen anti-Tl^-seerumin kanssa.

30 Kuviosta 7 ilmenee fraktioimattomien T-solujen ja fraktioitujen T-solujakeiden teho solumyrkkynä. Koordi-naatta kuvaa solujen prosenttista spesifistä hajoamista ja abskissa efektori/kohde (EIT)-suhdetta.

Kuten kuviosta 1 ilmenee, noin 45 % normaalin ihmi-35 sen perifeerisistä T-verisoluista reagoi OKT4:n kanssa, mutta samasta yksilöstä eristetyt B-solut, nollasolut ja 75230 makrofagit eivät reagoi lainkaan OKT4:n kanssa. Samanlaiset tulokset saatiin viidestätoista muusta normaalista ihmisestä eristetyille lymfosyyttipopulaatioille. Mono-klonaaliselle vasta-aineelle on siten tunnusomaista, 5 että se reagoi antigeenin kanssa, joka on löydetty 55 %:lta ihmisen terveitä perifeerisiä T-soluja, mutta se ei reagoi kolmen muun mainitun solutyypin minkään pinta-antigeenin kanssa. Kuten myöhemmin mainitaan, OKT4-positiivinen osa ihmisen perifeerisistä T-soluista 10 kuuluu auttaja-T-soluihin. Tätä reaktiivisuuseroa voidaan käyttää kyseisen vasta-aineen OKT4 toteamiseen ja erottamaan se muista vasta-aineista.

Kuviosta 2 ilmenee, että noin 80 % kuuden kuukauden ikäisen lapsen normaaleista tymosyyteistä reagoi 15 0KT4:n kanssa. Samanlaisia tuloksia (80 % aktiivisuus) saatiin käytettäessä kuutta muuta kateenkorvanäytettä, jotka oli saatu normaaleista ihmisistä, joiden ikä vaih-teli kahdesta kuukaudesta 19 vuoteen. Kuvion 2 reaktii-visuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta kyseinen 20 vasta-aine OKT4 ja erottaa se muista vasta-aineista.

Kuviosta 3 ilmenee, että B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden leukemia-solut eivät reagoi käsillä olevan vasta-aineen kanssa.

Esillä olevaa vasta-ainetta 0KT4 voidaan edelleen 25 karakterisoida sen perusteella, miten se reagoi erilaisten ihmisen T-solulinjojen kanssa, tätä on havainnollistettu kuvioissa 4 ja 5. Kuviosta nähdään, että kyseisen antigeenin reaktiivisuus ihmisen T-solulinjojen kanssa vaihteli, solulinja CEM kanssa reaktio oli voi-30 makas, mutta solulinjan HJD-1 kanssa reaktiota ei tapahtunut lainkaan. OKT4 ei reagoinut myöskään solulinjojen Laz 191 ja HM1 kanssa. Tämän erilaisen reaktiivisuuden avulla on myös mahdollista karakterisoida 0KT4.

Kuviossa 6 on esitetty, miten OKT4:llä fraktioidut 35 jakeet reagoivat anti-TH2:n kanssa. NOin 25 % fraktioi-mattomasta T-solupopulaatiosta reagoi anti-TH2:n kanssa.

75230 16

Sitä vastoin OKT4+-populaatio ei sisällä lainkaan anti-TH2:n kanssa reagoivia soluja, kun taas suurin osa OKT4“-populaatiosta on TH2-positiivinen ja kaikki frak-tioimattoman T-solupopulaation TH2+-solut kuuluvat OKT--5 populaatioon. Tämä osoitti, että OKT4+-jakeeseen ei kuulu TH2+-soluja eikä TH2+-jakeeseen OKT4+-soluja ja nämä jakeet ovat siten täysin erillisiä.

Kuviossa 7 on esitetty fraktioimattomien T-solujen, OKT4+-T-solujen ja OKT4~-T-solujen teho solumyrkkyinä.

10 OKT4+-popuolaatio toimii hyvin vähäisessä määrin solumyrkkynä, kun taas OKT4”-populaation soluja tuhoava vaikutus on suurempi kuin fraktioimattoman T-solupopulaation. Kuvioissa 6 ja 7 esitettyjen OKT4+- ja OKT4“-solupopulaa-tioiden erilaisten reaktiivisuuksien avulla on myös mah-15 dollista karakterisoida käsillä oleva vasta-aine.

Kuvioiden 1-5 esittämät tulokset on koottu taulukkoon I, jossa on myös muutamia lisätietoja. Taulukossa on verrattu OKTl-, OKT3- ja 0KT4-hybridomien tuottamia mono-klonaalisia vasta-aineita (näistä viimeinen on kuvattu 20 esillä olevassa hakemuksessa). Kuvioissa 1-5 esitettyjen tulosten lisäksi taulukosta I havaitaan myös, että OKT4 ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa eikä myöskään T-so-lujen ja nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sai-25 rastavien potilaiden leukemiasolujen eikä EBV:llä transformoitujen B-solulinjojen kanssa. Päinvastoin kuin OKTl, 0KT4 ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolujen kanssa.

Solujen toimintaa koskevat tutkimukset suoritet-30 tiin imusolupopulaatioilla, jotka oli fraktioitu fluore-senssiaktivointiin perustuvalla solulajittelijalla (FACS). Näiden tutkimusten tulokset on esitetty taulukoissa II, III ja IV, ja tulokset tukevat edelleen käsillä olevan monoklonaalisen vasta-aineen edellä esitettyjä 35 karakterisointituloksia.

17 75230 Näissä tutkimuksissa fraktioimaton T-solupopulaa-tio käsiteltiin OKT4:llä (laimennus 1:1000) ja G/M FITCrllä ja fraktioitiin FACS:illa OKT4+- ja OKT4“-jakeiksi. Näihin fraktioituihin populaatioihin lisättiin 5 5 % makrofageja (populaatioiden puhtausaste, joka oli yhtä suuri tai suurempi kuin 95 %, otettiin huomioon) ennen in vitro-viljelyä. Fraktioimattomaan T-solupopu-laatioon ja eristettyihin OKT4+- ja QKT4 - ala jakeisiin lisättiin stimulaattoriksi PHA:ta, Con A:ta, liukoisia an-10 tigeeneja ja allonantigeenejä populaatioiden prolifera- tiivisten vasteiden määrittämiseksi in vitro-olosuhteissa.

Fraktioimattomien T-solupopulaatioiden prolife-ratiivinen vaste PHAin ja Con A:n läsnäollessa ilmenee taulukosta II. Fraktioimattoman T-solupopulaation proli-15 feratiivinen vaste on maksimaalinen käytettäessä 1 pg PHA:ta 10^ solua kohti, käytettäessä 0,5 pg tai 0,1 pg PHA:ta 10^ solua kohti vaste pieneni. Käsiteltäessä frak-tioimattomia T-soluja OKT4:llä ja vuohi-hiiri-FITC:llä proliferatiivinen vaste pysyi samana. Eristetyt OKT4+-20 ja OKT4“-T-alajakeet käyttäytyivät sen sijaan PHA:n läsnäollessa eri tavalla. OKT4+-solupopulaatio käyttäytyi kaikilla käytetyillä PHA:n annoksilla samalla tavalla kuin fraktioimaton T-solupopulaatio. OKT4“-solujen proliferatiivinen vaste oli sen sijaan huomattavasti pie-25 nempi kaikilla tutkituilla PHA:n annoksilla. Lisäksi havaittiin, että PHA:n annoksen ollessa 0,1 pg 10^ solua kohti OKT4“-T-solut eivät lisääntyneet lainkaan, kun taas OKT4+-T-solujae ja fraktioimattomat solut vielä lisääntyivät. Toisaalta näiden jakeiden proliferatiivi-30 nen vaste Con A:n läsnäollessa oli samanlainen, joten tällöin näitä kahta solujaetta ei pystytty erottamaan toisistaan tai fraktioimattomasta T-solupopulaatiosta.

Seuraavaksi tutkittiin proliferatiivista vastetta alloantigeenin läsnäollessa MLCtssä sekä liukois-35 ten antigeenien läsnäollessa. Taulukosta III ilmenee, että Laz 156:n läsnäollessa MLC:ssä fraktioimattoman 18 75230 T-solupopulaation, 0KT4:llä ja G/M FITCrllä käsitellyn fraktitoimattoman T-solupopulaation ja sekä OKT4+- että OKT4“-T-solualajakeiden vaste oli samanlainen. On kuitenkin huomattava, että tutkituista kuudesta yksilöstä 5 kahden OKT4--solut sitoivat vähemmän ^H-TdR-yhdistettä kuin vastaava OKT4+-jae (tuloksia ei ole esitetty), vaikka ne lisääntyvät runsaasti MLC:ssä. Nämä kaksi solujaet-ta erosivat kuitenkin selvemmin toisistaan tutkittaessa niiden proliferatiivista vastetta liukoisten antigeenien 10 läsnäollessa. Kaikissa tutkituissa tapauksissa OKT+-T-solujae lisääntyi runsaasti liukoisten antigeenien, te-tanus-toksoidin ja Herpes-Zosterin läsnäollessa, kun taas OKT“-T-solujae ei lisääntynyt käytännöllisesti katsoen lainkaan.

15 Taulukosta IV ilmenee, että OKT4”-T-solujae ei aiheuta juuri lainkaan solujen hajoamista, kun se herkistetään sellaisenaan MLC:ssä. Vaikka OKT4~-T-soluista tuli tällöin solumyrkkyjä/efektoreita fraktioimattomassa allo-herkistetyssä T-solupopulaatiossa, ne eivät sellaisenaan 20 pystyneet toimimaan välittäjinä CML:ssä. Kun OKT4+-popu-laatio herkistettiin MLC:ssä ilman OKT4“-T-soluja, ne aiheuttivat kohtalaista, mutta kuitenkin huomattavaa solujen hajoamista MLC:ssä. 0KT4+- ja OKT4“-T-solujen uudelleen yhdistetty seos sen sijaan aiheutti kaikkein eni-25 ten solujen hajoamista, kuten myös fraktioimaton T-solu-populaatio. Nämä havainnot osoittavat, että OKT4”-alajae ei sellaisenaan toimi tehokkaimmalla mahdollisella tavalla solumyrkkynä, vaan tähän vaaditaan myös OKT4+-populaatiota. Tämä T-T-vuorovaikutus on analoginen sen T-T-vuorovaiku-30 tuksen kanssa, jota esiintyy TH2_-T-solujakeen ja TH2+-T-solujakeen välillä näiden toimiessa tehokkaimmalla mahdollisella tavalla solumyrkkynä.

Kyseisen vasta-aineen 0KT4 havaittiin kuuluvan IgG2-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä ala-35 luokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle 19 75230 antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla 5 on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG^, IgG2a, IgG2b tai IgG3 tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyy-teen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine 10 reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää tyyppiä II olevan agammaglobulinemian toteamiseen antamalla vasta-aineen reagoida potilaan T-solunäytteen kanssa.

15 Jos perifeeristen T-solujen kokonaispopulaatiosta vähemmän kuin 55 % reagoi OKT4:n kanssa, auttaja-T-soluja esiintyy liian vähän tai ns. puuttuvat kokonaan. Tätä koetta voidaan käyttää myös yleisesti auttaja-T-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseen. Diagnostiset koos-20 tumukset, jotka sisältävät diagnostisesti vaikuttavia määriä OKT4-vasta-ainetta sekoitettuna diagnostisesti hyväksyttäviin kantaja-aineisiin, kuuluvat myös esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

752 30 20

Taulukko I

Monoklonaallsten vasta-aineiden reaktiivisuus ja ominaisuudet Reaktiivisuus prosentteina 5 seuraavien solutyyppien kanssa: CKTl OKT3 CKT4

Perifeeriset T-solut (10 näytettä) 95 % 95 % 55 %

Perifeeriset B-solut (10 näytettä) 2 % 2 % 2 %

Perifeeriset nollasolut (10 näytettä) 2 % 2 % 2 %

Tymosyytit x (8 näytettä) 5-1Q % 5-10 % 80 % 10

Reaktiivisuus seuraavien solujen ja soluiinjojen kanssa: T-solujen krooninen lymfaattlnen leukemia (3 tapausta) + + (l);-(2) T-solujen akuutti lymfaattinen leukemia (8 tapausta) - - - 1 5

Nollasolujen akuutti lymfaattinen leukemia (15 tapausta) - B-solujen krooninen lymfaattinen leukemia (6 tapausta) +(4);-(2) - - B-solulinjat+ (4) - - - 20 T-solulinjat + HJI>-1 + (+) CEM Ψ · +

Laz 191 + HM1 +

IgG-alaluokka IgG, IgG, IgG_ 25 Komplementin sitomiskyky + + 1

Saatu potilailta, joiden ikä vaihteli 2 kuukaudesta 18 vuoteen.

+ Saatu tohtori H. Lazarukselta, Sidney Farber Cancer Center. 30 B-solulinjat Laz 256, 156, 007 ja SB saatu transformoimalla Epstein-Barr-viruksella ihmisen perifeerisiä B-soluja, ja T-solulinjat HJD-1, CEM, Laz 191 ja HMl saatu leukemiaa sairastavista potilaista.

2i 75230 o- CM η σν 2 2 ® -4 [1 in « η jj Ο ® ® Ο ” +ι +1 +1 +' 1' +ι +'

a V ^ uo μ £ 2 2 S

£ S S 1" sss1 2 S m n 2 S “ •h o CM r1 00 »n O ^

H

4-> « +> ro ro r~ 22 S °°

1-1 3·Μ·ΟΓ- r+OO'H

l|_) r-| o ® ® VÖ O<-l

ro m 1 «N <T> 'T

r—1 I cH

0) ^ +1 +1 +' . +l +l +l +l e +O< ro cn ® o ro cr\ r- 3 EH 5 o σν ® o £ ® ft \o cm σ> m o γλ r-i ιΰ ° σ>ΐΠΜ· 22 2 5 o -+ 2 .

U3 rH

(0 > « * zi ti 3 «3 in ro ro ® ° 2 ^ $ UO vo VD in ™ r1 00 ^ h” uocn Z 1 ^ 2 S 4J 11+1 +1 +' ·1·' +l ** o O m r- ® r1 c- -H S CM 2 U0 ro £ «I.

•^ .+0) f- 1 ro r+ VO ro

a ·«. ίί mP'-M· CM <N «N

g jS S» S Docvm co 5i ^

to co S

•m >

-G -li co vo r- -g· m fN

«S 3 ® ® ^ £ 1—, G o uo ro ro cd «-i 5 'g ro ro ^ ® « 0 ® . <-i

is <U

1 D- +I +» +1 +· ♦· +1+1 H -8 3 vo «n m O ® 2 2 CJ -hR f^00 r-i r+lNP'® § E o ® O CM ror-®

m g c ? CD®11 ‘’'SS

H§0)^ OVM 2S

i) Tj r-l <-l

O +i -H

Λί «e a» i . v M g λ; o \ ^ .

3 .5 id -H vo· Cp O' i iH q-i-i+J-H o S \ ___ 3 5 ^2

3 -H 3 ra +j ^ θ' σ' rt « in 1. Ϊ S

15 2 O 2 C m ^ ^ <0 S 3 rl « o « >

S ? J1 5 2. s -3 - % s J

- S I i s 2 8 28 <S «§ <8 3 | ä S ä§ XO ίο oo 0°O O o £ 9

' O, H CU .r-l U-H UrU UH > 4J

22 75230 :nj oo tn σι n in ro in oo

C in vo in rt σ> IN IN

U] IN Ή Γ~ :<d +»

rH 3 «n "T

I—( c o +1+1 +1 +1 ♦» +1 +' +1 (1) » I n- m co vo n vo cv rt c ft oo «h oo o oo o vo n C m I Oin.-H.-t N· IN rt ® QJ » ^ ti tn ^ r» r- 3 -H E+ vo vo M £ « ^ -g C °

° O

4J_2 +J VO 00 00 O rt rt CV rt ,* [j g. ΓΪ TJ> O rl VO rt O Ν' id r H n m vo ro ov vo P ^ 0 «w_, m nrotc n· ^ •rv 1 «β Et rl r | +1 +i +1 *1 +1 +' +1 +· fH +

QjO) rt o vn O in rt rt oo 4) '"2 ch vo vo cd m *-t in in σν gr w ovor-rt vo in σ in

H ^ O

rj o oi m Γ' r- in I Cn r- ri m ov rt in R» 'm r.

P £ »J

01 5 rl

Id 10 rl -P

>3 “5

Qj rr » r*1 ,5 -P E+ra o «β· m m +r m vo r* ,_|ΙΛ I n rt o r-ι m n· m m φ -H &tE+ vo in rv rt vo σ (0 ® rt ·* g+J r~ CO ir ^ VO rt rt 'Jj ·Η ^ ^ -M +1 +1 +1 +1 +i +i +i β H h 4l n H oi -It h rr r~ cd ^ tn eneooo

rt -P ^.it^oo-evr-rtj, cn m ao IN

,4J » E-I W β) O

o Id xa O O' ci O £2 CD 00 IN

C > S3 £ N· π rr «voniN

o — -H

e c B a) id ζ •η ·Η > r-H vo rt oo in vo n r- m m rt vo p- o in vo o r- n·

+J Ot IN IN N· O VO

3 Id rl Vt VO m m rt f*l

0 <D

m m +1+1 +1 +1 +1 +1 *· ♦»

1 -H 4J

(L ,—I T, tt vo vo m η σ'

ο N· rt vo vo m IN VO

c t3 O m o N· rt IN oo vo n £ ^ a « oeor- r^voo

H EC! Eh mriN1 lOrtfN

0 <D " Ο -P Ό -rt rt

-P -rl .0 «Q

2 Id d) I rt rt 3 1-¾ 2 0 u 0 u rl -P Ό Ή »Si « ΛΙ

3 O nnJ+J H

td rt3Wid+J O S Om E-t-Priwnj+J +j 2 4-> n e I ° r I S »

tdWrtdJld E tN -. fc VN

UlrltHrl VOWlS VOOTI^J

ft s i s l S 5 2 i S 3 2 -P NPU^ ΛΜ 5 S. X 5 JHS> 23 752 30 ·—( σ* r~ η

ΐή rH Π VO ΓΗ ΙΟ S

P 'P ·Η <-( Η 03 ΓΜ -Η C Μ * 3 3 ^ en η -* ·* [0 'ο 'ΓΊ ιη ο οο ή vj^ £ * ™ ™ ™ ^ " 3 e

(U 3 -H

S u> ö 5 -x tn 30 0 +J -rl T3 ? h 2 . . 3 S Τ!| i «r m *3· -t "rt01 vnl ^ -n r-, 4J ao

g rH 4J

1 * | fi •2 ^ _ + I * rH ® .. O -q tO VO CO ij·^

H S |0 TT Ό· fN TT Tv -J

>1 « Irsi a 1 · g bL Q δ e * c 5 tn tu 7! .· « a « % -° -h

g 3 « O

g to m

® I -H tH «H

tn to P

^ \ JX P -I

Ό m 3 C

g « 0) t0 B a to tn -ή to o tn 2 p p a> Λί a tu 2 to tn +» 6 tn -h jc ,. tn S 3 P äo ie tn

2 -H MO

® Ή -rl Tb >t ·· m to 4->

5 - * >C P

p u tu 3 h + «#> e · p w + tu to tn p - a -P o ti tn ή tö +>4J 3 e» - 3 tn Ό > 3 3 S rH · -H -H £ p rH -H \ o C tö O O >1 p OOO tn -h r—t in ή

O ;nj tn tn I 3 Ή I P

5« 11 + E-t .X P B «J I

►^>0) E4 ft I (U to-M· . 1 I · Ό· · I P P C P E-t M e-< j p p gt p ί* a .e <u 3 *

o S lO tö tt 3 P frt g 3 P CU O

HEhu g g o -H 3 * <U tn ε o 3 8 o o p o e 1 =o a to 5 tu p P in o «HP-r-i H P >, 4JP>i ltntO P \ p tö 'Π P -PO tOlOPE-tl-c*» aw=3tn + 3 ·· P P g g P | E-· g M H1 fi g <U P P P <U II · t0 :«} P Et M «ο u id 00P1++ es p p 3 sx tn tn to -«H -h -h tj· · ri 1/1 u o

rH -H <—l P P tn El ε-l E-t tn -H P P

M3 MM 30 US « « M M M II

r~ U Cu 10 tO M O O O Il P Ut P

lOtUOPP «3 0)3 + jjsaaa + .x rn p +

Claims (2)

75230 24

1. Diagnostinen menetelmä potilaan auttaja-T-solujen ylimäärän tai puutteen toteamiseksi, esimerkiksi auttaja-T- 5 solujen puutteen toteamiseksi, joka aiheutuu tyyppiä II olevasta agammaglobulinemiasta, tunnettu siitä, että potilaan T-solunäytteen annetaan reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 10 8002 , ja joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, joita on noin 55 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen

15 B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaalia tymo-syyttejä, c) ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileuke-miaa, B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, T-solujen 20 akuuttia lymfoblastileukemiaa tai nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi ihmisen T-solulinjan CEM kanssa, mutta ei reagoi ihmisen T-solulinjojen HJD-1, Laz 191 eikä HM1 kans- 25 sa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa, f) reagoi noin 55 %:n kanssa Rhesus-apinan perifee- 30 risiä T-soluja, g) sitoo komplementin, ja h) määrittelee T-solupopulaation (OKT4+), joka ei reagoi anti-TI^-seerumin kanssa ja jonka solumyrkyllisyys on erittäin vähäinen, 35 ja määritetään, kuinka suuri osa perifeeristen T-solujen kokonaispopulaatiosta reagoi mainitun vasta-aineen kanssa.

2. Diagnostinen koostumus auttaja-T-solujen puutteen 752 30 25 toteamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää aut-taja-T-solujen puutteen toteamiseen tarvittavan määrän mo-noklonaalista vasta-ainetta sekoitettuna diagnostisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen, jota vasta-ainetta tuottaa 5 hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 8002, ja joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen auttaja-T-solujen kanssa, joita on noin 55 % kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-so- 10 luista, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymo-syyttejä, c) ei reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileuke- 15 miaa, B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa, T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa tai nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi ihmisen T-solulinjan CEM kanssa, mutta ei 20 reagoi ihmisen T-solulinjojen HJD-1, Laz 191 eikä HM1 kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa, 25 f) reagoi noin 55 %:n kanssa Rhesus-apinan perifee risiä T-soluja, g) sitoo komplementin, ja h) määrittelee T-solupopulaation (OKT4+), joka ei reagoi anti-Tf^-seerumin kanssa ja jonka solumyrkyllisyys 30 on erittäin vähäinen. 75230 26