FI75598B - Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en maensklig tymocytantigen medelst en ny hybridcellinje. - Google Patents

Description

1 75598

Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen tymosyyttiantigeenille uuden hybridisolulinjän avulla 5 Keksintö kohdistuu menetelmään monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi pinta-antigeenille, joka on löydetty noin 70 %:lta ihmisen normaaleja tymosyytte-jä. Menetelmässä käytetään hyväksi uutta hybridisolulin-jaa. Vasta-ainetta voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoi-10 tuksiin.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin /Nature 256 (1975) 495-49/7» jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulin-15 ja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: 20 Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphocyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et ai., Cell 14 (toukokuu 1978) 9-20; P. Parham. jaW.F. Bodmer, 25 Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2, toimittaja D.M. Wier, Black-well 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineers News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja 30 esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybridomaa siinä on-35 nistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa 75598 vasta-ainetta tai että noin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hybridoman eristämisessä käytetystä selektiotekniikasta.

5 Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigee neille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen 10 lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyytti-leukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä hybri-domeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille 15 spesifistä vasta-ainetta.

Äskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvattu sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jotka tuottavat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta. Katso esim. Reinherz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 20 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei., 76, 4061-4065 (1979); ja Rung, P.C., et ai., Science, 206, 347-349 (1979).

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä 25 toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista. Ka-teenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymo-syyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. 30 Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka 35 T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee li 75598 eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immuuni-järjestelmän toiminnoissa säätelevästi. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

5 Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin ole viin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kanta-soluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa 10 elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluik-15 si, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktioita tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 20 145 (1977) 221-232 ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja O. Stut-man, Plenum Press 1977, vol. 7, 363-379.

25 Eri T-solulajien tai alalajien identifiointi tai nii den heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregulatoristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvain-muotojen taudinkuva on erilainen sen mukaan, ovatko ne läh-30 töisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää täytyy pystyä erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological 35 Diagnosis of Leukemias and Lynphomas", toimittajat S. Thier-felder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

75598

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa tautitiloissa ja agammaglobulinemiassa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-5 T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobulinemiassa tiettyjä "heikentäjä”-T-soluja esiintyy ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Joissakin leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimää-10 rin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan tai määrittämään, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin. Katso esimerkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", 15 teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20, Springer-Verlag 1977, 17-23 ja julkaisun sisältämät viitteet sekä E.L. Reinberg et ai., J. Clin. Invest. 64 (1979) 392-397.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immunoglo-20 buliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä.

Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu, koska heikentäjä-T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-ai-25 neen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan näiden B-solujen toimintaa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobuliinin tuotantoa tai keskeyttää tuotannon kokonaan. Agammaglobulinemiatyyppi voidaan siten 30 määrittää sen perusteella, esiintyykö heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa auto-immuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin 35 esiintyvälle T-solulajille, vasta-aineet voivat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-solu- tl 5 75598 syöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvaimia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle auttaja-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista tautia, joka aiheutuu 5 auttaja-solujen ylimäärästä, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja (esim. pahanlaatuisia tautitiloja tai tyyppiä I olevaa agammaglobulinemiaa), jotka aiheutuvat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle vasta-ainetta, joka on spesifinen heiken-10 täjä-T-soluantigeenille.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-so-luihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG) , ovat osoittautunut terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Kos-15 ka T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimisme-kanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai, "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver 20 Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerume-25 ja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T- soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla ei-al-logeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien val-30 mistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdis-tusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-so-35 luilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen, jotka vaikuttavat useisiin antigeenilajeihin, joi- 6 75598 ta on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista.

Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallises-5 ti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spe-sifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10®.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mai-10 nittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-leh-dessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT 6), joka pystyy 15 tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta antigeenille, jota on löydetty noin 70 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyt-tejä, mutta ei ihmisen normaaleista perifeerisistä lymfoidi-soluista (T-solut, B-solut tai nollasolut) eikä luuydinso-luista. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdel-20 le ainoalle ihmisen normaalien T-solujen pinta-antigeeni- determinantille, jota esiintyy noin 70 %:lla ihmisen normaaleja tymosyyttejä, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaista immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisäl-25 tävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen tymosyytin antigeenille) . Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-ai-30 neen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

35 Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuottamas ta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä

II

7 75598 "OKT 6", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on talletettu 21.11.1979 laitokseen "The American Type Culture Collection", 21301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on 5 annettu ATCC-talletusnumero CRL 8020.

Vasta-aineelle OKT6 on tunnusomaista, että se a) reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja ty-mosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen 10 T-solujen, B-solujen, nollasolujen eikä luuydinsolujen kanssa, b) reagoi noin 65 %:n kanssa käsittelemättömiä tymo-syyttejä, 10 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybridiso- 15 lulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8002, ja komplementilla, 82 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybridi-solulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8001, ja komplementilla sekä 13 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsi-20 telty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybri-disolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8014 ja komplementilla, c) reagoi vaiheen II T-ALL-solujen kanssa, mutta ei reagoi vaiheen I tai vaiheen III T-ALL-solujen kanssa, 25 d) reagoi solulinjojen CEM ja MOLT-4 kanssa, mutta ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja e) määrittelee T-solupopulaation (OKT6+), jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä ja 30 normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elinsiirrossa ja joka puuttuu täydellisesti myasthenia graviksessa, akuutissa mononukleoosi-infektiossa, kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa.

Vasta-aineen OKT6 valmistus hybridisolulinjän ATCC 35 CRL 8020 avulla on kuvattu patenttivaatimuksissa 1 ja 2.

Hybridoma valmistettiin pääpiirteittäin Milsteinin 8 75598 ja Kohlerin esittämällä menetelmällä. Tässä immunisoitiin ensin hiiriä normaaleilla ihmisen tymosyyteillä ja sen jälkeen immunisoitujen hiirien pernasolut yhdistettiin hiiren myeloomasolulinjan soluihin, ja viljelmän pinta-5 nesteestä seulottiin ne hybridomat, jotka tuottivat ihmisen normaaleihin E-rosettipositiivisiin T-soluihin ja/ tai tymosyytteihin selektiivisesti sitoutuvaa vasta-ainetta. Halutut hybridomat kloonattiin ja karakterisoitiin. Tulokseksi saatiin hybridoma, joka tuottaa vasta-10 ainetta (OKT6) antigeenille, jota oli löydetty noin 70 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä. Tämä vasta-aine reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyytte jä, mutta se ei reagoi veren normaalien perifeeristen lymfoidisolujen eikä luuydinsolujen kanssa.

15 Otettaessa huomioon tähän asti esiintyneet vaikeudet ja huonot tulokset käytettäessä pahanlaatuisten tautien solulinjoja antigeeninä, on yllättävää, että esillä olevalla menetelmällä saatiin aikaan haluttu hybridoma. On korostettava, että hybridisolujen valmistuksessa esiinty-20 vien arvaamatomien tekijöiden vuoksi ei pystytä tietyllä antigeeni/solu-yhdistelmällä saatujen tulosten perusteella ennustamaan jonkin muun antigeeni/solu-yhdistelmän käyttäytymistä. On nimittäin havaittu, että käytettäessä antigeeninä pahanlaatuisen taudin T-solulinjoja tai solun pin-25 naita eristettyjä puhdistettuja antigeenejä, ei yleensä ole saatu onnistuneita tuloksia.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus ja karakterisointi on tarkemmin selostettu keksinnön kuvauksessa ja esimerkeissä.

30 Hybridoman valmistusmenetelmä koostuu pääpiirteittäin seuraavista vaiheista: A. Hiiriä immunisoidaan normaaleilla ihmisen tymosyyteillä. Yleensä naaraspuoliset CAF^-hiiret on havaittu tähän parhaiten soveltuviksi, mutta myös muiden hiirikanto-35 jen käyttöä voidaan ajatella. Immunisointiaikataulun ja ja T-solupitoisuuden pitäisi olla sellainen, että saadaan

II

9 75598 käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä spleno- 7 syyttejä. Kolme immunisointia 2 x 10 solulla/hiiri/-ruiske 0,2 mlsssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein on havaittu tehokkaaksi.

5 B. Pernat poistetaan immunisoiduista hiiristä, ja valmistetaan pernasuspensio sopivaan väliaineeseen. Sopiva väliainemäärä on yksi millilitra yhtä pernaa kohti. Nämä koemenetelmät ovat sinänsä tunnettuja.

C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään sopivasta so-10 lulinjasta saatuihin hiiren myeloomasoluihin sopivan katalysaattorin avulla. Edullinen suhde on noin viisi pernaso- 8 lua yhtä myeloomasolua kohti. Noin 10 splenosyytille sopiva yhdistämiseen käytetyn väliaineen kokonaistilavuus on noin 0,5 - 1,0 ml. Monet hiiren myeloomasolulinjät ovat 15 tunnettuja ja saatavissa yleensä akateemisista tutkimuslaitoksista tai erilaisista talletuspankeista, esimerkkinä mainittakoon the Salk Institute Cell Distribution Center,

La Jolla, Ca. Käytetyn solulinjan pitäisi edullisesti kuulua ns. lääkeaineille vastutuskykyiseen lajiin, jotta mye-20 loomasolut eivät eläisi selektiivisessä väliaineessa, jossa hybridisolut puolestaan elävät. Yleisimpään lajiin kuuluvat 8-atsaguaniinille vastustuskykyiset solulinjat, joista puuttuu hypoksantiiniguaniinifosforibosyyli-transferaa-sientsyymi, ja täten tämä laji ei kasva HAT-väliaineessa 25 (sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä).

On myös yleensä edullista, että käytetty myeloomasolulinja kuuluisi ns. "ei-erittävään" lajiin, jolloin se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, mutta myös vasta-aineita tuottavia lajeja voidaan käyttää. Kuitenkin eräissä tapauksis-30 sa vasta-aineita tuottavat myeloomasolulinjät voivat olla edullisia. Edullinen solujen yhdistämiseen käytettävä katalysaattori on polyetyleeniglykoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 1 000 - 4 000 (kaupallisesti saatavissa nimikkeellä PEG 100 jne.), mutta myös muita sinänsä tun-35 nettuja yhdistämiskatalysaattoreita voidaan käyttää.

D. Vapaiden pernasolujen, vapaiden myeloomasolujen, 10 755 9 8 ja yhdistettyjen solujen seos laimennetaan, ja laimennuksia viljellään erillisillä alustoilla selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut kuolevat noin yhdessä viikossa. Laimennus voi olla ns. rajaava laimennus, 5 jossa laimennukseen käytetyn nesteen tilavuus on tilastollisesti laskettu niin, että pystytään eristämään haluttu määrä soluja (esim. 1-4) kullekin erilliselle alustalle (esim. mikrotitrauslevyn kuhunkin syvennykseen). Väliaineena käytetään esim. HAT-väliainetta, jossa lääkeaineille 10 (esim. 8-atsaguaniinille) vastustuskykyinen vapaa myeloo-masolulinja tuhoutuu. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niiden lisääntymiskyky on rajattu. Täten tietyn ajan kuluttua (noin yhdessä viikossa) vapaiden pernasolujen lisääntyminen lakkaa. Yhdistetyt solut sen si-15 jaan lisääntyvät jatkuvasti, koska ne ovat toisaalta peräisin myeloomasoluista, jotka on eristetty pahanlaatuisesta kasvaimesta ja toisaalta pernasoluista, jotka pystyvät elämään selektiivisessä väliaineessa.

E. Tarkastetaan, löytyykö eri kasvatusalustojen pin-20 tanesteestä, joka sisältää hybridoman, E-rosettipositiivi- sille puhdistetuille ihmisen T-soluille tai tymosyyteille spesifistä vasta-ainetta.

F. Valitaan (esim. rajäävällä laimennuksella) ja kloonataan hybridomat, jotka tuottavat haluttua vasta-ai- 25 netta.

Kun haluttu hybridoma on valittu ja kloonattu, muodostuvaa vasta-ainetta voidaan tuottaa kahdella eri tavalla. Puhtainta monoklonaalista vasta-ainetta saadaan viljelemällä haluttua hybridomaa in vitro sopivassa väliaineessa so-30 pivan pituisen ajan, minkä jälkeen haluttu vasta-aine otetaan talteen pintanesteestä. Sopiva väliaine ja viljely-ajan pituus ovat tunnettuja tai ne voidaan helposti määrittää. Tämä in vitro -menetelmä tuottaa käytännöllisesti katsoen monospesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka ei 35 sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia spesifisiä immunoglobuliineja. Muita immunoglobu-

II

11 755 9 8 liineja on mukana pieni määrä, koska väliaine sisältää ksenogeenistä seerumia (esim. vasikan sikiöseerumia). Tällä in vitro -menetelmällä ei kuitenkaan saada tiettyihin tarkoituksiin riittävää vasta-ainemäärää tai riittävän 5 suurta vasta-ainepitoisuutta, koska monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuus on vain noin 50 yug/ml.

Haluttaessa valmistaa paljon suurempia pitoisuuksia hieman epäpuhtaampaa monoklonaalista vasta-ainetta, haluttu hybridoma voidaan ruiskuttaa hiiriin, edullisesti syn-10 geenisiin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen hiiriin sopivan inkubaatioajän kuluttua, mikä johtaa halutun vasta-aineen pitoisuuden kohoamiseen hiiren veressä (noin 5-20 mg/1) ja peritoneaalisessatulehdusnesteessä (vesivat-15 sa). Vaikka näiden hiirten veressä ja vesivatsassa on myös tavallisia vasta-aineita, näiden pitoisuus on vain noin 5 % monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuudesta. Koska sitä paitsi nämä tavalliset vasta-aineet eivät ole ihmisen vastaisia spesifisyydeltään, eristetyistä vesivatsoista ja 20 seerumista saatu monoklonaalinen vasta-aine ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan kontaminoivia ihmisen vastaisia immunoglobuliineja. Tämän monoklonaalisen vasta-aineen tiitteri on korkea (aktiivinen laimennuksissa 1:50 000 ja myös suuremmissa laimennuksisa), ja sen spe-25 sifisen ja ei-spesifisen immunoglobuliinin suhde on korkea (noin 1/20). Sellaiset muodostuneet immunoglobuliinit, joiden rakenteessa on kevyitä K-myeloomaketjuja, ovat ei-spesifisiä, ei-vaikuttavia peptidejä, jotka pelkästään laimentavat monoklonaalista vasta-ainetta vaikuttamatta 30 haitallisesti sen spesifisyyteen.

Esimerkki 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus A. Immunisointi ja somaattinen solujen hybridisointi Naaraspuolisia CAF^-hiiriä (Jackson Laboratories, 35 hiirien ikä 6-8 viikkoa) immunoitiin intraperitoneaalises-ti 2 x 10^:llä ihmisen tymosyytillä 0,2 ml:ssa fosfaatilla 12 75598 puskuroitua suolaliuosta 14 päivän välein. Neljän päivän kuluttua kolmannesta immunisointikerrasta hiiristä poistettiin pernat, ja näistä valmistettiin yhtä solulaatua sisältävä suspensio puristamalla kudos ruostumattomasta 5 teräksestä valmistetun seulan lävitse.

Solujen yhdistäminen suoritettiin Kohlerin ja Mil- g steinin kehittämällä menetelmällä. 1 x 10 splenosyyttiä yhdistettiin 0,5 ml:ssa yhdistämisväliainetta, joka koostui 35 %:sta polyetyleeniglykolia (PEG 1000) ja 2 %:sta 10 dimetyylisulfoksidia RPMI-1640 väliaineessa (Gibco, Grand 7

Island, NY), 2 x 10 P3X63AgUi-myeloomasoluun, jotka toimitti tohtori M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Nämä myeloomasolut erittävät IgG^rn K-kevyitä ketjuja.

15 B. Hybridoman valinta ja kasvatus

Kun solut oli yhdistetty, niitä viljeltiin HAT-väli-aineessa (sisälsi hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymi-diiniä) 37°C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä kosteassa atmosfäärissä. Useita viikkoja myöhemmin 40-100 jil viljel-20 mien hybridomapitoista pintaliuosta siirrettiin alustalle, joka sisälsi 10^ perifeeristä lymfosyyttiä, jotka oli jaettu E-rosettipositiivisiin (E+) ja E-rosettinegatiivisiin (E ) populaatioihin, nämä oli valmistettu terveiden luovuttajien verestä Mendesin kuvaamalla menetelmällä {J5. Immu-25 nol. 111 (1973) 86Q7· Näihin soluihin sitoutuneet hiiren hybridoman tuottamat vasta-aineet todettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetelmällä. Viljelmien pintaliuoksissa inkuboidut solut värjättiin fluoresiinilla käsitellyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Me-30 loy Laboratories, Springfield, VA, F/p =2,5) ja fluoresoivat vasta-aineella värjätyt solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla FC200/4800A (Ortho Instruments, Westwood, MA) esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Hybridoma-viljelmät, jotka sisälsivät spesifisesti E -lymfosyyttien 35 (T-solujen) ja/tai tymosyyttien kanssa reagoivia vasta- aineita, valittiin ja kloonattiin kahdesti rajäävällä lai-mennusmenetelmällä syöjäsolujen läsnäollessa. Sen jälkeen kloonit siirrettiin intraperitoneaalisesti ruiskuttamalla

II

7 13 755 98 1 x 10 tietyn kloonin solua (0,2 ml:n tilavuudessa) CAF^-hiireen, joka oli esikäsitelty 2,6,10,14-tetrametyylipenta-dekaanilla, jota toimittaa Aldrich Chemical Company kauppanimellä "Pristine". Näiden hiirien pahanlaatuisia vesivatso-5 ja käytettiin sen jälkeen lymfosyyttien karakterisoimiseen esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Hybridivasta-aineen OKT6 todettiin standardimenetelmillä kuuluvan IgG^-alaluokkaan.

Esimerkki 2 OKT 6-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi 10 A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen

Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointimene-telmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH), Boymin 15 esittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotet tiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig“ (T- ja nollasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F (ab ’) 2-pylväskro-matografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet 20 Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974). T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig~-kanta 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH4Cl:lla (10 ml 10® so-25 lua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2-%risesti EAC-rosettipositiivinen ja >95-%:isesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muo-dostamaton Ig~ (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-ra-japinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5-%:isesti 30 E-positiivinen ja £2-%:isesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%risesti pinta Ig-posi-tiivinen ja <5-%:isesti E-positiivinen.

35 Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin terveiden vapaaehtoisten luovuttajien taaemmasta suoliluunharjusta punktiomenetelmallä.

75598 14 B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateen-5 korvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiöseeru-mia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi so-10 lut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja £90-%:isesti E-rosettipositii-visia.

C. T-solulinjat ja T-solujen akuutin lymfoblastileu-15 kemian solut T-solulinjat CEM, HSB-2 ja MOLT-4 toimitti tohtori H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukemiasolut saatiin 25:Itä akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavalta potilaalta. Näiden yksittäisten kasvainten 20 oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu olevan peräisin T-soluista, koska kasvainsolut muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (> 20 % E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten heteroantiseerumien, anti-HTL (B.K.)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten edellä 25 on kuvattu. Kasvainpopulaatioita kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa dimetyylisulfok-sidissa ja 20-%:isesti ihmisseerumissa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat >90-%:isesti blasteja sytosentrifugivalmisteiden 30 Wright-Giemsa-morfologialtaan.

Esimerkki 3

Solufluorografinen analyysi ja solujen erotus

Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solupopulaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografinen analyysi 35 suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valli 15 75598 mistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solufluorografia FC200/4800A (Ortho Instruments) . Tällöin 1 x 10® solua käsiteltiin 0,15 ml:lla vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, solut inku-5 boitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla, jossa kunkin solun 10 aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin puls-sinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennuksella 1:10000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:11a suhteessa 1:500 laimennettua vesi-15 vatsanestettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidusta CAF^-hiirestä.

Kokeissa, jossa tutkittiin vasta-aine- ja komplement-tivälitteistä lymfolyysiä, tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja viljeltiin yön yli, minkä jälkeen seurasi selektii-20 vinen hajotus, ja sen jälkeen solut analysoitiin solufluorografilla.

Esimerkki 4

Lymfoidipopulaatioiden hajotus monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla 25 40 x 10® perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä lisät tiin 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). Solupellet-teihin lisättiin 0,8 ml vasta-ainetta OKT3, OKT4, 0KT8 tai tavallista vesivatsanestettä (vertailuaine), jotka oli laimennettu suhteessa 1:200 PBS:llä, seokset suspendoitiin ja 30 inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuutin ajan. Sen jälkeen vasta-aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, seos suspendoitiin ja sitä inkuboitiin edelleen 37°C:ssa 60 minuutin ajan vesihauteessa, joka oli liitetty ravistelijaan. Inkuboinnin päätyttyä 35 solut sentrifugoitiin ja elinkykyiset solut määritettiin Trypan-sinisellä. Solut laskettiin, pestiin kaksi kertaa 16 75598 5-%:lla FCLrllä ja asetettiin lopulliseen väliaineeseen RPMI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY), joka sisälsi 20 % ihmisen AB+-seerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-pus-5 kuria ja 0,5 % natriumkarbonaattia ja seosta inkuboitiin yön yli 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CO2 ·

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille, 10 joiden on annettu reagoida OKT 6:n ja muiden monoklonaalis-ten vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Taustafluoresenssivärjäys määritettiin lisäämällä kuhunkin populaatioon suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuottavaa kloonia, ja in-15 kuboimalla seosta.

Kuviossa 2 on esitetty tymosyyttien erilaistuminen kateenkorvassa.

Hybridoma valmistettiin, ja monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin ja karakterisoitiin edellä olevissa esimer-20 keissä kuvatulla tavalla. Vaikkakin suuria määriä esillä olevaa vasta-ainetta valmistettiin injektoimalla esillä olevaa hybri-domaa intraperitoneaalisesti hiiriin ja ottamalla hiiristä talteen pahanlaatuiset vesivatsat, on selvää, että hybridomaa voidaan viljellä myös alalla hyvin tunnetuilla in vitro-mene-25 telmillä, jolloin vasta-aine erotetaan viljelmien pintanesteestä.

Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-aineiden OKT6, OKT8, OKT9 ja OKT10 reaktiivisuus ihmisen eri lymfoi-disolupopulaatioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine OKT6 reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyt-30 tejä, mutta ei minkään muiden tutkittujen lymfoidisolujen kanssa. Muun muassa tämän reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT6 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluo-35 resenssispektri ihmisen normaaleista tymosyyteistä koostuvalle suspensiolle, jonka on annettu reagoida vasta-aineiden 11 17 755 98 0KT3, 0KT4, 0KT5, 0KT6, OKTS, OKT9 ja OKT10 (kaikkien lai-mennussuhde 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Samanlaiset reak-tiivisuuskaavat saatiin 12 muulle tutkitulle ihmisen normaalille tymosyyttipopulaatiolle. Kuviosta ilmenee, että reak-5 tiivisuusprosentissa ja fluoresenssi-intensiteetissä on merkittäviä eroja kaikkien tutkittujen monoklonaalisten vasta-aineiden välillä. Esimerkiksi OKT9 reagoi noin 10 i:n kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa heikko, kun taas OKT5, OKT6, OKT8 ja OKTIO reagoivat noin 70 %:n 10 kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa voimakkaampi. OKT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyttejä, sijoittuu fluoresenssi-intensiteetin suhteen OKT9:n ja sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden väliin, joiden fluoresenssi-intensiteetti on voimakkaampi. Lisäksi kuviosta 1 15 ilmenee, että noin 15 % tymosyyteistä voidaan todeta OKT3:lla käyttämällä epäsuoraa immunofluoresenssimenetelmää. OKTl, joka reagoi tymosyyttien kanssa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla kuin 0KT3, ei tällöin tule esiin. Myös kuviossa 1 esitetyn reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva 20 vasta-aine OKT6 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista .

Taulukosta 2 ilmenee erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemien antigeenien jakaantuminen ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja lymfosyytteihin, jakaantuminen 25 on määritetty sarjalla hajotuskokeita esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Koska ainoastaan OKT3, OKT4 ja OKT8 olivat komplementin sitovia monoklonaalisia vasta-aineita, näitä kolmea käytettiin määrityksessä.

Taulukosta 2A ilmenee, että koko T-solupopulaatio 30 reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, OKT5 ja OKT8 reagoivat 60 %:n, 25 %:n ja 34 %:n kanssa T-soluja. Hajotus OKT4:llä ja komplementilla vähensi solujen kokonaislukumäärää 62 %:lla ja tuhosi spesifisesti OKT4+-populaation. Lisäksi OKT5+- ja OKT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, mutta 35 OKT5+- ja OKT8+-T-solujen kokonaismäärä ei muuttunut. Tästä kokeesta voitiin vetää se johtopäätös, että OKT4+-populaa- 18 75598 tio erosi 0KT5+- ja OKT8+-populaatioista. Lisää tukea tälle olettamukselle saatiin kokeesta, jossa T-soluja hajotettiin 0KT8:lla ja komplementilla. Tällöin 0KT4+-T-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, kokonaislukumäärä pysyi samana ja 5 0KT8+- ja 0KT5+-populaatiot tuhoutuivat. Lisäksi nämä kokeet osoittivat, että 0KT8+-populaatio oli vastakkainen OKT4+-populaatiolle sisältäen koko OKT5+-T-solujakeen.

Samanlaiset ihmisen tymosyytti populaatioilla suoritetut kokeet antoivat erilaisia tuloksia. Taulukosta 2B 10 ilmenee, että noin 75 % tymosyyteistä oli 0KT4-positiivisia tai OKT8-positiivisia. Sitä paitsi hajotettaessa soluja OKT4:llä tai OKT8:lla ainoastaan 25 % tymosyyteistä jäi jäljelle. Suurin osa jäljelle jääneistä tymosyyteistä reagoi 0KT3:n kanssa, kun taas niistä pieni osa reagoi OKT6:n 15 kanssa. Nämä havainnot osoittavat, että suurimmalla osalla ihmisen tymosyyteistä on OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-pinta-antigeenit samassa solussa. Lisäksi taulukosta 2 ilmenee, että käsiteltäessä soluja OKT8:lla ja OKT4:llä OKT3-anti-geenin sisältävien kypsien tymosyyttien määrä kasvaa huomat-20 tavasti. Täten suurin osa 0KT3:n kanssa reagoivista tymo-syyteistä on jo erottunut OKT4+- ja OKT8+-jakeiksi, koska suurin osa soluista, jotka eivät reagoineet OKT4:n ja OKT8:n kanssa, olivat OKT3-positiivisia. Jos OKT3+-alapopu-laatio olisi sekä OKT4-positiivinen että OKT8-positiivinen, 25 hajotus jommalla kummalla monoklonaalisella vasta-aineella olisi tuhonnut OKT3:n kanssa reagoivat tymosyytit.

Jotta saataisiin edelleen selville OKT3:n kanssa reagoivien tymosyyttialapopulaatioiden suhde muiden monoklo-naalisten vasta-aineiden määrittelemiin tymosyyttifraktioi-30 hin, tymosyyttejä käsiteltiin OKT3:lla ja komplementilla ja käsittelyssä jäljelle jääneitä soluja verrattiin sitten käsittelemättömiin tymosyyttipopulaatioihin. Taulukosta 2B ilmenee, että OKT3 ja komplementti poisti 25 % tymosyyteistä. Sen sijaan OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-vasta-aineiden 35 kanssa reagoivat populaatiot pysyivät käytännöllisesti katsoen muuttumattomina. Näistä havainnoista voidaan vetää se johtopäätös, että suurin osa OKT6-markkerin sisältävistä

II

75598 19 tymosyyteistä kuuluu 0KT3**-populaatioon. Lisäksi tuloksista voidaan vetää se johtopäätös, että tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät 0KT4 : n, 0KT5:n ja 0KT8:n määrittelemät antigeenit, rajoittuvat samalla tavalla 0KT3”-populaatioon.

5 On myös huomattava, että 0KT9:n kanssa reagoiva tymosyytti-populaatio ei vähentynyt käsiteltäessä fraktioimattomia ty-mosyyttejä 0KT3:lla ja komplementilla, mikä osoittaa, että 0KT9+-alapopulaatio rajoittuu suurimmaksi osaksi 0KT3--ty-mosyyttipopulaatioon.

10 Näiden tulosten pohjalta on ollut mahdollista määrit tää ihmisen tymosyyttien kehitysvaiheet kateenkorvassa. Kuviosta 2 ilmenee, että käytännöllisesti katsoen kaikissa tymosyyteissä on OKTIO-markkeri. Lisäksi tymosyytit saavat varhaisessa vaiheessa OKT9-antigeenin (Thyl ja Thy2). Tämä 15 vaihe käsittää pienen osan tymosyyteistä, ja siihen kuuluu noin 10 % ei-fraktioidusta populaatiosta.

Sen jälkeen ihmisen tymosyytit saavat 0KT6:n määrittelemän tymosyyttiantigeenin ja samanaikaisesti ne ilmentävät OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n (Thy4). Jälkimmäinen alapopu-20 laatio edustaa valtaosaa tymosyyteistä, ja siihen kuuluu yli 70-80 % tymosyyttipopulaatiosta. Tymosyyttien edelleen kypsyessä niiden OKT6-reaktiivisuus häviää, ne tulevat reaktiivisiksi 0KT3:n (ja OKTl:n) kanssa ja erottuvat OKT4+- ja OKT5+/OKT8+-jakeiksi (Thy7 ja Thy8). Näyttää siltä, että 25 viimeisessä vaiheessa tymosyyttien irrotessa kateenkorvasta perifeeristen T-solujen joukkoon, niiden OKTIO-markkeri häviää, sillä tämä antigeeni puuttuu käytännöllisesti katsoen kaikilta perifeerisiltä T-lymfosyyteiltä. Näiden kolmen pää-kehitysvaiheen välisiä mahdollisia siirtymävaiheita on mer-30 kitty kuviossa 2 Thy3:lla, Thy5:llä ja Thy6:lla.

Koska akuutin T-solujen lymfoblastileukemian on arveltu johtuvan epäkypsistä tymosyyteistä, määritettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyjen kasvain-solujen ja mainittujen oletettujen tymosyyttien kehitys-35 vaiheiden välinen suhde. Määrityksessä käytettiin T-ALL- leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyä 25 kasvain-solupopulaatiota ja kolmea T-solulinjaa, jotka oli etukäteen 20 75598 tutkittu tavanomaisilla anti-T-solureagensseilla ja E-rose-toinnilla. Taulukosta 3 ilmenee, että suurin osa T-ALL-leu-kemiasoluista reagoi joko pelkän OKT10:n tai 0KT9:n ja OKTlOrn kanssa, mutta solut eivät reagoineet muiden mono-5 klonaalisten vasta-aineiden kanssa. Täten 15/25 tutkituista tapauksista näytti sisältävän varhaisen tymosyyttivaiheen antigeenejä (vaihe 1).

Sitä vastoin 5/25 tapauksista reagoi 0KT6:n kanssa, mistä voidaan vetää se johtopäätös, että ne ovat peräisin 10 kypseramästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 2). Tämä T-ALL-ryhmä reagoi eri tavoin OKT4:n, OKT8:n ja OKT9:n kanssa, kuten taulukosta 3 ilmenee. Kahdella viidesosalla potilaista oli sellaisia kasvainsoluja, jotka sisälsivät suurimman osan tavallisista tymosyyttiantigeeneista, mukaan lukien 15 OKT4, OKT5 ja 0KT8. On huomattava, että 0KT5 ei esiinny yhdessäkään näistä viidestä vaiheen 2 kasvaimesta, vaikkakin OKT8-reaktiivisuutta havaittiin. Tästä jälkimmäisestä tuloksesta voidaan selvästi vetää se johtopäätös, että OKT5 ja OKT8 määrittelevät eri antigeenejä tai eri determinant-20 teja samassa antigeenissä. Lopuksi 1/25:11a potilaista oli sellaisia kasvaimia, jotka olivat peräisin kypsästä tymo-syyttipopulaatiosta (vaihe 3) OKT3-reaktiivisuuden perusteella määritettynä. Tämän henkilön kasvain oli lisäksi reaktiivinen OKT5:n, OKT8:n ja OKT10:n kanssa. Tutkituista 25 25 leukemiapopulaatiosta ainoastaan neljä oli sellaista, joita ei voitu selvästi luokitella. Näistä kolme oli OKT4-ja OKT8-positiivisia, mutta ne eivät reagoineet OKT3:n eikä OKT6:n kanssa, jolloin ne olivat todennäköisimmin Thy4:n ja Thy 7,8:n välisiä siirtymävaiheita. Yksi 25 tapauksesta 30 osoittautui olevan Thy3:n ja Thy4:n välinen siirtymävaihe, sillä se oli reaktiivinen OKT8:n ja OKTlO:n kanssa.

T-ALL-kasvainpopulaatioista peräisin olevat T-solulin-jat edustivat myös spesifiseen kateenkorvansisäiseen erilais-tumisvaiheeseen kuuluvia soluja. Taulukosta 4 ilmenee, että 35 HSB-2 reagoi yksinomaan 0KT9:n ja OKTlOrn kanssa, ja täten se määrittelee vaiheesta 1 peräisin olevan kasvainpopulaa-tion. Sitä vastoin CEM-T-solulinja reagoi OKT4:n, OKT6:n, ti 21 75 5 98 0KT9:n ja OKTlO:n kanssa ja se osoittautui olevan peräisin vaiheen 2 tymosyyteistä. Lopuksi solulinja MOLT-4 on ilmeisesti HSB-2 ja CEM:in välillä oleva leukemiatrans-formaatio, sillä se ekspressoi 0KT6:n, 0KT8:n, 0KT9:n ja 5 OKTIO:n.

Koska myöhempien vaiheiden (esim. vaiheen II) T-so-lujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien henkilöiden on todettu parantuvan täydellisemmin kuin vaiheen I ALL-leukemiaa sairastavien, 0KT6-vasta-aineen avulla 10 voidaan vetää johtopäätöksiä T-solujen ALL-leukemiaa sairastavan henkilön prognoosista.

Taulukosta 5 ilmenee perifeeristen T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuuksien ja eri tautitilojen välinen suhde. Näitä suhteita voidaan käyttää terapeuttisiin tar-15 koituksiin tautitilan aiheutuessa jonkin T-solujakeen kohonneesta pitoisuudesta (esim. tyyppiä I oleva agammaglobulinemia) . Tällöin potilaalle, jolla esiintyy ylimäärin jotakin T-solujaetta, annetaan sopivaa monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin ylimäärä saadaan vähenemään tai ko-20 konaan poistetuksi. Myös taulukoissa 2-5 esitettyjen suhteiden avulla 0KT6-vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Muita monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hybridomeja (0KT1, 0KT3, 0KT4 25 ja OKT5 sekä OKT8, OKT9 ja OKTIO) ja menetelmiä näiden hyb-ridomien ja vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 800846, 801343, 801342 ja 802917 sekä 803758, 803756 ja 803757.

Kyseisen vasta-aineen OKT6 havaittiin kuuluvan IgG^-30 alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta 35 siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä 22 75598 kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG^-IgG2a, IgG2b tai IgG^ tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mut-5 ta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Esillä olevaa vasta-ainetta 0KT6 voidaan käyttää tymosyyttien erilaistumisen toteamiseen ja tutkimiseen, 10 kuten kuviossa 2 on esitetty. Jos OKT6:n kanssa reagoivien tymosyyttien määrä poikkeaa 70 %:sta, tymosyyttien kehitysvaiheessa II esiintyy poikkeavuuksia.

Tautitiloja (esim. pahanlaatuisia tauteja, kuten vaiheen II ALL-leukemiaa), jotka aiheutuvat 0KT6+-solujen 15 ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle terapeuttisesti vaikuttava määrä OKT6-vasta-ainetta. Reagoimalla selektiivisesti OKT6+-antigeenin kanssa, vaikuttava määrä OKTIO-vasta-ainetta vähentää ylimäärin esiintyviä 0KT6 -soluja vaikuttaen täten taudin kulkuun edullisesti.

20 Vasta-ainetta 0KT6 voidaan sisällyttää terapeuttisiin koostumuksiin, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKT6-vasta-ainetta ja farmaseuttisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista.

Taulukko 1 25 Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus ihmisen lymfoidipopulaatioiden kanssa

Monoklonaalinen Perifeerinen Luuydin (6) Kateenkorva vasta-aine veri (22) E+ E“ 30 OKT6 0% 0% 0% 70% 0KT8 30 % 0 % <2 % 80 % OKT9 0 % 0 % 0 % $10 % OKT10 <5 % 10 % $20 % 95 %

Suluissa olevat luvut merkitsevät tutkittujen näytteiden 35 määrää; %-arvot ovat keskiarvoja

II

75598 23 <*> o lii

c 3 H

W 3 J2 ri III (N LO m UD C

•H tt JJJ O h co co :fö β *£c :o3 <*> r* l> ~ jj h '^3 2 w m +j t^r S III 00 kD m (N λ;

O ^ m ° r—I rH -H

H α> -I

S m3 00 a 0

•h ^ ° ιτ,ιηοο CC

E m.Sn ^ ^ O' root

3 .^2 ° ro C

-m E -H

S io 2 ε (0 Swv- OOO in o m (n -u o X So VOHH00 o-rn

(¾ r-· “> ^ fO

Sr »> λ e Ό C m .

<D ’Hlll ^ m o o omoo Jjqi ‘g S« O " ^ Γ" co oo x c nj o> ;S ^ 4J u-i to CU “5L rt _ to ή u £ ' -h «g S S°S 2 ° m o oi S u is - - - -- w g* 5

-h *5 ΦΛϋ li L

3 - -n o ro 'l -rH. CO

2 § •'Jn^ ®^cn o o m o wWii ^ C O ίί «τισισι m oo oo >ι·3 H n E ° >1 n 3 ε *—i -p ,04 CD :rö fO to

Ή to :tö C -H 4J

<u to I J-l ro 0 fö 4-> ·Η -H :t0 | -H > -PtDQJCtlO duo o ·-* c <d ε ,_. i-itojj M >i :re-i-i 3 \D κo vomioio toto a) >t :ιβ 0 Λ ooo oooo -h .h 3 :id to -r-iiH 3 l—I Ή I-I rH r-I rH rH φ 3 ig E E l)Sffl XXX XXX* too^

C >Ί rH ·Η 4J Q. 4J

<D -P rH C Ifl O CN (N O O in O -H QJ

Ό <D tl) G ττκν rH * ro Otroto •rl (0 -nö o in in <Ti -H |J y

CD-nrH-rHAi |H(N HJtOO

3 :(0 <D O tO -h rH

•H (0 %) G Ai ij >, p

Ό W ,. rH h H

' “ 3 3 rH

ns -h 3 α ω -P 3 ^ n jj rl

3 O w ^ a n S

> f ° Hi S 2 2 *2 3 G H ti CU 0) E^J2t5

<D 2 HJ+J -p rOOJDC

P 8β «β CU-P -P ϋ rH « M

tr. to ^ to -H- -P -H Hjinae

•H tQ 3 -H 10 - * Ή to* - - tro ·Η t0 <D

Ή -H 3. MtfOUU-PtrOUUU PhjhJi—i <o to o cu x >. a: oca 2\h5 <u + + > + + + rHtutoe

G O 1!^ t*-<C tOC (D E 10 O

OtD^U -H röTCO O n) ^ co n -P <u to -S£ •—* <I) *ηΕΗΗΕΕΗΗΗ d h h

* ΊΗ i2 H a Λ II

O -H *tj Oi H O O Hl M o O O to e rH

5 ^ v. . :r0 O rO - QUO ‘ · X _V V f ) g Oi ^ < m y * Z- 75598 24

4J

ω .h Ό I .

3 I w « ' p ^ S -i 2 w xi . α >i T* •H < e J7 -P >1 •3 I 3 φ Ή

C El λ; 2 W C

•H g Λ ,* <t3 -H

GC-Hin 3 >* ·^ O

S St" " c s » c 3 2" ^ “ -. -< N o 0 2 '2

•H -U 1/) r· (Μ Ή W

Q< -H 3^· 1 +> «* C

Λί HJ m C OJ

—· 4J Q4 -HOW

Π3 3 nj fQ Ο Γ» <U

t hjj sN s QJ o M 'H 3 3 I 5 , ° 4-> 0*4-1

Q) -H E-, ί . X

rH Γ3 S£ +. , m 10 -H :nj Π3 •H I n ++ + + + + + W+>w

0J«U ^-^03 WWW

1/) 4J . ^ C ·Η ·Η * w o 3-8^°

»H fd f-ι ^ C uj ·Η *H

X( > ^ ,, £ 0) 0JU)V)

O o + +111 , 2 Ό P QJ C

+4C _2‘H ο α οι npo) ^-wawa, S 4J oo m c Γ1 w O rH W Η λ; h n; ί , n · ο w -*Cmo ++1+ + § n f,·^1 2 3 3<um IH -r-> 10 o C - o | | § g s” 3 1 s

? | o 11 + + + + I 2 S Π S

Fn C C +* O, Q) w . O .n w j? W .5 « x! g b . . :9 s w > * ^ 32¾ 1 1 1 * 1 + e ti Äi 2 3 5 W -H £ , £ « ^WC-rr 3-h J® ω

5 ·ρ 2 h -H M

: *s ' + + < . . is i “ I

.“Il * · ή £ 3 'S

Ϊ «s .5 S c 5 0 ? 8 S S S 11 - . * m . 8 > s s H ♦ 2 | 7 ? 3 g g E ~ W ^ rH 3 ,H .H ^

S -Hio O, Λί W > 4J

2 >iW-h 5 C O -H

q .c -h 4j -p ή >i «o a -h c m Eh Ό +t S ~ f >1 ^ 2 m ^ ’H ^ /.. »H >1 -H O) 4J ,η (0 Π S Tj 2 W -H ί 2 H ‘H O ^ 10 *i 4J > n . 1 -C ‘H -H L» jj 52 4-» C 'J^H*HW>(/j4j

m >i G rH ^ 3 Q

.2 >1 -H 4J ^ O > .·(0 3 -n Ui C W 4J >i -H -H 4J y, ω § o >, C J2 •Hio-Pc-Hv'" 2 E >1 r-« o; 2

^ >1 U) n C ^ Λ P 03 rH Φ Λ! -H H |J

-H H -11 O >, M H TT VO rn ?T -P (U W H -H »H 4-1 H -H Ex M _ T i -PP-^QJP(1)>,

II

5a&e31li7.T.s??. ί II tl n 2 W > < CQ H^-§H+aa 3 ä · x; + h- 25

Taulukko 4 7 5 5 9 8

Solulinjojen reaktiivisuus monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa

Solutinja 0KT3 0KT4 0KT5 0KT6 OKT8 0KT9 OKTIO

5 HSB-2 -x - - - - + + CEM - + - + + + + MOLT-4 ---+++ +

X

Kriteerit (-)- ja (+)-reaktiivisuudelle olivat samat kuin taulukossa 3.

26 75598

Taulukko 5

Perifeeristen T-solujen pitoisuudet eri tauti-—°-S-Sa T-solujen pitoisuudet

Tautitila 0KT3+ ΟΚΤΤ* ÖKT5 0KT8 + 0KT6 +

Primäärinen maksa- N + kirroosi (2)

Multippeliskleroosi (pitkälle edennyt) (8) - N - - -

Myasthenia Gravis n n n n 10 (ei hoidettu varhaises- 00000 sa vaiheessa) (3)

Akuutti elinsiirto 0 . 0 + +

Agammaglobulinemia is Tyyppi i +

Tyyppi II 0

Hyper IgE (4) - N 0··*- 0 * * · -

Akuutti mononukleoosi- + 0 ...— ++ ++ 0 2Q infektio (4) x

Hodgkinsin tauti

Vaiheet I i II N N N N 0

Vaiheet III & IV — N N NO

25 Psoriasis (3/5) N +···++ N N 0 N = normaali pitoisuus 0 = puuttuu 30 + = normaalia suurempi ++ = huomattavasti normaalia suurempi _ a normaalia pienempi - huomattavasti normaalia pienempi x Nämä pitoisuudet palaavat normaaleiksi noin viikkoa aikaisemmin kuin kliiniset oireet häviävät.

Suluissa olevat arvot ilmaisevat tutkittujen potilaiden lukumäärän.

Il

Claims (3)

75598

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine 5 a) reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja ty- mosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-so-lujen, B-solujen, nollasolujen eikä luuydinsolujen kanssa, b) reagoi noin 65 %:n kanssa käsittelemättömiä tymo-syyttejä, 10 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen 10 käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja kopmlementilla, 82 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8001 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, ja 13 %:n 15 kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridi-solulinjan ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, c) reagoi vaiheen II ALL-T-solujen kanssa, mutta ei vaiheen I tai vaiheen III ALL-T-solujen kanssa, 20 d) reagoi solulinjojen CEM ja MOLT-4 kanssa, mutta ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja e) määrittelee T-solupopulaation, jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä ja normaalia 25 suurempina pitoisuuksina akuutissa elinsiirtoreaktiossa ja joka puuttuu täydellisesti myasthenia graviksessa, akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa, kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja psoriasiksessa, tunnettu siitä, että menetelmä koostuu seuraavista 30 vaiheista: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8020 i) immunisoimalla hiiriä ihmisen normaaleilla tymo-syyteillä, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja val- 35 mistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren mye-loomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, 28 7 5 5 9 8 iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen 5 pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivi- sille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille spesifisiä vasta-aineita, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8020, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi noin 10 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ih misen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen eikä luuydinsolujen kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) viljelemällä hybridoomaa ATCC CRL 8020 sopivas- 15 sa väliaineessa, ja viii) ottamalla vasta-aine talteen mainitun hybri-doman pintanesteestä.

2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine 20 a) reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja ty- mosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nollasolujen eikä luuydinsolujen kanssa, b) reagoi noin 65 %:n kanssa käsittelemättömiä tymosyytte jä, 10 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen 25 käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8002 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja kopmlementilla, 82 %:n kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridisolulinjän ATCC CRL 8001 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, ja 13 %:n 30 kanssa tymosyyttejä, jotka on etukäteen käsitelty hybridi-solulinjan ATCC CRL 8014 avulla valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla, c) reagoi vaiheen II ALL-T-solujen kanssa, mutta ei vaiheen I tai vaiheen III ALL-T-solujen kanssa, 35 d) reagoi solulinjojen CEM ja MOLT-4 kanssa, mutta ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja e) määrittelee T-solupopulaation, jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroo- ii 75598 sissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä ja normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elinsiirtoreaktiossa ja joka puuttuu täydellisesti myasthenia graviksessa, akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa, kaikissa Hodgkinsin taudin 5 vaiheissa ja psoriasiksessa, tunnettu siitä, että menetelmä koostuu seuraavista vaiheista: A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8020 i) immunisoimalla hiiriä ihmisen normaaleilla tymo- 10 syyteillä, ii) poistamalla pernat mainituista hiiristä ja valmistamalla pernasolususpensio, iii) yhdistämällä mainitut pernasolut hiiren mye-loomasoluihin yhdistämiskatalysaattorin läsnäollessa, 15 iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä so luja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva, v) arvioimalla eri syvennysten hybridoomapitoinen pintaneste sen suhteen, sisältääkö se E-rosettipositiivi- 20 sille puhdistetuille T-soluille tai ihmisen tymosyyteille spesifisiä vasta-aineita, vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8020, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ih- 25 misen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen eikä luuydinsolujen kanssa, ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) siirtämällä hybridooma ATCC CRL 8020 intraperi-toneaalisesti hiiriin, ja 30 viii) ottamalla vasta-aine talteen hiirien pahan laatuisesta vesivatsasta tai seerumista. 75598