DK154090B - Fremgangsmaade til fremstilling af et monoklonalt antistof, hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmaaden samt fremgangsmaade til diagnose under anvendelse af det fremstillede monoklonale antistof - Google Patents

Description

i

DK 154090 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof, en hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmåden samt en fremgangsmåde til diagnose under anvendelse af det fremstillede monoklonale antistof.

5 Fusionen af muse-myeloma-celler til milt-celler fra immuniserede mus af Kohier og Milstein i 1975 (Nature 256, 495-497 (1975)) viste for første gang, at det var muligt at opnå en kontinuert celle-linie, der fremstiller homogent (såkaldt "monoklonalt") antistof. Siden dette grundlæggende arbejde har der været udfoldet store anstrengelser på at 10 fremstille forskellige hybride celler (kaldet "hybridomas") og på at anvende det ved hjælp af disse hybridomas fremstillede antistof til forskellige videnskabelige undersøgelser. Der henvises fx. til Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter og N. Warner, Editors, Springer-15 Verlag, 1978 og de deri angivne referencer, C.J. Barnstable, et al.,

Cell, 14, 9-20 (maj 1978), P. Parham og W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978), Handbook of Experimental Immunology, 3. udgave, bind 2, D.M. Wier, Editor, Blackwell, 1978, kapitel 25, og Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15-17. Disse referencer indikerer 20 samtidig belønningerne og komplikationerne ved at forsøge at fremstille monoklonalt antistof ud fra hybridomas. Selvom den almene teknik forstås principielt godt, mødes mange vanskeligheder og variationer kræves for hvert specifikt tilfælde. I virkeligheden er der ingen sikkerhed, forud for forsøget på at fremstille et givet hybridoma, for at det ønskede 25 hybridoma vil blive opnået, at det, hvis opnået, vil producere antistof eller at det således fremstillede antistof vil have den ønskede specificitet. Graden af success påvirkes principalt af den anvendte antigentype og den til isolering af det ønskede hybridoma anvendte udvælgelsesteknik.

30 Den tilstræbte fremstilling af monoklonalt antistof for humane lymfocyt celle-overflade antigener er kun blevet rapporteret i nogle få tilfælde. Se fx. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De i disse rapporterede forsøg anvendte antigener var dyrkede humane lymfoblastoide leukæmia og humane kroniske lymfocytiske 35 leukæmia celle-linier. Mange opnåede hybridomas syntes at danne antistof over for forskellige antigener på alle humane celler. Ingen af disse hybridomas dannede antistof over for en forud defineret klasse af humane lymfocyter.

DK 154090 B

2

Det er endvidere for nylig blevet kendt, se fx. Reinherz, E.L., et al., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et al., Proc.

Natl. Acad. Sci., 76, 4061-4065 (1979); og Kung, P.C., et al., Science, 206, 347-349 (1979), at fremstille monoklonale antistoffer kaldet 0KT1, 5 3 og 4 ved hjælp af hybridomacellelinier. 0KT1 og 3 reagerer med alle humane perifere T-celler, medens 0KT4 reagerer med 55% af de humane perifere T-celler og 80% af thymocyterne.

Det bør forstås, at der findes to principielle klasser af lymfocyter, som er involveret i immunsystemet hos mennesker og dyr. Den 10 første af disse (den thymus-afledte celle eller T-celle) differentieres i thymus fra hæmopoietiske stam-celler. Mens de befinder sig i thymus, kaldes de differentierende celler for "thymocyter", De modne T-celler forlader thymus og cirkulerer mellem væv, lymfekar og blodbaner. Disse T-celler udgør en stor andel af mængden af recirkulerende 15 små lymfocyter. De har immunologisk specificitet og er direkte involveret i celle-medierede immun-reaktioner (såsom transplantationsafvisning) som effektor-celler. Selvom T-celler ikke sekreterer humorale antistoffer, kræves de under tiden for udskillelsen af disse antistoffer af den nedenfor omtalte anden klasse af lymfocyter. Nogle 20 typer af T-celler har en regulerende funktion ved andre aspekter af immun-systemet. Mekanismen for denne proces ved celle-samvirke forstås endnu ikke fuldt ud.

Den anden klasse af lymfocyter (de benmarvs-afledte celler eller B-celler) er de som udskiller antistof. De dannes også fra hæmopoietiske 25 stam-celler, men deres differentiering bestemmes ikke af thymus. I fugle differentieres de i et med thymus analogt organ, kaldet Bursa Fabricii.

I pattedyr har man imidlertid ikke fundet et ækvivalent organ og det antages, at disse B-celler differentierer i benmarven.

Det anerkendes nu, at T-celler kan opdeles i mindst adskillige 30 undertyper, kaldet "hjælpe", "suppressor", og "dræbe" T-celler, der har den funktion (hhv.) at fremme en reaktion, undertrykke en reaktion eller dræbe (lysere) fremmede celler. Disse underklasser forstås godt inden for musefamilien, men er kun for nyligt blevet beskrevet for humane systemer. Se fx. R.L. Evans, et al., Journal of Experimental Medicine, 35 bind 145, 221-232, 1977 og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, Editor,

Plenum Press, 1977, bind 7, 363-379.

DK 154090B

3

Evnen til at identificere eller undertrykke klasser eller underklasser af T-celler er vigtig for diagnosen eller behandlingen af forskellige immuno-regulatoriske uregelmæssigheder eller tilstande.

Fx. har visse leukæmityper og lymfomas forskellig prognose i 5 afhængighed af, om de er af B-celle eller T-celle oprindelse. Således afhænger vurderingen af sygdomsprognosen af, at man kan skelne mellem disse to klasser af lymfocyter. Se fx. A.C. Aisenberg og J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (marts 1975), D. Belpomme, et al., i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, 10 et al., eds, Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Belpomme, et al.,

British Journal of Haematology, 1978, 38, 85.

Visse sygdomstilstande (fx. juvenil rheumatoid arthritis, maligne tilstande og agammaglobulinæmi) hænger sammen med en ubalance af T-celle underklasser. Det er blevet foreslået, at autoimmune sygdomme i 15 almindelighed hænger sammen med et overskud af "hjælpe" T-celler eller mangel på visse "suppressor" T-celler, mens agammaglobulinæmi hænger sammen med et overskud af visse "suppressor" T-celler. I almindelighed hænger maligne tilstande sammen med et overskud af "suppressor" T-celler.

20 I visse leukæmityper produceres overskud af T-celler på et hæmmet udviklingsstade. Diagnosen kan derfor afhænge af muligheden for at påvise sådan ubalance eller overskud og for at bestemme, hvilken udviklingsfase er i overskud. Se. fx. J. Kersey, et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i 25 Haematology and Blood Transfusion, bind 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 og de deri anførte referencer, og E.L. Reinherz, et al., J. Cl in.

Invest., 64, 392-397 (1979).

Erhvervet agammaglobulæmi, som er en sygdomstilstand, hvor der ikke produceres immunt globulin, omfatter mindst to forskellige typer. I type 30 I skyldes manglen på at producere immunt globulin et overskud af suppressor T-celler, mens den i type II skyldes en mangel på hjælpe T-celler. I begge typer synes der ikke at være nogen defekt eller mangler i patienternes B-celler, lymfocyterne som er ansvarlige for den aktuelle sekretion af antistoffet. Imidlertid er disse B-celler enten undertrykte 35 eller "ikke hjulpne", hvilket fører til stærkt formindsket eller manglende immungi obul i n-produktion. Typen af erhvervet agammaglobulinæmi kan således bestemmes ved at teste for et overskud af suppressor T-celler eller et fravær af hjælpe T-celler.

DK 154090 B

4 På den terapeutiske side er der en endnu ikke endeligt bevist forskning om, at administrering af antistoffer over for T-celle subtypen i overskud kan have terapeutisk gavnlig virkning på autoimmune sygdomme eller maligne tilstande. Fx. kan en hjælpe T-celle cancer 5 (visse kutane T-celle lymphomatyper og visse T-celle akut lymfoblasti ske leukæmityper) behandles med et antistof for et hjælpe T-celle antigen. Behandling af autoimmun sygdom forårsaget af et overskud af hjælpeceller kan også ske på samme måde. Sygdomme (fx. maligne tilstande eller erhvervet type I agammaglobulinæmi), som skyldes et overskud af 10 suppressor T-celler, kan behandles ved administrering af et antistof for et suppressor T-celle antigen.

Antisera mod hele klassen af humane T-celler (såkaldt antihuman thymocyt globulin eller ATG) har været anført som værdifulde terapeutisk på patienter, der modtager organ-transplantation. Da den celle-medierede 15 immunreaktion (mekanismen, hvorved transplantationer afvises) afhænger af T-celler, forebygger eller forsinker administrering af antistof mod T-celler denne afvisningsproces. Se fx. Cosimi, et al., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40:155-163 (1976) og de deri anførte 20 referencer.

Identifikationen og undertrykkelsen af humane T-celle klasser og underklasser er tidligere sket ved anvendelse af spontane autoantistoffer eller selektive antisera for humane T-celler opnået ved immunisering af dyr med humane T-celler, tapning af dyrene til opnåelse 25 af serum og adsorption af antiserum med (fx.) autologe, men ikke allogene B-celler til fjernelse af antistoffer med uønskede aktiviteter. Fremstillingen af disse antisera er særdeles vanskelig, især i adsorptions-og rensningstrinnene. De adsorberede og rensede antisera kan endog indeholde mange urenheder foruden det ønskede antistof, 30 af adskillige grunde. For det første indeholder serum millioner af antistof-molekyler, selv før T-celle-immuniseringen. For det andet bevirker immuniseringen dannelse af antistoffer mod en lang række antigener, som findes på alle injicerede humane T-celler. Der er ingen selektiv dannelse af antistof over for et enkelt antigen. For det tredje 35 er titeren af specifikt antistof opnået ved sådanne metoder sædvanligvis meget lav (fx. inaktiv ved fortyndinger på mere end 1:100) og forholdet

C

mellem specifikt og non-specifikt antistof er mindre end 1/10 , se fx. den ovenfor omtalte artikel af Chess og Schlossman (side 365 og

DK 154090B

5 følgende) og den ovenfor omtalte artikel i Chemical and Engineering News, hvor manglerne ved hidtil kendte antisera og fordelene ved mono-klonalt antistof er beskrevet.

Der er nu fundet en ny hybridomacellelinie, som er i stand til at 5 producere hidtil ukendt monoklonalt antistof kaldet OKT 6 over for et antigen, som findes på omkring 70% af normale humane thymocyter, men ikke på normale humane perifere lymfoide celler (T-celler, B-celler eller nul-celler) eller knoglemarvs-celler.

Det således dannede antistof er monospecifikt for en enkelt de-10 terminant på omkring 70% af normale, humane thymocyter og indeholder i det væsentlige ingen anden antihuman immunglobulin, i modsætning til tidligere kendte antisera (som nødvendigvis er kontami-neret med antistof, der er reaktivt over for talrige humane antigener) og til hidtil kendte monoklonale antistoffer (der ikke er mono-15 specifikke for et humant thymocyt-antigen). Endvidere kan dette hybridoma dyrkes til fremstilling af antistof uden nødvendigheden af at immunisere og dræbe dyr, efterfulgt af de trivielle adsorptions-og rensningstrin, som er nødvendig for at opnå blot de urene antisera ifølge den kendte teknik.

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af det mono klonale antistof kaldet 0KT6 er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8020 in vitro i et egnet medium eller indfører den intraperitonealt til mus, og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitrodyrkningen eller fra maligne 25 ascites eller serum fra musene. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af mangel eller overskud af 0KT6+ celler i et individ, især påvisning af T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-celle ALL), er ejendommelig ved at man omsætter en T-celle eller thymocytkomposition fra dette individ med en diagnostisk effektiv mængde af det monoklonale 30 antistof 0KT6 fremstillet ved den ovenfor omhandlede fremgangsmåde og måler procentdelen af den totale perifere T-celle og thymocyt-population, som reagerer med dette antistof.

Hybridomacellelinien ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at det er hybridomacellelinie ATCC nr. CRL 8020.

35 Den omhandlede hidtil ukendte hybridomacellelinie ATCC nr. CRL 8020 er blevet fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Milstein og Kohier. Efter immunisering af mus med normale humane thymocyter, fusioneredes de immuniserede mus' milt-celler med celler fra en muse-

DK 154090B

6 myeloma-1inie og de resulterende hybridomas screenedes for sådanne med supernatanter indeholdende antistof, som gav selektiv binding til normale E-roset positive humane T-celler og/eller thymocyter. De ønskede hybridomas blev derefter klonet og karakteriseret. Som resultat opnåedes 5 hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8020, som danner antistof (kaldet 0KT6) over for et antigen på omkring 70% af normale humane thymocyter.

Ikke alene reagerer dette antistof med omkring 70% af normale humane thymocyter, men det reagerer heller ikke med normale perifere blod-lymfoide celler eller knoglemarvs-celler.

10 I betragtning af de anførte vanskeligheder ved den kendte teknik og manglen på success, som er rapporteret ved anvendelse af maligne cellelinier som antigen, var det selvom hybridomacellelinien er opnået på i og for sig kendt måde ikke til at forudsige, om det var muligt at tilvejebringe det ønskede hybridoma. Det skal understreges, at den 15 uforudsigelige natur af hybrid-celle fremstilling ikke gør det muligt at ekstrapolere fra et antigen eller cellesystem til et andet. Det har endda i forbindelse med den foreliggende opfindelse vist sig, at anvendelse af en T-celle malign cellelinie eller rensede antigener adskilt fra celle-overfladen som antigen var generelt uden gunstigt 20 resultat.

Det omtalte hybridoma blev den 21. november 1979 deponeret hos American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,

Maryland 20852, og har fået tildelt ATCC accessionsnummer CRL 8020.

Fremstillingen og karakteriseringen af det omhandlede hybrido-25 ma og det resulterende antistof vil blive nærmere forklaret i det følgende.

Fremgangsmåden til fremstilling af det omhandlede hybridoma omfatter følgende trin: 30 A. Man immuniserer mus med normale, humane thymocyter.

B. Miltene fjernes fra de immuniserede mus og der fremstilles en milt-suspension i et passende medium.

35 C. De suspenderede milt-celler fusioneres med muse-myeloma- celler fra en passende celle-linie ved anvendelse af en passende fusionspromoter.

DK 154090 B

7 D. Man fortynder og dyrker i separate beholdere blandingen af ufusionerede milt-celler, ufusionerede myeloma-celler og fusionerede celler i et selektivt medium, som ikke nærer de ufusionerede myeloma-celler i et tidsrum, som er til -5 strækkel ig til at de ufusionerede celler dør.

E. Man vurderer supernatanten i hver beholder (fordybning), som indeholder et hybridoma, for tilstedeværelsen af antistof mod E-roset positive rensede humane T-celler eller 10 thymocyter.

F. Man udvælger (fx. ved begrænsningsfortynding) og kloner hybridomas, som producerer det ønskede antistof.

15 Det monoklonale antistof kan produceres på én af to måder. Det reneste monoklonale antistof dannes ved in vitro dyrkning af det omhandlede hybridoma i et egnet medium i et passende tidsrum efterfulgt af udvinding af det ønskede antistof fra supernatanten. Det egnede medium og den egnede dyrkningstid kendes eller kan let bestemmes. Denne in 20 vitro metode danner i det væsentlige monospecifikt monoklonalt antistof, der er i det væsentlige frit for andet specifikt antihuman immungi obul in. Der er en lille smule andet immun-giobul in til stede eftersom mediet indeholder xenogent serum (fx. foetalt kalveserum). Denne in vitro metode kan imidlertid ikke producere en tilstrækkelig mængde eller 25 koncentration af antistof til visse formål, eftersom koncentrationen af monoklonalt antistof kun er ca. 50 øg/ml.

Til fremstilling af en meget større koncentration af en smule mindre rent monoklonalt antistof kan det omhandlede hybridoma injiceres i mus, fortrinsvis syngeniske eller semi-syngeniske mus. Hybridomaet 30 vil bevirke dannelse af antistof-producerende tumorer efter en passende inkubationstid, som vil resultere i en høj koncentration af det ønskede antistof (ca. 5-20 mg/ml) i blodbanerne og peritonealt exudat (ascites) hos værtsmusene. Selvom disse værtsmus også har normale antistoffer i deres blod og ascites, er koncentrationen af disse normale antistoffer 35 kun ca. 5% af den monoklonale antistof-koncentration. Da disse normale antistoffer endvidere er ikke antihumane med hensyn til deres specificitet, er det fra udvundet ascites eller fra serum opnåede monoklonale antistof i det væsentlige fri for noget forurenende anti-

DK 154090B

8 humant immun-globulin. Dette monoklonale antistof har høj titer (aktiv ved fortyndinger på 1:50.000 eller mere) og højt forhold mellem specifikt og non-specifikt immun-globulin (ca. 1/20). Immun-globulin produceret under inkorporering af de såkaldte "k light" myeloma-kæder 5 er non-specifikke "nonsens" peptider, som blot fortynder det monoklonale antistof uden at nedsætte dets specificitet.

Eksempel 1

Fremstilling af monoklonale antistoffer 10 A. Immunisering og somatisk celle-hybridicerina CAF,-mus af hunkøn (Jackson Laboratories, 6-8 uger gamle) 1 7 immuniseredes intraperitonealt med 2 x 10 humane thymocyter i 0,2 ml fosfat-forpufret saltopløsning med 14 dages intervaller. Fire dage efter 15 den tredje immunisering fjernedes milten fra musene og en enkelt celle-suspension fremstilledes ved at presse vævet gennem et rustfrit stålnet. Celle-fusion foretoges iht. den af Kohier og Milstein udviklede o metode. 1 x 10 splenocyter fusioneredes i 0,5 ml fusionsmedium indeholdende 35% polyethylenglycol (PEG 1000) og 5% dimethyl sulfoxid i 20 "RPMI 1640" medium (Gibco, Grand Island, NY) med 2 x Ϊ07 P3X63Ag8Ul myeloma-celler leveret af Dr. M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx. NY. Disse myeloma-celler sekreterer IgGj κ light kæder.

25 B. Udvælgelse og vækst af hvbridoma

Efter celle-fusion dyrkedes celler i HAT medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% CO2 i en fugtig atmosfære.

Adskillige uger senere tilsattes 40 til 100 μΐ supernatant fra kulturer g indeholdende hybridomas til en tablet af 10 perifere lymfocyter adskilt 30 i E-roset positive (E+) og E-roset negative (E") populationer, som var fremstillet ud fra blod af sunde humane donorer som beskrevet af Mendes (J. Immunol. 111:860, 1973). Påvisning af muse-hybridoma-antistoffer, som binder til disse celler, bestemtes ved indirekte immunofluorescens.

Celler inkuberet med dyrknings-supernatanter stænkedes med et 35 fluoresceret gede-anti-muse IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories,

Springfield, VA, F/p = 2,5) og de fluorescerende antistof-belagte celler analyseredes dernæst på cytof1uorograf "FC200/4800A" (Ortho Instruments, Westwood, MA) som beskrevet i eksempel 2. Hybridoma-kul turer indehol-

DK 154090 B

9 dende antistoffer, der reagerede specifikt med thymocyter udvalgtes og klonedes to gange ved begrænsnings-fortyndingsmetoder i nærværelse af føde-celler. Derefter overførtes klonerne intraperitonealt ved injektion af 1 x 10^ celler af en given klon (0,2 ml volumen) i CAFj-mus, der 5 var forbehandlet med 2,6,10,14-tetramethylpentadecan leveret af Aldrich Chemical Company under navnet "Pristine". De maligne ascites fra disse mus anvendtes dernæst til karakterisering af lymfocyter som beskrevet nedenfor i eksempel 2. Det pågældende hybrid-antistof OKT6 blev ved standardteknik påvist at være af IgGj underklasse.

10

Eksempel 2

Karakterisering af 0KT6 reaktivitet A. Isolering af lymfocyt-populationer 15 Humane perifere blod-mononukleære celler isoleredes fra raskefri-villige donorer (alder 15-40) ved hjælp af "Ficoll-Hypaque" densitetsgradient-centrifugering (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) efterfulgt af teknikken beskrevet af Boyum i Scand. J. Cl in. Lab.

Invest. 21 (Suppl. 97):77, (1968). Ufraktionerede mononukleære celler 20 opdel tes i overflade Ig+ (B) og Ig‘ (T plus nul) populationer ved hjælp af "Sephadex G-200" anti-F(ab')2 søjlekromatografi som tidligere beskrevet af Chess, et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). T-celler blev vundet ved E-rosettering af Ig" populationen med 5% fåre-erythrocyter (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Den rosetterede blanding 25 lagdeltes over Picoll-Hypaque og den vundne E+-tablet behandlet med 0,155M NH^Cl (10 ml per 108 celler). Den således opnåede T-celle population var mindre end 2% EAC-roset positiv og mere end 95¾ E-roset positiv bestemt ved standardmetoder. Endvidere blev den non-rosetterende Ig" (nul-celle) population udvundet fra Ficoll - interfladen. Denne 30 sidstnævnte population var mindre end 5¾ E+ og mindre end eller lig 2% slg+. Overflade Ig+ (B) populationen opnåedes fra "Sephadex G-200" kolonnen efter eluering med normal human gamma-globulin som tidligere beskrevet. Denne population var mere end 95% overflade IG+ og mindre end 5% E+.

35 Normale humane knogl emarvs-cel ler opnåedes fra den bageste hoftebensrand af normale frivillige personer ved nåleaspiration.

DK 154090 B

10 B. Isolering af thvmocvter

Normal human thymus-kirtel opnåedes fra patienter med en alder mellem 2 måneder og 14 år, som var under korrektiv kardial-kirurgi.

Frisk opnåede portioner af thymus-kirtlen anbragtes straks i 5% foetalt 5 kalve-serum i medium "199" (Gibco) fint parteret med forceps og saks, og tildannedes derefter til enkeltcelle-suspensioner ved presning gennem trådnet. Cellerne lagdeltes dernæst over Ficoll-Hypaque og blev spundet og vasket som beskrevet i afsnit A ovenfor. De således opnåede thymo-cyter var mere end 95% levende og mere end eller lig 90% E-roset 10 positiv.

C. Cellelinier af T-linie οα T akut Ivmfoblastisk leukæmia celler T-celle linier CEM, HSB-2 og M0LT-4, der kan opnås fra American

Type Culture Collection under accessionsnumrene ATCC nr. CCL 119, ATCC 15 nr. CCL 120.1 og ATCC nr. CRL 1582, leveredes af Dr. H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukæmiceller opnåedes fra 25 patienter med diagnosticeret T-celle ALL. Disse individers tumorer var forud bestemt at være af T-celle linie ved deres spontane roset-dannelse med fåre-erythrocyter (> 20% E+) og reaktivitet med T-celle specifikke 20 hetero-antisera, anti-HTL (B.K.) og A99, som tidligere beskrevet. Tumorpopulationer kryopræserveredes i -196°C dampfase flydende nitrogen i 10% DMS0 og 20% AB humant serum indtil tidspunktet for overfladekarak-terisering. Alle analyserede tumor-populationer var mere end 90% biastomer ved Wright-Giemsa morfologi af cytocentrifuge-præparationer.

25

Cvtofluoroarafisk analyse oo celledeling

Cytofluorografisk analyse af monoklonale antistoffer med alle celle-populationer foretoges ved indirekte immunofluorescens med fluo-rescein-konjugeret gede-anti-muse IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories) 30 under anvendelse af en cytof1uorograf "FC200/4800A" (Ortho Instruments).

I korte træk behandledes 1 x 10® celler med 0,15 ml 0KT6 ved 1:500 fortynding, inkuberedes ved 4°C i 30 minutter og vaskedes to gange.

Cellerne reagerede dernæst med 0,15 ml af en 1:40 fortynding G/M FITC ved 4°C i 30 minutter, centrifugeredes og vaskedes 3 gange. Celler 35 analyseredes dernæst på cytofluorografen og fluorescens-intensiteten per celle registreredes på en impulshøjde-analysator. Et tilsvarende reaktivitetsmønster iagttoges ved en fortynding på 1:10.000, men yderligere fortynding bevirkede tab af reaktivitet. Baggrundspietning 11

DK 154090B

opnåedes ved at substituere en 0,15 ml portion 1:500 ascites fra en CAFj mus, der var intraperitonealt injiceret med en non-producerende hybrid klon.

I forsøg, der involverede antistof og komplement medieret lymfo-5 lyse, dyrkedes thymocyter og perifere T-celler efter selektiv lysis natten over og analyseredes dernæst på Cytofluorografen.

Lvsis af lvmfoide populationer med monoklonalt antistof oa komplement g 40 x 10 perifere T-celler eller thymocyter anbragtes i et 15 ml 3 10 plastikrør (Falcon, Oxnard, CA). Celletabletter inkuberedes med 0,8 cm OKT3, 0KT4, 0KT8 eller normale ascites som kontrol fortyndet 1:200 i PBS, resuspenderedes og inkuberedes ved 20°C i 60 minutter. Dernæst sattes 0,2 cm frisk kanin komplement til de med antistof behandlede populationer, resuspenderedes, og inkuberedes yderligere ved 37°C i et 15 rystende vandbad i 60 minutter. Ved afslutning af denne periode centrifugeredes cellerne og levedygtige celler taltes ved Trypan-blå eksklusion. Efter tælning vaskedes cellerne yderligere to gange i 5% FCS, anbragtes i slutmedier [RPMI 1640 (Grand Island Biological Company,

Grand Island, NY) indeholdende 20% AB+ humant serum, 1% penicillin-20 streptomycin, 200 mM L-glutamin, 25 mM HEPES puffer og 0,5% natriumbi carbonat] og inkuberedes natten over i en fugtig atmosfære med 5% C02 ved 37°C.

Der henvises i det følgende til tegningen.

Figur 1 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster 25 efter reaktion af normale humane thymocyter med 0KT6 og andre mono-klonale antistoffer ved 1:500 fortynding og G/M FITC. Baggrunds-fluorescens-pletning opnåedes ved at inkubere hver population med en 1:500 fortynding af ascites-fluidum fra en mus injiceret med en ikke-producerende klon.

30 Figur 2 viser stadierne af intrathymisk differentiering hos mennesker.

Tabel (I) viser reaktiviteten af 0KT6, 0KT8, 0KT9 og OKT10 (jfr. beskrivelserne til de danske patentansøgninger nr. 5174/80, 5172/80 og 5173/80) med forskellige humane lymfoide celle-populationer. Det mono-35 klonale antistof 0KT6 er reaktivt med omtrentlig 70% af normale humane thymocyter og ikke med nogen af de andre testede lymfoide celler. Dette reaktivitetsmønster udgør én test, ved hvilken det pågældende antistof 0KT6 kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

DK 154090 B

12

Figur I viser et repræsentativt fluorescens-mønster opnået på Cytofl uorografen efter reaktion af normale humane thymocyt-suspensioner med en 1:500 fortynding af 0KT3, 0KT4, 0KT5 (jfr. beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3948/80), 0KT6, 0KT8, OKT9, 0KT10 og G/M FITC.

5 Lignende reaktivitetsmønstre iagttoges ved yderligere 12 af de testede normale humane thymocytpopulationer. Som det kan ses, består der betydelige forskelle både i reaktivitetsprocenten og fluorescensintensiteten for hvert af disse monoklonale antistoffer. Fx. reagerer OKT9 med omkring 10% af thymocyter med lav fluorescens-intensitet, 10 hvorimod 0KT5, 0KT6, 0KT8 og 0KT10 reagerer med omkring 70% af thymocyter ved en højere fluorescens-intensitet. 0KT4, som reagerer med 75% af thymocyter, ligger imellem 0KT9 og det monoklonale antistof, hvilket giver et mønster med højere fluorescens-intensitet. Ydermere viser figur 1, at omkring 15% af thymocyter bliver påvist med 0KT3 ved 15 indirekte immunofluorescens. OKTl, hvis reaktivitetsmønster praktisk taget er identisk med 0KT3 på thymocyter, er ikke vist. Reaktivitetsmønsteret i figur 1 er en anden test, ved hvilken det pågældende antistof 0KT6 kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Tabel (II) viser fordelingen af antigener bestemt ved forskellige 20 monoklonale antistoffer på humane perifere T-celler og lymfocyter, som bestemt i rækken af lysis-forsøg beskrevet her. Da kun 0KT3, 0KT4 og 0KT8 var komplement fikserede monoklonale antistoffer, blev disse tre benyttet.

Som vist i tabel (IIA) reagerer hele T-celle populationen med 0KT3, 25 hvorimod 0KT4, OKT5 og 0KT8 reagerer med hhv. 60%, 25% og 34% af T-celler. Lysis med 0KT4 og komplement formindskede det totale antal med 62% og udelukkede især 0KT4+ populationen. Ydermere forøgedes procentdelen af 0KT5+ og 0KT8+ celler og der fandtes ingen virkning på det absolute antal 0KT5+ og 0KT8+ T-celler. Disse forsøg tydede på, at 0KT4+ 30 var forskellig fra 0KT5+ og 0KT8+ populationerne. Yderligere støtte for denne konklusion opnåedes ved lysis af T-celler med 0KT8 og komplement.

I dette tilfælde forøgedes procentdelen af 0KT4+ T-celler, det absolute antal forblev det samme, og 0KT8+ og 0KT5+ populationer elimineredes. Derudover demonstrerede disse resultater, at 0KT8+ populationen var 35 reciprok til 0KT4+ populationen og indeholdt hele 0KT5+ T-celle delmængden.

Lignende forsøg med humane thymocyt-populationer gav forskellige resultater. Som vist i tabel (IIB), var omkring 75% af thymocyter 0KT4+

DK 154090 B

13 og 0KT8+. Desuden blev efter lysis med enten 0KT4 eller 0KT8 kun 25% af thymocyter tilbage. Hovedparten af de resterende thymocyter reagerede med 0KT3, hvorimod kun et fåtal reagerede med 0KT6. Disse resultater viser, at hoved-populationen af humane thymocyter bærer 0KT4, 0KT5, OKT6 5 og 0KT8 overflade-antigenerne på samme celle. Derudover viser tabel (II), at der efter behandling med 0KT8 eller 0KT4 sker en påfaldende forøgelse af de modne thymocyter, som bærer OKT3 antigenen. Således har hovedparten af 0KT3 reaktive thymocyter allerede adskilt sig i 0KT4+ eller 0KT8+ delmængder, da størstedelen af de resterende celler efter 10 0KT4 eller 0KT8 lysis er 0KT3+. Hvis 0KT3+ subpopulationen var både 0KT4+ og 0KT8+, ville lysis med et hvilket som helst monoklonalt antistof have fjernet de 0KT3 reaktive thymocyter.

Til yderligere bestemmelse af forholdet mellem 0KT3 reaktive thymocyt-subpopulationer og de andre monoklonalt antistof bestemte 15 thymocytfraktioner, behandledes thymocyter med 0KT3 og komplement og de resterende celler sammenlignedes dernæst med ubehandlede thymocyt-populationer. Som vist i tabel (116), fjernede QKT3 og komplement 25% af thymocyter. Desuden skete der ingen større tab af 0KT4, 0KT5, 0KT6 eller 0KT8 reaktive populationer. Disse resultater tyder på, at en helt over-20 vejende del af thymocyter med 0KT6 mærkning er indeholdt i 0KT3’ populationen. Derudover tyder disse resultater på, at også thymocyter, som samtidig udtrykker antigener defineret som 0KT4, 0KT5 og 0KT8, er begrænset til 0KT3" populationen. Opmærksomheden henledes også på, at den 0KT9 reaktive thymocyt-population ikke formindskedes efter 0KT3 og 25 komplement-behandling af de ufraktionerede thymocyter, hvilket viser, at 0KT9+ subpopulationen hovedsagelig er begrænset til 0KT3" thymocyt-populationen.

På basis af disse resultater har det været muligt at beskrive stadierne af intrathymisk udvikling af humane thymocyter. Som vist 30 i figur 2, bærer praktisk taget alle thymocyter 0KT10 mærkningen.

Endvidere erhverver thymocyter i et tidligt stadium 0KT9 mærkningen (hhv. Thyl og Thy2). Dette stadium definerer minoriteten af thymocyter og tegner sig for ca. 10% af den ufraktionerede population. Derefter erhverver humane thymocyter et unikt thymocyt-antigen defineret af 0KT6 35 og udtrykker samtidig 0KT4, 0KT5 og 0KT8 (Thy4). Denne sidstnævnte subpopulation repræsenterer hovedparten af thymocyter og tegner sig for op til 70-80% af den thymiske population. Ved yderligere modning taber thymocyter 0KT6 reaktivitet, erhverver 0KT3 (og 0KT1) reaktivitet og

DK 154090B

14 adskiller sig i 0KT4+ og 0KT5+/0KT8+ delmængder (Thy7 og Thy8). Endelig taber thymocyten ved flytning til den perifere T-celle afdeling tilsyneladende 0KT10 mærkningen, da dette antigen mangler på praktisk taget alle perifere T-lymphocyter. Mulige overgangsstadier mellem disse 5 tre hovedstadier af thymisk udvikling betegnes som Thy3, Thy5 og Thy6 i figur 2.

Da akut lymfoblastisk leukæmia af T-afstamning kan tænkes at hidrøre fra umodne thymocyter, bestemtes forholdet mellem tumorceller fra individer med T-ALL og disse foreslåede stadier af intrathymisk 10 differentiering. Der undersøgtes 25 tumorcelle-populationer fra individer med T-ALL og tre T-celle linier, som tidligere var blevet undersøgt med konventionelle anti-T-celle reagenser og E rosettering. Som vist i tabel (III), var hovedparten af T-ALL leukæmiske celler reaktive med enten OKTIO alene eller 0KT9 og 0KT10 og reagerede ikke med de andre 15 monoklonale antistoffer. Således havde tilsyneladende 15/25 af de undersøgte tilfælde tidlige thymocyt-antigener (stadium I). Derimod var 5/25 af tilfældene reaktive med 0KT6, hvilket tyder på afstamning fra en mere moden thymuspopulation (stadium II). Denne T-ALL gruppe var selv heterogen med henblik på 0KT4, 0KT8 og 0KT9 reaktivitet som vist i tabel 20 (III). Celler fra 2/5 patienter har flest af de almindelige thymocyt-antigener inklusive 0KT4, 0KT6 og 0KT8. Det fortjener opmærksomhed, at 0KT5 ikke er til stede på nogen af disse fem stadie-(II) tumorer, selvom 0KT8 reaktiviteten iagttoges. Dette sidstnævnte resultat tyder klart på, at 0KT5 og 0KT8 definerer forskellige antigener eller forskellige 25 determinanter på samme antigen. Endelig kom tumorerne hos 1/25 af patienterne fra en moden thymocytpopulation (stadium III), hvilket bestemtes ved dens reaktivitet med 0KT3. Dette individs tumor reagerede yderligere med 0KT5, 0KT8 og 0KT10. Ud fra de 25 analyserede leukæmi-populationer kunne kun 4 tumorer ikke klassificeres entydigt. Tre var 30 positive med 0KT4 og 0KT8, men manglede 0KT3 og 0KT6 og repræsenterede højst sandsynligt overgangsstadier fra Thy4 og Thy7,8. Et ud af 25 tilfælde var tilsyneladende et overgangsstadium fra Thy3 til Thy4, da det havde 0KT8 og 0KT10 reaktivitet.

T-celle linier, som afstammede fra T-ALL tumor-populationer 35 repræsenterede også celler fra et specifikt stadium af intrathymisk differentiering. Som vist i tabel 4, reagerede HSB udelukkende med 0KT9 og 0KT10 og definerer derfor en tumorpopulation opnået fra stadium I. I modsætning hertil reagerede CEM med 0KT4, 0KT6, 0KT8, 0KT9 og 0KT10

DK 154090 B

15 og stammede tilsyneladende fra en thymocyt af stadium II. Endelig repræsenterer MOLT-4 tilsyneladende en leukæmisk transformation ved et stadium mellem HSB-2 og CEM, da det udtrykte OKT6, 0KT8, OKT9 og OKTIO.

Da patienter med fremskredne stadipf4 (fx. stadium II) af T-celle 5 akut lymfoblastisk leukæmi viste sig^åx have længere sygdomsfri overlevelse end patienter med stadium7! ALL, tillader anvendelsen af 0KT6 antistof konklusioner angående prognosen for en bestemt patient med Τ'-cel le ALL. /

Tabel (V) viser sammenhængen mellem niveauet af perifere T-celler 10 og T-celle delmængder og fprskellige sygdomstilstande. Denne sammenhæng kan anvendes til diagnost/ske formål (fx. for at påvise akut infektiøs mononukleosis) ved at analysere blodprøven af et individ, som mistænkes for at have en af dissp sygdomstilstande, for at bestemme niveauet af T- celler og T-celle delmængder. Denne sammenhæng kan også anvendes til / 15 terapeutiske formål,/når årsagen til sygdomstilstanden er et forhøjet niveau af en T-cellé- delmængde (fx. type I erhvervet agammaglobu-linæmia). Til terapeutisk anvendelse vil administrering af det passende monoklonale antistof til en patient med forhøjet T-celle delmængde niveau formindske eller eliminere overskuddet. De i tabel (II)-(V) viste 20 sammenhænge er en anden måde, på hvilken 0KT6 antistof kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Tabel I

25 Reaktivitet af monoklonalt antistof på humane Ivmfoid-DODulationer

Monoklonalt Perifert blod Knoglemarv (6) Thymus (22) antistof_(301 _ 30 E+ E" 0KT6 0% 0% 0% 70% 0KT8 30% 0% <2% 80% 0KT9 0% 0% 0% <10% OKTIO <5% 10% <20% 95% 35

Tallene i parentes angiver antallet af testede prøver; %-værdier er gennemsnitlige.

DK 154090 B

16 «ί ο .2 ® *± \- iii N in w ίο r fe * 05 fv oo co fe ^ O O) ro Ό r οι ω *— I v — C iii » ω in w · -χ c- v) O) 0 O O) Ό.

c _c “ 1 «o · e TJ S ss° S s ° s » <o i- ® o ro , Φ ε X n e ^ <2 > i. CD —

O OOO £ O 00 CM -S

E a * to^-^oo g. > > 2 0 I· -s

XI ^ ro m « C

ro ^ c_ l_ „ c ro > O) I- moo o lo o o ro ro o 4— ^ CM r- ^ CO oo ro* Ϊ i- ra 0 ^ ^ fe -2 <*° c g- I ro - j* § *- ti V O O CM JO O LD O <U J- -gi- ^ 5| (O 05 ^ ro ro -ro s. ro .E i ro gro S {2 5 * ro·- Sv: co lo lo o o ίο o -n — = .51 ro æo 050505 cococo ]g 3 _ +; α E ro

5 S · « K

(D u_. — · H ro I fe £ -g

.s = S -fe I

ro °ro ro -Q 4_> "P a c ro ro ro ro ro ro ro

Jr Ό OOO OOO O J ® (P O C 5-r-i- r-τ-ί-ί- c — ^ +i 3 n ro - m > XXX X X X X .2 _ ro£ C O CM CM O O LO O _2ο\0 = ra 2, ^ r- - CO -=5¾ ro ra ® in lo 05 o vii

X 4-> <“ M g- V

“ «5 S o- fe £ I S o> > v ° in -*· 4J t_ O — S_ (i) || ΐ * E ° Bi (0 Ί- SL 3 υ c - g- s.

.2 ffl* 4- * o. Y5 c ro Y I ϋ ϋ tjJuDu ro<= = 3 H Ό . . £ Ό + Ό o i o. c++ >c+ + + <u — 0 f® ^ 00 g 2 M* 00 CO =5 . 9-

°· oj "S I— i— ^ ro 1— I— I— c ro E

Ό £ ,α x x E .o x x x 2>.5 £ »30° |=ooo I I „ 1 · 3 ® u _! < DQ * +-

DK 154090 B

17 i ω W in

< O) S

I C c g h τ E u E i g I il I S II ^ 00 "" - W - ^|V 3 E '5 TO S r I N S O c +3 C lu 5 TO v»^ s_ U) Q.

1 "m TO "Π TO

·- I * I 3 "S < t) 2 .

Ϊ i. O) — c to σ> "33

.5 o + "ro 5 V

£ |— , TO i. o 8Jv£:++ + + + + +o to£ 3 0 ^ O 5 - O (3) u- TO 0f0 * s. P , + + , , , · Φ a

Sig 1 Ξ s ®

in ία i to ,E

to - c -Ω £ £ 5. ° ω Ξ ° c ^ ' +++ + £ 5= ά

- I ~ O 1 * -S

5 - g ΐί E c ro ^ C p „up

L 3 o h TO U

To o xxx ·<!) <nO)

X! O — TO

**- m ® o\° jQ

TO ^ Ό o £ m Ό co ra S .p h i , + c v" £ to * ' ' i... + - M-

~ ϋ O « · I TO

ΐ> > ϋ CVJ ^ TO

m S TO i- in -jj £ S ^ <’ ++ii ' ^ σ> ό ^ s* ° ; _ s · 5 co i p .E i * $ ' ' ·... + .i TO <“ .* J5 0 CVJ S. TO p ^ V +- >· TO Jr CU p ^ -c 1. 4-* ~ > C 1- £ s t; > > n ^ ^ r? Ei. --4-1 i -c 4-> y d +? -* TO 1— ti >* c Ί-* > m ro

— J, >> U C J- TO TO

gi £ g § £ 2 h 2 ^ z il- - S 2 | 8 i ~ TO in >-Q) = Ό rii ?> TO > > •p 3 — i D) “ /o ^ TO O) ,> C - 4-1 c c 5 c ω ^ cn c S ^ ^s-cn.tJro II ro ξ ΟΌ TTjODii ι^ίη -S£ (D in O) l_4J]!.,-D*M^MCf3|/iC0 TOm+jgaj to to s o. |— ·π — ^ OajTOa.c ifc 1 TOEffffroTOf >- £ ω 7Z 4_> . *4_) — j— )— [— |— 4->Lm|— -Ιο 0*) < CO (/) LL '—' * 4— +

DK 154090 B

18

Tabel IV

Reaktivitet med monoklonalt antistof Celle-linie 0KT3 0KT4 0KT5 0KT6 0KT8 0KT9 0KT10 HSB-2 + 5CEM - + - + + + + MOLT-4 ---++++ ft·

Kriterier for - og + reaktivitet var de samme som i tabel III.

10 Tabel V

Perifere T-celle niveauer ved sygdomstilstande Sygdomstilstand 0KT3+ 0KT4+ 0KT5+ 0KT8* 0KT6+

Primær galdecirrose (2) N +

Dissemineret sclerose 15 (frmskredet sygdom) (8) - N

Myasthenia Gravis (begyndende,ubehandlet)(3) 00000 Akut transpi./vært (3) 0 til - - 0 + +

Erhvervet agammaglobul i næmi a 20 type I 0 type II 0

Hyper-IgE (4) - N 0 til - 0 til -

Akut infektiøs mononukleose (4)* + 0 til - ++ ++ 0 25 Hodgkins sygdom I. og II. stadium N N N N 0 III. og IV. stadium N N N 0

Psoriasis (3/5) N + til ++ N N 0 30 N = inden for normale grænser 0 = fraværende + = over normal ++ = meget over normal - = under normal 35 -- = meget under normal ft disse niveauer vender tilbage til normal ca. en uge før de kliniske symptomer forsvinder "Tallene i parentes angiver antallet af vurderede patienter."

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof kaldet 0KT6, hvilket antistof: a) reagerer med omkring 70% af normale humane thymocyter, 5 men ikke med normale humane perifere T-celler, B-celler, nul-celler eller knoglemarvs-celler, b) udviser reaktivitetsmønsteret over for normale humane thymocyter vist i figur 1, c) udviser reaktivitetsmønsteret over for perifere T-celler og 10 thymocyter vist i tabel (II), d) udviser reaktivitetsmønsteret med T-celle ALL stadier vist i tabel (III)", e) reagerer med CEM (ATCC nr. CCL 119) og MOLT-4 (ATCC nr. CRL 1528) cellelinier, men ikke med HSB-2 (ATCC nr.

15 CCL 120.1) celle-linier, KENDETEGNET ved, at man dyrker hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8020 in vitro i et egnet medium eller indfører den intraperitonealt til mus og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

2. Hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det er hybridomacel! el i ni e ATCC nr. CRL 8020.

3. Fremgangsmåde til påvisning af en mangel eller et overskud af 0KT6+ celler i et individ især til påvisning af T-celle akut lymfo-25 bl atisk leukæmi (T-celle ALL), KENDETEGNET ved, at man omsætter en T-celle- eller thymocytkomposition fra dette individ med en diagnostisk effektiv mængde af det monoklonale antistof 0KT6 fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 og måler procentdelen af den totale perifere T-celle- og thymocytpopulation, som reagerer med dette anti-30 stof. 35