DK154092B - Fremgangsmaade til fremstilling af et monoklonalt antistof, hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmaaden samt fremgangsmaade til diagnose og diagnostisk praeparat med det fremstillede monoklonale antistof - Google Patents

Description

i

DK 154092B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof, en hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmåden samt en fremgangsmåde til diagnose og et diagnostisk præparat med det fremstillede monoklonale antistof.

5 Fusionen af muse-myeloma-celler til milt-celler fra immuniserede mus af Kohier og Milstein i 1975 (Nature 256, 495-497 (1975)) viste for første gang, at det var muligt at opnå en kontinuert celle-linie, der fremstiller homogent (såkaldt "monoklonalt") antistof. Siden dette grundlæggende arbejde har der været udfoldet store anstrengelser på at 10 fremstille forskellige hybride celler (kaldet "hybridomas") og på at anvende det ved hjælp af disse hybridomas fremstillede antistof til forskellige videnskabelige undersøgelser. Der henvises fx. til Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter og N. Warner, Editors, Springer-15 Verlag, 1978 og de deri angivne referencer, C.J. Barnstable, et al.,

Cell, 14, 9-20 (maj 1978), P. Parham og W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978), Handbook of Experimental Immunology, 3. udgave, bind 2, D.M. Wier, Editor, Blackwell, 1978, kapitel 25, og Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15-17. Disse referencer indikerer 20 samtidig belønningerne og komplikationerne ved at forsøge at fremstille monoklonalt antistof ud fra hybridomas. Selvom den almene teknik forstås principielt godt, mødes mange vanskeligheder og variationer kræves for hvert specifikt tilfælde. I virkeligheden er der ingen sikkerhed, forud for forsøget på at fremstille et givet hybridoma, for at det ønskede 25 hybridoma vil blive opnået, at det, hvis opnået, vil producere antistof eller at det således fremstillede antistof vil have den ønskede specificitet. Graden af succes påvirkes principalt af den anvendte antigen-type og den til isolering af det ønskede hybridoma anvendte udvælgelsesteknik.

30 Den tilstræbte fremstilling af monoklonalt antistof for humane lymfocyt celle-overflade antigener er kun blevet rapporteret i nogle få tilfælde. Se fx. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De i disse rapporterede forsøg anvendte antigener var dyrkede humane lymfoblastoide leukæmia og humane kroniske lymfocytiske 35 leukæmia celle-linier. Mange opnåede hybridomas syntes at danne antistof over for forskellige antigener på alle humane celler. Ingen af disse hybridomas dannede antistof over for en forud defineret klasse af humane lymfocyter.

DK 154092B

2

Det er endvidere fornylig blevet kendt, se fx. Reinherz, E.L., et al., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et al., Proc.

Natl. Acad. Sci., 76, 4061-4065 (1979); og Kung, P.C., et al., Science, 206, 347-349 (1979), at fremstille monoklonale antistoffer kaldet 0KT1, 5 3 og 4 ved hjælp af hybridomacellelinier. 0KT1 og 3 reagerer med alle humane perifere T-celler, mens 0KT4 reagerer med 55% af de humane perifere T-celler og 80% af thymocyterne.

Det bør forstås, at der findes to principielle klasser af lymfocyter, som er involveret i immunsystemet hos mennesker og dyr. Den 10 første af disse (den thymus-afledte celle eller T-celle) differentieres i thymus fra hæmopoietiske stam-celler. Mens de befinder sig i thymus, kaldes de differentierende celler for "thymocyter". De modne T-celler forlader thymus og cirkulerer mellem væv, lymfekar og blodbaner. Disse T-celler udgør en stor andel af mængden af recirkulerende 15 små lymfocyter. De har immunologisk specificitet og er direkte involveret i celle-medierede immun-reaktioner (såsom transplantationsafvisning) som effektor-celler. Selvom T-celler ikke sekreterer humorale antistoffer, kræves de under tiden for udskillelsen af disse antistoffer af den nedenfor omtalte anden klasse af lymfocyter. Nogle typer af T-20 celler har en regulerende funktion ved andre aspekter af immun-systemet. Mekanismen for denne proces ved celle-samvirke forstås endnu ikke fuldt ud.

Den anden klasse af lymfocyter (de benmarvs-afledte celler eller B-celler) er de som udskiller antistof. De dannes også fra hæmopoietiske 25 stam-celler, men deres differentiering bestemmes ikke af thymus. I fugle differentieres de i et med thymus analogt organ, kaldet Bursa Fabricii.

I pattedyr har man imidlertid ikke fundet et ækvivalent organ og det antages, at disse B-celler differentierer i benmarven.

Det anerkendes nu, at T-celler kan opdeles i mindst adskillige 30 undertyper, kaldet "hjælpe", "suppressor", og "dræbe" T-celler, der har den funktion (hhv.) at fremme en reaktion, undertrykke en reaktion eller dræbe (lysere) fremmede celler. Disse underklasser forstås godt inden for musefamilien, men er kun for nyligt blevet beskrevet for humane systemer. Se fx. R.L. Evans, et al., Journal of Experimental Medicine, 35 bind 145, 221-232, 1977 og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, Editor,

Plenum Press, 1977, bind 7, 363-379.

DK 154092 B

3

Evnen til at identificere eller undertrykke klasser eller underklasser af T-celler er vigtig for diagnosen eller behandlingen af forskellige immuno-regulatoriske uregelmæssigheder eller tilstande.

Fx. har visse leukæmityper og lymfomas forskellig prognose i 5 afhængighed af, om de er af B-celle eller T-celle oprindelse. Således afhænger vurderingen af sygdomsprognosen af, at man kan skelne mellem disse to klasser af lymfocyter. Se fx. A.C. Aisenberg og J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (marts 1975), D. Bel pomme, et al., i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, 10 et al., eds, Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Belpomme, et al.,

British Journal of Haematology, 1978, 38, 85.

Visse sygdomstilstande (fx. juvenil rheumatoid arthritis, maligne tilstande og agammaglobulinæmi) hænger sammen med en ubalance af T-celle underklasser. Det er blevet foreslået, at autoimmune sygdomme i 15 almindelighed hænger sammen med et overskud af "hjælpe" T-celler eller mangel på visse "suppressor" T-celler, mens agammaglobulinæmi hænger sammen med et overskud af visse "suppressor" T-celler. I almindelighed hænger maligne tilstande sammen med et overskud af "suppressor" T-celler.

20 I visse leukæmityper produceres overskud af T-celler på et hæmmet udviklingsstade. Diagnosen kan derfor afhænge af muligheden for at påvise sådan ubalance eller overskud og for at bestemme, hvilken udviklingsfase er i overskud. Se. fx. J. Kersey, et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i 25 Haematology and Blood Transfusion, bind 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 og de deri anførte referencer, og E.L. Reinherz, et al., J. Cl in.

Invest., 64, 392-397 (1979).

Erhvervet agammaglobulæmi, som er en sygdomstilstand, hvor der ikke produceres immunt globulin, omfatter mindst to forskellige typer. I type 30 I skyldes manglen på at producere immunt globulin et overskud af suppressor T-celler, mens den i type II skyldes en mangel på hjælpe T-celler. I begge typer synes der ikke at være nogen defekt eller mangler i patienternes B-celler, lymfocyterne som er ansvarlige for den aktuelle sekretion af antistoffet. Imidlertid er disse B-celler enten undertrykte 35 eller "ikke hjulpne", hvilket fører til stærkt formindsket eller manglende immungiobul in-produktion. Typen af erhvervet agammaglobulinæmi kan således bestemmes ved at teste for et overskud af suppressor T-celler eller et fravær af hjælpe T-celler.

DK 154092B

4 På den terapeutiske side er der en endnu ikke endeligt bevist forskning om, at administrering af antistoffer over for T-celle subtypen i overskud kan have terapeutisk gavnlig virkning på autoimmune sygdomme eller maligne tilstande. Fx. kan en hjælpe T-celle cancer 5 (visse kutane T-celle lymphomatyper og visse T-celle akut lymfoblasti ske leukæmityper) behandles med et antistof for et hjælpe T-celle antigen. Behandling af autoimmun sygdom forårsaget af et overskud af hjælpeceller kan også ske på samme måde. Sygdomme (fx. maligne tilstande eller erhvervet type I agammaglobulinæmi), som skyldes et overskud af 10 suppressor T-celler, kan behandles ved administrering af et antistof for et suppressor T-celle antigen.

Antisera mod hele klassen af humane T-celler (såkaldt antihuman thymocyt globulin eller ATG) har været anført som værdifulde terapeutisk på patienter, der modtager organ-transplantation. Da den celle-medierede 15 immunreaktion (mekanismen, hvorved transplantationer afvises) afhænger af T-celler, forebygger eller forsinker administrering af antistof mod T-celler denne afvisningsproces. Se fx. Cosimi, et al., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40:155-163 (1976) og de deri anførte 20 referencer, og Wechter, et al., "Manufacture of Antithymocyte Globulin for Clinical Trials", Transplantation, 28 (4), 303-307 (1979).

Identifikationen og undertrykkelsen af humane T-celle klasser og underklasser er tidligere sket ved anvendelse af spontane autoantistoffer eller selektive antisera for humane T-celler opnået ved immuni-25 sering af dyr med humane T-celler, tapning af dyrene til opnåelse af serum og adsorption af antiserum med (fx.) autologe, men ikke allogene Bceller til fjernelse af antistoffer med uønskede reaktiviteter. Fremstillingen af disse antisera er særdeles vanskelig, især i adsorptions-og rensningstrinnene. De adsorberede og rensede antisera kan endog 30 indeholde mange urenheder foruden det ønskede antistof, af adskillige grunde. For det første indeholder serum millioner af antistof-molekyler, selv før T-celle-immuni seringen. For det andet bevirker immuniseringen dannelse af antistoffer mod en lang række antigener, som findes på alle injicerede humane T-celler. Der er ingen selektiv dannelse af antistof 35 over for et enkelt antigen. For det tredje er titeren af specifikt antistof opnået ved sådanne metoder sædvanligvis meget lav (fx. inaktiv ved fortyndinger på mere end 1:100) og forholdet mellem specifikt og non-specifikt antistof er mindre end 1/10®, se fx. den ovenfor omtalte

DK 154092B

5 artikel af Chess og Schlossman (side 365 og følgende) og den ovenfor omtalte artikel i Chemical and Engineering News, hvor manglerne ved hidtil kendte antisera og fordelene ved monoklonalt antistof er beskrevet.

5 Der er nu fundet en ny hybridomacellelinie, som er i stand til at producere et hidtil ukendt monoklonalt antistof kaldet 0KT11 over for et antigen, som findes på i det væsentlige alle normale humane perifere Τεεί ler og på omkring 95% af normale humane thymocyter, men ikke på normale humane B-celler eller nul-celler.

10 Det således dannede antistof er monospecifikt for en enkelt determinant på i det væsentlige alle normale, humane perifere T-celler og indeholder i det væsentlige ingen anden antihuman immungi obul in, i modsætning til tidligere kendte antisera (som nødvendigvis er kon-tamineret med antistof, der er reaktivt over for talrige humane anti-15 gener) og til hidtil kendte monoklonale antistoffer (der ikke er monospecifikke for et humant T-celle og thymocyt antigen). Endvidere kan dette hybridoma dyrkes til fremstilling af antistof uden nødvendigheden af at immunisere og dræbe dyr, efterfulgt af de trivielle adsorptions-og rensningstrin, som er nødvendig for at opnå blot de urene antisera 20 ifølge den kendte teknik.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af det monoklonale antistof kaldet 0KT11 er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8027 in vitro i et egnet medium eller indfører den intraperitonealt til mus og udvinder 25 antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

Hybridomacellelinien ifølge opfindelsen til anvendelse ved ovennævnte fremgangsmåde til fremstilling af det monoklonale antistof er ejendommelig ved, at den er hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8027.

30 Fremgangsmåden til påvisning af en mangel eller et overskud af 0KT11+ celler i et individ er ejendommelig ved, at man omsætter en lymfocyt-komposition fra dette individ med en diagnostisk effektiv mængde af det monoklonale antistof 0KT11 fremstillet ved ovennævnte fremgangsmåde og måler procentdelen af populationen, som reagerer med 35 dette antistof.

Det diagnostiske præparat ifølge opfindelsen til påvisning af 0KT11+ celle overskud eller mangel er ejendommelig ved, at det i blanding med en diagnostisk acceptabel bærer omfatter det monoklonale

DK 154092 B

6 antistof 0KT11 fremstillet ved ovennævnte fremgangsmåde i en mængde, som er effektiv til at påvise 0KT11+ celle overskud eller mangel.

Den omhandlede hidtil ukendte hybridomacellelinie ATCC nr. CRL 8027 er blevet fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Mil stein 5 og Kohier. Efter immunisering af mus med leukæmiske celler fra et menneske med T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) fusioneredes de immuniserede mus' milt-celler med celler fra en muse-myeloma-linie og de resulterende hybridomas screenedes for sådanne med supernatanter indeholdende antistof, som gav selektiv binding til normale E-roset positive 10 humane T-celler og/eller E" humane celler. De ønskede hybridomas blev derefter klonet og karakteriseret. Som resultat opnåedes et hybridoma, som danner antistof (kaldet 0KT11) over for et antigen på i det væsentlige alle normale humane perifere T-celler. Ikke alene reagerer dette antistof med i det væsentlige alle normale humane perifere T-15 celler, men det reagerer også med omkring 95% af normale humane thymocyter, men reagerer ikke med normale humane B-celler eller nul-celler.

I betragtning af de anførte vanskeligheder ved den kendte teknik og manglen på succes, som er rapporteret ved anvendelse af maligne celle-20 linier som antigen, var det, selvom hybridomacellelinien er opnået på i og for sig kendt måde, ikke til at forudsige, om det var muligt at tilvejebringe det ønskede hybridoma. Det skal understreges, at den uforudsigelige natur af hybrid-celle fremstilling ikke gør det muligt at ekstrapolere fra et antigen eller celle system til et andet. Det har 25 endda i forbindelse med den foreliggende opfindelse vist sig, at anvendelse af en T-celle malign celle-linie eller rensede antigener adskilt fra celle-overfladen som antigen var generelt uden gunstigt resultat.

Det omtalte hybridoma blev den 13. december 1979 deponeret hos 30 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,

Maryland 20852, og har fået tildelt ATCC accessionsnummer CRL 8027.

Fremstillingen og karakteriseringen af det omhandlede hybridoma og det resulterende antistof vil blive nærmere forklaret i det følgende.

Fremgangsmåden til fremstilling af det omhandlede hybridoma 35 omfatter følgende trin: A. Man immuniserer mus med leukæmi celler fra et menneske med T-ALL.

DK 154092B

7 B. Miltene fjernes fra de immuniserede mus og der fremstilles en milt-suspension i et passende medium.

C. De suspenderede milt-celler fusioneres med muse-myeloma-- 5 celler fra en passende celle-linie ved anvendelse af en pas sende fusionspromoter.

D. Man fortynder og dyrker i separate beholdere blandingen af ufusionerede milt-celler, ufusionerede myeloma-celler og 10 fusionerede celler i et selektivt medium, som ikke nærer de ufusionerede myeloma-celler i et tidsrum, som er tilstrækkelig til at de ufusionerede celler dør.

E. Man vurderer supernatanten i hver beholder (fordybning), 15 som indeholder et hybridoma, for tilstedeværelsen af anti stof mod E-roset positive rensede humane T-celler eller thymocyter.

F. Man udvælger (fx. ved begrænsningsfortynding) og kloner 20 hybridomas, som producerer det ønskede antistof.

Det monoklonale antistof produceres på én af to måder. Det reneste monoklonale antistof dannes ved in vitro dyrkning af det omhandlede hybridoma i et egnet medium i et passende tidsrum efterfulgt af 25 udvinding af det ønskede antistof fra supernatanten. Det egnede medium og den egnede dyrkningstid kendes eller kan let bestemmes. Denne in vitro metode danner i det væsentlige monospecifikt monoklonalt antistof, der er i det væsentlige frit for andet specifikt antihuman immun-globulin. Der er en lille smule andet immun-globulin til stede eftersom 30 mediet indeholder xenogent serum (fx. foetalt kalveserum). Denne in vitro metode kan imidlertid ikke producere en tilstrækkelig mængde eller koncentration af antistof til visse formål, eftersom koncentrationen af monoklonalt antistof kun er ca. 50 pg/ml.

Til fremstilling af en meget større koncentration af en smule 35 mindre rent monoklonalt antistof kan det omhandlede hybridoma injiceres i mus, fortrinsvis syngeni ske eller semi-syngeni ske mus. Hybridomaet vil bevirke dannelse af antistof-producerende tumorer efter en passende inkubationstid, som vil resultere i en høj koncentration af det ønskede

DK 154092 B

8 antistof (ca. 5-20 mg/ml) i blodbanerne og peritonealt exudat (ascites) hos værtsmusene. Selvom disse værtsmus også har normale antistoffer i deres blod og ascites, er koncentrationen af disse normale antistoffer kun ca. 5% af den monoklonale antistof-koncentration. Da disse normale 5 antistoffer endvidere er ikke antihumane med hensyn til deres specificitet, er det fra udvundet ascites eller fra serum opnåede monoklonale antistof i det væsentlige fri for noget forurenende antihumant immun-giobul in. Dette monoklonale antistof har høj titer (aktiv ved fortyndinger på 1:50.000 eller mere) og højt forhold mellem 10 specifikt og non-specifikt immun-globulin (ca. 1/20). Immun-globulin produceret under inkorporering af de såkaldte "/c light" myeloma-kæder er non-specifikke "nonsens" peptider, som blot fortynder det monoklonale antistof uden at nedsætte dets specificitet.

15 Eksempel 1

Fremstil!ino af monoklonale antistoffer A. Immunisering oq somatisk celle-hvbridicerinq CAF,-mus af hunkøn (Jackson Laboratories, 6-8 uger gamle) 1 7

20 immuniseredes intraperitonealt med 2 x 10 humane leukæmiske T-ALL

celler i 0,2 ml fosfat-forpufret saltopløsning med 14 dages intervaller.

Fire dage efter den tredje immunisering fjernedes milten fra musene og en enkelt celle-suspension fremstilledes ved at presse vævet gennem et rustfrit stålnet.

25 Celle-fusion foretoges iht. den af Kohier og Milstein udviklede metode. 1 x 10 splenocyter fusioneredes i 0,5 ml fusionsmedium indeholdende 35% polyethylenglycol (PEG 1000) og 5% dimethyl sul foxid i "RPMI 1640" medium (Gibco, Grand Island, NY) med 2 x 107 P3X63Ag8Ul myeloma-celler leveret af Dr. M. Scharff, Albert Einstein College of 30 Medicine, Bronx. NY. Disse myeloma-celler sekreterer IgGj light kæder.

B. Udvælgelse og vækst af hvbridoma

Efter celle-fusion dyrkedes celler i HAT medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% C0^ i en fugtig atmosfære.

35 Adskillige uger senere tilsattes 40 til 100 1 supernatant fra kulturer indeholdende hybridomas til en tablet af 10® perifere lymfocyter adskilt i E-roset positive (E+) og E-roset negative (E") populationer, som var fremstillet ud fra blod af sunde humane donorer som beskrevet af Mendes

DK 154092B

9 (J. Immunol. 111:860, 1973). Påvisning af muse-hybridoma-antistoffer, som binder til disse celler, bestemtes ved indirekte immunofluorescens.

Celler inkuberet med dyrknings-supernatenter stænkedes med et fluoresceret gede-anti-muse IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories, 5 Springfield, VA, F/p = 2,5) og de fluorescerende antistof-belagte celler analyseredes dernæst på cytof1uorograf "FC200/4800A" (Ortho Instruments, Westwood, MA) som beskrevet i eksempel 2. Hybridoma-kul turer indeholdende antistoffer, der reagerede specifikt med E+ lymfocyter (T-celler) og/eller thymocyter udvalgtes og klonedes to gange ved 10 begrænsnings-fortyndingsmetoder i nærværelse af føde-celler. Derefter overførtes klonerne intraperitonealt ved injektion af 1 x 10^ celler af en given klon (0,2 ml volumen) i CAFj-mus, der var forbehandlet med 2,6, 10,14-tetramethylpentadecan leveret af Aldrich Chemical Company under navnet "Pristine". De maligne ascites fra disse mus anvendtes dernæst 15 til karakterisering af lymfocyter som beskrevet nedenfor i eksempel 2.

Det pågældende hybrid-antistof 0KT11 blev ved standardteknik påvist at være af IgG^ underklasse.

Eksempel 2 20 Karakterisering af 0KT11 reaktivitet A. Isolering af lymfocyt-populationer

Humane perifere blod-mononukleære celler i soleredes fra raske frivillige donorer (alder 15-40) ved hjælp af "Ficoll-Hypaque" densitets-25 gradient-centrifugering (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) efterfulgt af teknikken beskrevet af Boyum i Scand. J. Cl in. Lab.

Invest. 21 (Suppl. 97):77, (1968). Ufraktionerede mononukleære celler opdeltes i overflade Ig+ (B) og Ig" (T plus nul) populationer ved hjælp af "Sephadex G-200" anti-Fiab'^ søjlekromatografi som tidligere 30 beskrevet af Chess, et al., 0. Immunol. 113:1113 (1974). T-celler blev vundet ved E-rosettering af Ig" populationen med 5% fåre-erythrocyter (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Den rosetterede blanding lagdeltes over Picoll-Hypaque og den vundne E+-tablet behandlet med 0,155M NH^Cl (10 ml per 10® celler). Den således opnåede T-celle 35 population var mindre end 2% EAC-roset positiv og mere end 95% E-roset positiv bestemt ved standardmetoder. Endvidere blev den non-rosetterende Ig" (nul-celle) population udvundet fra Ficoll-interfladen. Denne sidstnævnte population var mindre end 5% E+ og mindre end eller lig 2%

DK 154092B

ίο $Ig+. Overflade Ig+ (B) populationen opnåedes fra "Sephadex G-200" kolonnen efter eluering med normal human.gamma-globul in som tidligere beskrevet. Denne population var mere end 95% overflade IG+ og mindre end 5% E+.

5 B. Isolering af thvmocvter

Normal human thymus-kirtel opnåedes fra patienter med en alder mellem 2 måneder og 14 år, som var under korrektiv kardial-kirurgi.

Frisk opnåede portioner af thymus-kirtlen anbragtes straks i 5% foetalt 10 kalve-serum i medium "199" (Gibco) fint parteret med forceps og saks, og tildannedes derefter til enkeltcelle-suspensioner ved presning gennem trådnet. Cellerne lagdeltes dernæst over Ficoll-Hypaque og blev spundet og vasket som beskrevet i afsnit A ovenfor. De således opnåede thymo-cyter var mere end 95% levende og mere end eller lig 90% E-roset 15 positiv.

Cvtofluoroorafisk analyse oa celledeling

Cytofluorografisk analyse af monoklonale antistoffer med alle celle-populationer foretoges ved indirekte immunofluorescens med fluo-20 rescein-konjugeret gede-anti-muse IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories) under anvendelse af en cytofluorograf "FC200/4800A" (Ortho Instruments).

I korte træk behandledes 1 x 10® celler med 0,15 ml 0KT11 ved 1:500 fortynding, inkuberedes ved 4°C i 30 minutter og vaskedes to gange.

Cellerne reagerede dernæst med 0,15 ml af en 1:40 fortynding G/M FITC 25 ved 4°C i 30 minutter, centrifugeredes og vaskedes 3 gange. Celler analyseredes dernæst på cytofluorografen og fluorescens-intensiteten per celle registreredes på en impulshøjde-analysator. Et tilsvarende reaktivitetsmønster iagttoges ved en fortynding på 1:10.000, men yderligere fortynding bevirkede tab af reaktivitet. Baggrundspietning 30 opnåedes ved at substituere en 0,15 ml portion 1:500 ascites fra en CAFj mus, der var intraperitonealt injiceret med en non-producerende hybrid klon.

Der henvises i det følgende til tegningen.

Figuren viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster 35 efter reaktion af normale humane thymocyter og E+ og E” perifere celler med OKT11 og andre monoklonale antistoffer ved 1:500 fortynding og G/M FITC. Baggrunds-fluorescens-pletning opnåedes ved at inkubere hver population med en 1:500 fortynding af ascites-fluidum fra en mus

DK 154092 B

11 injiceret med en ikke-producerende klon.

Tabel (I) viser reaktiviteten af 0KT1, 0KT3-6 og 0KT8-T1 med forskellige humane lymfoide celle-populationer. Dette reaktivitetsmønster udgør én test, ved hvilken det pågældende antistof 0KT11 kan påvises og 5 skelnes fra andre antistoffer.

Figuren viser et repræsentativt fluorescens-mønster opnået på Cytofluorografen efter reaktion af normale humane thymocyt-suspensioner og E" og E+ perifere celler med en 1:500 fortynding af 0KT11, 0KT10, 0KT8 og G/M FITC. I modsætning til 0KT1 og OKT3 T-celle antigener (som 10 forøges, når thymocyter modner til perifere T-celler), formindskes 0KT11 antigenet samtidigt. Reaktivitetsmønsteret i figuren er en aaden test, ved hvilken det pågældende antistof 0KT11 kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Tabel (II) viser antigenfænotyperne af humane lymfocyter med 15 T-afstamning under anvendelse af 0KT11 og andre monoklonale antistoffer.

Dette fænotyp-mønster udgør endnu en måde, ved hvilken 0KT11 antistoffet kan påvises og skelnes fra andre anitstoffer.

Tabel (III) viser sammenhængen mellem niveauet af perifere T-celler og T-celle delmængder og forskellige sygdomstilstande. Denne sammenhæng 20 kan anvendes til diagnostiske formål (fx. for at påvise akut infektiøs mononukleosis) ved at analysere blodprøven af et individ, som mistænkes for at have en af disse sygdomstilstande, for at bestemme niveauet af T-celler og T-celle delmængder. Denne sammenhæng kan også anvendes til terapeutiske formål, når årsagen til sygdomstilstanden er et forhøjet 25 niveau af en T-celle delmængde (fx. type I erhvervet agammaglobu- linæmia). Til terapeutisk anvendelse vil administrering af det passende monoklonale antistof til en patient med forhøjet T-celle delmængde niveau formindske eller eliminere overskuddet. De i tabel (III) viste sammenhænge er en anden måde, på hvilken 0KT11 antistof kan påvises og 30 skelnes fra andre antistoffer.

DK 154092 B

12

Tabel I

Celle- og vævsfordeling af OKT-antigener

Monoklonalt Ig-type Perifert blod Milt (4) Knogle- Thymus (15) * 5 antistof_Π 51-_marv (61_ E+ Η’ 0KT1 IgGj 100 0 29±9 <5 18+8 0KT3 IgG2a 100 0 31±8 <5 21+8 0KT4 IgGb 64±4 0 16±3 <5 75±10 10 0KT5 IgGj 25+4 0 15±4 <5 77+8 OKT6 IgGj 0 0 0 <5 68±8 0KT8 IgG2a 34±3 0 17±4 <5 85±7 0KT9 IgGj 0 0 0 <5 4±3 0KT10 IgGj 5±3 13±4 10+5 16±4 96+4 15 0KT11++ IgGj 100 0 NT+ NT 95±3 *

Antal testede prøver Gennemsnit + IS.D.

+ Ikke bestemt 20 ++ Fem perifere blod- og thymusprøver blev testet

DK 154092 B

13 Γ- μ I + + + + i +

X

O

o i— h + + + + + ii

O

05 h I +1 +1 I I 1'

O

8 CO

Ξ h C ^ 1 1 + 1 + 1 +

E O

<u

H

(J£ to t . , + . .

o Ό I tn I i · + - +

<D O

4-> U «tf·

° H

— c ^ i + + + i +'

“ > O

tU

Q- ® CO C- C

ro c μ 5 5 •"c 5'YY++ + +

I O

C r', /> q- Γ 5 5 (0 I— - w* I t I + + + + SL ~

<u O

i c Jr <u m ου ® +J v> W1 σι V. ro (u 4= U ^ ® Jr C O S_ Jr o < +* P t! O “ 3 ^ >. E > α cl sz

U r" ΰ "rn 3 O

μ O 5 2 W c > ε ε E Y 3

8 έ ? έ - ! I

E +» <u ^ s- x .E

> _ Ό r <u O

x: .5? c £ ^ £ σ +j — ·- -S 3 S ro o Ό E ^ Ό γ > CL h < Σ - u

+J

(1) </) <D i- O)

-t i_ <D O

c tu z= E

E 3= tu > s. υ ii x: tu i (— cl f— 5

DK 154092B

14

Tabel (III)

Perifere mononukleære celleniveauer i sygdomstilstande

Mononukleære celleniveauer Sygdomstilstand 0KT3+ 0KT4* 0KT5 0KT8 0KT6 0KT11 0KM1 5 Primær galdecirrose (2) N + ---++-

Dissemineret sclerose (fremskreden sygdom) (8) - N - +

Myasthenia Gravis (begyndende, ubehandlet) (3) 0 0 0 0 0 + 10 Akut transpi./vært (3) O til - - 0 + + +

Erhvervet agammaglobul inæmi a type I + type II 0

Hyper-IgE (4) - N 0 til - 0 til - - + N

15 Akut infektiøs mono-* nukleose (4) + 0 til -- ++ ++ 0 ++

Hodgkins sygdom

I. og II. stadium NN N N 0 O N

III. og IV. stadium - N N N 0 0 ++

20 Psoriasis (3/5) N + til+N N 0 N N

N = inden for normale grænser 0 = fraværende + = over normal 25 ++ = meget over normal - = under normal = meget under normal disse niveauer vender tilbage til normal ca. en uge før de kliniske symptomer forsvinder 30 "Tallene i parentes angiver antallet af vurderede patienter."

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstå!ling af et monoklonalt antistof, kaldet 0KT11, hvilket antistof: a) reagerer med i det væsentlige alle normale humane perifere

5 T-celler og med omkring 95% af normale humane thymoey- ter, men ikke med normale humane B-cell er eller nul-celler, b) udviser reaktivitetsmønsteret over for normale humane thy-mocyter, E+ og E" celler vist på tegningen, c) udviser reaktivitetsmønsteret over for lymfocyt-fænotyper 10 med T-afstamning vist i tabel (II), KENDETEGNET ved, at man dyrker hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8027 in vitro i et egnet medium eller indfører den intraperitonealt til mus og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

2. Hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den er hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8027.

3. Fremgangsmåde til påvisning af en mangel eller et overskud af 0KT11+ celler i et individ, KENDETEGNET ved, at man omsætter en 20 lymfocyt-komposition fra dette individ med en diagnostisk effektiv mængde af det monoklonale antistof 0KT11 fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 og måler procentdelen af populationen, som reagerer med dette antistof.

4. Diagnostisk præparat til påvisning af 0KT11+ celle overskud 25 eller mangel, KENDETEGNET ved, at det i blanding med en diagnostisk acceptabel bærer omfatter det monoklonale antistof 0KT11 fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 i en mængde, som er effektiv til at påvise 0KT11+ celle overskud eller mangel. 30 35