DK154093B - Fremgangsmaade til fremstilling af et monoklonalt antistof, hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmaaden samt diagnostisk praeparat med det fremstillede monoklonale antistof - Google Patents

Description

i

DK 154093 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof, en hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmåden samt et diagnostisk præparat med det fremstillede monoklonale antistof.

5 Fusionen af muse-myeloma-celler til milt-celler fra immuniserede mus af Kohier og Milstein i 1975 (Mature 256, 495-497 (1975)) viste for første gang, at det var muligt at opnå en kontinuert celle-linie, der fremstiller homogent (såkaldt "monoklonalt") antistof. Siden dette grundlæggende arbejde har der været udfoldet store anstrengelser på at 10 fremstille forskellige hybride celler (kaldet "hybridomas") og på at anvende det ved hjælp af disse hybridomas fremstillede antistof til forskellige videnskabelige undersøgelser. Der henvises fx. til Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter og N. Warner, Editors, Springer-15 Verlag, 1978 og de deri angivne referencer, C.J. Barnstable, et al.,

Cell, 14, 9-20 (maj 1978), P. Parham og W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978), Handbook of Experimental Immunology, 3. udgave, bind 2, D.M. Wier, Editor, Blackwell, 1978, kapitel 25, og Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15-17. Disse referencer indikerer 20 samtidig belønningerne og komplikationerne ved at forsøge at fremstille monoklonalt antistof ud fra hybridomas. Selvom den almene teknik forstås principielt godt, mødes mange vanskeligheder og variationer kræves for hvert specifikt tilfælde. I virkeligheden er der ingen sikkerhed, forud for forsøget på at fremstille et givet hybridoma, for at det ønskede 25 hybridoma vil blive opnået, at det, hvis opnået, vil producere antistof eller at det således fremstillede antistof vil have den ønskede specificitet. Graden af succes påvirkes principalt af den anvendte . antigen-type og den til isolering af det ønskede hybridoma anvendte udvælgelsesteknik.

30 Den tilstræbte fremstilling af monoklonalt antistof for humane lym-fpcyt celle-overflade antigener er kun blevet rapporteret i nogle få tilfælde. Se fx. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De i disse rapporterede forsøg anvendte antigener var dyrkede humane lymfoblastoide leukæmia og humane kroniske lymfocytiske 35 leukæmia celle-linier. Mange opnåede hybridomas syntes at danne antistof over for forskellige antigener på alle humane celler. Ingen af disse hybridomas dannede antistof over for en forud defineret klasse af humane lymfocyter.

DK 154093B

2

Det er fornylig blevet kendt, se fx. Reinherz, E.L., et al., J.

Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., 76, 4061-4065 (1979); og Kung, P.C., et al., Science, 206, 347-349 (1979), at fremstille monoklonale antistoffer kaldet 0KT1, 3 og 5 4, ved hjælp af hybridomacellelinier. OKU og 3 reagerer med alle humane perifere T-celler, mens 0KT4 reagerer med 55% af de humane perifere T-celler og 80% af thymocyterne.

Derudover fremkom der fornylig en rapport om fremstilling af en anti-makrofag-producerende klon. Se Springer, et al., Eur. J. Immunol., 10 9, 301 (1979).

Det bør forstås, at der findes to principielle klasser af lymfocyter, som er involveret i immunsystemet hos mennesker og dyr. Den første af disse (den thymus-afledte celle eller T-celle) differentieres i thymus fra hæmopoietiske stam-celler. Hens de befinder sig 15 i thymus, kaldes de differentierende celler for "thymocyter". De modne T-celler forlader thymus og cirkulerer mellem væv, lymfekar og blodbaner. Disse T-celler udgør en stor andel af mængden af recirku-1erende små lymfocyter. De har immunologisk specificitet og er direkte involveret i celle-medierede immun-reaktioner (såsom transpiantations-20 afvisning) som effektor-celler. Selvom T-celler ikke sekreterer humorale antistoffer, kraves de under tiden for udskillelsen af disse antistoffer af den nedenfor omtalte anden klasse af lymfocyter. Nogle typer af T-celler har en regulerende funktion ved andre aspekter af immun-systemet. Mekanismen for denne proces ved celle-samvirke forstås endnu ikke fuldt 25 ud.

Den anden klasse af lymfocyter (de benmarvs-afledte celler eller B-celler) er de som udskiller antistof. De dannes også fra hæmopoietiske stam-celler, men deres differentiering bestemmes ikke af thymus. I fugle differentieres de i et med thymus analogt organ, kaldet Bursa Fabricii.

30 I pattedyr har man imidlertid ikke fundet et ækvivalent organ og det antages, at disse B-celler differentierer i benmarven.

Det anerkendes nu, at T-celler kan opdeles i mindst adskillige undertyper, kaldet “hjælpe", “suppressor", og "dræbe" T-celler, der har den funktion (hhv.) at fremme en reaktion, undertrykke en reaktion eller 35 dræbe (lysere) fremmede celler. Disse underklasser forstås godt inden for musefamilien, men er kun for nyligt blevet beskrevet for humane systemer. Se fx. R.L. Evans, et al., Journal of Experimental Medicine, bind 145, 221-232, 1977 og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional

DK 154093 B

3

Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens”, i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, Editor, Plenum Press, 1977, bind 7, 363-379.

Evnen til at identificere eller undertrykke klasser eller under-5 klasser af T-celler er vigtig for diagnosen eller behandlingen af forskellige immuno-regulatoriske uregelmæssigheder eller tilstande.

Fx. har visse leukæmityper og lymfomas forskellig prognose i afhængighed af, om de er af B-celle eller T-celle oprindelse. Således afhænger vurderingen af sygdomsprognosen af, at man kan skelne mellem 10 disse to klasser af lymfocyter. Se fx. A.C. Aisenberg og J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (marts 1975), D. Bel pomme, et al., i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, et a!., eds, Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Bel pomme, et al., British Journal of Haematology, 1978, 38, 85.

15 Visse sygdomstilstande (fx. juvenil rheumatoid arthritis, maligne tilstande og agammaglobulinæmi) hænger sammen med en ubalance af T-celle underklasser. Det er blevet foreslået, at autoimmune sygdomme i almindelighed hænger sammen med et overskud af "hjælpe" T-celler eller mangel på visse "suppressor" T-celler, mens agammaglobulinæmi hænger 20 sammen med et overskud af visse "suppressor” T-celler. I almindelighed hænger maligne tilstande sammen med et overskud af "suppressor" T-celler.

I visse leukæmityper produceres overskud af T-celler på et hæmmet udviklingsstade. Diagnosen kan derfor afhænge af muligheden for at 25 påvise sådan ubalance eller overskud og for at bestemme, hvilken udviklingsfase er i overskud. Se. fx. J. Kersey, et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses” i Haematology and Blood Transfusion, bind 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 og de deri anførte referencer, og E.L. Reinherz, et al., J. Cl in.

30 Invest., 64, 392-397 (1979).

Erhvervet agammaglobulæmi, som er en sygdomstilstand, hvor der ikke produceres immunt globulin, omfatter mindst to forskellige typer. I type I skyldes manglen på at producere immunt globulin et overskud af suppressor T-celler, mens den i type II skyldes en mangel på hjælpe T-35 celler. I begge typer synes der ikke at være nogen defekt eller mangler i patienternes B-celler, lymfocyterne som er ansvarlige for den aktuelle sekretion af antistoffet. Imidlertid er disse B-celler enten undertrykte eller "ikke hjulpne”, hvilket fører til stærkt formindsket eller

DK 154093 B

4 manglende imnunglobul in-produktion. Typen af erhvervet agammaglobulinsmi kan således bestemmes ved at teste for et overskud af suppressor T-celler eller et fravær af hjælpe T-celler.

På den terapeutiske side er der en endnu ikke endeligt bevist 5 forskning om, at administrering af antistoffer over for T-celle subtypen i overskud kan have terapeutisk gavnlig virkning på autoimmune sygdomme eller maligne tilstande. Fx. kan en hjælpe T-celle cancer (visse kutane T-celle lymphomatyper og visse T-celle akut lymfoblasti ske leukæmityper) behandles med et antistof for et hjælpe T-celle antigen. Behandling af 10 autoimmun sygdom forårsaget af et overskud af hjælpeceller kan også ske på samme måde. Sygdomme (fx. maligne tilstande eller erhvervet type I agammaglobulinæmi), som skyldes et overskud af suppressor T-celler, kan behandles ved administrering af et antistof for et suppressor T-celle antigen.

15 Antisera mod hele klassen af humane T-celler (såkaldt antihuman thymocyt globulin eller ATG) har været anført som værdifulde terapeutisk på patienter, der modtager organ-transplantation. Da den celle-medierede immunreaktion (mekanismen, hvorved transplantationer afvises) afhænger af T-celler, forebygger eller forsinker administrering af antistof mod 20 T-celler denne afvisningsproces. Se fx. Cosimi, et al., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40:155-163 (1976) og de deri anførte referencer.

Lymfocyter omfatter imidlertid kun én klasse leukocyter. De to 25 andre klasser, granulocyter og monocyter, er også vigtige i immunsystemfunktionen hos mennesker og dyr. Især er makrofager, som er en type monocyter, i høj grad involveret i immun-funktionen. Fx. har det vist sig, at makrofager, selvom de ikke selv sekreterer antistof, er nødvendige for T-celle-cooperationen i B-cellers antistof-produktion.

30 Makrofager er også nødvendige til dannelse af cytotoxiske T-celler og optræden af en formerings-respons hos T-celler som reaktion på mitogener såsom PHA eller Con A. Selvom der har været spekulationer omkring funktionen af makrofaget i disse processer, er dets nøjagtige rolle ikke kendt. Se fx. E.S. Golub, The Cellular Basis of the Immune 35 Response, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, 1977, side 146-158.

Identifikationen og undertrykkelsen af humane T-celle og monocyt klasser og underklasser er tidligere sket ved anvendelse af spontane

DK 154093 B

5 autoantistoffer eller selektive antisera for humane T-celler opnået ved immunisering af dyr med humane T-celler, tapning af dyrene til opnåelse af serum og adsorption af antiserum med (fx.) autologe, men ikke allogene B-celler til fjernelse af antistoffer med uønskede reakti-5 viteter. Fremstillingen af disse antisera er særdeles vanskelig, især i adsorptions-og rensningstrinnene. De adsorberede og rensede antisera kan endog indeholde mange urenheder foruden det ønskede antistof, af adskillige grunde. For det første indeholder serum millioner af antistof-molekyler, selv før T-celle-immuniseringen. For det andet bevirker 10 immuniseringen dannelse af antistoffer mod en lang række antigener, som findes på alle injicerede humane T-celler. Der er ingen selektiv dannelse af antistof over for et enkelt antigen. For det tredje er titeren af specifikt antistof opnået ved sådanne metoder sædvanligvis meget lav (fx. inaktiv ved fortyndinger på mere end 1:100) og forholdet 15 mellem specifikt og non-specifikt antistof er mindre end 1/106, se fx. den ovenfor omtalte artikel af Chess og Schlossman (side 365 og følgende) og den ovenfor omtalte artikel i Chemical and Engineering News, hvor manglerne ved hidtil kendte antisera og fordelene ved mono-klonalt antistof er beskrevet.

20 Der er nu fundet en ny hybridomacellelinie, som er i stand til at producere et hidtil ukendt monoklonalt antistof kaldet 0KM1 over for et antigen, som findes på normale humane perifere blod-monocyter og -granulocyter, men ikke på normale humane perifere lymfoid-celler (T-celler, B-celler eller nul-celler), thymocyter, lymfoblastoide celle-25 linier eller tumor-celler af T- eller B-celle afstamning.

Det således dannede antistof er monospecifikt for en enkelt determinant på normale humane perifere blod-monocyter og -granulocyter og indeholder i det væsentlige ingen anden antihuman immungiobul in, i modsætning til tidligere kendte antisera (som nødvendigvis er konta-30 mineret med antistof, der er reaktivt over for talrige humane antigener) og til hidtil kendte monoklonale antistoffer (der ikke er monospecifikke for et humant monocyt-antigen). Endvidere kan dette hybridoma dyrkes til fremstilling af antistof uden nødvendigheden af at immunisere og dræbe dyr, efterfulgt af de trivielle adsorptions- og rensningstrin, som er 35 nødvendig for at opnå blot de urene antisera ifølge den kendte teknik.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af det monoklonale antistof kaldet 0ΚΜ 1 er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8026 i et egnet

DK 154093 B

6 medium eller indfører den intraperitonealt til mus, og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

Hybridomacellelinien ifølge opfindelsen til anvendelse ved nævnte 5 fremgangsmåde til fremstilling af det monoklonale antistof er ejendommelig ved, at den er hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8026.

Det diagnostiske præparat til påvisning af 0KM1* celle overskud eller mangel er ejendommeligt ved, at det i blanding med en diagnostisk acceptabel bærer omfatter det monoklonale antistof 0KM1 fremstillet ved 10 ovennævnte fremgangsmåde i en mængde, som er effektiv til at påvise OKH 1+ celle overskud eller mangel.

Den omhandlede hidtil ukendte hybridomacellelinie ATCC nr. CRL 8026 er blevet fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Nilstein og Kohier. Efter immunisering af mus med normale E-roset rensede humane 15 mononukleære celler, fusioneredes de immuniserede mus' milt-celler med celler fra en muse-myeloma-linie og de resulterende hybridomas screenedes for sådanne med supernatanter indeholdende antistof, som gav selektiv binding til normale E-roset positive og E-roset negative humane perifere blod-lymfocyt-populationer. De ønskede hybridomas blev derefter 20 klonet og karakteriseret. Som resultat opnåedes et hybridoma, som danner antistof (kaldet 0KM1) over for et antigen på normale humane perifere blod-monocyter.

I betragtning af de anførte vanskeligheder ved den kendte teknik og manglen på succes, som er rapporteret ved anvendelse af maligne celle-25 linier som antigen, var det, selvom hybridomacellelinien er opnået på i og for sig kendt måde, ikke til at forudsige, om det var muligt at tilvejebringe det ønskede hybridoma. Det skal understreges, at den uforudsigelige natur af hybrid-celle fremstilling ikke gør det muligt at ekstrapolere fra et antigen eller cellesystem til et andet. Det har 30 endda i forbindelse med den foreliggende opfindelse vist sig, at anvendelse af en T-celle malign celle-linie eller rensede antigener adskilt fra celle-overfladen som antigen var generelt uden gunstigt resultat.

Det omtalte hybridoma blev den 13. december 1979 deponeret hos 35 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,

Maryland 20852, og har fået tildelt ATCC accessionsnummer CRL 8026.

Fremstillingen og karakteriseringen af det omhandlede hybridoma og det resulterende antistof vil blive nærmere forklaret i det følgende.

DK 154093B

7

Fremgangsmåden til fremstilling af det omhandlede hybridoma omfatter følgende trin: A. Han immuniserer mus med normale humane perifere blod- 5 mononukleære celler.

B. Niltene fjernes fra de immuniserede mus og der fremstilles en milt-suspension i et passende medium.

10 C. De suspenderede milt-celler fusioneres med muse-myeloma- celler fra en passende celle-linie ved anvendelse af en passende fusionspromoter.

D. Han fortynder og dyrker i separate beholdere blandingen 15 af ufusionerede milt-celler, ufusionerede myeloma-celler og fusionerede celler i et selektivt medium, som ikke nærer de ufusionerede myeloma-celler i et tidsrum, som er tilstrækkelig til at de ufusionerede celler dør.

20 E. Han vurderer supernatanten i hver beholder (fordybning), som indeholder et hybridoma, for tilstedeværelsen af antistof mod E-roset positive rensede eller E-roset negative humane perifere blod-lymfocyter.

F. Han udvælger (fx. ved begrænsningsfortynding) og kloner 25 hybridomas, som producerer det ønskede antistof.

Det monoklonale antistof produceres på én af to måder. Det reneste monoklonale antistof dannes ved in vitro dyrkning af det omhandlede hybridoma i et egnet medium i et passende tidsrum efterfulgt af 30 udvinding af det ønskede antistof fra supernatanten. Det egnede medium og den egnede dyrkningstid kendes eller kan let bestemmes. Denne in vitro metode danner i det væsentlige monospecifikt monoklonalt antistof, der er i det væsentlige frit for andet specifikt antihuman immungi obul in. Der er en lille smule andet immun-globulin til stede eftersom 35 mediet indeholder xenogent serum (fx. foetalt kalveserum). Denne in vitro metode kan imidlertid ikke producere en tilstrækkelig mængde eller koncentration af antistof til visse formål, eftersom koncentrationen af monoklonalt antistof kun er ca. 50 øg/ml.

DK 154093B

8 ΤΠ fremstilling af en meget større koncentration af en smule mindre rent monoklonalt antistof kan det omhandlede hybridoma injiceres i mus, fortrinsvis syngeniske eller semi-syngeniske mus. Hybridomaet vil bevirke dannelse af antistof-producerende tumorer efter en passende 5 inkubationstid, son vil resultere i en høj koncentration af det ønskede antistof (ca. 5-20 mg/ml) i blodbanerne og peritonealt exudat (ascites) hos værtsmusene. Selvom disse vsrtsmus også har normale antistoffer i deres blod og ascites, er koncentrationen af disse normale antistoffer kun ca. 5% af den monoklonale antistof-koncentration. Da disse normale 10 antistoffer endvidere er ikke antihumane med hensyn til deres specificitet, er det fra udvundet ascites eller fra serum opnåede monoklonale antistof i det væsentlige fri for noget forurenende antihumant immun-globulin. Dette monoklonale antistof har høj titer (aktiv ved fortyndinger på 1:50.000 eller mere) og højt forhold mellem specifikt og 15 non-specifikt immun-globulin (ca. 1/20). Immun-globulin produceret under inkorporering af de såkaldte "k light" myeloma-kæder er non-specifikke "nonsens" peptider, som blot fortynder det monoklonale antistof uden at nedsætte dets specificitet.

20 Eksempel 1

Fremstil!ino af monoklonale antistoffer A. Immunisering oo somatisk celle-hvbridicerino BALB/cJ-mus af hunkøn (Jackson Laboratories, 6-8 uger gamle) 25 immuniseredes intraperitonealt med 2 x 107 roset rensede humane mono-nukleære celler i 0,2 ml fosfat-forpufret saltopløsning med 14 dages intervaller. Fire dage efter den tredje immunisering fjernedes milten fra musene og en enkelt celle-suspension fremstilledes ved at presse vævet gennem et rustfrit stålnet.

30 Celle-fusion foretoges iht. den af Kohier og Nilstein udviklede o metode. 1 x 10 splenocyter fusioneredes i 0,5 ml fusionsmedium indeholdende 35% polyethylenglycol (PEG 1000) og 5% dimethyl sul foxid i "RPMI 1640" medium (Gibco, Grand Island, NY) med 2 x 107 P3X63Ag8Ul myeloma-cel!er leveret af Dr. M. Scharff, Albert Einstein College of 35 Medicine, Bronx. NY. Disse myeloma-celler sekreterer IgGj light kæder.

DK 154093 B

9 B. Udval ael se oa vækst af hvbridoma

Efter celle-fusion dyrkedes celler i HAT medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% C02 i en fugtig atmosfære.

Adskillige uger senere tilsattes 40 til 100 1 supernatant fra kulturer 5 indeholdende hybridomas til en tablet af 10® perifere lymfocyter adskilt i E-roset positive (E+) og E-roset negative (E“) populationer, som var fremstillet ud fra blod af sunde humane donorer som beskrevet af Nendes (J. Immunol. 111:860, 1973). Påvisning af muse-hybridoma-antistoffer, som binder til disse celler, bestemtes ved indirekte immunofluorescens.

10 Celler inkuberet med dyrknings-supernatenter stænkedes med et fluoresceret gede-anti-muse IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories,

Springfield, VA, F/p = 2,5) og de fluorescerende antistof-belagte celler analyseredes dernæst på cytof1uorograf "FC200/4800A" (Ortho Instruments, Westwood, NA) som beskrevet i eksempel 2. Hybridoma-kulturer inde-15 holdende antistoffer, der reagerede specifikt med E+ lymfocyter (T-celler) og/eller thymocyter udvalgtes og klonedes to gange ved begrænsnings-fortyndingsmetoder i nærværelse af føde-celler. Derefter overførtes klonerne intraperitonealt ved injektion af 1 x 10^ celler af en given klon (0,2 ml volumen) i BALB/cJ-mus, der var forbehandlet med 20 2,6, 10,14-tetramethylpentadecan leveret af Aldrich Chemical Company under navnet "Pristine". De maligne ascites fra disse mus anvendtes dernæst til karakterisering af mononukleære celler som beskrevet nedenfor i eksempel 2. Det af én af disse kloner fremstillede mono-klonale antistof, der reagerede med en fraktion af både E+ og E~ celler, 25 blev kaldet 0KN1. Det pågældende hybrid-antistof 0KN1 blev ved standardteknik påvist at være af IgG2a underklasse.

Eksempel 2

Karakterisering af 0KN1 reaktivitet 30 A. Isolering af mononukleære celle-populationer

Humane perifere blod-mononukleære celler isoleredes fra raske frivillige donorer (alder 15-40) ved hjælp af "Ficoll-Hypaque" densitetsgradient-centrifugering (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) 35 efterfulgt af teknikken beskrevet af Boyum i Scand. J. Cl in. Lab.

Invest. 21 (Suppl. 97):77, (1968).

Adhærente celler opnåedes ved inkubering af mononukleære celler i 1 time i polystyren-skåle (100 x 20 mm vævskultur-skåle) (Falcon, Oxnard,

DK 154093 B

10 CA) i RPNI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY) suppleret med 20% pooled humant AB serum. Efter fjernelse af den non-adhærente fraktion adskiltes de adhærente celler ved inkubering ved 4°C i serum-fri MEM og 2,5 mM EDTA efterfulgt af forsigtig skrabning med 5 gummi-spidsen af stemplet på en éngangs-sprøjte.

Hononukleære celler opdeltes i E+ og E" populationer ved rosettering med fåre-erythrocyter og differentiel centrifugering over Ficoll-Hypaque. Rosettering gennemførtes ved centrifugering af de mononukleære celler/fåre-erythrocytblandingen i 5 minutter ved 800 opm og inkubering 10 i 1 time ved 4°C. Forholdet mellem erythrocyter og lymfocyter var 40:1.

E+ cellerne blev udvundet ved lysis af fåre-erythrocyterne med en 0,85% ammoniumchlorid-opløsning.

Nul-celler fremstilledes ved lignende rosettering på overflade immunoglobulin negativ (sig-) populationen ved hjælp af “Sephadex 15 G-200H anti-human (F(ab1)2 kromatografi som tidligere beskrevet af Chess, et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). Polymorphonukleære leuko-cyter opnåedes ved lysis af de erythrocyter, der var til stede i den ved Ficoll-Hypaque-centri fugering af perifert blod dannede tablet.

20 B. Isolering af thvmocvter

Normal human thymus-kirtel opnåedes fra patienter med en alder mellem 2 måneder og 14 år, som var under korrektiv kardial-kirurgi.

Frisk opnåede portioner af thymus-kirtlen anbragtes straks i 5% foetalt kalve-serum i medium H199H (Gibco) fint parteret med forceps og saks, og 25 til dannedes derefter til enkeltcelle-suspensioner ved presning gennem trådnet. Cellerne lagdeltes dernæst over Ficoll-Hypaque og blev spundet og vasket som beskrevet i afsnit A ovenfor. De således opnåede thymo-cyter var mere end 95% levende og mere end eller lig 90% E-roset positiv.

30 C. Cellelinier af T-linie og T akut Ivmfoblastisk leukaemia celler T-celle linier CEN og HSB-2 og B-celle linier Laz 156 og Laz 388 leveredes af Dr. H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, HA). Leukæmiceller opnåedes fra patienter med diagnosticeret akut myelo-35 monocytisk leukæmi (AMML; 5 patienter) og akut myeloblastisk leukæmi (AHL; 8 patienter). Tumor-populationer kryopræserveredes i -196°C dampfase flydende nitrogen i 10% DNS0 og 20% AB humant serum indtil tidspunktet for overfladekarakterisering.

DK 154093 B

11

Cvtofluoroarafisk analyse oq celledeling

Cytofluorografisk analyse af monoklonale antistoffer med alle celle-populationer foretoges ved indirekte immunofluorescens med fluo-rescein-konjugeret gede-anti-muse IgG (G/H FITC) (Neloy Laboratories) 5 under anvendelse af en fluorescens-aktiveret celle-sorterer (FACS-I) (Becton, Dickinson, Mountain View, CA) eller en cytof1uorograf HFC200/4800AH (Ortho Instruments). I korte træk behandledes 1 x 10® celler med 0,15 ml 0KM1 ved 1:500 fortynding, inkuberedes ved 4°C i 30 minutter og vaskedes to gange. Cellerne reageredes dernæst med 0,15 ml 10 af en 1:40 fortynding G/M FITC ved 4°C i 30 minutter, centrifugeredes og vaskedes 2 gange. Celler analyseredes dernæst på FACS-I og fluorescens-intensiteten per celle registreredes på en impulshøjde-analysator.

Baggrundspietning opnåedes ved at substituere en 0,15 ml portion 1:500 ascites fra en BALB/c«J-mus, der var intraperitonealt injiceret med en 15 non-producerende hybrid klon.

I forsøg, der involverede antistof og komplement medieret lymfo-lyse, dyrkedes thymocyter og perifere T-celler efter selektiv lysis natten over og analyseredes dernæst på Cytofluorografen eller FACS.

20 A. Cvtotoxiske studier

Sensibiliserings-kulturer for celle-medieret lymfolyse (CML) tilvejebragtes ved følgende fremgangsmåde. Fem X 10® angrebs-celler behandledes med 0,2 ml 51Cr natriumchromat (292 /iCi/ml) (New England Nuclear,

Boston, HA) og inkuberedes i 90 minutter ved 37°C. Efter to vaskninger 25 fortyndedes cellerne til 2 x 105/ml i medier, der indeholdt 10% FCS.

Tyve liter mærkede celler fordeltes i koniske mikro-plade fordybninger med 20 /ti serie-fortyndinger af hybridoma-antistof. Efter inkubering i 1 time ved 4°C sattes 20 /il friskt kanin-serum (1:10 fortynding) til fordybningerne som komplement-kilde. Pladerne inkuberedes ved 37°C i 1 30 time. 140 /il medium sattes så til fordybningerne og pladerne centrifugeredes ved 400 g i 10 minutter. 100 μΐ supernatant fjernedes fra hver fordybning og taltes på en gamma-scintillations-tæller (Parkard 51

Instrumentation Company, Downer's Grove, II). Specifik Cr-frigørelse beregnedes under anvendelse af følgende formel:

35 % specifik 51Cr-frigørelse Exp - SR j0Q

MR - SR

hvori Exp = gennemsnit af det iagttagede tripi ikat, SR = spontan frigørelse fra de kun med komplement inkuberede celler, og MR = maksimal

DK 154093B

12 frigørelse opnået ved behandling af cellerne med detergenten Triton X (1% opløsning).

Lysis af et større antal celler til efterfølgende formerings-analyser gennemførtes ved resuspendering af 20 til 50 x 106 mononu-5 kleære celler i 1 ml 0KM1 ved en 1:250 fortynding og inkubering ved 4°C i 1 time.

Dernæst tilsattes 0,1 ml frisk kanin-serum og cellerne inkuberedes i yderligere 1 time ved 37°C. Efter tre vaskninger taltes cellerne og deres levedygtighed bestemtes ved Trypan-blå eksklusion.

10 B. Formerinos-respons-analvse

Formerings-respons over for opløselige antigener måltes som tidli- 6 gere beskrevet. Celler bragtes til en koncentration på 2 x 10 levedygtige celler/ml i RPMI 1640 suppleret med 20% humant AB serum og 15 dyrkedes på mikrotiter-piader i nærværelse af tetanus-toxoid (TT) (Massachusetts Department of Public Health Biological Laboratories,

Boston, MA), renset protein-derivat (PPD) (National Institutes of Health, Bethesda, MD) eller fåresyge (Parotitis epidemica) CF antigen (Microbiological Associates, Walkersville, MD). Kulturerne impuls- 3 20 behandledes efter fem dage med 0,2 Ci [H-methyl] thymidin ( H TdR) (1,9 β Ci/mM specifik aktivitet) (Schwarz-Mann, Orangeburg, NY) og blev udvundet 18 timer senere på et MASH 11 apparat (Microbiological 3

Associates). H-TdR-inkorporation måltes i en Packard flydende scintillations-tæller (Packard instrumentation Company). Hver eksperi-25 mentel gruppe analyseredes i tripi ikat og resultaterne er udtrykt som gennemsnitlige tællinger per minut (cpm) ± gennemsnitlig standardfejl.

Der henvises i det følgende til tegningen.

Figur 1 viser det på FACS opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af ufraktionerde, non-adhærente, og adhærente normale humane 30 perifere blod-mononukleære celler med 0KM1 ved 1:500 fortynding og G/M FITC. Baggrunds-fluorescens-pletning opnåedes ved at inkubere hver population med en 1:500 fortynding af ascites-fluidum fra en mus injiceret med en ikke-producerende klon.

Figur 2 viser den på FACS opnåede fluorescens efter reaktion af 35 normale humane E+ og E” perifere blod-mononukleære celler med 0KM1 og G/M FITC.

Figur 3 viser det på FACS opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af normale humane Ig”, E", non-adhærente nul-celler med 0KM1 og G/M

DK 154093B

13 FITC.

Figur 4 viser den lytiske kapacitet af 0KH1 og komplement på humane mononukleære celler.

Perifere blod-mononukleære celler fra ni normale donorer adskiltes 5 i adhærente og non-adhærente populationer på polystyren-skåle, og hver fraktion analyseredes ved indirekte immunofluorescens på FACS. Procentdelen af specifikt med 0KH1 mærkede celler er vist i tabel (I). Gennemsnittet af positive celler var 27% for ufraktionerede celler, 18% for non-adhsrente celler og 78% for adhsrente celler. FACS fluorescens-10 profilerne af de tre populationer fra donor nr. 1 er illustreret i figur 1. Som det kan ses i figur 1A, er fluorescens-mønsteret af 0KM1 på ufraktionerede mononuklesre celler bimodalt. En todimensional kortlægning af den samme population viste, at de med 0KM1 lyst plettede celler også er større. Der påvistes også en population af mindre celler 15 med en svagere fluorescens-intensitet. De fleste af disse mindre celler findes i de non-adhsrente fraktioner (figur IB). I modsætning hertil indeholder adhsrente celler den lyst plettede større population (figur 1C). Denne reaktivitet af 0KM1 med adhsrente populationer lader formode, at den af antistoffet genkendte mononuklesre celle var en monocyt, og 20 udgør en test, ved hvilken det pågældende antistof kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Studiet af lymfoide og myeloide celler med forskellig oprindelse gav yderligere beviser for denne specificitet. 0KM1 var ureaktiv med B-celle linier (Laz 156 og Laz 388), T-celle linier (CEN og HSB2) og tre 25 humane thymocyt-prsparationer. Desuden var tre T-CLL, seks B-CLL, tre T-ALL og seks non-T-ALL tumor-celler også negative. I modsætning hertil reagerede 0KM1 stærkt med 44 til 82% af cellerne fra fem prøver af akut myelomonocytisk leukæmi (AMML) og med ca. 35% af cellerne i to ud af otte tilfælde af akut myeloblastisk leukæmi (ANL). To myeloide linier, 30 K562 (Lozzio, et al., Blood 45, 321 (1975) og HL 60 (Collings, et al.,

Native, 270 347 (1977) var negatve. Isolerede polymorphonukleære leukocyter fra fire normale donorer blev lyst mærkede. Disse resultater var i overensstemmelse med antagelsen, at granulocyter og monocyter er nært beslægtede celler med fælles oprindelse. Ydermere synes de med AML-35 celler opnåede data at vise, at 0KM1 reagerede fortrinsvis med monocyt-celler med myeloid afstamning. Dette reaktivitets-mønster udgør en yderligere test, ved hvilken det pågældende antistof kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

DK 154093 B

14 PIetnings-mønsteret, der iagttoges på ufraktionerede, adhærente, og non-adharente mononukleare celler, lader formode, at den med antistoffet bestemte monocyt-population var heterogen med hensyn til størrelse og adharente egenskaber. Da overflade la antigener er blevet beskrevet på 5 monocyt-subpopulationer, testedes de ovenfor anførte celle-fraktioner (donor nr. 1) med et monoklonalt anti-Ia antistof, OKU, for yderligere at karakterisere fanotypen af de med 0KH1 identificerede celler.

Procentdelen af 0KI1+ celler i de non-adharente og adhærente fraktioner var hhv. 9% og 80%. Da la-bærende B-lymfocyter forklarer en del af 10 pletningen, der med 0KI1 blev fundet i non-adharente populationer, syntes den lille, non-adharente celle, der blev genkendt af 0KM1, i hovedsagen at vare la". I modsætning hertil barer de store, adhærente 0KM1+ monocyter overflade la determinanter.

Fordelingen af 0KM1 celler inden for E+ og E" populationer er vist 15 i tabel (II). Selvom de fleste mærkede celler blev fundet i E" populationen, indtil 22% (gennemsnit, 13%), var positive celler til stede i E+ fraktionen. FACS fluorescens-profiler for E" og E+ celler er vist i figur 2. E" celler havde p.g.a. nærværelsen af de ovenfor beskrevne store og små celler et bimodalt pletnings-mønster.

20 Fluorescens-intensiteten på E+ populationen var homogen. De i denne fraktion fundne positive celler var af ringe størrelse og hovedsagelig la" (gennemsnits-reaktivitet med 0KI1, 3%). Dette reaktivitetsmønster er en yderligere test, ved hvilken det pågældende antistof kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

25 Et repræsentativt FACS-histogram af 0KM1 reaktivitet med den Ig", E", non-adharente celle-population er illustreret i figur 3. 84% af cellerne plettedes med 0KM1 og 11% med 0KI1. Således viser disse studier, at den 0KM1+, la’, non-adharente celle overraskende tegnede sig for de fleste nul-celle populationer. Dette reaktivitetsmønster er endnu 30 en test, ved hvilken det pågældende antistof kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Komplement-medieret lysis-analyse gennemførtes på nogle af de ovenfor beskrevne populationer. Serie-fortyndinger af 0KH1 testedes på 51 ufraktionerede, non-adharente, og adharente celler. Specifikke Cr-35 frigørelses-værdier er vist i figur 4. Der var en god overensstemmelse mellem procentdelene, der blev fundet ved indirekt immunofluorescens (donor nr. 5, tabel (I)) og komplement-medieret lysis for hver population.

DK 154093 B

15 E+ og E‘ celler blev også undersøgt og de opnåede data er vist i tabel (III). Igen svarede de specifikke 51Cr-frigørelses-resul tater til mærkningen, der blev fundet ved indirekte immunofluorescens (donor nr.

8, nr. 9 og nr. 10).

5 Virkningen af 0KM1 og komplement for-behandling på en kendt monocyt-afhængig T-celle-funktion, nemlig formering til opløselige antigener undersøgtes. Mononukleære celler fra en normal donor inkuberedes med 0KM1 antistof (1:250 fortynding) i nærværelse af komplement. En sorteret mængde af autologe adhærente celler sattes 10 til denne for-behandlede population forud for aktivering med opløselige antigener. Som vist i tabel (IV) formerede 0KM1 og komplement-behandlede mononukleære celler sig ikke som respons på opløselige antigener, mens tilsætning af 1% adhærente celler var 1 stand til at genoprette deres formerings-respons. Da inkubering med 0KM1 antistoffer i fraværelse af 15 komplement ikke påvirkede denne T-celle funktion, kunne den i nærværelse af komplement iagttagne virkning tilskrives specifikt drab af monocyter inden for den mononukleære celle-population.

Det bør bemærkes, at både baggrunds- og antigen-induceret formering blev forøget i forhold til den ubehandlede population, når 10 til 20% 20 adhærente celler sattes til 0KM1 for-behandlede celler.

Virkningen af 0KM1 på CHL er også en test, ved hvilken det pågældende antistof kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Tabel (V) viser sammenhængen mellem niveauet af perifere T-celler og T-celle delmængder og forskellige sygdomstilstande. Denne sammenhæng 25 kan anvendes til diagnostiske formål (fx. for at påvise akut infektiøs mononukleosis) ved at analysere blodprøven af et individ, som mistænkes for at have en af disse sygdomstilstande, for at bestemme niveauet af T-celler og T-celle delmængder. Denne sammenhæng kan også anvendes til terapeutiske formål, når årsagen til sygdomstilstanden er et forhøjet 30 niveau af en T-celle delmængde (fx. type I erhvervet agammaglobu- linæmia). Til terapeutisk anvendelse vil administrering af det passende monoklonale antistof til en patient med forhøjet T-celle delmængde niveau formindske eller eliminere overskuddet. De i tabel (V) viste sammenhænge er en anden måde, på hvilken 0KM1 antistof kan påvises og 35 skelnes fra andre antistoffer.

DK 154093 B

16

Tabel I

Procentdel af celler, der er reaktive med 0KM1 ved indirekte Immunofluorescens Donor Procentdel af positive celler 5 F/Ha F/H non-adharent adherent 1 32,3 20,4 80,6 2 28,2 23,6 83,4 3 20,4 17,5 67,6 4 20,6 16,1 74,4 10 5 26,1 16,5 82,7 6 28,1 20,2 74,2 7 30,5 ND 84,8 8 27,7 ND 80,7 9 28,7 11,2 76,0 15 Gennemsnit 26,9 17,9 78,2 a Hononuklesre celler fremstillet ved centrifugering på Ficoll-Hypaque gradient.

20 Tabel fill

Procentdel af celler, der er reaktive med 0KM1 i E-roset positive oo E-roset negative populationer

Donor Procentdel af positive celler 25 E+ E" 1 18,2 64,2 2 12,1 51,2 3 13,8 47,9 4 9,7 67,9 30 5 14,2 41,5 6 22,2 69,0 7 11,5 51,2 8 10,6 58,6 9 9,4 55,6 35 10 12,8 68,5

Gennemsnit 13,5 57,5

DK 154093 B

17

Tabel ΠΙΠ 0KM1-reaktivitet ved komplement-medieret lvsis Då E-roset positive oa E-roset negative populationer 51

Procentuel specifik —Cr-frigørelse 5 Antistof E+

Fortynding Donor nr. 8 Donor nr. 9 Donor nr. 10 10”2 11,2 ±3 9,8 ± 2 12,5 ± 1 10“3 7,8 ± 2 10,7 ± 2 11,7 ± 2 10"4 4,4 ± 2 9,0 ± 2 11,2 + 2 10 10_S 1,5 ±1 6,7 ± 1 5,5 ± 2 E" 10"2 71,5 ± 4 68,7 ± 5 74,3 ± 5 10"3 73,0 ± 3 63,3 ± 7 70,6 ± 4 15 10'4 67,0 ± 5 57,3 ± 4 70,9 ± 3 10-5 56,7 ± 3 52,9 + 3 60,2 ± 5

DK 154093 B

18

Tabel IV

Virkning af for-behandl ino af mononukleare celler med 0KM1 og C' på antigen-inducerede formerings-resoonser- 3 -H-thvmidin-inkorporering 5 Cellepopulation Medium TT^ PPDC Mumos** F/H 385±88 1.767+425 5.063±1.010 19.094+3.139 F/H 0KM1+C' 144±10 142±12 162±23 254±4 F/H 0KM1+C' 10 +1% adherente 190±51 1.358±209 5.777±1.013 7.269+1.090 celler ±10% adhæ- rente celler 1.425±259 4.128+921 16.412±2.747 38.558il.680 +20% adhæ- 15 rente celler 1.944±665 5.926±1.429 13.182±3.007 40.065+5.810

Adhsrente celler 192±69 261±186 224±95 804±42 a Alle kulturer fremstilledes i trip!ikat. Resultater udtrykt som gennemsnits-tællinger per minut ± gennemsnitlige standard-fejl 20 bTT (tetanus-toxoid): 10 g/ml CTT (renset protein-derivat): 10 g/ml ^fåresyge: 1/20 fortynding

DK 154093 B

19 L· s ® O + +' z ' Z + 2 ° α £ - r- > V) s_ I- t I . . + _ ™ <*> *-* x + '+ + + 0°z5e^:c O £ s. <n <u cd s_ co I 00°0CC=Q.

”0 a> j— i O + . c_ C 3 v 1 Jr 0) m 0)

V Q Π ' § Ό -Π V

£<U° - ncO(U

Pr CO + ^It+jOk-S

*2*1— 1 i O + O

E ω + O) q) 3 0 = n , + <u g) > σι o -ίζΖ-,Φ ^ « 2 h , ° ° 0 5 c Ϊ S ” a fli * O ® ! . ® §2 0 ! + Hl .s jS <5

> x 1 + > — u -P

s- 3 + =ZZ-2irai § S j! + z o, oz * 5 t E ? ; > S S ^ 0 + " 2 o § > s ° j_ c ~ ω c — Οφ—® -Q i + * 1V ^ '+> £ μ = hZ , O O . + Z ! Z ^ 3 α> *

8 * .2 H ?S

o £ d, rn -Ω C

(U ro ω in to —· cu £- —. vp j2 O S_ · 4_> E_ 1 «> 9 ~ -2 £ ra .. J. g.

- Ό · 9 1 " -§ 2 li i r; g c £ g o S t B g S 2 i o § c g JS o “ Ό m -S ^ ™ O ^ <C 10 O C > 0) o » 2 ® o S S S E E g £ . cs_J- = E Ϊ3 *G S} « 2 = > I - m ^.^2o>“h p ίω,ρ-Ρϋφ — O) 3 ~ 5 £ o $ ~ ,<u o— tlOmr10 ..i wi-nO'-^c+J>5_ S= O5“5a>~Sc^<u<u‘ii<u „S5 « ® c © s. Ol^c^S-n^^aa^5^ r° · W Ό Cp -n ® ^ L r ? c ii L·^" ,Ε § · : S C ® °- Wflj:£w£b^aj+J+JL. jc — -©~Ew.- •o (U E m ίί ·Ρ "s Q) ,ρ Π) Tu in > .1 S I I ? i I S: 1*" f o ό £ q.OC'2C'<uj x<vSx Q.Z+* <£

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof kaldet OKM 1, hvilket antistof a) reagerer med et antigen, der findes på normale humane 5 monocyter og granulocyter, men ikke med normale humane perifere T-celler, B-celler, nul-celler, thymocyter, lymfo-blastoide celle-linier eller tumor-celler af T- eller B-celle-linie; b) udviser reaktivitetsmønsteret over for normale humane mono- 10 cyter vist i figur 1 og tabel (I),· c) udviser reaktivitetsmønsteret med normale humane E+ og E" perifere blod-celler vist i figur 2 og tabel (II); d) udviser reaktivitetsmønsteret med normale humane Ig~, E”, non-adhærente nul-celler vist i figur 3; 15 e) udviser det lytiske kapacitetsmønster vist i figur 4 og tabel (III); f) reagerer med leukæmi-celler fra patienter med akut myelo-monocytisk leukæmi (AHNL); KENDETEGNET ved, at man dyrker hybri domacel1el i ni en ATCC nr. CRL 8026 in 20 vitro i et egnet medium eller indfører den intraperitonealt til mus, og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

2. Hybridomacellelinie til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det er hybridomacellelinien ATCC nr.

25 CRL 8026.

3. Diagnostisk præparat til påvisning af 0KM1+ celle overskud eller mangel, KENDETEGNET ved, at det i blanding med en diagnostisk acceptabel bærer omfatter det monoklonale antistof 0KM1 fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1 i en mængde, som er effektiv til at påvise 0KM1+ 30 celle overskud eller mangel. 33