FI75600C - Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot en maensklig monocytantigen medelst en ny hybridcellinje. - Google Patents

Description

1 75600

Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ihmisen monosyyttiantigeenille uuden hybridisolulinjän avulla 5 Keksinnön kohteena on menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi antigeenille, joka esiintyy ihmisen normaaleissa monosyyteissä ja granulosyyteissä. Menetelmässä käytetään hyväksi uutta hybridisolulinjaa. Vasta-ainetta voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituk-10 siin.

Kohler'in ja Milstein'in 1975 /Nature 256, 495-497 (1975X7 aikaansaama hiiren myeloomasolujen yhdistäminen immunoitujen hiirien pernasoluihin osoitti ensimmäisen kerran, että oli mahdollista valmistaa jatkuva 15 solulinja, joka tuotti homogeenistä (ns. "monoklonaalis-ta") vasta-ainetta. Tämän alkutyön jälkeen on paljon ponnisteluja suunnattu erilaisten hybridisolujen (joita nimitetään "hybridomiksi") tuottamiseen ja näillä hybridomilla tehtyjen vasta-aineiden käyttämiseen eri-20 laisiin tieteellisiin tutkimuksiin. Ks. esimerkiksi

Current Topics in Microbiology and Immunology, nide 81 -"Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, toimittajia, Springer-Verlag, 1978, ja siinä esitetyt viitteet; C.J. Barstable, et al., Cell, 14, 25 9-20 (toukokuu, 1978); P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (marraskuu, 1978); Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, nide 2, D.M. Wier, toimittaja, Blackwell, 1978, luku 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1, 1979, 15-17. Nämä viitteet osoitta-30 vat samanaikaisesti menestykset ja vaikeudet yritettäessä tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta hybridomista. Samalla kun yleinen menetelmä on hyvin ymmärretty teo-rissa, kohdataan monia vaikeuksia ja tarvitaan modifikaatioita kutakin erikoistapausta varten. Itse asias-35 sa ei ole mitään varmuutta yritettäessä valmistaa tiet- 2 75600 tyä hybridomaa, että saadaan haluttu hybridoma, ja että siinä onnistuttaessa se tuottaa vasta-ainetta, tai että näin tuotetulla vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistumiseen vaikuttaa pääasiallisesti käytetty an-5 tigeenityyppi ja selektiomenetelmä, jota käytetään halutun hybridoman eristämiseen.

Yrityksiä valmistaa monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen lymfosyyttisolujen pinta-antigeeneille on kuvattu vain muutamassa tapauksessa. Ks. esimerkiksi Current 10 Topics in Microbiology and Immunology, samat, 66-69 ja 164-169. Näissä kuvatuissa kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblatoidileukemian ja ihmisen kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet saadut hybridomat näyttivät tuottavan vasta-ainet-15 ta kaikissa ihmisen soluissa esiintyville eri antigeeneille. Yksikään hybridoma ei tuottanut vasta-ainetta tiettyä ihmisen lymfosyyttiryhmää vastaan.

Äskettäin ovat tämän hakemuksen hakijat ja muut julkaisseet artikkeleita, joissa kuvataan sellaisten 20 hybridomien, jotka tuottavat vasta-ainetta tietyille T-solu-antigeeneille, valmistusta ja testausta. Ks. esimerkiksi Reinherz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 4061-4065 (1979); ja Kung, P.C., et 25 ai., Science, 206, 347-349 (1979).

Lisäksi on äskettäin esitetty kuvaus anti-makro-fagia tuottavan kloonin valmistuksesta. Ks. Springer et ai., Eur. J. Immunol., 9, 301 (1979).

On olemassa kaksi lymfosyyttien pääluokkaa, jot-30 ka osallistuvat ihmisten ja eläinten immuunijärjestelmään. Toinen näistä (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kanta-soluista. Näiden erikoistuvien solujen ollessa kateenkorvassa niitä nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-35 solut poistuvat kateenkorvasta ja kiertävät kudoksissa, imuku-

II

3 75600 doksissa ja verenkiertojärjestelmässä. Nämä T-solut muodostavat suuren osan kiertävistä pienistä lymfosyyteistä.

Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja ovat suoraan osallisina soluvälitteisissä immuunivasteissa (kuten elinsiirtoi-5 hin liittyvä hylkiminen) efektorisoluina. Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiluokka tarvitsee joskus näitä T-soluja näiden vasta-aineiden eritykseen. Joillakin T-solu-tyypeillä on säätelevä tehtävä immuunijärjestelmän 10 muissa toiminnoissa. Tämän soluyhteistyöprosessin mekanismia ei ole vielä täydellisesti ymmärretty.

Toinen lymfosyyttiluokka (luuytimestä peräisin olevat solut eli B-solut) on sellainen, joka erittää vasta-ainetta. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, 15 mutta niiden erilaistumista ei määrää kateenkorva. Linnuissa ne erilaistuvat kateenkorvaa vastaavassa elimessä, nimeltään "Bursa of Fabricius". Nisäkkäillä vastaavaa elintä ei kuitenkaan ole tavattu ja ajatellaan, että nämä B-solut erikoistuvat luuytimessä.

20 Nyt on todettu, että T-solut jakautuvat useiksi ala tyypeiksi, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, joiden tehtävänä on vastaavasti edistää reaktiota, heikentää reaktiota tai tappaa (liuottaa) vieraita soluja. Nämä alaluokat ymmärretään hyvin hiirten 25 elimistössä, mutta vasta äskettäin niitä on kuvattu ihmisen elimistössä. Ks. esimerkiksi R.L. Evans, et ai., Journal of Experimental Medicine, nide 145, 221-232, 1977; ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Diffrentation 30 Antigens", julkaisussa "Contemporary Topics in Immunobiology", O. Stutman, toimittaja, Plenum Press, 1977, nide 7, 363-379.

Kyky tunnistaa tai heikentää T-solujen luokkia tai alaluokkia on tärkeä erilaisten immunoregulatooristen sai-35 rauksien tai tilojen diagnoosia tai hoitoa varten.

4 75600

Esimerkiksi tietyillä leukemioilla ja luuydinkasvai-milla on erilainen prognoosi riippuen siitä, ovatko ne lähtöisin B-soluista tai T-soluista. Siten sairauden prognoosin arviointi riippuu siitä, pystytäänkö nämä kaksi 5 lymfosyyttiryhmää erottamaan toisistaan. Ks. esimerkiksi A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (maaliskuu, 1975); D. Belpomme, et ai., julkaisussa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, et al., toimittajia, Springer, Heidelberg, 10 1977, 33-45? ja D. Belpomme, et al., British Journal of

Haematology, 1978, 38, 85.

Tiettyihin sairaustiloihin (esim. nuoruudenaikaiseen nivelreumaan, pahanlaatuisiin tauteihin ja agammaglobuline-miaan) liittyy epätasapaino T-solujen alaluokkien välillä.

15 On otaksuttu, että autoimmuuneihin sairauksiin yleensä liittyy "auttaja"-T-solujen ylimäärä tai tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen puute, kun taas agammaglobulinemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä tai "auttaja"-T-solu-jen puute. Pahanlaatuisiin tauteihin liittyy tavallisesti 20 "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä.

Tietyissä leukemiamuodoissa syntyy liikaa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja. Diagnoosi riippuu siten kyvystä todeta tämä epätasapaino tai ylimäärä ja määrittää mitä kehitysvaihetta on liikaa. Ks. esimerkiksi J. Ker-25 sey, et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" julkaisussa Haematology and Blood Transfusion, nide 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 ja siinä esitetyt viitteet; sekä E.L. Reinherz, et al., J. Clin. Invest., 64, 392-397 (1979).

30 Agammaglobulinemia, sairaustila, jossa immunoglobulii- nia ei muodostu lainkaan, käsittää ainakin kaksi eri tyyppiä. Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu heikentäjä-T-solujen ylimäärästä johtuen, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Kummassakaan tyypis-35 sä ei potilaan B-soluissa, imusoluissa, jotka ovat vastuussa vasta-aineen varsinaisesta erittämisestä, näytä olevan

II

75600 vajausta tai puutosta; kuitenkin nämä B-solut on joko heikennetty tai niitä ei ole "autettu", mistä on seurauksena suuresti alentunut immunoglobuliinin tuotanto tai sen puuttuminen. Agammaglobulinemiatyyppi voidaan siten 5 määrittää testaamalla, onko heikentäjä-T-soluja ylimäärin tai puuttuvatko auttaja-T-solut.

Terapeuttisella puolella oletetaan, mitä vielä ei ole täysin todistettu, että vasta-aineiden antaminen T-so-lujen alatyyppiä vastaan ylimäärin vaikuttaa terapeuttises-10 ti edullisesti autoimmuuneissa sairauksissa tai pahanlaatuisissa taudeissa. Esimerkiksi auttaja-T-solu-syöpää (tiettyjä ihon T-solu-imukudoskasvaimia ja tiettyjä T-so-lujen akuutteja lymfoblastileukemioita) voidaan hoitaa vasta-aineella auttaja-T-solu-antigeenille. Auttaja-solu-15 jen ylimäärän aiheuttamien autoimmuunisairauksien hoito voi tapahtua samalla tavalla. Heikentäjä-T-solujen ylimäärän aiheuttamia sairauksia (esim. pahanlaatuisia tauteja tai tyypin I agammaglobulinemiaa) voidaan hoitaa antamalla vasta-ainetta heikentäjä-T-solu-antigeenille.

20 Ihmisen koko T-solujen luokkaa vastaan vaikuttavien antiseerumien (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG) on esitetty olevan terapeuttisesti hyödyllisiä potilaille, joille on suoritettu elinsiirtoja. Koska soluvälitteinen immuunivaste (mekanismi, joka liittyy siirretty-25 jen elinten hylkimiseen) riippuu T-soluista, estää tai hidastaa vasta-aineen antaminen T-soluille tätä hylkimis-prosessia. Ks. esimerkiksi Cosimi, et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40: 155-163 (1976) 30 ja siinä esitetyt viitteet.

Lymfosyytit muodostavat kuitenkin vain yhden valkosolujen luokan. Kaksi muuta luokkaa, granulosyytit ja mono-syytit, ovat myös tärkeitä ihmisten ja eläinten immuunijärjestelmien toiminnassa. Erityisesti makrofagit, jotka ovat 35 monosyyttien eräs laji, ovat voimakkaasti osallisina immuu-nitoiminnassa. Esimerkiksi, vaikka makrofagit eivät itse 6 75600 eritä vasta-ainetta, ne on havaittu välttämättömiksi T-so-lujen yhteistyölle B-solujen vasta-ainetuotannon yhteydessä.

Makrofageja tarvitaan myös sytotoksisten T-solujen 5 kehittämiseen ja proliferatiivisen vasteen esiintymiseen T-soluilla reaktiossa mitogeenien, kuten PHA:n ja Con A:n kanssa. Vaikka makrofagin toiminnasta näissä prosesseissa on esitetty teorioita, sen tarkka tehtävä ei ole tunnettu. Ks. esimerkiksi E.S. Golub, The Cellular Basis of the 10 Immune Response, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, 1977, sivut 146-158.

Ihmisen T-solujen ja monosyyttiluokkien ja -alaluokkien tunnistaminen ja heikentäminen on tähän asti suoritettu käyttäen spontaaneja autovasta-aineita tai selektii-15 visiä antiseerumeita ihmisen T-soluille,jotka antiseerumit on saatu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, juoksuttamalla veri eläimistä seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi (esimerkiksi) autologisilla, mutta ei-allogeenisilla B-soluilla, vasta-aineiden poistamiseksi, 20 joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on äärimmäisen vaikeata, erityisesti adsorptio-ja puhdistusvaiheissa. Jopa adsorboidut ja puhdistetut antiseerumit sisältävät monia epäpuhtauksia halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä. Ensinnäkin seerumi sisältää 25 miljoonia vasta-aine-molekyylejä jo ennen immunointia T- soluilla. Toiseksi immunointi aikaansaa vasta-aineiden tuotannon monia antigeenejä vastaan, joita esiintyy kaikissa injektoiduissa ihmisen T-soluissa. Ei tapahdu mitään selektiivistä vasta-aineen tuotantoa yksittäistä antigeeniä vas-30 taan. Kolmanneksi tällaisilla menetelmillä saadun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti hyvin alhainen (esim. inaktiivinen suuremmissa laimennuksissa kuin 1:100) ja spesifisen vasta-aineen suhde ei-spesifiseen on pienempi kuin 1/106.

35 Ks. esimerkiksi Chess'in ja Schlossman'in artikkelia, johon edellä viitattiin (sivulta 365 eteenpäin), ja Chemi-

II

7 75600 cal and Engineering News'in artikkelia, johon edellä viitattiin, ja joissa tekniikan tason antiseerumien puutteet ja monoklonaalisen vasta-aineen edut on kuvattu.

Nyt on löydetty uusi hybridoma (nimeltään OKM1), jo-5 ka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta antigeeniä vastaan, jota esiintyy normaaleilla ihmisen perifeerisillä veren monosyyteillä ja granulosyyteillä mutta ei normaaleilla ihmisen perifeerisillä lymfosyyteillä (T-soluilla, B-soluilla tai nollasoluilla), tymosyyteillä, 10 lymfoblastoidisolulinjoilla tai T- tai B-soluperäisillä kasvainsoluilla.

Näin tuotettu vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle determinantille normaaleissa ihmisen perifeerisissä ääreisverimonosyyteissä ja -granulosyyteissä eikä pää-15 asiallisesti sisällä mitään muuta ihmisen vastaista immuno-globuliinia vastakohtana alan aikaisemmille antiseerumeille (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-ainetta, joka on reaktiokykyinen lukuisten ihmisen antigeenien kanssa) ja alan aikaisemmille monoklonaalisille vas-20 ta-aineille (jotka eivät ole monospesifisiä ihmisen mono-syyttigeenille). Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi tarvitsematta immunoida ja tappaa eläimiä, mitä seuraa aikaavievät adsorptio- ja puhdis-tusvaiheet, jotka ovat tarpeen alan aikaisempien epäpuhtai-25 denkin antiseerumeiden saamiseksi.

Sekä esillä oleva hybridoma että sillä tuotettu vasta-aine identifioidaan tässä nimityksellä "OKM1", kumpaa kulloinkin tarkoitetaan, käy ilmi asiayhteydestä. Hybridoma tallennettiin 13.12.1979 kokoelmaan American Type Culture 30 Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 ja sille annettiin ATCC-talletusnumero CRL 8026.

Vasta-aineelle OKM1 on tunnusomaista, että se a) reagoi antigeenin kanssa, jota esiintyy normaaleilla ihmisen monosyyteillä ja granulosyyteillä, mutta 35 joka ei reagoi normaalien ihmisen perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen, tymosyyttien, lymfoblastoidiso- 8 75600 lulinjajen tai T- tai B-soluista peräisin olevien kasvain-solujen kanssa; b) reagoi noin 27 %:n kanssa fraktioimattomia, noin 18 %:n kanssa ei-kiinnittyviä ja noin 78 %:n kans- 5 sa kiinnittyviä ihmisen perifeerisen veren mononukleaa-risia soluja; c) reagoi noin 13,5 %:n kanssa E-rosetti-positii-visia ja noin 57,5 %:n kanssa E-rosetti-negatiivisia ihmisen perifeerisiä lymfosyyttejä; 10 d) reagoi noin 84 %:n kanssa ihmisen normaaleja

Ig“, E-- ja ei-kiinnittyviä nollasoluja; e) reagoi akuuttia myelomonosyyttistä leukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolujen kanssa; f) määrittelee monosyyttipopulaation, joka on 15 välttämätön proliferatiivista vastetta varten liukoisille antigeeneille; g) määrittelee monosyyttipopulaation, jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, akuutissa tarttuvassa mononukleoo- 20 sissa ja elinsiirtoreaktiossa, normaalia suurempina pitoisuuksina multippeliskleroosissa, myasthenia graviksessa ja epänormaalissa Hodgkins'in taudissa, ja normaaleina pitoisuuksina hyper-IgE:ssa, varhaisessa Hodgkins'in taudissa ja psoriasiksessa.

25 Vasta-aineen OKM1 valmistus uuden hybridisolu- linjan ATCC CRL 8026 avulla on kuvattu patenttivaatimuksissa 1 ja 2.

Hybridoma valmistettiin seuraten yleisesti Milstein'in ja Köhler'in menetelmää. Hiirien immunoin- 30 nin jälkeen normaaleilla E-rosetti-puhdistetuilla ihmisen yksitumaisilla soluilla immunoituihin hiiriin ruiskutettiin hiiren luuydinkasvainlinjan soluja ja saaduista hybridomista seulottiin ne, joiden pinta-nesteet sisälsivät vasta-ainetta, joka sitoutui selek- 35 tiivisesti normaaleihin E-rosetti-positiivisiin ja E-

II

75600 rosetti-negatiivisiin ihmisen perifeerisen veren imu-solupopulaatioihin. Halutut hybridomat kloonattiin sen jälkeen ja karakterisoitiin. Tulokseksi saatiin hybridoma, joka tuottaa vasta-ainetta (nimeltään 0KM1) antigeeniä 5 vastaan, jota esiintyy normaaleilla ihmisen perifeerisen veren monosyyteillä.

Ottaen huomioon alalla esiintyneet vaikeudet ja epäonnistuneet tulokset käytettäessä pahanlaatuisia solulinjoja antigeeninä, oli yllättävää, että tällä 10 menetelmällä saatiin haluttu hybridoma. On korostettava, että hybridisolujen valmistuksen ennalta arvaamattoman luonteen vuoksi ei ole mahdollista ekstrapoloida yhdestä antigeeni- tai solusysteemistä toiseen. Itseasiassa on havaittu, että pahanlaatuisen solulinjan T-15 solujen tai solun pinnalta erotettujen puhdistettujen antigeenien käyttö antigeeninä ei yleensä johtanut onnistuneisiin tuloksiin.

Hybridoman ja sillä saadun vasta-aineen valmistus ja karakterisointi tulevat paremmin ymmärrettäviksi 20 seuraavan selityksen ja esimerkkien avulla.

Hybridoman valmistusmenetelmä käsittää yleensä seuraavat vaiheet: A. Hiiriä immunoidaan normaaleilla ihmisen yksitumaisilla ääreisverisoluilla. Samalla kun on havait- 25 tu, että naaraspuoliset BALB/cJ-hiiret ovat edullisia, myös muiden hiirikantojen käyttöä voidaan ajatella. Immunointiaikataulun ja tymosyyttien pitoisuuden tulisi olla sellaiset, että saadaan käyttökelpoiset määrät sopivasti esikäsiteltyjä splenosyyttejä. Kol-30 me immunointia neljäntoista päivän välein 2 x 10^ solulla/hiiri/ruiske 0,2 mlrssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta on havaittu tehokkaaksi.

B. Pernat poistetaan immunoiduista hiiristä ja valmistetaan pernasoiususpensio sopivaan väliaineeseen.

35 Noin yksi millilitra väliainetta pernaa kohti on riittävä. Nämä koemenetelmät ovat hyvin tunnettuja.

10 75600 C. Suspendoidut pernasolut yhdistetään, sopivasta solulinjasta saatujen hiiren luuydinkasvainsolujen kanssa käyttämällä sopivaa yhdistymistä edistävää ainetta. Edullinen suhde on noin 5 pernasolua luuydin- 5 kasvainsolua kohti. Noin 0,5-1,0 ml:n kokonaistilavuus

O

yhdistämisväliainetta on riittävä noin 10 pernasolua varten. Tunnetaan useita hiiren luuydinkasvainsolu-linjoja ja niitä on saatavissa yleensä akateemisen yhteisön jäseniltä tai eri talletuspankeista, kuten kes-10 kuksesta Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla CA. Käytetyn solulinjan tulisi edullisesti olla ns. "lääkeaineen kestävää" tyyppiä, niin että vapaat luuydinkasvainsolut eivät jää eloon selektiivisessä väliaineessa, kun taas hybridit jäävät eloon. Ylei-15 simmän luokan muodostavat 8-atsaguaniinia kestävät solulinjat, joilta puuttuu hypoksantiiniguaniini-fos-foribosyyli-transferaasientsyymi eivätkä ne siten kasva HAT-väliaineessa (sisältää hypoksantiinia, aminopte-riiniä ja tymidiiniä).

20 Yleensä on myös edullista, että käytetty luuydin- kasvainsolulinja on ns. "ei-erittävää" tyyppiä, niin että se ei itse tuota mitään vasta-ainetta, joskin myös erittäviä tyyppejä voidaan käyttää. Tietyissä tapauksissa erittävät luuydinkasvainlinjat voivat 25 kuitenkin olla edullisia. Samalla kun edellinen yhdistymistä edistävä aine on polyetyleeniglykoli, jonka keskimääräinen molekyylipaino on väliltä noin 1000 -noin 4000 (saatavana kaupallisesti PEG 1000:na, jne.), voidaan käyttää myös muita alalla tunnettuja yhdisty-30 mistä edistäviä aineita.

D. Vapaiden pernasolujen, vapaiden luuydinkasvainsolujen ja yhdistyneiden solujen seosta laimennetaan ja viljellään erillisissä astioissa selektiivisessä väliaineessa, jossa vapaat luuydinkasvain- 35 solut eivät kasva sellainen aika, joka on riittävä vapaiden solujen kuolemiseksi (noin 1 viikko). Lai-

II

11 75600 mentaminen voi olla rajoittavaa tyyppiä, jossa laimenti-men tilavuus on tilastollisesti laskettu tietyn määrän soluja (esim. 1-4) eristämiseksi jokaiseen erilliseen astiaan (esim. mikrotiitterilevyn jokaiseen syvennyk-5 seen). Väliaineena on väliaine (esim. HAT-väliaine), jossa lääkkeenkestävä (esim. 8-atsaguaniinia kestävä) vapaa luuydinkasvainsolulinja ei kasva. Täten nämä luuydinkasvainsolut tuhoutuvat. Koska vapaat pernasolut eivät ole pahanlaatuisia, niillä on ainoastaan 10 äärellinen lukumäärä sukupolvia. Siten tietyn ajan (noin 1 viikon) kuluttua nämä vapaat pernasolut eivät pysty lisääntymään. Toisaalta yhdistyneet solut jatkavat lisääntymistään, koska niillä on luuydinkasvai-mesta peräisin oleva pahanlaatuinen luonne ja perna-15 soluista peräisin oleva kyky jäädä eloon selektiivisessä väliaineessa.

E. Arvioidaan hybridoman sisältävä pintaneste jokaisessa säiliössä (syvennyksessä) sen suhteen, sisältääkö se vasta-ainetta E-rosetti-positiivisille 20 puhdistetuille tai E-rosetti-negatiivisille ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteille.

F. Haluttua vasta-ainetta tuottavat hybridomat valikoidaan (esim. rajoittavalla laimennuksella) ja kloonataan.

25 Kun haluttu hybridoma on valittu ja kloonattu, voidaan saatua vasta-ainetta tuottaa kahdella eri tavalla. Puhtainta monokloonista vasta-ainetta tuotetaan viljelemällä in vitro haluttua hybridomaa sopivassa väliaineessa sopivan pituinen aika, mitä seuraa 30 halutun vasta-aineen talteenotto viljelmän pintanes-teestä. Sopiva väliaine ja sopiva viljelyajan pituus ovat tunnettuja tai helposti määritettävissä. Tämä in vitro menetelmä antaa pääasiallisesti monospesifi-sen monokloonisen vasta-aineen, joka on pääasiallises-35 ti vapaa muusta spesifisestä ihmisen vastaisesta immuno- 12 7560 0 globuliinista. Pieni määrä muuta immunoglobuliinia on läsnä, koska väliaine sisältää ksenogeenistä seerumia (esim. vasikan sikiöseerumia). Tämä in vitro menetelmä ei kuitenkaan tuota riittävää vasta-ainemäärää tai vas-5 ta-ainepitoisuutta joihinkin tarkoituksiin, koska mono-kloonisen vasta-aineen pitoisuus on ainoastaan noin 50 jig/ml.

Haluttaessa paljon suurempia pitoisuuksia hieman vähemmän puhdasta monokloonista vasta-ainetta halut-10 tua hybridomaa injektoidaan hiiriin, edullisesti syngeenisiin tai semisyngeenisiin hiiriin. Hybridoma aiheuttaa vasta-ainetta tuottavien kasvainten muodostumisen sopivan inkuboimisajän jälkeen, mistä on seurauksena halutun vasta-aineen suuri pitoisuus (noin 15 5-20 mg/ml) isäntähiiren veressä ja peritoneaalisessa tulehdusnesteessä (vesivatsa). Vaikka näillä isäntä-hiirillä on myös normaaleja vasta-aineita veressään ja vesivatsassaan, näiden normaalien vasta-aineiden pitoisuus on ainoastaan noin 5 % monoklonaalisen vas-20 ta-aineen pitoisuudesta. Lisäksi, koska nämä normaalit vasta-aineet eivät ole ihmisen vastaisia spesifisyydeltään, on monoklooninen vasta-aine, joka on saatu talteenotetuista vesivatsoista tai seerumista, pääasiallisesti vapaa kaikesta kontaminoivasta ihmisen 25 vastaisesta immunoglobuliinista. Tällä monokloonisel-la vasta-aineella on suuri tiitteri (aktiivinen laimennuksissa 1:50,000 tai suuremmissa) ja suuri spesifisen immunoglobuliinin suhde ei-spesifiseen (noin 1/20). Immunoglobuliinit, jotka sisältävät rakentees-30 saan kevyitä luuydinkasvainketjuja, ovat ei-spesifi-siä, ei-vaikuttavia peptidejä, jotka pelkästään laimentavat monokloonista vasta-ainetta vähentämättä sen spesifisyyttä.

li 13 75600

Esimerkki I

Monokloonisten vasta-aineiden valmistus A. Immunointi ja somaattinen soluhybridisointi

Naaraspuolisia BALB/cJ-hiiriä (Jackson Laboratories; 5 6-8 viikon ikäisiä) immunoitiin vatsaontelon sisäisesti n 2 x 10':llä rosetti-puhdistetulla ihmisen yksitumaisella solulla 0,2 mlrlla fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta 14 päivän väliajoin. 4 päivää kolmannen immunoinnin jälkeen pernat poistettiin hiiristä ja tehtiin yksinkertai-10 nen solususpensio puristamalla kudos ruostumattoman te-räslankaverkon läpi.

Solujen yhdistäminen suoritettiin Köhler'in ja

O

Milstein'in kehittämällä menetelmällä. 1 x 10° perna-solua yhdistettiin 0,5 ml:ssa fuusioväliainetta, joka 15 sisälsi 35 % polyetyleeniglykolia (PEG 1000) ja 5 % dimetyylisulfoksidia RPMI 1640-väliaineessa (Cibco,

Grand Island, NY), 2 x 10^ P3X63Ag8Ul-myelooma-soluja, joita toimittaa Dr. M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Nämä luuydinkasvainsolut erittä-20 vät kevyitä IgG-^-ketjuja.

B. Hybridoman valinta ja kasvatus

Solujen yhdistämisen jälkeen niitä viljeltiin HAT-väliaineessa (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini) 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka si-25 sälsi 5 % C02· Useita viikkoja myöhemmin 40-100 1 hyb-ridomia sisältävien viljelmien pintanestettä lisättiin pellettiin, jossa oli 10^ perifeeristä imusolua erotettuna E-rosetti-positiivisiksi (E+) ja E-rosetti-nega-tiivisiksi (E“)-populaatioiksi, jotka valmistettiin 30 terveiden luovuttajien verestä kuten Mendes (J.Immunol. 111:860, 1973) on kuvannut. Näihin soluihin sitoutuvien hiirien hybridoma-vasta-aineiden havaitseminen suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssilla. Solut, joita oli inkuboitu viljelmien pintanesteiden kanssa, vär-35 jättiin fluoresiinilla käsitellyllä vuohi-anti-hiiri- 14 75600

IgG (G/M FITC):lla (Meloy Laboratories, Springfield, VA; F/p = 2,5) ja fluoresoivat vasta-aineella päällystetyt solut analysoitin senjälkeen Cytofluorograf FC200/4800A (Ortho Instruments, Westwood, MA)-laitteella kuten esi-5 merkissä 3 on selostettu. Hybridoma-viljelmät, jotka sisälsivät vasta-ainetta, jotka reagoivat spesifisesti E+-lymfosyyttien (T-solujen) ja/tai E“-lymfosyyttien kanssa, valittiin ja kloonattiin kahdesti rajoittavilla laimennusmenetelmillä syöttösolujen läsnäollessa. Sen 10 jälkeen kloonit siirrettiin vatsaontelon sisäisesti injektoimalla 1 x 107 annetun kloonin solua (0,2 ml) BALB/cJ-hiiriin, joita oli esikäsitelty 2,6,10,14-tetra-metyylipentadekaanilla, jota myy Aldrich Chemical Company nimeltä Pristine. Näistä hiiristä saatuja pahanlaatuisia 15 vesivatsoja käytettiin sitten yksitumaisten solujen karakterisointiin, kuten seuraavassa esimerkissä 2 on selostettu. Yhdellä näistä klooneista tuotettu monoklooninen vasta-aine, joka reagoi sekä E+- että E--solufraktioiden kanssa, nimettiin OKMlrksi. Esillä olevan hybridi-vasta-20 aineen OKM1 osoitettiin standardimenetelmin kuuluvan IgG2a-alalu°fckaan·

Esimerkki 2 OKMl;n reaktiivisuuden karakterisointi A. Yksitumaisten solupopulaatioiden eristäminen 25 Ihmisen yksitumaisia perifeerisiä verisoluja eris tettiin terveistä vapaaehtoisista luovuttajista (iältään 15-40 vuotta) Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoi-nilla (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) seuraten Boyum'in menetelmää, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 30 (Suppl. 97): 77, 1968.

Tarttuvia soluja saatiin inkuboimalla yksitumaisia soluja yksi tunti polystyreeni-maljoissa (100 x 20 mm kudosviljelymaljoja) (Falcon, Oxnard, CA) RPMI 1640:ssa (Grand Island Biological Company, Grand Island, 35 NY), jota oli täydennetty 20 %:lla ihmisen AB-seerumia.

15 75 600

Tarttumattoman jakeen poistamisen jälkeen tarttuvat solut irrotettiin inkuboimalla 4°C:ssa seerumivapaassa MEM-väliaineessa, joka sisälsi 2,5 mM EDTA:ta, mitä seurasi varovainen raapiminen kertakäyttöisen injektio-5 ruiskun kumikärjellä.

Yksitumaiset solut erotettiin E+- ja E“-popu-laatioiksi rosetoimalla lampaan erytrosyyttien kanssa ja differentiaali-sentrifugoinnilla Ficoll-Hypaque'11a. Rosetoiminen suoritettiin sentrifugoimalla yksitumais-10 ten solujen ja lampaan erytrosyyttien seosta viisi minuuttia kierrosnopeudella 800 r/min ja inkuboimalla yksi tunti 4°C:ssa. Erytrosyytti/lymfosyytti-suhde oli 40:1. E+-solut otettiin talteen hajottamalla lampaan punasoluja 0,85-%:isella ammoniumkloridi-liuoksella.

15 Nollasoluja valmistettiin rosetoimalla samalla tavalla pinta-immunoglobuliini-negatiivisella (sGg-)-populaatiolla, joka oli saatu Sephadex G-200-anti-ihmis-(F (ab^-) 2~kromatograf iällä, kuten Chess et ai., ovat aikaisemmin selostaneet, J. Immunol., 113:1113 (1974).

20 Polymorfonukleaarisia valkosoluja saatiin hajottamalla punasoluja, joita oli läsnä ääreisveren Ficoll-Hypaque-sentrifugoinnissa muodostuneessa pelletissä.

B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin 25 potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia, iältään kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Vasta-saadut kateenkorvarauhasen osat pantiin välittömästi 5-%:iseen vasikan sikiöseerumiin väliaineessa 199 (Gibco), hienonnettiin pihdeillä ja saksilla ja tehtiin senjälkeen yksittäisiksi solususpensioiksi puris-30 tamalla metallilankaverkon läpi. Senjälkeen solut kerrostettiin Ficoll-Hypaque:lie ja sentrifugointiin ja pestiin kuten edellä osassa A kuvattiin. Näin saadut tymosyytit olivat yli 95-%:isesti elinkykyisiä ja 90-%:isesti E-rosettipositiivisia.

16 75600 C. T-soluperäiset solulinjat ja T-solujen akuutin lymfoblastoidileukemian solut T-solulinjoja CEM ja HSB-2 sekä B-solulinjoja Laz 156 ja Laz 388 saatiin tohtori H. Lazarukselta 5 (Sidney Farber Cancer Institute, Boston MA). Leukemia-soluja saatiin potilailta, joiden diagnoosi oli akuutti myelomonosyyttinen leukemia (OMML; 5 potilasta) ja akuutti myeloblastinen leukemia (AML; 8 potilasta). Kasvain-populaatioita säilytettiin alhaisessa -196°C:n lämpö-10 tilassa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa DMSO:ssa ja 20-%:isessa AB-ihmisseerumissa pintakarak-terisointiin asti.

Esimerkki 3

Solufluoroqrafinen analyysi ja solujen erotus 15 Monoklonaalisten vasta-aineiden solufluorografi- nen analyysi kaikilla solupopulaatioilla suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssilla fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories) käyttäen fluoresenssiakti-20 vointiin perustuvaa solulajittelijaa (FACS-I) (Beckton, Dickinson, Mountain View, CA) tai solufluorografia FC200/4800A (Ortho Instruments). Lyhyesti, 1 x 10® solua käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta laimennuksena 1:500, inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuuttia ja pestiin 25 kahdesti. Solut saatettiin sitten reagoimaan 0,15 ml:n kanssa suhteessa 1:40 laimennettua G/M FITC 4°C:ssa 30 minuutin ajaksi, sentrifugoitiin ja pestiin kahdesti. Solut analysoitiin sitten FACS:I:lla ja fluore-soinnin voimakkuus solua kohti rekisteröitiin puls-30 sinkorkeusanalysaattorilla. Taustavärjäys saatiin käyttämällä 0,15 ml suhteessa 1:500 laimennettua vesi-vatsanestettä BALB/cH-hiirestä, johon oli vatsaontelon sisäisesti ruiskutettu ei-tuottavaa hybridikloonia.

Kokeissa, jotka käsittävät vasta-aineen ja komp-35 lementtivälitteisen lymfolyysin, tymosyyttejä ja peri- 17 75600 feerisiä T-soluja viljeltiin yli yön, mitä seurasi selektiivinen hajotus ja sen jälkeen analysointi solufluo-rografilla tai FACS:lla.

A. Solumyrkyllisyystutkimukset 5 Herkistysviljelyt soluvälitteistä lymfolyysiä (CML) varten suoritettiin seuraavalla menetelmällä.

5 x 10° kohdesolua käsiteltiin 0,2 ml :11a JiCr-natrium-kromaattia (292 pCi/ml) (New England Nuclear, Boston, MA) ja inkuboitiin 90 minuuttia 37°C:ssa. Kahden pesun 10 jälkeen solut laimennettiin 2 x 10^/ml:ksi väliaineessa, joka sisälsi 10 % FCS. Kaksikymmentä pl merkittyjä soluja jaettiin kartiomaisiin mikrolevyn syvennyksiin 20 |il:n kanssa hybridoma-vasta-aineen sar jalaimennoksia. Yhden tunnin inkuboinnin jälkeen 4°C:ssa lisättiin 15 20 pl tuoretta kaniinin seerumia (1:10-laimennus) sy vennyksiin komplementtilähteeksi. Levyjä inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunti. 140 |il väliainetta lisättiin sitten syvennyksiin ja levyjä pyöritettiin nopeudella 400 g 10 minuuttia. Sata γιΐ supernatanttia poistettiin jo-20 kaisesta syvennyksestä ja aktiivisuus laskettiin gamma-tuikelaskimella (Packard Instrumentation Company Downer's Grove, II). Spesifinen ^Cr-vapautuminen laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa:

c I

25 % vapautunutta spesifistä Cr = Exp - SR

MR - SR

jossa Exp = havaittujen kolminkertaisten määritysten keskiarvo, SR = spontaani vapautuminen soluista, joita 30 on inkuboitu pelkästään komplementin kanssa, ja MR = maksimivapautuminen, joka on saatu käsittelemällä soluja pinta-aktiivisella aineella Triton X (l-%:isella liuoksella).

Suurempien solumäärien hajotus myöhempiä prolife-35 ratiivisia määrityksiä varten suoritettiin suspendoimalla 18 75600 uudelleen 20-50 x 10^ yksitumaista solua 1 ml:aan OKMl 1:250-laimennuksessa ja inkuboimalla 4°C:ssa yksi tunti.

Sen jälkeen lisättiin 0,1 ml tuoretta kaniinin seerumia ja soluja inkuboitiin 37°C:ssa vielä yksi tunti.

5 Kolmen pesun jälkeen solut laskettiin ja niiden elinvoimaisuus määritettiin Trypan-sinisellä.

B. Proliferatiivisen vasteen määritys

Proliferatiivinen vaste liukoisille antigeeneille määritettiin kuten edellä selostettiin. Solut saatet-10 tiin väkevyyteen 2 x 10 elinvoimaista solua/ml RPMI

1640:ssa, joka oli täydennetty 20 %:lla ihmisen AB-see-rumia ja viljelty mikrotiitterilevyillä tetanustoksoidin (TT) läsnäollessa (Massachusetts Department of Public Health Biological Laboratories, Boston, MA), tai puhdis-15 tetun proteiinijohdannaisen (PPD) (National Institutes of Health, Bethesda, MD) tai sikotauti-CF-antigeenin (Microbiological Associates, Walkersville, MD) läsnäollessa. Viljelmät käsiteltiin 5 päivän kuluttua 0,2 Ci:11a /H-metyyli7tymidiniä (½ TdR) (1,9 pCi/mM 20 ominaisaktiivisuus) (Schwarz-Mann, Orangeburg, NY) ja otettiin talteen 18 tuntia myöhemmin MASH 11-laitteella

O

(Microbiological Associates). H-TdR:n aktiivisuus mitattiin Packard Liquid Scintillation Counter-tuikelas-kimella (Packard Instrumentation Company). Jokainen 25 koeryhmä määritettiin kolminkertaisesti ja tulokset on ilmaistu keskiarvolukuina/min (cpm) + standardipoikkeama keskiarvosta.

Kuva 1 esittää fluoresenssimallia, joka on saatu FACS:lla senjälkeen kun fraktioimattomat, tarttu-30 mattomat ja tarttuvat normaalit ihmisen yksitumaiset ääreisverisolut luovuttajasta n:o 1 on saatettu reagoimaan vasta-aineen OKMl (laimennuksessa 1:500) ja G/M FITC:n kanssa. Taustan fluoresenssi saatiin inkuboimalla kutakin populaatiota vesivatsanesteen 1:500 laimen-35 noksen kanssa hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuotta-vaa kloonia.

Il 19 75600

Kuva 2 esittää fluoresenssia, joka on saatu FACS:lla sen jälkeen kun normaaleja ihmisen E+- ja E--yksitumaisia ääreisverisoluja on saatettu reagoimaan OKMl:n ja F/M FITC:n kanssa.

5 Kuva 3 esittää fluoresenssimallia, joka on saatu FACS:lla sen jälkeen kun normaaleja ihmisen Ig-, E- ja tarttumattomia nollasoluja on saatettu reagoimaan vasta-aineen OKMl ja G/M FITC:n kanssa.

Kuva 4 esittää vasta-aineen OKMl ja komplementin 10 hajotuskykyä ihmisen yksitumaisille soluille.

Hybridoman valmistus ja tuloksena saadun mono-kloonisen vasta-aineen valmistus ja karakterisointi suoritettiin kuten edellä esitetyissä esimerkeissä on kuvattu. Vaikka suuria määriä haluttua vasta-ainetta 15 valmistettiin injektoimalla esillä olevaa hybridomaa vatsaontelon sisäisesti hiiriin ja ottamalla pahanlaatuiset vesivatsat talteen, hybridomaa voidaan viljellä myös in vitro alalla hyvin tunnetuin menetelmin ja vasta-aine ottaa talteen viljelmän pintanesteestä.

20 Yhdeksän normaalin luovuttajan yksitumaiset ääreisverisolut erotettiin tarttuviksi ja tarttumatto-miksi populaatioiksi polystyreenimaljoissa ja jokainen jae analysoitiin epäsuoralla immunofluoresenssilla FACS:lla. Solujen, jotka spesifisesti on merkitty 25 OKMl:11a, prosentuaaliset osuudet on annettu taulukossa I. Positiivisten solujen keskiarvo oli 27 % fraktioi-mattomille soluille, 18 % tarttumattomille soluille ja 78 % tarttuville soluille. Luovuttajan n:o 1 kolmen populaation FACS-fluoresenssiprofiilit on esitetty ku-30 vassa 1. Kuten kuvasta IA nähdään, on OKMl:n fluore-senssimalli fraktioimattomilla yksitumaisilla soluilla bimodaalinen. Saman populaation kaksiulotteinen kartoitus osoitti, että OKMl:11a kirkaasti värjäytyneet solut ovat myös suurempia. Havaittiin myös pienem-35 pien solujen populaatio, jonka fluoresenssivoimakkuus oli heikompi. Useimmat näistä pienistä soluista löyty- 20 7 5 6 0 0 vät tarttumattomasta jakeesta (kuva IB). Tarttuvat solut sitävastoin sisältävät kirkkaasti värjäytyneen suuremman populaation (kuva 1C). Tästä OKMl:n reaktiivisuudesta tarttuvien populaatioiden kanssa voitiin päätellä, 5 että vasta-aineen tunnistama yksitumainen solu oli mono-syytti, ja tämän reaktiivisuuden avulla kyseessä oleva vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Eri alkuperää olevien lymfoidi- ja myeloidisolu-jen tutkiminen antoi lisätodisteita tästä spesifisyydes-10 tä. OKM1 ei reagoinut B-solulinjojen (Laz 156 ja Laz 388), T-solulinjojen (CEM ja HSB 2) ja kolmen ihmisen tymo-syytti-valmisteen kanssa. Lisäksi kolme T-CLL-, kuusi B-CLL-, kolme T-ALL- ja kuusi ei-T-ALL-kasvainsolua olivat myös negatiivisia. Sitävastoin OKM1 reagoi voimak-15 kaasti 44-82 %:n kanssa viiden akuutin myelomonosyytti-leukemia (AMML)-näytteen soluista ja noin 35 %:n kanssa soluista kahdessa tapauksessa kahdeksasta akuutista mye-loblastileukemia(AML)-tapauksesta. Kaksi myeloidisolu-linjaa, K562 (lozzio, et ai., Blood 45, 321 (1975) ja 20 HL 60 (Collins, et ai., Native, 270 307 (1977) oli negatiivisia. Eristetyt polymorfonukleaariset valkosolut neljältä normaalilta luovuttajalta olivat kirkkaasti merkittyjä. Nämä tulokset olivat yhtäpitäviä sen käsityksen kanssa, että granulosyytit ja monosyytit ovat 25 läheisesti toistensa sukuisia soluja, joilla on yhteinen alkuperä. Lisäksi AML-soluilla saadut tiedot näyttivät osoittavan, että OKMl reagoi ensisijaisesti mono-syyttisolujen kanssa, jotka olivat myeloidiperäisiä.

Myös tämän reaktiivisuusmallin avulla kyseessä oleva 30 vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.

Värjäysmallista, joka havaittiin fraktioimattomil-la, tarttuvilla ja tarttumattomilla yksitumaisilla soluilla, voidaan päätellä, että vasta-aineen määrittämä mono-35 syyttipopulaatio oli heterogeeninen koon ja tarttumisominaisuuksien suhteen. Kun pinta-Ia-antigeenejä on kuvattu monosyyt-

II

75600 tien alapopulaatioilla, testattiin edellä esitettyjä solu-jakeita (luovuttaja nro 1) monoklonaalisella anti-Ia-vasta-aineella OKU, OKMl:n tunnistamien solujen fenotyypin ka-rakterisoimiseksi edelleen. OKIl+-solujen prosentuaalinen 5 osuus tarttumattomissa ja tarttuvissa jakeissa oli 9 % ja vastaavasti 80 %. Koska Ia:n sisältävät B-lymfosyytit ovat vastuussa osasta siitä värjäytymisestä, joka havaittiin OKU :11a tarttumattomissa populaatioissa, näytti siltä, että OKMl:n tunnistama pieni, tarttumaton solu oli pää-10 asiallisesti Ia . Sensijaan suuret, tarttuvat OKMl+-mono-syytit sisältävät pinta-Ia-determinantteja.

OKMl-solujen jakautuminen E+- ja E -populaatioihin on esitetty taulukossa II. Vaikka useimmat merkityistä soluista löytyivät E -populaatiosta, oli positiivisia soluja 15 läsnä 22 %:iin asti (keskiarvo 13 %) E+-jakeessa. FACS- fluoresenssiprofiilit E - ja E+-soluille on esitetty kuvassa 2. E -soluilla oli bimodaalinen värjäytymismalli, mikä johtuu edellä kuvattujen suurten ja pienten solujen läsnäolosta. Fluoresenssivoimakkuus E+-populaatioilla oli homo-20 geenisempi. Tästä jakeesta löydetyt positiiviset solut olivat pienikokoisia ja suureksi osaksi Ia (keskimääräinen reaktiivisuus OKIl:n kanssa 3 %). Tämän reaktiivisuusmal-lin avulla kyseessä oleva vasta-aine voidaan edelleen todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

25 Edustava FACS-histogrammi OKMl:n reaktiivisuudesta

Ig , E - ja tarttumattoman solupopulaation kanssa on esitetty kuvassa 3. 84 % soluista oli värjäytynyt OKMl:lla ja 11 % OKU :11a. Siten nämä tutkimukset osoittivat, että 0KM1+, Ia -tarttumaton solu oli yllättäen vastuussa suurim-30 masta osasta nollasolu-populaatiota. Tämä reaktiivisuusmal-li on vielä eräs lisätesti, jolla kyseessä oleva vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Komplementtivälitteisiä hajotusmääräyksiä tehtiin useilla edellä kuvatuista populaatioista. OKMl:n sarjalai- 35 mennuksia testattiin fraktioimattomilla, tarttumattomilla 51 ja tarttuvilla soluilla. Spesifiset Cr-vapautusmisarvot 22 7 5 60 0 on esitetty kuvassa 4. Prosentuaaliset arvot, jotka saatiin epäsuoralla iinmunofluoresenssilla (luovuttaja nro 5, taulukko I) ja komplementtivälitteisellä hajotuksella vastasivat hyvin toisiaan kullakin populaatiolla.

5 E+- ja E -soluja tutkittiin myös ja saadut tulokset on esitetty taulukossa III. Jälleen spesifiset ~^Cr-vapau-tumistulokset vastasivat epäsuoralla immunofluoresenssilla saatuja merkitsemistuloksia (luovuttajat nro 8, nro 9 ja nro 10).

10 OKM1- ja komplementti-esikäsittelyn vaikutusta tun nettuun monosyytistä riippuvaan T-solutoimintaan, ts. pro-liferaatiota liukoisten antigeenien läsnäollessa, tutkittiin. Yksitumaisia soluja normaalilta luovuttajalta inku-boitiin OKMl-vasta-aineen (1:250 laimennus) kanssa komple-15 mentin läsnäollessa. Lajiteltu määrä autologisia tarttuvia soluja lisättiin tähän esikäsiteltyyn populaatioon ennen käsittelyä liukoisilla antigeeneillä. Kuten taulukossa IV on esitetty, OKMl:lla ja komplementilla käsitellyt yksitumaiset solut eivät lisääntyneet vasteena liukoisille anti-20 geeneille, kun taas tarttuvien solujen lisääminen (1 %) pystyi palauttamaan niiden lisääntymisvasteen. Koska inku-bointi OKMl-vasta-aineiden kanssa komplementin poissaollessa ei vaikuttanut tähän T-solu-toimintaan, voitaisiin komplementin läsnäollessa havaitun vaikutuksen katsoa aiheutu-25 neen monosyyttien spesifisestä tuhoutumisesta yksitumaisten solujen populaatiossa.

On huomattava, että kun 10-20 % tarttuvia soluja lisättiin 0KMl:lla esikäsiteltyihin soluihin, sekä tausta että antigeenin aiheuttama lisääntyminen lisääntyivät ver-30 rattuina käsittelemättömään populaatioon.

OKMl:n vaikutus CML:aan on myös eräs testi, jolla kyseessä oleva vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.

Taulukko V esittää suhdetta perifeeristen T-solujen 35 ja T-solu-alaryhmien pitoisuuksien ja eri sairaustilojen välillä. Naita suhteita voidaan käyttää terapeuttisiin

II

23 75600 tarkoituksiin, kun tautitila aiheutuu jonkin T-solu-alaryhmän kohonneesta pitoisuudesta (esim. tyyppiä I oleva agammaglobulinemia). Terapeuttisessa käytössä sopivan monokloonisen vasta-aineen antaminen potilaal-5 le, jolla on kohonnut T-solujen alaryhmän pitoisuus, vähentää ylimäärää tai poistaa sen. Taulukossa V esitetyt suhteet ovat vielä eräs tapa, jolla OKMl-vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.

Muita tämän patenttihakemuksen hakijoiden valmis-10 tamia monoklonaalista vasta-ainetta tuottavia hybrido-meja (OKT1, OKT3, OKT4 ja OKT5 sekä OKT6, 0KT8, OKT9 ja OKTIO) ja menetelmä näiden hybridomien ja vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu FI-patenttihake-muksissa 800846, 801343, 801342 ja 802917 sekä 803755, 15 803758, 803756 sekä 803757. Lisäksi hybridoma OKT11 ja sen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 810026.

24 75600

Taulukko I

OKMl:n kanssa reaktiivisten solujen %-osuus epäsuoralla immunofluoresenssilla määritettynä 5 Luovuttaja Positiivisten solujen %-osuus _F/Ha_F/H tarttumaton Tarttuva 1 32,3 20,4 80,6 2 28,2 23,6 83,4 3 20,4 17,5 67,6 10 4 20,6 16,1 74,4 5 26,1 16,5 82,7 6 28,1 2Q,2 74,2 7 30,5 ND 84,8 8 27,7 ND 80,7 15 9 28,7 11,2 76,0

Keskiarvo 26,9 17,9 78,2 a = Yksitumaisia soluja, jotka on valmistettu sentrifu-goimalla Ficoll-Hypaque-gradientilla 20

Taulukko II

0KMl:n kanssa reaktiivisten solujen %-osuus E-ro-setti-positiivisissa ja E-rosetti-negatiivisissa populaatioissa 25

Luovuttaja Positiivisten solujen %-osuus _E^__EΓ_ 1 18,2 64,2 2 12,1 51,2 30 3 13,8 47,9 4 9,7 67,9 5 14,2 41,5 6 22,2 69,0 7 11,5 51,2 35 8 10,6 58,6 9 9,4 55,6 10 12,8 68,5

Keskiarvo 13,5 57,5

II

25 75 60 0

Taulukko III

OKMlrn reaktiivisuus määritettynä komplementtivä-litteisellä hajotuksella E-rosetti-positiivisilla ka E-rosetti-negatiivisilla populaatioilla 5

Spesifinen ^Cr:n vapautumis-%

Vasta-aine E+

Laimennus Luovuttaja Luovuttaja Luovuttaja nro 8 nro 9 nro 10 10 10*2 11,2+3 9,8+2 12,5+1 10-3 7, 8+2 10, 7+2 11 ,7+2 10“4 4,4+2 9,0+2 11,2+2 10 “5 1,5+1 6,7+1 5,5+2 15 E“ 10-2 71, 5+4 68 ,7+5 74,3 + 5 ΙΟ"3 73, 0+3 63,3+7 70,6 + 4 20 10”4 67, 0+5 57,3+4 70,9 + 3 10-5 56,7+3 52,9+3 60,2+5 26 75600

(O

MO G

(H *H

pH ITi O o O o •H CO OV 00 .H >

G Ή O VO 00 P

φ ^ tH * » » s (N ^ 0)5 -P 00 rH Γ-H LT)

θ' ϊ 3+1+1 +1 +1 +| +| MO

•H ” ίΟ^'Μ’σνΟΟίΠ'Τ c +)’d -P σ' in vo in vo o -h G.5 O O (N (N m O00 m to x - - .h

Tj -h σν r» oo o mo 03 j co h m p 3 »o a J :<0

3 M F

X - -H

•H R X

<0 ‘P o ro n- i"- m > 1 iH rH TT O φ

‘P O O f» O X

MO pj » m k - »in Ή ^ fH (N rH (N n σι 3

h ’3 +1 +l +1 +1 +1 +l -P

·· P m (n n- m «ν'» in - y vo vo r» f—i oo rs -h

Uy Q O rH Γ- 'T rH (N (0

_ M Λ * »·.» E

(0 (¾ m in vo m ·Η

•n1^ *Η »H -H

MO +>

rH 5 Φ rH

h !h in E

” m A! \ h ® uv O en

S "P CN rH

!*;?{ in (Tv rH Tf 3 o

o -P INlNOCN» EH rH

> “ H* «H (N Ov rH vo H G 5 +1 +1 +1 +1 +1 00 >1 ** Γ" IN 00 00 VO -H (0 ^

O rH vo »r in in in +1 e A G

Ai Q)P r»rHf*lrHCnrH -H-P 0)

^+>'P Eh »»»vo in in G

3 -P 'P Eh Ή rH xj· in IN -HO -H

H -H « (0 > G

2 « +) M G

<0 mo p ρ ta e

E-< Αί H H) -H G

H T] XX Ό w t! 03 G in rH Jp 0) G ovin -h φ E o p -h oo o »h ιη νοσν E Ai >- -n CD ro oo h in in vo vo h tn l

Φ -H +1 +1 +1 +| +1 +| O to -H

•n ή rHin^j· o in in ^ E ° Co 3 H :ro co h· u\ rvi rr σ\ (ΟΉ-ηιν HO > n rH rH Oi rH >ld) -H \

OP » -P X ·· Q) rH

in a rH rH x; x *-- -p „ ο -h h o tn CP +)0¾ P 3 '2 a -h a g •P -P +) -H o e »H >, <o en 3 φ

H 3 <#> <0 (0 rH p A! 4-> E

to H O τι <0 i0 -n φ <0 O +> -H

6 'P -H rH 3 -h -h G -n Ό +> φ (0

30 -P + H > > rH rHCI+*H

+*52 10 033 0 -Hiomin h 3 φ - - m -P +) m >4-i 3 -h

03¾ H UU+J4-) 036¾ -H

C 3 + + (0 p p (0 -H I0.C+) >H‘h 0» rH rH -H 10 (0 -H A! +1 +> 3 3 0 s S > +) +i > a; φ en ro

0j ««3 ro (03 -HGEh^-P

1 OOPopt-1 kp-(-0+) ro-H—' O

3 +) 3 3 -P «E Q Ai

rHKBtCPOrHOrHp En CU -H

O \ \\ rörHOCNO rfl r^ EH CU 03

Ifl h (k CuP +1 03 + 1 03 Eh Φ Λ O ¾

II

27 75 60 0

f I

g S3 ui + + i z i z t Z α| <! w »a Ή ' 3 g C * oi I 1+ + t O O Z 3 Φ fu g +> 1

O O (0 H

Ό S vp C 9 I

M -H H -H 2 g 01 _ & Ή -M 3 -H g O I I 0+ IO O O O >1 ·Η 2

0 -r» e H

^ P o C „

H -n -H C

-PO -H O 3 01 « _ <0 C Ό

3 C En -H

2 5} % + Il 0) H

3 S 8 1 ' °+ ° + 2 2 z + 3 3 * -d + ¢1 » » i . ^ α

-P 4-) -H § S

dl -h m f-t p -o

> a s b . §HS

0^?O I I oo + o + Z Z Z E -h

X oi O ro -H

λ; -h c > p g 5 3 3® 3 ·ρ + fn ra -p E· 0 11 5 > S o + Z OI o z o Z Z + + +}

V T .OH

3 + 3 S 8 0 4-1+4 0

01 + 3 :m -P

e g s I 2 Φ K _ 2 3 +J O Z I OO I + Z I Z II Ή •H o 'x -p il 5 B (0 -H 0) 3 0} <—I Ή

+j 01 (0 O

“ -P I § >-ri^S

M (0 —· -H s rn Q H <0 O 01 * 8& mfa -H “ .. H <0 M c t rl gö-P-H-Pfl) (0 -H -l—i ίΟφΉ S 3 Φ P +J > -H +J >+J(0 ^ 0) rH 3 ® +-1 s φ -d (°S ciT axg-riHinoir-jcn -P Ό _3 -h x| wj3 .dm +j ra h \ -h ra oi i—i c+j-iiaJ—ö :2-,1, H'r+j-^'+iHMro ai 1 . 0] VQO «. :<0 5 i-t l_J ^ Tj ^ ^ r3 C · P-P G JU -H ® S ^ ^ ·Ι0 'S P q+J-P 52 O :aj

rt! rl > H dl -½ CU ro ^ O -H-HW-P-H-P φ φ oi ra -n -P

il li lii f li f# li 11 f il 11 j 1 i ? i s 5 il Pilli is L3 fin g iii 2 ft 75600

Kyseessä oleva vasta-aine OKMl kuuluu alaluokkaan IgG2a» joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliinin G alaluokat poikkeavat toisistaan ns. "kiinteillä" alueilla, vaikkakin jonkin spesifisen 5 antigeenin vasta-aineessa on ns. "muuttuva" alue, joka on funktionaalisesti sama riippumatta siitä, mihin immunoglobuliinin G alaluokkaan se kuuluu. Ts. monoklo-naalinen vasta-aine, jolla on tässä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkaa IgG-^, IgG2a, IgG2b tai IgG3, tai 10 luokkiin IgM, IgA tai muihin tunnettuihin Ig-luokkiin. Erot näiden luokkien tai alaluokkien välillä eivät vaikuta vasta-aineen reaktiomallin selektiivisyyteen, mutta saattavat vaikuttaa vasta-aineen jatkoreaktioon muiden aineiden, kuten (esimerkiksi) komplementin tai 15 anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Vasta-ainetta OKMl voidaan käyttää monosyyttien erilaistumisen havaitsemiseen ja tutkimiseen.

Sairaustiloja (esim. pahanlaatuisia tauteja, kuten AMML), joissa esiintyy ylimäärin OKMl+-soluja, 20 voidaan hoitaa antamalla terapeuttisesti vaikuttava määrä OKMl-vasta-ainetta yksilölle, joka on tällaisen hoidon tarpeessa. Selektiivisellä reaktiolla OKMl+-antigeenin kanssa tehokas määrä OKMl-vasta-ainetta vähentää OKMl+-solujen ylimäärää, parantaen 25 siten ylimäärän vaikutukset.

Vasta-ainetta OKMl voidaan sisällyttää terapeuttisiin yhdistelmiin, jotka sisältävät vaikuttavia määriä OKMl-vasta-ainetta sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävien kantajien kanssa.

Il

Claims (6)

1. 75600
2. 1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka vasta-aine 5 a) reagoi antigeenin kanssa, jota esiintyy normaa leilla ihmisen monosyyteillä ja granulosyyteillä, mutta joka ei reagoi normaalien ihmisen perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen, tymosyyttien, lymfoblastoidiso-lulinjojen tai T- tai B-soluista peräisin olevien kasvain- 10 solujen kanssa; b) reagoi noin 27 %:n kanssa fraktioimattomia, noin 18 %:n kanssa ei-kiinnittyviä ja noin 78 %:n kanssa kiinnittyviä ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja; 15 c) reagoi noin 13,5 %:n kanssa E-rosetti-positiivi- sia ja noin 57,5 %:n kanssa E-rosetti-negatiivisia ihmisen perifeerisiä lymfosyyttejä; d) reagoi noin 84 %:n kanssa ihmisen normaaleja Ig , E - ja ei-kiinnittyviä nollasoluja; 20 e) reagoi akuuttia myelomonosyyttistä leukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolujen kanssa; f) määrittelee monosyyttipopulaation, joka on välttämätön proliferatiivista vastetta varten liukoisille antigeeneille; 25 g) määrittelee monosyyttipopulaation, jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa ja elin-siirtoreaktiossa, normaalia suurempina pitoisuuksina multippeliskleroosissa, myasthenia graviksessa ja epänormaa- 30 lissa Hodgkins'in taudissa, ja normaaleina pitoisuuksina hyper-IgE:ssa, varhaisessa Hodgkins'in taudissa ja psoriasiksessa; tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraavat vaiheet:
3. 35 A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8026 i) immunoimalla hiiriä ihmisen yksitumaisilla so- 75600 luilla; ii) poistamalla pernat näistä hiiristä ja valmistamalla pernasolujen suspensio; iii) yhdistämällä pernasolut hiiren myeloomasolu-5 jen kanssa yhdistämistä edistävän aineen läsnäollessa; iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva; v) arvioimalla kunkin syvennyksen hybridoomapitoi-10 nen pintaneste sen suhteen sisältääkö se vasta-ainetta ihmisen perifeerisen veren E+- ja E”-lymfosyyteille; vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8026, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi antigeenin kanssa, jota esiintyy normaaleilla ihmisen mono- 15 syyteillä ja granulosyyteillä, mutta joka ei reagoi normaalien ihmisen perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen, tymosyyttien, lymfoblastoidisolulinjojen tai T-tai B-soluista peräisin olevien kasvainsolujen kanssa; ja B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine 20 vii) viljelemällä hybridoomaa ATCC CRL 8026 sopivas sa väliaineessa, ja viii) ottamalla talteen vasta-aine tämän hybridooman pintanesteestä.
4. 2. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmista-25 miseksi, joka vasta-aine a) reagoi antigeenin kanssa, jota esiintyy normaaleilla ihmisen monosyyteillä ja granulosyyteillä, mutta joka ei reagoi normaalien ihmisen perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen, tymosyyttien, lymfoblastoidiso- 30 lulinjojen tai T- tai B-soluista peräisin olevien kasvain-solujen kanssa; b) reagoi noin 27 %:n kanssa fraktioimattomia, noin 18 %:n kanssa ei-kiinnittyviä ja noin 78 %:n kanssa kiinnittyviä ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia 35 soluja; c) reagoi noin 13,5 %:n kanssa E-rosetti-positii- 31 75600 visia ja noin 57,5 %:n kanssa E-rosetti-negatiivisia ihmisen perifeerisiä lymfosyyttejä; d) reagoi noin 84 %:n kanssa ihmisen normaaleja Ig , E -ja ei-kiinnittyviä nollasoluja; 5 e) reagoi akuuttia myelomonosyyttistä leukemiaa sairastavien potilaiden leukemiasolujen kanssa; f) määrittelee monosyyttipopulaation, joka on välttämätön proliferatiivista vastetta varten liukoisille antigeeneille ? 10 g) määrittelee monosyyttipopulaation, jota esiin tyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, akuutissa tarttuvassa mononukleoosissa ja elinsiirtoreaktiossa, normaalia suurempina pitoisuuksina multippeliskleroosissa, myasthenia graviksessa ja epänor- 15 maalissa Hodgkins1 in taudissa, ja normaaleina pitoisuuksina hyper-IgE;ssa, varhaisessa Hodgkins'in taudissa ja psoriasiksessa; tunnettu siitä, että menetelmään kuuluu seuraa-vat vaiheet:
5. 20 A) valmistetaan hybridooma ATCC CRL 8026 i) immunoimalla hiiriä ihmisen yksitumaisilla soluilla ; ii) poistamalla pernat näistä hiiristä ja valmistamalla pernasolujen suspensio; 25 iii) yhdistämällä pernasolut hiiren myeloomasolu- jen kanssa yhdistämistä edistävän aineen läsnäollessa; iv) laimentamalla ja viljelemällä yhdistettyjä soluja erillisissä syvennyksissä väliaineessa, jossa vapaat myeloomasolut eivät kasva; 30 v) arvioimalla kunkin syvennyksen hybridoomapitoi- nen pintaneste sen suhteen sisältääkö se vasta-ainetta ihmisen E+- ja E - lymfosyyteille; vi) valikoimalla ja kloonaamalla hybridooma ATCC CRL 8026, joka tuottaa vasta-ainetta, joka reagoi anti- 35 geenin kanssa, jota esiintyy normaaleilla ihmisen mono-syyteillä ja granulosyyteillä, mutta joka ei reagoi nor- 32 7 5 6 0 0 maalien ihmisen perifeeristen T-solujen, B-solujen, nolla-solujen, tymosyyttien, lymfoblastoidisolulinjojen tai T- tai B-soluista peräisin olevien kasvainsolujen kanssa; ja
6. 5 B) valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine vii) siirtämällä hybridooma ATCC CRL 3026 intraperi-toneaalisesti hiiriin; ja viii) ottamalla talteen vasta-aine hiirien pahanlaatuisesta vesivatsasta tai seerumista. Il 75600