FI75233C - Diagnostiskt foerfarande, vid vilket man utnyttjar en ny monoklonal antikropp specifik mot maenniskans monocytantigen och i foerfarandet anvaendbar komposition. - Google Patents

Description

1 75233

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään hyväksi uutta ihmisen monosyyttiantigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, ja menetelmässä käyttökelpoinen ainekoostumus 5

Jakamalla erotettu hakemuksesta 810027

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään OKMl+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä se-10 kä menetelmässä käyttökelpoiseen ainekoostumukseen. Menetelmässä käytetään hyväksi ihmisen normaaleissa monosyy-teissä ja granulosyyteissä esiintyvälle antigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla.

15 Kohler'in ja Milstein'in 1975 Zjiature 256, 495-497 (1975L/ aikaansaama hiiren myeloomasolujen yhdistäminen im-munoitujen hiirien pernasoluihin osoitti ensimmäisen kerran, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja, joka tuotti homogeenistä (ns. "monoklonaalista") vasta-ai-20 netta. Tämän alkutyön jälkeen on paljon ponnisteluja suunnattu erilaisten hybridisolujen (joita nimitetään "hybri-domiksi") tuottamiseen ja näillä hybridomilla tehtyjen vasta-aineiden käyttämiseen erilaisiin tieteellisiin tutkimuksiin. Ks. esimerkiksi Current Topics in Microbiology and 25 Immunology, nide 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, tornittajia, Springer-Verlag, 1978, ja siinä esitetyt viitteet; C.J. Barnstable, et al., Cell, 14, 9-20 (toukokuu, 1978); P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (marraskuu, 1978); Handbook of Experimental 30 Immunology, 3. painos, nide 2, D.M. Wier, toimittaja, Black-well, 1978, luku 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1, 1979, 15-17. Nämä viitteet osoittavat samanaikaisesti menestykset ja vaikeudet yritettäessä tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta hybridomista. Samalla kun yleinen 35 menetelmä on hyvin ymmärretty teoriassa, kohdataan monia vaikeuksia ja tarvitaan modifikaatioita kutakin erikoista- 75233 pausta varten. Itse asiassa ei ole mitään varmuutta yritettäessä valmistaa tiettyä hybridomaa, että saadaan haluttu hybridoma, ja että siinä onnistuttaessa se tuottaa vasta-ainetta, tai että näin tuotetulla vasta-aineella on halut-5 tu spesifisyys. Onnistumiseen vaikuttaa pääasiallisesti käytetty antigeenityyppi ja selektiomenetelmä, jota käytetään halutun hybridoman eristämiseen.

Yrityksiä valmistaa monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen lymfosyyttisolujen pinta-antigeeneille on kuvattu 10 vain muutamassa tapauksessa. Ks. esimerkiksi Current Topics in Microbiology and Immunology, samat, 66-69 ja 164-169. Näissä kuvatuissa kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemian ja ihmisen kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet saadut hyb-15 ridomat näyttivät tuottavan vasta-ainetta kaikissa ihmisen soluissa esiintyville eri antigeeneille. Yksikään hybridoma ei tuottanut vasta-ainetta tiettyä ihmisen lymfosyyttiryh-mää vastaan.

Äskettäin ovat tämän hakemuksen hakijat ja muut jul-20 kaisseet artikkeleita, joissa kuvataan sellaisten hybrido-mien, jotka tuottavat vasta-ainetta tietyille T-solu-anti-geeneille, valmistusta ja testausta. Ks. esimerkiksi Rein-herz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 4061-25 4065 (1979); ja Kung, P.C., et ai., Science, 206, 347-349 (1979).

Lisäksi on äskettäin esitetty kuvaus anti-makrofagia tuottavan kloonin valmistuksesta. Ks. Springer et ai.,

Eur. J. Immunol., 9, 301 (1979).

30 On olemassa kaksi lymfosyyttien pääluokkaa, jotka osallistuvat ihmisten ja eläinten immuunijärjestelmään. Toinen näistä (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kanta-soluista. Näiden erikoistuvien solujen ollessa kateenkor-35 vassa niitä nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut poistuvat kateenkorvasta ja kiertävät kudoksissa, imuku- 3 75233 doksissa ja verenkiertojärjestelmässä. Nämä T-solut muodostavat suuren osan kiertävistä pienistä lymfosyyteistä.

Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja ovat suoraan osallisina soluvälitteisissä immuunivasteissa (kuten elinsiirtoi-5 hin liittyvä hylkiminen) efektorisoluina. Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiluokka tarvitsee joskus näitä T-soluja näiden vasta-aineiden eritykseen. Joillakin T-solu-tyypeillä on säätelevä tehtävä immuunijärjestelmän 10 muissa toiminnoissa. Tämän soluyhteistyöprosessin mekanismia ei ole vielä täydellisesti ymmärretty.

Toinen lymfosyyttiluokka (luuytimestä peräisin olevat solut eli B-solut) on sellainen, joka erittää vasta-ainetta. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, 15 mutta niiden erilaistumista ei määrää kateenkorva. Linnuissa ne erilaistuvat kateenkorvaa vastaavassa elimessä, nimeltään "Bursa of Fabricius". Nisäkkäillä vastaavaa elintä ei kuitenkaan ole tavattu ja ajatellaan, että nämä B-solut erikoistuvat luuytimessä.

20 Nyt on todettu, että T-solut jakautuvat useiksi ala tyypeiksi, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluiksi, joiden tehtävänä on vastaavasti edistää reaktiota, heikentää reaktiota tai tappaa (liuottaa) vieraita soluja. Nämä alaluokat ymmärretään hyvin hiirten 25 elimistössä, mutta vasta äskettäin niitä on kuvattu ihmisen elimistössä. Ks. esimerkiksi R.L. Evans, et ai., Journal of Experimental Medicine, nide 145, 221-232, 1977; ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Diffrentation 30 Antigens", julkaisussa "Contemporary Topics in Immunobiology", O. Stutman, toimittaja, Plenum Press, 1977, nide 7, 363-379.

Kyky tunnistaa tai heikentää T-solujen luokkia tai alaluokkia on tärkeä erilaisten immunoregulatooristen sai-35 rauksien tai tiloja diagnoosia tai hoitoa varten.

4 75233

Esimerkiksi tietyillä leukemioilla ja luuydinkasvai-milla on erilainen prognoosi riippuen siitä, ovatko ne lähtöisin B-soluista tai T-soluista. Siten sairauden prognoosin arviointi riippuu siitä, pystytäänkö nämä kaksi 5 lymfosyyttiryhmää erottamaan toisistaan. Ks. esimerkiksi A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (maaliskuu, 1975); D. Belpomme, et ai., julkaisussa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lympomas", S. Thierfelder, et ai., toimittajia, Springer, Heidelberg, 10 1977, 33-45; ja D. Belpomme, et al., British Journal of

Haematology, 1978, 38, 85.

Tiettyihin sairaustiloihin (esim. nuoruudenaikaiseen nivelreumaan, pahanlaatuisiin tauteihin ja agammaglobuline-miaan) liittyy epätasapaino T-solujen alaluokkien välillä.

15 On otaksuttu, että autoimmuuneihin sairauksiin yleensä liittyy "auttaja"-T-solujen ylimäärä tai tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen puute, kun taas agammaglobulinemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä tai "auttaja"-T-solu-jen puute. Pahanlaatuisiin tauteihin liittyy tavallisesti 20 "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä.

Tietyissä leukemiamuodoissa syntyy liikaa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja. Diagnoosi riippuu siten kyvystä todeta tämä epätasapaino tai ylimäärä ja määrittää mitä kehitysvaihetta on liikaa. Ks. esimerkiksi J. Ker-25 sey, et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" julkaisussa Haematology and Blood Transfusion, nide 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 ja siinä esitetyt viitteet; sekä E.L. Reinherz, et ai., J. Clin. Invest., 64, 392-397 (1979).

30 Agammaglobulinemia, sairaustila, jossa immunoglobulii- nia ei muodostu lainkaan, käsittää ainakin kaksi eri tyyppiä. Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu heikentäjä-T-solujen ylimäärästä johtuen, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Kummassakaan tyypis-35 sä ei potilaan B-soluissa, imusoluissa, jotka ovat vastuussa vasta-aineen varsinaisesta erittämisestä, näytä olevan 5 75233 vajausta tai puutosta; kuitenkin nämä B-solut on joko heikennetty tai niitä ei ole "autettu", mistä on seurauksena suuresti alentunut immunoglobuliinin tuotanto tai sen puuttuminen. Agammaglobulinemiatyyppi voidaan siten 5 määrittää testaamalla, onko heikentäjä-T-soluja ylimäärin tai puuttuvatko auttaja-T-solut.

Terapeuttisella puolella oletetaan, mitä vielä ei ole täysin todistettu, että vasta-aineiden antaminen T-so-lujen alatyyppiä vastaan ylimäärin vaikuttaa terapeuttises-10 ti edullisesti autoimmuuneissa sairauksissa tai pahanlaatuisissa taudeissa. Esimerkiksi auttaja-T-solu-syöpää (tiettyjä ihon T-solu-imukudoskasvaimia ja tiettyjä T-so-lujen akuutteja lymfoblastileukemioita) voidaan hoitaa vasta-aineella auttaja-T-solu-antigeenille. Auttaja-solu-15 jen ylimäärän aiheuttamien autoimmuunisairauksien hoito voi tapahtua samalla tavalla. Heikentäjä-T-solujen ylimäärän aiheuttamia sairauksia (esim. pahanlaatuisia tauteja tai tyypin I agammaglobulinemiaa) voidaan hoitaa antamalla vasta-ainetta heikentäjä-T-solu-antigeenille.

20 Ihmisen koko T-solujen luokkaa vastaan vaikuttavien antiseerumien (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG) on esitetty olevan terapeuttisesti hyödyllisiä potilaille, joille on suoritettu elinsiirtoja. Koska soluvälitteinen immuunivaste (mekanismi, joka liittyy siirretty-25 jen elinten hylkimiseen) riippuu T-soluista, estää tai hidastaa vasta-aineen antaminen T-soluille tätä hylkimis-prosessia. Ks. esimerkiksi Cosimi, et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40: 155-163 (1976) 30 ja siinä esitetyt viitteet.

Lymfosyytit muodostavat kuitenkin vain yhden valkosolujen luokan. Kaksi muuta luokkaa, granulosyytit ja mono-syytit, ovat myös tärkeitä ihmisten ja eläinten immuunijärjestelmien toiminnassa. Erityisesti makrofagit, jotka ovat 35 monosyyttien eräs laji, ovat voimakkaasti osallisina immuu-nitoiminnassa. Esimerkiksi, vaikka makrofagit eivät itse 75233 eritä vasta-ainetta, ne on havaittu välttämättömiksi T-so-lujen yhteistyölle N-solujen vasta-ainetuotannon yhteydessä .

Makrofageja tarvitaan myös sytotoksisten T-solujen 5 kehittämiseen ja proliferatiivisen vasteen esiintymiseen T-soluilla reaktiossa mitogeenien, kuten PHA:n ja Con A:n kanssa. Vaikka makrofagin toiminnasta näissä prosesseissa on esitetty teorioita, sen tarkka tehtävä ei ole tunnettu. Ks. esimerkiksi E.S. Golub, The Cellular Basis of the 10 Immune Response, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, 1977, sivut 146-158.

Ihmisen T-solujen ja monosyyttiluokkien ja -alaluokkien tunnistaminen ja heikentäminen on tähän asti suoritettu käyttäen spontaaneja autovasta-aineita tai selektii-15 visiä antiseerumeita ihmisen T-soluille,jotka antiseerumit on saatu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, juoksuttamalla veri eläimistä seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi (esimerkiksi) autologisilla, mutta ei-allogeenisilla B-soluilla, vasta-aineiden poistamiseksi, 20 joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on äärimmäisen vaikeata, erityisesti adsorptio-ja puhdistusvaiheissa. Jopa adsorboidut ja puhdistetut antiseerumit sisältävät monia epäpuhtauksia halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä. Ensinnäkin seerumi sisältää 25 miljoonia vasta-aine-molekyylejä jo ennen immunointia T- soluilla. Toiseksi immunointi aikaansaa vasta-aineiden tuotannon monia antigeenejä vastaan, joita esiintyy kaikissa injektoiduissa ihmisen T-soluissa. Ei tapahdu mitään selektiivistä vasta-aineen tuotantoa yksittäistä antigeeniä vas-30 taan. Kolmanneksi tällaisilla menetelmillä saadun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti hyvin alhainen (esim. inaktiivinen suuremmissa laimennuksissa kuin 1:100) ja spesifisen vasta-aineen suhde ei-spesifiseen on pienempi kuin 1/10®.

35 Ks. esimerkiksi Chess'in ja Schlossman'in artikkelia, johon edellä viitattiin (sivulta 365 eteenpäin), ja Chemi- 7 75233 cal and Engineering News'in artikkelia, johon edellä viitattiin, ja joissa tekniikan tason antiseerumien puutteet ja monoklonaalisen vasta-aineen edut on kuvattu.

Nyt on löydetty uusi hybridoma (nimeltään 0KM1), jo-5 ka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta antigeeniä vastaan, jota esiintyy normaaleilla ihmisen perifeerisillä veren monosyyteillä ja granulosyyteillä mutta ei normaaleilla ihmisen perifeerisillä lymfosyyteillä (T-soluilla, B-soluilla tai nollasoluilla), tymosyyteillä, 10 lymfoblastoidisolulinjoilla tai T- tai B-soluperäisillä kasvainsoluilla.

Näin tuotettu vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle determinantille normaaleissa ihmisen perifeerisissä ääreisverimonosyyteissä ja -granulosyyteissä eikä pää-15 asiallisesti sisällä mitään muuta ihmisen vastaista immuno-globuliinia vastakohtana alan aikaisemmille antiseerumeille (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-ainetta, joka on reaktiokykyinen lukuisten ihmisen antigeenien kanssa) ja alan aikaisemmille monoklonaalisille vas-20 ta-aineille (jotka eivät ole monospesifisiä ihmisen mono-syyttigeenille). Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi tarvitsematta immunoida ja tappaa eläimiä, mitä seuraa aikaavievät adsorptio- ja puhdis-tusvaiheet, jotka ovat tarpeen alan aikaisempien epäpuhtai-25 denkin antiseerumeiden saamiseksi.

Sekä esillä oleva hybridoma että sillä tuotettu vasta-aine identifioidaan tässä nimityksellä "OKM1", kumpaa kulloinkin tarkoitetaan, käy ilmi asiayhteydestä. Hybridoma tallennettiin 13.12.1979 kokoelmaan American Type Culture 30 Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 ja sille annettiin ATCC-talletusnumero CRL 8026.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuskessa 810027.

Keksinnön mukaiselle diagnostille menetelmälle, jos-35 sa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että saatetaan tästä yksiköstä otettu 75233 monosyyttikoostumus reagoimaan diagnostisesta tehokkaan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8026, ja joka vasta-aine reagoi normaaleilla ihmisen 5 monosyyteillä ja granulosyyteillä esiintyvän antigeenin kanssa, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solu-jen, B-solujen, nollasolujen, tymosyyttien, lymfoblastoi-disolulinjojen eikä T- tai B-soluperäisten kasvainsolujen kansa, ja määritetään monosyyttipopulaation prosentuaali-10 nen osuus, joka reagoi mainitun vasta-aineen kanssa. Esimerkki 1 0KMl:n reaktiivisuuden karakterisointi A. Yksitumaisten solupopulaatioiden eristäminen Ihmisen yksitumaisia perifeerisiä verisoluja eristet-15 tiin terveistä vapaaehtoisista luovuttajista (iältään 15- 40) Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoinnilla (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) seuraten Boyum'in menetelmää, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97): 77, 1968.

20 Tarttuvia soluja saatiin inkuboimalla yksitumaisia soluja yksi tunti polystyreeni-maljoissa (100 x 20 mm ku-dosviljelymaljoja) (Falcon, Oxnard, CA) RPMI 1640:ssa (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 20 %:lla ihmisen AB-seerumia. Tarttumatto-25 man jakeen poistamisen jälkeen tarttuvat solut irrotettiin inkuboimalla 4°C:ssa seerumivapaassa MEM-väliaineessa, joka sisälsi 2,5 mM EDTA:ta, mitä seurasi varovainen raapiminen kertakäyttöisen injektioruiskun kumikärjellä.

Yksitumaiset solut erotettiin E+- ja E -populaatioik-30 si rosetoimalla lampaanerytrosyyttien kanssa ja differen-tiaali-sentrifugoinnilla Ficoll-Hypaque'11a. Rosetoiminen suoritettiin sentrifugoimalla yksitumaisten solujen ja lampaan erytrosyyttien seosta viisi minuuttia kierrosnopeudel-la 800 r/min ja inkuboimalla yksi tunti 4°C:ssa. Erytrosyyt-35 tilymfosyytti-suhde oli 40:1. E+-solut otettiin talteen hajottamalla lampaan punasoluja punasoluja 0,85-%:isella 75233 9 ammoniumkloridi-liuoksella.

Nollasoluja valmistettiin rosetoimalla samalla tavalla pinta-immunoglobuliini-negatiivisella (sGg )-populaatiolla, joka oli saatu Sephadex G-200-anti-ihmis-5 (F (ak>) 2~kromatograf iällä, kuten Chess et ai., ovat aikai semmin selostaneet, J. Immunol., 113:1113 (1974). Poly-morfonukleaarisia valkosoluja saatiin hajottamalla punasoluja, joita oli läsnä ääreisveren Ficoll-Hypaque-sentri-fugoinnissa muodostuneessa pelletissä.

10 B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia, iältään kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Vastasaadut kateenkorvarauhasen osat pantiin välittömästi 5-%:iseen vasikan 15 sikiöseerumiin väliaineessa 199(Gibco), hienonnettiin pihdeillä ja saksilla ja tehtiin senjälkeen yksittäisiksi solususpensioiksi puristamalla metallilankaverkon läpi. Senjälkeen solut kerrostettiin Ficoll-Hypaque:lie ja sentrifugoitiin ja pestiin kuten edellä osassa A kuvattiin. 20 Näin saadut tymosyytit olivat yli 95-%:isesti elinkykyisiä ja 90-%:isesti E-rosettipositiivisia.

C. T-soluperäiset solulinjat ja T-solujen akuutin lymfoblastoidileukemian solut T-solulinjoja CEM ja HSB-2 sekä B-solulinjoja Laz 25 156 ja Laz 388 saatiin tohtori H. Lazarukselta (Sidney Far- ber Cancer Institute, Boston MA). Leukemiasoluja saatiin potilailta, joiden diagnoosi oli akuutti myelomonosyytti-nen leukemia (OMML; 5 potilasta) ja akuutti myeloblastinen leukemia (AML; 8 potilasta). Kasvainpopulaatioita säilytet-30 tiin alhaisessa -196°C:n lämpötilassa nestemäisen typen höy-ryfaasissa 10-%:isessa DMSO:ssa ja 20-%:isessa AB-ihmissee-rumissa pintakarakterisointiin asti.

Esimerkki 2

Solufluorografinen analyysi ja solujen erotus 35 Monoklonaalisten vasta-aineiden solufluorografinen analyysi kaikilla solupopulaatioilla suoritettiin epäsuo- 75233 10 ralla immunofluoresenssilla fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories) käyttäen fluoresenssiaktivointiin perustuvaa solulajittelijaa (FACS-I) (Beckton, Dickinson, Mountain 5 View, CA) tai solufluorografiaa FC200/4800A (Ortho Instru- g ments). Lyhyesti, 1 x 10 solua käsiteltiin 0,15 ml:lla vasta-ainetta laimennuksena 1:500, inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuuttia ja pestiin kahdesti. Solut saatettiin sitten reagoimaan 0,15 ml:n kanssa suhteessa 1:40 laimennettua 10 G/M FITC 4°C:ssa 30 minuutin ajaksi, sentrifugoitiin ja pestiin kahdesti. Solut analysoitiin sitten FACS-I:11a ja fluoresoinnin voimakkuus solua kohti rekisteröitiin puls-sinkorkeusanalysaattorilla. Taustavärjäys saatiin käyttämällä 0,15 ml suhteessa 1:500 laimennettua vesvatsanestettä 15 BALB/cH-hiirestä, johon oli vatsaontelon sisäisesti ruiskutettu ei-tuottavaa hybridikloonia.

Kokeissa, jotka käsittivät vasta-aineen ja komplement-tivälitteisen lymfolyysin, tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja viljeltiin yli yön, mitä seurasi selektiivinen 20 hajotus ja senjälkeen analysointi solufluorografilla tai FACS:11a.

A. Solumyrkyliisyystutkimukset

Herkistysviljelyt soluvälitteistä lymfolyysiä (CML) varten suoritettiin seuraavalla menetelmällä. 5 x 10^ koh- 51 25 desolua käsiteltiin 0,2 ml :11a Cr-natriumkromaattia (292 ^iCi/ml) (New England Nuclear, Boston, MA) ja inkuboitiin 90 minuuttia 37°C:ssa. Kahden pesun jälkeen solut laimennettiin 2 x 10^/ml:ksi väliaineessa, joka sisälsi 10 % FCS. Kaksikymmentä μΐ merkittyjä soluja jaettiin kartiomai-30 siin mikrolevyn syvennyksiin 20 yal:n kanssa hybridoma-vas-ta-aineen sarjalaimennoksia. Yhden tunnin inkuboinnin jälkeen 4°C:ssa lisättiin 20 μΐ tuoretta kaniinin seerumia (1:10-laimennus) syvennyksiin komplementtilähteeksi. Levyjä inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunti. 140 jal väliainetta lisättiin 35 sitten syvennyksiin ja levyjä pyöritettiin nopeudella 400 g 10 minuuttia. Sata μΐ supernatanttia poistettiin jokaisesta 11 75233 syvennyksestä ja aktiivisuus laskettiin gammatuikelaskimel-la (Packard Instrumentation Company Downer's Grove, II). Spesifinen Cr-vapautuminen laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: 5 51

% vapautunutta spesifistä Cr = Exp - SR

MR - SR X 1UU' jossa Exp = havaittujen kolminkertaisten määritysten keskiarvo, SR = spontaani vapautuminen soluista, joita on in-10 kuboitu pelkästään komplementin kanssa, ja MR = maksimi-vapautuminen, joka on saatu käsittelemällä soluja pinta-aktiivisella aineella Triton X (l-%:isella liuoksella).

Suurempien solumäärien hajotus myöhempiä prolifera-tiivisia määrityksiä varten suoritettiin suspendoimalla 15 uudelleen 20-50 x 10^ yksitumaista solua 1 ml:aan OKMl 1: 250-laimennuksessa ja inkuboimalla 4°C:ssa yksi tunti.

Senjälkeen lisättiin 0,1 ml tuoretta kaniinin seerumia ja soluja inkuboitiin 37°C:ssa vielä yksi tunti. Kolmen pesun jälkeen solut laskettiin ja niiden elinvoi-20 maisuus määritettiin Trypan-sinisellä.

B. Proliferatiivisen vasteen määritys Proliferatiivinen vaste liukoisille antigeeneille määritettiin kuten edellä selostettiin. Solut saatettiin väkevyyteen 2 x 10^ elinvoimaista solua/ml RPMI 1640:ssa, 25 joka oli täydennetty 20 %:lla ihmisen AB-seerumia ja viljelty mikrotiitterilevyillä tetanustoksoidin (TT) läsnäollessa (Massachusetts Department of Public Health Biological Laboratories, Boston, MA), tai puhdistetun proteiini-johdannaisen (PPD) (National Institutes of Health, Bethes-30 da, MD) tai sikotauti-CF-antigeenin (Microbiological Associates, Walkersville, MD) läsnäollessa. Viljelmät käsiteltiin 5 päivän kuluttua 0,2 Ci:11a /H-metyyli7tymidiiniä 3 ( H TdR) (1,9 jiCi/mM ominaisaktiivisuus) (Schwarz-Mann, Orangeburg, NY) ja otettiin talteen 18 tuntia myöhemmin 3 35 MASH 11-laitteella (Microbiological Associates). H—TdR:n aktiivisuus mitattiin Packard Liquid Scintillation Counter- 12 75233 tuikelaskimella (Packard Instrumentation Company). Jokainen koeryhmä määritettiin kolminkertaisesti ja tulokset on ilmaistu keskiarvolukuina/min (cpm) + standardipoikkeama keskiarvosta.

5 Kuva 1 esittää fluoresenssimallia, joka on saatu FACS:lla senjälkeen kun fraktioimattomat, tarttumattomat ja tarttuvat normaalit ihmisen yksitumaiset ääreisveriso-lut luovuttajasta n:o 1 on saatettu reagoimaan vasta-aineen 0KM1 (laimennuksessa 1:500) ja G/M FITC:n kanssa.

10 Taustan fluoresenssi saatiin inkuboimalla kutakin populaatiota vesivatsanesteen 1:500 laimennoksen kanssa hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuottavaa kloonia.

Kuva 2 esittää fluoresenssia, joka on saatu FACS:lla senjälkeen kun normaaleja ihmisen E+- ja E -yksitumaisia 15 ääreisverisoluja on saatettu reagoimaan OKMl:n ja F/M

FITC:n kanssa.

Kuva 3 esittää fluoresenssimallia, joka on saatu FACS:lla senjälkeen kun normaaleja ihmisen Ig , E ja tart-tumattomia nollasoluja on saatettu reagoimaan vasta-aineen 20 OKM1 ja G/M FITC:n kanssa.

Kuva 4 esittää vasta-aineen OKM1 ja komplementin ha-jotuskykyä ihmisen yksitumaisille soluille.

Yhdeksän normaalin luovuttajan yksitumaiset ääreis-verisolut erotettiin tarttuviksi ja tarttumattomiksi popu-25 laatioiksi polystyreenimaljoissa ja jokainen jae analysoitiin epäsuoralla immunofluoresenssilla FACS:lla. Solujen, jotka spesifisesti on merkitty OKMl:lla, prosentuaaliset osuudet on annettu taulukossa I. Positiivisten solujen keskiarvo oli 27 % fraktioimattomille soluille, 18 % tart-30 tumattomille soluille ja 78 % tarttuville soluille. Luovuttajan n:o 1 kolmen populaation FACS-fluoresenssiprofiilit on esitetty kuvassa 1. Kuten kuvasta IA nähdään, on OKMl:n fluoresenssimalli fraktioimattomilla yksitumaisilla soluilla bimodaalinen. Saman populaation kaksiulotteinen kartoitus 35 osoitti, että OKMl:lla kirkkaasti värjäytyneet solut ovat myös suurempia. Havaittiin myös pienempien solujen populaa- 13 75233 tio, jonka fluoresenssivoimakkuus oli heikompi. Useimmat näistä pienistä soluista löytyvät tarttumattomasta jakees-ta (kuva IB). Tarttuvat solut sisävastoin sisältävät kirkkaasti värjäytyneen suuremman populaation (kuva 1C). Tästä 5 0KM1:n reaktiivisuudesta tarttuvien populaatioiden kanssa voitiin päätellä, että vasta-aineen tunnistama yksitumainen solu oli monosyyt.ti, ja tämän reaktiivisuuden avulla kyseessä oleva vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

10 Eri alkuperää olevien lymfoidi- ja myeloidisolujen tutkiminen antoi lisätodisteita tästä spesifisyydestä.

OKM1 ei reagoinut B-solulinjojen (Laz 156 ja Laz 388) , T-so-lulinjojen (CEM ja HSB 2) ja kolmen ihmisen tymosyytti-val-misteen kanssa. Lisäksi kolme T-CLL-, kuusi B-CLL-, kolme 15 T-ALL- ja kuusi ei-T-ALL-kasvainsolua olivat myös negatiivisia. Sitävastoin OKM1 reagoi voimakkaasti 44-82 %:n kanssa viiden akuutin myelomonosyyttileukemia(AMML)-näytteen soluista ja noin 35 %:n kanssa soluista kahdessa tapauksessa kahdeksasta akuutista myeblastileukemia(AML)-tapaukses-20 ta. Kaksi myeloidisolulinjaa, K562 (Lozzio, et ai., Blood 45, 321 (1975) ja HL 60 (Collins, et ai.. Native, 270 307 (1977) oli negatiivisia. Eristetyt polymorfonukleaariset valkosolut neljältä normaalilta luovuttajalta olivat kirkkaasti merkittyjä. Nämä tulokset olivat yhtäpitäviä sen 25 käsityksen kanssa, että granulosyytit ja monosyytit ovat läheisesti toistensa sukuisia soluja, joilla on yhteinen alkuperä. Lisäksi AML-soluilla saadut tiedot näyttivät osoittavan, että OKM1 reagoi ensisijaisesti monosyytti-solujen kanssa, jotka olivat myeloidiperäisiä. Myös tämän 30 reaktiivisuusmallin avulla kyseessä oleva vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.

Värjäysmallista, joka havaittiin fraktioimattomilla, tarttuvilla ja tarttumattomilla yksitumaisilla soluilla, voidaan päätellä, että vasta-aineen määrittämä monosyytti-35 populaatio oli heterogeeninen koon ja tarttumisominaisuuk-sien suhteen. Kun pinta-Ia-antigeenejä on kuvattu monosyyt- 75233 14 tien alapopulaatioilla, testattiin edellä esitettyjä solu-jakeita (luovuttaja nro 1) monoklonaalisella anti-Ia-vasta-aineella OKU, OKMl:n tunnistamien solujen fenotyypin ka-rakterisoimiseksi edelleen. OKIl+-solujen prosentuaalinen 5 osuus tarttumattomissa ja tarttuvissa jakeissa oli 9 % ja vastaavasti 80 %. Koska lain sisältävät B-lymfosyytit ovat vastuussa osasta siitä värjäytymisestä, joka havaittiin OKU:11a tarttumattomissa populaatioissa, näytti siltä, että OKMl:n tunnistama pieni, tarttumaton solu oli pää-10 asiallisesti Ia . Sensijaan suuret, tarttuvat OKMl+-mono-syytit sisältävät pinta-Ia-determinantteja.

OKMl-solujen jakautuminen E+- ja E -populaatioihin on esitetty taulukossa II. Vaikka useimmat merkityistä soluista löytyivät E -populaatiosta, oli positiivisia soluja 15 läsnä 22 %:iin asti (keskiarvo 13 %) E+-jakeessa. FACS- fluoresenssiprofiilit E - ja E+-soluille on esitetty kuvassa 2. E~-soluilla oli bimodaalinen värjäytymismalli, mikä johtuu edellä kuvattujen suurten ja pienten solujen läsnäolosta. Fluoresenssivoimakkuus E+-populaatioilla oli homo-20 geenisempi. Tästä jakeesta löydetyt positiiviset solut olivat pienikokoisia ja suureksi osaksi Ia (keskimääräinen reaktiivisuus OKIl:n kanssa 3 %). Tämän reaktiivisuusmal-lin avulla kyseessä oleva vasta-aine voidaan edelleen todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

25 Edustava FACS-histogrammi OKMl:n reaktiivisuudesta

Ig , E - ja tarttumattoman solupopulaation kanssa on esitetty kuvassa 3. 84 % soluista oli värjäytynyt OKMlrlla ja 11 % OKU:11a. Siten nämä tutkimukset osoittivat, että 0KM1+, Ia -tarttumaton solu oli yllättäen vastuussa suurim-30 masta osasta nollasolu-populaatiota. Tämä reaktiivisuusmal-li on vielä eräs lisätesti, jolla kyseessä oleva vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Komplementtivälitteisiä hajotusmääräyksiä tehtiin useilla edellä kuvatuista populaatioista. OKMl:n sarjalai- 35 mennuksia testattiin fraktioimattomilla, tarttumattomilla 51 ja tarttuvilla soluilla. Spesifiset Cr-vapautusmisarvot 15 75233 on esitetty kuvassa 4. Prosentuaaliset arvot, jotka saatiin epäsuoralla immunofluoresenssilla (luovuttaja nro 5, taulukko I) ja komplementtivälitteisellä hajotuksella vastasivat hyvin toisiaan kullakin populaatiolla.

5 E+- ja E -soluja tutkittiin myös ja saadut tulokset on esitetty taulukossa III. Jälleen spesifiset ur-vapau-tumistulokset vastasivat epäsuoralla immunofluoresenssilla saatuja merkitsemistuloksia (luovuttajat nro 8, nro 9 ja nro 10).

10 0KM1- ja komplementti-esikäsittelyn vaikutusta tun nettuun monosyytistä riippuvaan T-solutoimintaan, ts. pro-liferaatiota liukoisten antigeenien läsnäollessa, tutkittiin. Yksitumaisia soluja normaalilta luovuttajalta inku-boitiin OKMl-vasta-aineen (1:250 laimennus) kanssa komple-15 mentin läsnäollessa. Lajiteltu määrä autologisia tarttuvia soluja lisättiin tähän esikäsiteltyyn populaatioon ennen käsittelyä liukoisilla antigeeneillä. Kuten taulukossa IV on esitetty, OKMltlla ja komplementilla käsitellyt yksitumaiset solut eivät lisääntyneet vasteena liukoisille anti-20 geeneille, kun taas tarttuvien solujen lisääminen (1 %) pystyi palauttamaan niiden lisääntymisvasteen. Koska inku-bointi OKMl-vasta-aineiden kanssa komplementin poissaollessa ei vaikuttanut tähän T-solu-toimintaan, voitaisiin komplementin läsnäollessa havaitun vaikutuksen katsoa aiheutu-25 neen monosyyttien spesifisestä tuhoutumisesta yksitumaisten solujen populaatiossa.

On huomattava, että kun 10-20 % tarttuvia soluja lisättiin OKMl:lla esikäsiteltyihin soluihin, sekä tausta että antigeenin aiheuttama lisääntyminen lisääntyivät ver-30 rattuina käsittelemättömään populaatioon.

OKMl:n vaikutus CML:aan on myös eräs testi, jolla kyseessä oleva vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista.

Taulukko V esittää suhdetta perifeeristen T-solujen 35 ja T-solu-alaryhmien pitoisuuksien ja eri sairaustilojen välillä. Näitä suhteita voidaan käyttää diagnostisiin tar- 75233 16 koituksiin (esim. akuutin tarttuvan mononukleoosin toteamiseen) analysoimalla jonkun yksilön, jolla epäillään olevan joku näistä sairaustiloista, verinäyte T-solujen ja T-solu-alaryhmien pitoisuuksien määrittämiseksi. Taulukos-5 sa V esitetyt suhteet ovat vielä eräs tapa, jolla 0KT11-vasta-aine voidaan havaita ja erottaa muista vasta-aineista .

Diagnostisia menetelmiä, joissa käytetään muita tämän patenttihakemuksen hakijoiden valmistamia monoklonaa-10 lista vasta-ainetta tuottavia hybridomeja (OKT1, OKT3, OKT4 ja OKT5 sekä OKT6, OKT8, OKT9 ja OKTIO) on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 84 4703, 84 4705, 84 4704 ja 84 4706 sekä 84 4707, 85 0062, 85 0063 ja 85 0061.

75233 17

Taulukko I

0KM1:n kanssa reaktiivisten solujen %-osuus epäsuoralla immunofluoresenssilla määritettynä 5 Luovuttaja Positiivisten solujen %-osuus _F/Ha_F/H tarttumaton Tarttuva 1 32,3 20,4 80,6 2 28,2 23,6 83,4 3 20,4 17,5 67,6 10 4 20,6 16,1 74,4 5 26,1 16,5 82,7 6 28,1 2Q,2 74,2 7 30,5 ND 84,8 8 27,7 ND 80,7 15 9 28,7 11,2 76,0

Keskiarvo 26,9 17,9 78,2 a = Yksitumaisia soluja, jotka on valmistettu sentrifu-goimalla Ficoll-Hypaque-gradientilla 20

Taulukko II

0KMl:n kanssa reaktiivisten solujen %-osuus E-ro-setti-positiivisissa ja E-rosetti-negatiivisissa populaatioissa 25

Luovuttaja Positiivisten solujen %-osuus _E^_ET__ 1 18,2 64,2 2 12,1 51,2 30 3 13,8 47,9 4 9,7 67,9 5 14,2 41,5 6 22,2 69,0 7 11,5 51,2 35 8 10,6 58,6 9 9,4 55,6 10 12,8 68,5

Keskiarvo 13,5 57,5 18 75233

Taulukko III

OKMl:n reaktiivisuus määritettynä komplementtivä-litteisellä hajotuksella E-rosetti-positiivisilla ka E-rosetti-negatiivisilla populaatioilla 5

Spesifinen ^Cr:n vapautumis-%

Vasta-aine E+

Laimennus Luovuttaja Luovuttaja Luovuttaja nro 8 nro 9 nro 10 10 10“2 11,2+3 9,8+2 12,5+1 10"3 7, 8+2 10,7+2 11 ,7+2 10-4 4,4+2 9, 0+2 11 ,2+2 10“5 1,5+1 6,7+1 5,5+2 15 E“ ΙΟ"2 71, 5+4 68 ,7+5 74 ,3 + 5 ΙΟ”3 73, 0+3 63 ,3+7 70,6 + 4 20 10~4 67, 0+5 57,3+4 70,9 + 3 10-5 56 ,7+3 52,9+3 60,2+5 75233 19 ίΰ

Md 5

pH σι o o o O

•h ro σ oo ή > G h o vo oo m

a)^ -H - - IN

Dj » +J ro h H

01 £ 3 -H -H +1 +1 +1 +1 :id

-H 5 rd h· h1 σ\ oo in G

+J s 4-* en in yo m ko o -h G E 0 o in in in o oo to

(0 M - -H

J·, -h σι oo o :id ui y ui >H ro h* p 3 ^ « 4J ^ :jg

3 ^ E

rj "rj -h 5 λ: id y; o ro r- r* tn >5 pH iH o tl) •h o o o m sfl 33 v ro - » »tn pH 'U pH IN pH IN fO Ui 3

.H ‘ä -H +1 -H -H -H +1 4J

.. c ro n r-~ rs in h· tn

- >7 ΙΟ ΙΟ Γ" pH 00 IN -H

Uy O O <H Γ~ H (N td

m K Cu LO uovoro iH

•ro^ pH iH -H

Md -P

rH β 0) <H

h tn E

.. -H X \ pH * OI O 01

x •rl IN pH

!*; Φ m σ rH h· 3 o O-*-1 IN IN O IN Eh h > w τΓιΗηισ<Ηνο M G <d -H -H +1 +1 +1 00 >,> Γ" (N 00 00 VO pH td

O pH ID H· U0 (N (N -M fild C

Λί <U g pH Γ0 pH OI pH -H 4-1 O)

4j h eh * * * ·> m tntn G

3 4J-H fu -H pH H· in fN -HO -H

pH -h ® td > td 3 tn -rj 4J (h c td :td > P id c

Eh M •'j <U -H td Ή ‘fj X X Ό tn -P tl) G tn H Λ

0) <d c oitn -h <U E O

P -H oo o pH in ko <j\ E v n

G <u 3 00 pH in (N KO KO H Oi I

O) *P -H +| +1 +| +| +1 +1 O id -H

n-P iH in H" O in H* IN .V E ° Co 3 Ή :rd oo h· ok rs h> ok id ή -h in pH O > ro rH rH -M· Oi (H >, φ -H \

O P - 4J Λ · 01 H

tn Λ Ή pH Λ Λ ~ 4J

<u ή ή o tn G Ö 4-> O 73 p 3

Φ -H α -H Or G

4J Ä 4-> -H O G

tn P >ι Ό tn 3 <u

H 3 <#> id id pH P Λί 4-i E

id-P O -nidid-n φ td o 4-> -H

§-H -H H 3 -H -H 3 το Ό 4-1 Q) id

O 4J + pH > > Ή H G I 4-1 iH

4J«J id 033 0 -h id tn tn •h 3 id “ “ tn 4-i 4-· tn >4->3-h·· n d ^h u u p 4-i mgo-h

X G 3 ++(dppld -H IdJGP

Jh-H a rHrH.H Id Id -H Λί+144 3 3 O SS>4J4J> λ! <u CU Id

a ««3 id «3 -h c h w -P

I o 0 41 «MO #-n 4) Id -H O

3 P334-1 K E Q Λί

pH KJEKPOpHOpHP Eh&i-H

o \ \\ idriO(NOid -s Eh cu tn W Pu tn Ph 4-1 +ltn +IW EH fl Λ O Ό 20 752 3 3 11 i π

οι + + i a » a ΐ a h S

H P « » Ϊ H ' it H * οί I 1+ + ί O O a M 8 ,1, Hi

•hGO I I O + I O O O O >1 -H J

3 3 8 e H

p o Ϊ7 "Ö S

en « m e Ό 3 g 1 °· -h -a 2 s § I , e + e t a » . " i 3

Ό -d 4 Φ Q

tn g -na p 3 3 18 Q) -H ITt rH E ·π + S g 3 00^0 i i o o + o T a a a e -0

V rn H 4-J O

S " g I -e

3 O 3 H

Ή -p *>H -P td <i *, s I s H e i 11 s. s

3 f · o -P

•3 M 5 S . g " °

g i S f I

p o a 1 00 1 + a 1 2 ii -H

tn

H O X P

g . q g i s 5 3 p tn to o .

m g j, Q . o ε to

5 S- -H& g £ V o S

* Jö 8 S «4 s 8 ·· ö m M 8 I

p3 Ά2 55 s _ 1=1 s k 5 .§ g ^ 33 ig Pi ** - i k H S i j: 3 H " 5 J ( , äin Ί I d o -diS^Sin -h -h ω P -h -h aj aj tn |·°!|3 3! Il 111 1|= Boti ilfaäälll i 2! i; il Hl III li II spi li f*" I ill 21 75233

Kyseessä oleva vasta-aine 0KM1 kuuluu alaluokkaan IgG2a, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta.

Nämä immunoglobuliinin G alaluokat poikkeavat toisistaan ns. "kiinteillä" alueilla, vaikkakin jonkin spesifisen 5 antigeenin vasta-aineessa on ns. "muuttuva" alue, joka on funktionaalisesti saraa huolimatta siitä, mihin immunoglobuliinin G alaluokkaan se kuuluu. Ts. monoklonaalinen vasta-aine, jolla on tässä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkaan IgG^, IgG2a, IgG2b tai IgG3, tai luokkiin 10 IgM, IgA tai muihin tunnettuihin Ig-luokkiin. Erot näiden luokkien tai alaluokkien välillä eivät vaikuta vasta-aineen reaktiomallin selektiivisyyteen, mutta saattavat vaikuttaa vasta-aineen jatkoreaktioon muiden aineiden, kuten (esimerkiksi) komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden 15 kanssa.

Vasta-ainetta 0KM1 voidaan käyttää monosyyttien erilaistumisen havaitsemiseen ja tutkimiseen. Lisäksi tätä vasta-ainetta voidaan käyttää sairaustilojen diagnoosiin kuten taulukossa V on esitetty. Näitä menetelmiä voidaan 20 soveltaa käyttäen vasta-ainetta OKM1 yksinään tai yhdessä muiden vasta-aineiden (esim. OKT3-OKT11) kanssa. Reaktii-visuusmallit ryhmällä vasta-aineita T-soluille tai T-solu-alaryhmille ja/tai monosyyttien alaryhmille sallivat tiettyjen sairaustilojen tarkemman toteamisen kuin on mahdol-25 lista käyttäen aikaisempia taudinmääritysdiagnoosimenetel-miä. Esimerkiksi AMML ja (vähemmässä määrin) AML voidaan todeta saattamalla potilaiden leukemiasoluja reagoimaan OKMl-vasta-aineen kanssa.

Diagnostiset yhdistelmät, jotka sisältävät vaikutta-30 vai määriä OKMl-vasta-ainetta sekoitettuna diagnostisesti hyväksyttävien kantajien kanssa, kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin.

Claims (2)

1. Diagnostinen menetelmä OKMl+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi jossakin yksilössä, tunnet- 5. u siitä, että saatetaan tästä yksiköstä otettu monosyyt-tikoostumus reagoimaan diagnostisesti tehokkaan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8026, ja joka vasta-aine reagoi normaaleilla ihmisen monosyyteil-10 lä ja granulosyyteillä esiintyvän antigeenin kanssa, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nollasolujen, tymosyyttien, lymfoblastoidisolulinjojen eikä T- tai B-soluperäisten kasvainsolujen kanssa, ja määritetään monosyyttipopulaation prosentuaalinen osuus, joka 15 reagoi mainitun vasta-aineen kanssa.

2. Diagnostinen ainekoostumus OKMl+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää seoksena diagnostisesti hyväksyttävän kantajan kanssa OKMl+-solujen puutteen tai ylimäärän toteami- 20 seen tarvittavan määrän hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnu-mero on CRL 8026, ja joka vasta-aine reagoi normaaleilla ihmisen monosyyteillä ja granulosyyteillä esiintyvän antigeenin kanssa, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen 25 T-solujen, B-solujen, nollasolujen, tymosyyttien, lymfoblastoidisolulin jo jen eikä T- tai B-soluperäis.ten kasvain-solujen kanssa.