FI75232B - Diagnostiskt foerfarande foer paovisande av underskott eller oeverskott pao en specifik t-cellpopulation under anvaendning av en monoklonal antikropp specifik mot maenniskans tymocytantigen. - Google Patents

Description

1 75232

Diagnostinen menetelmä spesifisen T-solupopulaation puutteen tai ylimäärän toteamiseksi käyttäen ihmisen tymosyyt-tiantigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 803755.

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään OKT6+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä. Menetelmässä käytetään hyväksi monoklaanista vasta-ainetta 10 pinta-antigeenille, joka on löydetty noin 70 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjan avulla.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren mye-loomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin Z^ature 15 256 (1975) 495-4977/ jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi.

Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien 20 tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J.

25 Barnstable et al., Cell 14 (toukokuu 1978) 9-20; P. Parham, ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

30 Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, 35 että yritettäessä valmistaa haluttua hybridomaa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa 75232 vasta-ainetta tai että noin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hybridoman eristämisessä käytetystä selektiotekniikasta.

5 Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigee neille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 66-69 ja 164-169. Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen 10 lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyytti-leukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä hybri-domeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille 15 spesifistä vasta-ainetta.

Äskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvattu sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jotka tuottavat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta. Katso esim. Reinherz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 20 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei., 76, 4061-4065 (1979); ja Rung, P.C., et ai., Science, 206, 347-349 (1979).

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä 25 toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista. Ka-teenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymo-syyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. 30 Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka 35 T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee 75232 eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immuuni-järjestelmän toiminnoissa säätelevästä. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

5 Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin ole viin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kanta-soluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa 10 elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluik-15 si, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktioita tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 20 145 (1977) 221-232 ja L. Chess ja S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja 0. Stut-man, Plenum Press 1977, vol. 7, 363-379.

25 Eri T-solulajien tai alalajien identifiointi tai nii den heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregulatoristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvain-muotojen taudinkuva on erilainen sen mukaan, ovatko ne läh-30 töisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää täytyy pystyä erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et al·., teoksessa "Immunological 35 Diagnosis of Leukemias and Lymhomas", toimittajat S. Thier-felder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

4 75232

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa), pahanlaatuisissa tautitiloissa ja agammaglobulinemiassa T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-5 T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobulinemiassa tiettyjä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Joissakin leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimää-10 rin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan tai määrittämään, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin. Katso esimerkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", 15 teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20, Springer-Verlag 1977, 17-23 ja julkaisun sisältämät viitteet sekä E.L. Reinberg et ai., J. Clin. Invest. 64 (1979) 392-397.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immunoglo-20 buliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä.

Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu, koska heikentäjä-T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-ai-25 neen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan näiden B-solujen toimintaa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobuliinin tuotantoa tai keskeyttää tuotannon kokonaan. Agammaglobulinemiatyyppi voidaan siten 30 määrittää sen perusteella, esiintyykö heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa auto-immuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin 35 esiintyvälle T-solulajille, vasta-aineet voivat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-solu- 5 75232 syöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvaimia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle auttaja-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista tautia, joka aiheutuu 5 auttaja-solujen ylimäärästä, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja (esim. pahanlaatuisia tautitiloja tai tyyppiä I olevaa agammaglobulinemiaa), jotka aiheutuvat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle vasta-ainetta, joka on spesifinen heikenit) täjä-T -soluantigeenille.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-so-luihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG) , ovat osoittautunut terapeuttissti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Kos-15 ka T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimisme-kanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai, "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver 20 Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerume-25 ja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T- soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla ei-al-logeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien val-30 mistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdis-tusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-so-35 luilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen, jotka vaikuttavat useisiin antigeenilajeihin, joi- 75232 ta on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista.

Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallises-5 ti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spe-sifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10^.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mai-10 nittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-leh-dessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT 6), joka pystyy 15 tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta antigeenille, jota on löydetty noin 70 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyt-tejä, mutta ei ihmisen normaaleista perifeerisistä lymfoidi-soluista (T-solut, B-solut tai nollasolut) eikä luuydinso-luista. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdel-20 le ainoalle ihmisen normaalien T-solujen pinta-antigeeni- determinantille, jota esiintyy noin 70 %:lla ihmisen normaaleja tymosyyttejä, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaista immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisäl-25 tävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen tymosyytin antigeenille) . Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-ai-30 neen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

35 Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuottamas ta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä 7 75232 "OKT 6", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on talletettu 21.11.1979 laitokseen "the American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on an-5 nettu ATCC-talletusnumero CRL 8020.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 803755.

Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käyte-10 tään, on tunnusomaista, että annetaan potilaasta otetun T-solu- tai tymosyyttinäytteen reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa IgG-luokkaan kuuluvaa monoklonaalis-ta vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8020 ja joka on valmistettu yhdistä-15 mällä hiiren myeloomasolulinjän soluja ihmisen tymosyyteil-lä immunisoidun hiiren pernasoluihin, ja joka vasta-aine a) reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja ty-mosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nollasolujen eikä luuydinsolujen kanssa, 20 b) reagoi noin 65 %:n kanssa käsittelemättömiä tymo- syyttejä, 10 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8002, ja komplementilla, 82 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty mono-25 klonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8001, ja komplementilla sekä 13 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8014 ja komplementilla, 30 c) reagoi vaiheen II T-ALL-solujen kanssa, mutta ei reagoi vaiheen I tai vaiheen III T-ALL-solujen kanssa, d) reagoi solulinjojen CEM ja MOLT-4 kanssa, mutta ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja e) määrittelee T-solupopulaation (OKT6+), jota esiin-35 tyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä ja 8 75232 normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elinsiirrossa ja joka puuttuu täydellisesti myasthenia graviksessa, akuutissa mononukleoosi-infektiossa, kaikissa Hodgkinsin taudin vaiheissa ja psoriaksiksessa, ja määritetään mainitun vasta-5 aineen kanssa reagoivien perifeeristen T-solujen ja tymo-syyttien prosentuaalinen osuus näiden kokonaismäärästä.

Esimerkki 1 OKT 6-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen 10 Normaalien vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15- 40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointimene-telmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH), Boymin esittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (suppl. 15 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotet tiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig- (T- ja nollasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F (ab') 2~Pylväskro~ matografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974). T-solut otettiin tal-20 teen E-rosetoimalla Ig”-kanta 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clrlla (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2-%risesti EAC-25 rosettipositiivinen ja >95-%risesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muo-dostamaton Ig" (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-ra-japinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5-%risesti E-positiivinen ja ^2-%risesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-30 populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%risesti pinta Ig-posi-tiivinen ja <5-%risesti E-positiivinen.

Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin terveiden 35 vapaaehtoisten luovuttajien taaemmasta suoliluunharjusta punktiomenetelmällä.

9 75232 B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateen-5 korvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiöseeru-mia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi so-10 lut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja £90-%:isesti E-rosettipositii-visia.

C. T-solulinjat ja T-solujen akuutin lymfoblastileu-15 kemian solut T-solulinjat CEM, HSB-2 ja MOLT-4 toimitti tohtori H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukemiasolut saatiin 25:Itä akuuttia lymfoblastleukemiaa sairastavalta potilaalta. Näiden yksittäisten kasvainten 20 oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu olevan peräisin T-soluista, koska kasvainsolut muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (> 20 % E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten heteroantiseerumien, anti-HTL (B.K.)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten edellä 25 on kuvattu. Kasvainpopulaatioita kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa dimetyylisulfok-sidissa ja 20-%:isesti ihmisseerumissa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat >90-%:isesti blasteja sytosentrifugivalmisteiden 30 Wright-Giemsa-morfologialtaan.

Esimerkki 2

Solufluorografinen analyysi ja solujen erotus

Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solupopulaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografinen analyysi 35 suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa vai- 10 752 32 mistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solufluorografia FC200/4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1 x ΙΟ** solua käsiteltiin 0,15 ml:lla vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, solut inku-5 boitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla, jossa kunkin solun 10 aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin puls-sinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennuksella 1:10000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:lla suhteessa 1:500 laimennettua vesi-15 vatsanestettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidusta CAF^-hiirestä.

Kokeissa, jossa tutkittiin vasta-aine- ja komplement-tivälitteistä lymfolyysiä, tymosyyttejä ja perifeerisiä T-soluja viljeltiin yön yli, minkä jälkeen seurasi selektii-20 vinen hajotus, ja sen jälkeen solut analysoitiin solufluorografilla.

Esimerkki 3

Lymfoidipopulaatioiden hajotus monoklonaalisella vasta-aineella ja komplementilla 25 40 x 10^ perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä lisät tiin 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). Solupellet-teihin lisättiin 0,8 ml vasta-ainetta OKT3, 0KT4, 0KT8 tai tavallista vesivatsanestettä (vertailuaine), jotka oli laimennettu suhteessa 1:200 PBS:llä, seokset suspendoitiin ja 30 inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuutin ajan. Sen jälkeen vasta-aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, seos suspendoitiin ja sitä inkuboitiin edelleen 37°C:ssa 60 minuutin ajan vesihauteessa, joka oli liitetty ravistelijaan. Inkuboinnin päätyttyä 35 solut sentrifugoitiin ja elinkykyiset solut määritettiin Trypan-sinisellä. Solut laskettiin, pestiin kaksi kertaa 11 75232 5-%:11a FCL:llä ja asetettiin lopulliseen väliaineeseen RPMI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, NY), joka sisälsi 20 % ihmisen AB+-seerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-pus-5 kuria ja 0,5 % natriumkarbonaattia ja seosta inkuboitiin yön yli 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % co2.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille, 10 joiden on annettu reagoida OKT 6:n ja muiden monolonaalis-ten vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Taustafluoresenssivärjäys määritettiin lisäämällä kuhunkin populaatioon suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuottavaa kloonia, ja in-15 kuboimalla seosta.

Kuviossa 2 on esitetty tymosyyttien erilaistuminen kateenkorvassa.

Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-aineiden OKT6, OKT8, OKT9 ja OKT10 reaktiivisuus ihmisen eri lymfoi-20 disolupopulaatioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine OKT6 reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyt-tejä, mutta ei minkään muiden tutkittujen lymfoidisolujen kanssa. Muun muassa tämän reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT6 voidaan todeta ja erottaa muista vas-25 ta-aineista.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluo-resenssispektri ihmisen normaaleista tymosyyteistä koostuvalle suspensiolle, jonka on annettu reagoida vasta-aineiden OKT3, 0KT4, OKT5, OKT6, OKT8, OKT9 ja OKT10 (kaikkien lai-30 mennussuhde 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Samanlaiset reak-tiivisuuskaavat saatiin 12 muulle tutkitulle ihmisen normaalille tymosyyttipopulaatioille. Kuviosta ilmenee, että reak-tiivisuusprosentissa ja fluoresenssi-intentsiteetissä on merkittäviä eroja kaikkien tutkittujen monoklonaalisten vas-35 ta-aineiden välillä. Esimerkiksi OKT9 reagoi noin 10 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa heik- 12 75232 ko, kun taas 0KT5, 0KT6, 0KT8 ja OKTIO reagoivat noin 70 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa voimakkaampi. OKT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyttejä, sijoittuu fluoresenssi-intensiteetin suhteen OKT9:n ja sel-5 laisten monoklonaalisten vasta-aineiden väliin, joiden fluoresenssi-intensiteetti on voimakkaampi. Lisäksi kuviosta 1 ilmenee, että noin 15 % tymosyyteistä voidaan todeta OKT3:lla käyttämällä epäsuoraa immunofluoresenssimenetelmää. OKT1, joka reagoi tymosyyttien kanssa käytännöllisesti kat-10 soen samalla tavalla kuin OKT3, ei tällöin tule esiin. Myös kuviossa 1 esitetyn reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT6 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista .

Taulukosta 2 ilmenee erilaisten monoklonaalisten vas-15 ta-aineiden määrittelemien antigeenien jakaantuminen ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja lymfosyytteihin, jakaantuminen on määritetty sarjalla hajotuskokeita esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Koska ainoastaan OKT3, OKT4 ja OKT8 olivat komplementin sitovia monoklonaalisia vasta-aineita, näitä 20 kolmea käytettiin määrityksessä.

Taulukosta 2A ilmenee, että koko T-solupopulaatio reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, OKT5 ja OKT8 reagoivat 60 %:n, 25 %:n ja 34 %:n kanssa T-soluja. Hajotus OKT4:llä ja komplementilla vähensi solujen kokonaislukumäärää 62 25 %:lla ja tuhosi spesifisesti OKT4+-populaation. Lisäksi OKT5+- ja OKT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, mutta OKT5+- ja OKT8+-T-solujen kokonaismäärä ei muuttunut. Tästä kokeesta voitiin vetää se johtopäätös, että OKT4+-populaa-tio erosi OKT5+- ja OKT8+-populaatioista. Lisää tukea tälle 30 olettamukselle saatiin kokeesta, jossa T-soluja hajotettiin OKT8:lla ja komplementilla. Tällöin OKT4+-T-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, kokonaislukumäärä pysyi samana ja OKT8+- ja OKT5+-populaatiot tuhoutuivat. Lisäksi nämä kokeet osoittivat, että OKT8+-populaatio oli vastakkainen OKT4+-35 populaatiolle sisältäen koko OKT5+-T-solujakeen.

13 75232

Samanlaiset ihmisen tymosyytti populaatioilla suoritetut kokeet antoivat erilaisia tuloksia. Taulukosta 2B ilmenee, että noin 75 % tymosyyteistä oli 0KT4-positiivisia tai 0KT8-positiivisia. Sitä paitsi hajotettaessa soluja 5 0KT4:llä tai 0KT8:lla ainoastaan 25 % tymosyyteistä jäi jäljelle. Suurin osa jäljelle jääneistä tymosyyteistä reagoi 0KT3:n kanssa, kun taas niistä pieni osa reagoi 0KT6:n kanssa. Nämä havainnot osoittavat, että suurimmalla osalla ihmisen tymosyyteistä on 0KT4-, 0KT5-, 0KT6- ja 0KT8-pinta-10 antigeenit samassa solussa. Lisäksi taulukosta 2 ilmenee, että käsiteltäessä soluja 0KT8:lla ja 0KT4:llä 0KT3-anti-geenin sisältävien kypsien tymosyyttien määrä kasvaa huomattavasti. Täten suurin osa 0KT3:n kanssa reagoivista tymosyyteistä on jo erottunut 0KT4+- ja OKT8+-jakeiksi, koska 15 suurin osa soluista, jotka eivät reagoineet 0KT4:n ja 0KT8:n kanssa, olivat OKT3-positiivisia. Jos OKT3+-alapopu-laatio olisi sekä 0KT4-positiivinen että 0KT8-positiivinen, hajotus jommalla kummalla monoklonaalisella vasta-aineella olisi tuhonnut OKT3:n kanssa reagoivat tymosyytit.

20 Jotta saataisiin edelleen selville OKT3:n kanssa rea

goivien tymosyyttialapopulaatioiden suhde muiden monoklo-naalisten vasta-aineiden määrittelemiin tymosyyttifraktioi-hin, tymosyyttejä käsiteltiin OKT3:lla ja komplementilla ja käsittelyssä jäljelle jääneitä soluja verrattiin sitten kä-25 sittelemättömiin tymosyyttipopulaatioihin. Taulukosta 2B

ilmenee, että OKT3 ja komplementti poisti 25 % tymosyyteistä. Sen sijaan OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-vasta-aineiden kanssa reagoivat populaatiot pysyivät käytännöllisesti katsoen muuttumattomina. Näistä havainnoista voidaan vetää se 30 johtopäätös, että suurin osa OKT6-markkerin sisältävistä tymosyyteistä kuuluu OKT3“-populaatioon. Lisäksi tuloksista voidaan vetää se johtopäätös, että tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n määrittelemät antigeenit, rajoittuvat samalla tavalla OKT3”-populaatioon. 35 On myös huomattava, että 0KT9:n kanssa reagoiva tymosyytti-populaatio ei vähentynyt käsiteltäessä fraktioimattomia ty- 14 75232 mosyyttejä 0KT3:lla ja komplementilla, mikä osoittaa, että 0KT9+-alapopulaatio rajoittuu suurimmaksi osaksi 0KT3“-ty-mosyyttipopulaatioon.

Näiden tulosten pohjalta on ollut mahdollista määrit-5 tää ihmisen tymosyyttien kehitysvaiheet kateenkorvassa. Kuviosta 2 ilmenee, että käytännöllisesti katsoen kaikissa tymosyyteissä on OKTIO-markkeri. Lisäksi tymosyytit saavat varhaisessa vaiheessa 0KT9-antigeenin (Thyl ja Thy2). Tämä vaihe käsittää pienen osan tymosyyteistä, ja siihen kuuluu 10 noin 10 % ei-fraktioiducta populaatiosta.

Sen jälkeen ihmisen tymosyytit saavat OKT6:n määrittelemän tymosyyttiantigeenin ja samanaikaisesti ne ilmentävät OKT4:n, OKt5:n ja OKT8:n (Thy4). Jälkimmäinen alapopu-laatio edustaa valtaosaa tymosyyteistä, ja siihen kuuluu 15 yli 70-80 % tymosyyttipopulaatiosta. Tymosyyttien edelleen kypsyessä niiden OKT6-reaktiivisuus häviää, ne tulevat reaktiivisiksi OKT3:n (ja OKTl:n) kanssa ja erottuvat OKT4+- ja OKT5+/OKT8+-jakeiksi (Thy7 ja Thy8). Näyttää siltä, että viimeisessä vaiheessa tymosyyttien irrotessa kateenkorvasta 20 perifeeristen T-solujen joukkoon, niiden OKTIO-markkeri häviää, sillä tämä antigeeni puuttuu käytännöllisesti katsoen kaikilta perifeerisiltä T-lymfosyyteiltä. Näiden kolmen pää-kehitysvaiheen välisiä mahdollisia siirtymävaiheita on merkitty kuviossa 2 Thy3:lla, Thy5:llä ja Thy6:lla.

25 Koska akuutin T-solujen lymfoblastileukemian on arvel tu johtuvan epäkypsistä tymosyyteistä, määritettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyjen kasvain-solujen ja mainittujen oletettujen tymosyyttien kehitysvaiheiden välinen suhde. Määrityksessä käytettiin T-ALL-30 leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyä 25 kasvain-solupopulaatiota ja kolmea T-solulinjaa, jotka oli etukäteen tutkittu tavanomaisilla anti-T-solureagensseilla ja E-rose-toinnilla. Taulukosta 3 ilmenee, että suurin osa T-ALL-leu-kemiasoluista reagoi joko pelkän OKTlO:n tai OKT9:n ja 35 OKT10:n kanssa, mutta solut eivät reagoineet muiden mono-klonaalisten vasta-aineiden kanssa. Täten 15/25 tutkituista 15 75232 tapauksista näytti sisältävän varhaisen tymosyyttivaiheen antigeenejä (vaihe 1) .

Sitä vastoin 5/25 tapauksista reagoi 0KT6:n kanssa, mistä voidaan vetää se johtopäätös, että ne ovat peräisin 5 kypseminästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 2) . Tämä T-ALL-ryhmä reagoi eri tavoin 0KT4:n, 0KT8:n ja 0KT9:n kanssa, kuten taulukosta 3 ilmenee. Kahdella viidesosalla potilaista oli sellaisia kasvainsoluja, jotka sisälsivät suurimman osan tavallisista tymosyyttiantigeeneista, mukaan lukien 10 OKT4, OKT6 ja OKT8. On huomattava, että OKT5 ei esiinny yhdessäkään näistä viidestä vaiheen 2 kasvaimesta, vaikkakin OKT8-reaktiivisuutta havaittiin. Tästä jälkimmäisestä tuloksesta voidaan selvästi vetää se johtopäätös, että OKT5 ja OKT8 määrittelevät eri antigeenejä tai eri determinant-15 teja samassa antigeenissä. Lopuksi l/25:lla potilaista oli sellaisia kasvaimia, jotka olivat peräisin kypsästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 3) 0KT3-reaktiivisuuden perusteella määritettynä. Tämän henkilön kasvain oli lisäksi reaktiivinen OKT5:n, OKT8:n ja OKTlO:n kanssa. Tutkituista 20 25 leukemiapopulaatiosta ainoastaan neljä oli sellaista, joita ei voitu selvästi luokitella. Näistä kolme oli OKT4-ja OKT8-positiivisia, mutta ne eivät reagoineet OKT3:n eikä OKT6:n kanssa, jolloin ne olivat todennäköisimmin Thy4:n ja Thy7,8:n välisiä siirtymävaiheita. Yksi 25 tapauksesta 25 osoittautui olevan Thy3:n ja Thy4:n välinen siirtymävaihe, sillä se oli reaktiivinen 0KT8:n ja OKTlO:n kanssa.

T-ALL-kasvainpopulaatioista peräisin olevat T-solulin-jat edustivat myös spesifiseen kateenkorvansisäiseen erilais-tumisvaiheeseen kuuluvia soluja. Taulukosta 4 ilmenee, että 30 HSB-2 reagoi yksinomaan OKT9:n ja OKTlO:n kanssa, ja täten se määrittelee vaiheesta 1 peräisin olevan kasvainpopulaa-tion. Sitä vastoin CEM-T-solulinja reagoi OKT4:n, 0KT6:n, OKT9:n ja OKTlOin kanssa ja se osoittautui olevan peräisin vaiheen 2 tymosyyteistä. Lopuksi solulinja MOLT-4 on ilmei-35 sesti HSB-2 ja CEM:in välillä oleva leukemiatransformaatio, sillä se ekspressoi OKT6:n, OKT8:n, OKT9:n ja OKT10:n.

16 75232

Koska myöhempien vaiheiden (esim. vaiheen II) T-solu-jen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien henkilöiden on todettu parantuvan täydellisemmin kuin vaiheen I ALL-leukemiaa sairastavien, 0KT6-vasta-aineen avulla voidaan 5 vetää johtopäätöksiä T-solujen ALL-leukemiaa sairastavan henkilön prognoosista.

Taulukosta 5 ilmenee perifeeristen T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuuksien ja eri tautitilojen välinen suhde. Näitä suhteita voidaan käyttää diagnostisiin tarkoituk-10 siin (esim. akuutin tarttuvan mononukleoosin toteamiseen) ottamalla verinäyte henkilöstä, jonka epäillään sairastavan jotakin näistä taudeista ja määrittämällä näytteestä T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuudet. Myös taulukoissa 2-5 esitettyjen suhteiden avulla OKT6-vasta-aine voidaan 15 todeta ja erottaa muista vasta-aineita.

Diagnostisia menetelmiä, jossa käytetään muita mono-klonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hydridomeja (OKTl, OKT3, OKT4 ja OKT5 sekä OKT8, OKT9 ja OKTIO) on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 844 703, 20 844 705, 844 704 ja 844 706 sekä hakemuksissa 850 062, 850 063 ja 850 061.

Kyseisen vasta-aineen OKT6 havaittiin kuuluvan IgG·^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns.

25 "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut 30 tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG^-IgG2a, IgG2b tai IgG3 tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden ainei-35 den, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

17 75232

Esillä olevaa vasta-ainetta OKT6 voidaan käyttää ty-mosyyttien erilaistumisen toteamiseen ja tutkimiseen, kuten kuviossa 2 on esitetty. Jos OKT6:n kanssa reagoivien tymo-syyttien määrä poikkeaa 70 %:sta, tymosyyttien kehitysvai-5 heessa II esiintyy poikkeavuuksia. Lisäksi esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää eri tautitilojen diagnoosiin taulukossa 5 esitetyllä tavalla. Tällöin voidaan käyttää OKT6-vasta-ainetta sellaisenaan tai OKT6:n ja muiden vasta-aineiden yhdistelmää (esim. OKT3-OKT10). Reaktiivisuuskaa-10 vojen avulla, jotka on saatu annettaessa useiden eri vasta-aineiden reagoida T-solujen ja T-solujakeiden kanssa, tietyt tautitilat pystytään toteamaan tarkemmin kuin käytettäessä tunnettuja diagnostisia menetelmiä.

Vasta-ainetta OKT6 voidaan sisällyttää diagnostisiin 15 koostumuksiin, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKT6-vasta-ainetta ja diagnostisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista .

Taulukko 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus ihmisen 20 lymfoidipopulaatioiden kanssa

Monoklonaalinen Perifeerinen Luuydin (6) Kateenkorva vasta-aine veri (22) E+ E" OKT6 0% 0% 0% 70% 25 0KT8 30 % 0 % <2 % 80 % 0KT9 0% 0% 0% «10 % OKT10 <5 % 10 % «20 % 95 %

Suluissa olevat luvut merkitsevät tutkittujen näytteiden määrää; %-arvot ovat keskiarvoja 18 75232

dP

O

- CO Ή rt) 3 fp

ω 3 ^ ^ ill cn in in id C

H ^ h oo co :¾ e 9 w k» 5 X2 h *g $ +J ij- ί III OOVUU-ICN λ;

ο -Ϊ S Q <P ή *P

M Φ Ή $ p-P 00 α 0 . ¢) H m o m m o o cc

g g " r^· in ° S S S

p ‘5* f5 E -h g nm vo

m O-P ^ o o o in o ro in -PO

M ω 2 ro w w H co o -n m «- 5 ° nm m 11 -c ci Ό c in s. c m -Hd|H moo omoo 4-)m H ™ ^ t-00 00 ΰ g C .Su ° >ι Ή · <n <u :2 5 4J u-i m m -h eg g S°S in o in o α Φ o 5 10 φ£ 2 ' m

2 c -i-»o ro 3 ω JS

5 Φ . comm o o m o to 5

^C '5 9¾ m σι σ> ro o to >i-C

•H n E ° >< m 3 e v m Φ ;m m to

Ή CO :m C -P -U

φ -tn r p m o m -P -H -P :m I -H > -P Φ Φ C :m Φ 4-i (tj •p -p c φ e p m -p p >1 :tci -n 3 voioio Ό ® id ie mto :m >i aJSJrl ooo O o o o -p ,-h 3 :m CO *r~iiH 3 f-H^Hr-4 >—I rp r-t ιΡ (1)3χ)

£ 0 0 H ,. CU CU

g Φ to CO XXX X X X X 1« o C £>i rp -p 4-1 CU 4-1 Φ-Ρ-HCm OCNCN O O in O -H Qj Ό φ φ C ^ v v P1 >P - CO o.-mto

h m ·η«ο O m in οί -f-t 4J X

Φτ-ΙιΗ-ΗΛ! -HtN 4-1 10 0 c :m <u o m -h f-i P Φ Ό C Λί m>i3

Φ CO , . P P H

I 10 -P 3 P

m -p -3 cu φ · p p ^ o -p m 1o I-I O X X CU -P tn m o m -m :m tn to > to 2 J ·** >i :m :m -p -p

i 'y. t-ι rp rP p m tn -P

C E-< P , φ Φ E .X -P

Φ 2 P "2 P :0 m 3 c P :<tJ 5 Φ-Ρ 4-1 4-J —l Π3 Of

tn tn ^ to-P*. 4-i -p -P p cu E

•p tn 2 T1 .!5 ~r, 7. 'Ί 01 " ;m -p m φ »—I *H ^ ^ *fÖ O O -J-* iflj OOO P 4J 4J ^ m CO O Φ Ä tP .X S c o, Φ -P 5* φ + + >- + + + ΉΦΦΕ

C P £ UPC toe QJ £ to O

ΟφΤ-> Pmp-ooom^ooro -PtutOA;

Ήφ'^ PEE-iHEEHHH 4JH-P

rX UP o tUrPUjus^^^^jjj -PCU.YII

Ο-p P CuhooEpImooo i/i e p e p g :m o m -

O 9 J * ίΧ -X .X U

2 Λ ^ ^ CQ X ^ 19 75232

f I

O -Hm

Ό 4J φ I

3 I M »1 M

3 C) Ο Ή ,-f « kJ · a to >_

H rC P rH 4J

fa I 3 <u x: c c E-ι -Y -CO ro ·η „ -¾ +» ai E Cnm 3 to (/) o OJ ΓΜ 4-> -H 3 m

f3 ·<-> C _ -H >, «J

C 3 2" ^ °° rHrHfNH ·—11 > -H

•H 4J W C IfNW OP C

Οι Ή 3 ' ·Η Λ! m Y Π3 <1) ο (Λ -*J Q, ro φ *0 d a) n c m ij •H Eh -p 4J O n ε ·ί , ·η 3

2 0 3 -I rH

-3,° C O U-t

" I —( + -H

O -H H + v O -h :ro aj 2 I § + + + + + + + s -S ;

5 0) C -Η -H

w 4-> ή +j φ m n Ό w σι |0 -¾ w ·η -h '-Jjoh £ q a> cn w

l+ +III I ίο U φ C

o ° S'* oa<u M § 2 Λ g S4 ^p-Uco ° ^ S O m "_,'Η^ II ++14. . 2 -H C ·η 3 -*Cmo -»-+I+ + DC φ,^ 3 a) m E c - o 3 3 c vd mj m 7 T £

2 7| ° H -o g ^ 1 .S

II + + + + I 7+1 W flJ

« -Y O 1- + + + I <D „ <UC> io c IS a o> m H 9 ,n 7 m c a)

O in i? tfi -H

7j E Η * m > ^ «n «0 O 11 ' ' ' ' + E ϋ £ 3 3 3 D W W (Λ

^ 3 to ,rf r^1 ' fU OJ

« -H § S 2 3 ? £ !2 3* g 11 + + ' · . §8 ~ c | « US * · rJ g 2 'μ •rn ,Υ Ό σι Cm c O :3 3 f0 -H H -H Y! C ·Η > ·—· (U o äc ii ,,.. , -h o > m m O ex C o 1111 + in . 0-H3+5 2 aj ·* 7 ή -π 3 m S +-u 2 > > +i m 3

'd — m S ^ 3 -H -rH

m -ΗΠ3 0^ Yim>4J

S >1 W -H ,S s Ο Ή

* r -π +j V 7 2 a ‘H C

r, Ei ns 4J *o -e m

*-4 U >, ld'H4j'HCE

o -HfO V) 'iO.HOQJnJ

+· > o 7l ’ --1 >4 4J

m 4J p

9 >1 C t^r-S 3 <0 O

w >1 -Ί 4-) b ς > 3 -n In *d m4-> b-H>i-*-,mQ) § O >1 e n -HrU+JC-H- S E >i —. Q) p

^ >i MM C _ ^ F_ ^7tUY;-HrH4J

W Ή 4J O >, Γ4 Η 'T V£> ΡΊ jj -4J (U 4J Ih -H rl 4J

7 -H Ex: -O 4J -Η φ 4J (U

5 5ΰ - 5111 li s "A S1 5 11 s i is > < o gseSfcfcSIi ^ £ i 11 ^ ί> ^ X + + 20 752 32

Taulukko 4

Solulinjojen reaktiivisuus monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa

Solulinja 0KT3 0KT4 0KT5 0KT6 0KT8 0KT9 OKTIO

5 HSB-2 -X - - - - + + CEM - + - + + + + MOLT-4 --- + + + + xKriteerit (-)- ja (+)-reaktiivisuudelle olivat samat kuin taulukossa 3.

21 75232

Taulukko 5

Perifeeristen T-solujen pitoisuudet eri tauti- tiloissa - T-solujen pitoisuudet

Tautitila 0KT3+ OKtT* ÖKT5 PKT8+ PKT 6*

Primäärinen maksa- N + kirroosi (2)

Multippeliskleroosi (pitkälle edennyt) (8) - N - - -

Myasthenia Gravis 10 (ei hoidettu varhaises- 0 O G O 0 sa vaiheessa) (3)

Akuutti elinsiirto G . ..- - p + +

Agammaglobulinemia 15 Tyyppi I +

Tyyppi II G

Hyper IgE (4) - N O * * · - O · * · -

Akuutti mononukleoosi- + O ...— ++ ++ G

2Q infektio (4) x

Hodgkinsin tauti

Vaiheet I & II N N N N G

Vaiheet III & IV — N N N O

2^ Psoriasis (3/5) N +···++ N N O

N = normaali pitoisuus O = puuttuu 30 + = normaalia suurempi ++ = huomattavasti normaalia suurempi _ = normaalia pienempi _ huomattavasti normaalia pienempi 2^ x Nämä pitoisuudet palaavat normaaleiksi noin viikkoa aikaisemmin kuin kliiniset oireet häviävät.

Suluissa olevat arvot ilmaisevat tutkittujen potilaiden lukumäärän.

Claims (1)

1. 75232 22 Patenttivaatimus Menetelmä 0KT6+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä, tunnettu siitä, että anne-5 taan potilaasta otetun T-solu- tai tymosyyttinäytteen reagoida diagnostisesta vaikuttavan määrän kanssa IgG-luokkaan kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8020 ja joka on valmistettu yhdistämällä hiiren mye-10 loomasolulinjan soluja ihmisen tymosyyteillä immunisoidun hiiren pernasoluihin, ja joka vasta-aine a) reagoi noin 70 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen, B-solujen, nollasolujen eikä luuydinsolujen 15 kanssa, b) reagoi noin 65 %:n kanssa käsittelemättömiä tymosyyttejä, 10 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8002, ja 20 komplementilla, 82 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8001, ja komplementilla sekä 13 %:n kanssa tymosyyttejä, joita on käsitelty monoklonaalisella vasta-aineella, jota tuot-25 taa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8014 ja komplementilla, c) reagoi vaiheen II T-ALL-solujen kanssa, mutta ei reagoi vaiheen I tai vaiheen III T-ALL-solujen kanssa, d) reagoi solulinjojen CEM ja MOLT-4 kanssa, mutta 30 ei solulinjan HSB-2 kanssa, ja e) määrittelee T-solupopulaation (OKT6+), jota esiintyy normaalia pienempinä pitoisuuksina primäärisessä maksakirroosissa, multippeliskleroosissa ja hyper-IgE:ssä ja normaalia suurempina pitoisuuksina akuutissa elinsiir- 35 rossa ja joka puuttuu täydellisesti myasthenia gravikses- 23 752 32 sa, akuutissa mononukleoosi-infektiossa, kaikissa Hodg-kinsin taudin vaiheissa ja psoriaksiksessa, ja määritetään mainitun vasta-aineen kanssa reagoivien perifeeristen T-solujen ja tymosyyttien prosentuaalinen osuus näiden kokonaismäärästä.