FI75059B - Diagnostiskt foerfarande, vid vilket man anvaender en komplement-fixerande monoklonal antikropp specifik mot maenniskans supressor-t-celler, och i foerfarandet anvaendbar komposition. - Google Patents

Description

1 75059

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään ihmisen heikentä-jä-T-soluille spesifistä komplementin sitovaa monoklonaa-lista vasta-ainetta, sekä menetelmässä käyttökelpoinen ainekoostumus 5

Jakamalla erotettu hakemuksesta 803758

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään OKT8+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisis-10 tä sekä menetelmässä käyttökelpoiseen ainekoostumukseen.

Menetelmässä käytetään hyväksi komplementin sitovaa mono-klonaalista vasta-ainetta ihmisen normaaleista heikentä-jä-T-soluista löydetylle pinta-antigeenille. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla. Tätä 15 diagnostista menetelmää voidaan soveltaa mm. akuutin mono-nukleaasi-infektion toteamiseen.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin ^Nature 256 (1975), ss. 495 - 497^, jolloin ensimmäisen 20 kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns. monoklonaalisen) vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistusta on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta on yritetty so-25 veltaa tieteelliseen käyttöön iks. esim. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toim. F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 sekä sen sisältämät kirjallisuusviitteet; C. J. Barnstable et al., Cell 14 (toukokuu 1978), 30 ss. 9 - 20; P. Parham ja W. F. Bodmer, Nature 276 (1978), ss. 397 - 399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2 (1978), kappale 25, toim. D. M. Wier; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979), ss. 15 - lj.

35 Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulok set ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybri-domeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaankin hyvin, vaikeuksia 2 75059 esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hyb-ridomaa, siinä onnistutaan, ja että onnistuttaessa hybri-doma tuottaa vasta-ainetta, tai että näin muodostuneella 5 vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riip puu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hyb-ridoman eristysmenetelmästä.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa 10 vain harvoissa tapauksissa (ks. esim. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 (1978), ss. 66 - 69 ja 164 - 169}. Näissä kokeissä käytetyt antigeenit olivat veljeltyjä ihmisen lymfoblastioidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyttileukemian solulinjoja. Monet näin 15 valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeenei-hin. Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut ihmisen lym-fosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Äskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvattu 20 sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jotka tuottavat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta ^cs. esim. E. L. Reinherz et ai., J. Immunol. 123 (1979), ss. 1312 - 1317; E. L. Reinherz et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 76 (1979), ss. 4061 - 4065; ja P. C. Kung et ai., 25 Science, 206 (1979) , ss. 347 - 349^.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu, eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista.

30 Erilaistuneita soluja nimitetään "tymosyyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja 35 osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka T-solut il 75059 eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immunologi-5 sissa järjestelmissä säätelevästä. Tämän solujen yhteis toimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin oleviin soluihin, eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista 10 kantasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä. 15 T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja-", "heikentäjä-" ja "tappaja-" T-soluiksi, nämä joko hidastavat tai nopeuttavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta 20 äskettäin on kuvattu niiden toimintaa ihmisen elimistössä /ks. esim. R. L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977), ss. 221 - 232; ja L. Chess ja S. F. Schlossmann, "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens"-25 niminen artikkeli teoksessa "Contemporary Topics in Immunology", toim. 0. Stutman, Plenum Press 1977, vol 7, ss.

363 - 379).

Eri T-solulajien ja -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregula-30 toristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskas-vainmuotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- vai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa nämä kaksi lymfosyyttiryhmää täytyy pystyä erot-35 tamaan toisistaan £ks. esim. A. C. Aisenberg ja J. C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975), s. 300; D. Bel-pomme et ai., artikkeli teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", toim. S. Thierfelder et al., 4 75059

Springer, Heidelberg 1977, ss. 33-45; ja D. Belpomme et ai., British Journal of Haematology 38 (1978), s. 85^.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa tautitiloissa ja agammaglobuline-5 miassa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon.

On mahdollista, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agam-maglobulinemiassa tiettyjä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy 10 ylimäärin tai "auttaja"-T-soluista on puutetta. Pahanlaatuisiin tauteihin liittyy yleensä "heikentäjä"-T-solujen ylimäärä. Joissakin leukemiamuodoissa tietyssä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epä-15 tasapaino tai ylimäärä havaitsemaan tai määrittämään se, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin £ks. esim. J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses"-niminen artikkeli teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20, Sprin-20 ger-Verlag 1977, ss. 17 - 23, ja sen sisältämät viitteet; sekä E. L. Reinberg et ai., J. Clin. Invest. 64 (1979), ss. 392 - 397).

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immuno-globuliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä. 25 Tyypissä I ei muodostu immunoglobuliinia, koska "heikentä jä"-T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu "auttaja"-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin 30 normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan näiden B-solujen toimintaa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobuliinin tuotantoa tai keskeyttää sen kokonaan. Agammaglobuline-miatyyppi voidaan siten määrittää sen perusteella, esiin-35 tyykö "heikentäjä"-T-soluja ylimääärin vai onko "auttaja"-T-soluista puutetta.

V

5 75059

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa autoimmuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin esiintyville T-solulajeille, vasta-aineet voi-5 vat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi "auttaja"-T-solusyöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvai-mia ja tiettyjä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemia-muotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle "auttaja"-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista 10 tautia, joka aiheutuu "auttaja"-T-solujen ylimäärästä, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja (esim. pahanlaatuisia tautitiloja tai tyyppiä I olevaa agammaglobilinemiaa), jotka aiheutuvat "heikentäjä"-T-so-lujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle 15 vasta-ainetta, joka on spesifinen "heikentäjä"-T-soluanti- geenille.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini, eli ATG), on osoittautunut terapeuttisesti käyttökelpoi-20 seksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elin tensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia 25 ^cs. esim. Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976), ss. 155 - 163 ja julkaisun sisältämät viitteet}1.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifioimi-30 seen ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerumeja, jotka on valmistettu inununoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi (esimerkiksi) auto-35 logisilla ei-allogeenisillä B-soluilla niiden vasta-ainei den poistamiseksi, joilla on ei-haluttu selektiivisyys. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheessa. Adsorboidut ja 6 75059 puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-aine-molekyylejä jo ennen immunointia T-soluilla. Toiseksi im-5 munointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen useita antigeenejä vastaan, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen 10 vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10°.

Tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteelli-15 suuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja on kuvattu mm. Chess'in ja Schlossmann'in edellä mainitussa artikkelissa (sivulta 365 alkaen) sekä edellä mainitussa artik-, kelissä "The Chemical and Engineering News"-lehdessä.

I Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT8), joka pys- 20 tyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta pinta-antigeenille, jota on löydetty ihmisen normaaleista "hei-kentäjä"-T-soluista (noin 30 % ihmisen normaaleista perifeerisistä soluista) ja noin 80 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei B-soluista eikä nollasoluista ja 25 alle 2 %:lta luuydinsoluja. Lisäksi monoklonaalinen vasta-aine OKT8 sitoo komplementin. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle pinta-antigeeni-determinantille, jota esiintyy noin 30 %:lla ihmisen normaaleja T-soluja, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen 30 lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka ei-35 vät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen "heikentä-jä"-T-solujen antigeenille). Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä antigeenin tuottamiseksi, jolloin eläinten

II

7 75059 käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä, eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdis-tusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin anti-seerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättö-5 miä.

Sekä esillä olevasta hybridomasta, että sen tuottamasta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKT8", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Tämä hybridoma on tallennettu 18.09.1979 laitok-10 seen The American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., talletusnume-rolla ATCC CRL 8014.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 803758.

15 Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että annetaan potilaasta otetun T-solunäytteen reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa 20 hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 8014, ja joka vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien "heikentäjä"-T-solujen kanssa, alle 2 %:n kanssa ihmisen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan ihmisen perifeeristen B-solujen eikä nollasolujen kanssa, 25 ja määritetään, kuinka suuri osa koko perifeerisestä T-solupopulaatiosta reagoi mainitun vasta-aineen kanssa.

Esimerkki 1 OKT8-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen 30 Terveiden vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15 - 40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoin-timenetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH) Boym'in esittämällä tavalla ^Scand. J. Clin. Lab. Invest. 35 21 (suppl. 97) (1968), s. 77^. Fraktioimattomat yksitumai set solut erotettiin pinta-Ig+ (B-) ja pinta-Ig (T- ja nollasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2-pylväkromatografiaa, menetelmällä, jonka ovat ku- 8 75059 vanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974). T-solut erotettiin talteen E-rosetoimalla Ig-populaatio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentri-5 fugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m g NH^Clrlla (10 ml 10 solua kohti). Näin saatu T-solupopu-laatio oli <2-%:isesti EAC-rosettipositiivinen ja >95-%:isesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig (nolla-10 solu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5-%:isesti E-positiivinen ja <2-%:isesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-kanta erotettiin Sephadex G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. 15 Tämä populaatio oli >95-%:isesti pinta-Ig-positiivinen ja <5-%:isesti E-positiivinen.

!

Normaaleja ihmisen luuydinsoluja saatiin terveiden vapaaehtoisten luovuttajien taaemmasta suoliluuharjusta punktiomenetelmällä.

20 B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin he-25 ti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiö-seerumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraa-vaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa 30 ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymo-syytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja -90-%:isesti E-rosettipositiivisia.

9 75059 C. T-solulinja ja T-solujen akuutin lymfoblastileu-kemian solut T-solulinjat CEM, HSB-2 ja MOLT-4 toimitti tohtori H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA).

5 Leukemiasolut saatiin 25:Itä T-solujen akuuttia lymfoblas-tileukemiaa sairastavalta potilaalta. Nämä yksittäiset kasvaimet oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu kuuluvan T-solukasvaimiin, koska kasvainsolut muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (>20 % 10 E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten hetero- antiseerumien, anti-HTL (B.K.)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten edellä on kuvattu. Kasvainpopulaatioita kylmä-säilytettiin -196°C:ssa nestemäisessä typessä 10-%:isessa dimetyylisulfoksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumis-15 sa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Kaikki analysoidut kasvainpopulaatiot olivat >90-%risesti blasteja sytosentrifugivalmisteiden Wright-Giemsa-morfologialtaan.

Esimerkki 2

Solufluoroqrafinen analyysi ja solujen erotus 20 Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solu- populaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetel-mällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy 25 Laboratories), analyysiin käytettiin solufluorografia FC200/4800A (Otho Instruments). Tällöin 10 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 min ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n 30 kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 min, reaktio-tuote sentrifugoitiin ja pestiin 3 kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuusmalli oli sa-35 manlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 mlrlla suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä, joka oli saatu intraperito- 10 75059 neaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidusta CAF^-hiirestä.

Kokeissa, joissa tutkittiin vasta-aine- ja komp-lementtivälitteistä lymfolyysiä, tymosyyttejä ja perifee-5 risiä T-soluja viljeltiin yön yli, minkä jälkeen seurasi selektiivinen hajotus ja sen jälkeen solut analysoitiin solufluorografilla.

Esimerkki 3

Lymfoidipopulaatioiden hajotus monoklonaalisella 10 vasta-aineella ja komplementilla 40 x 10° perifeeristä T-solua tai tymosyyttiä lisättiin 15 ml:n muoviputkeen (Falcon, Oxnard, CA). So-lupelletteihin lisättiin 0,8 ml vasta-ainetta OKT3, OKT4 tai 0KT8 tai tavallista vesivatsanestettä (vertailuaine), 15 jotka oli laimennettu suhteessa 1:200 PBS:llä, seokset suspendoitiin ja inkuboitiin 20°C:ssa 60 minuutin ajan.

Sen jälkeen vasta-aineella käsiteltyihin populaatioihin lisättiin 0,2 ml tuoretta kaniinin komplementtia, seos suspendoitiin ja sitä inkuboitiin edelleen 37°C:ssa 60 min 20 vesihauteessa, joka oli liitetty ravistelijaan. Inkuboin-nin päätyttyä solut sentrifugoitiin ja elinkykyiset solut määritettiin Trypan-sinisellä. Solut laskettiin, pestiin 2 x 5-%:isella FCS:llä ja asetettiin lopulliseen väliaineeseen RPMI 1640 (Grand Island Biological Company, Grand 25 Island, NY), joka sisälsi 20 % ihmisen AB+-seerumia, 1 % penisilliini-streptomysiiniä, 200 mM L-glutamiinia, 25 mM HEPES-puskuria ja 0,5 % natriumkarbonaattia, ja seosta inkuboitiin yön yli 37°C:ssa kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5 % CC>2.

30 Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille, joiden on annettu reagoida OTK^rn ja muiden monolonaalis-ten vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Taustafluoresenssivärjäys määritettiin lisäämällä ku-35 hunkin populaatioon suhteessa 1:500 laimennettua vesivatsanestettä hiirestä, johon oli injektoitu ei-tuottavaa kloonia, ja inkuboimalla seosta.

ii 11 75059

Kuviossa 2 on esitetty tymosyyttien erilaistuminen kateenkorvassa.

Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-aineiden OKT6, 0KT8, OKT9 ja OKTIO reaktiivisuus ihmisen eri 5 lymfodisolupopulaatioiden kanssa. Monoklonaalinen vasta-aine OKT8 reagoi noin 30 %:n kanssa ihmisen normaaleja T-soluja, noin 80 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, alle 2 %:n kanssa luuydinsoluja eikä lainkaan B-solu-jen eikä nollasolujen kanssa. Muun muassa tämän reaktiivi-10 suuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT8 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri ihmisen normaaleista tymosyyteistä koostuvalle suspensiolle, jonka on annettu reagoida vasta-15 aineiden OKT3, OKT4, OKT5, OKT6, OKT8, OKT9 ja OKTIO

(kaikkien laimennussuhde 1:500), sekä G/M FITC:n kanssa. Samanlaiset reaktiivisuuskaavat saatiin 12 muulle tutkitulle ihmisen normaalille tymosyyttipopulaatiolle. Kuviosta ilmenee, että reaktiivisuusprosentissa ja fluoresenssi-in-20 tensiteetissä on merkittäviä eroja kaikkien tutkittujen monoklonaalisten vasta-aineiden välillä. Esimerkiksi OKT9 reagoi noin 10 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresenssi-intensiteetin ollessa heikko, kun taas OKT5, 0KT6, 0KT8 ja OKTIO reagoivat noin 70 %:n kanssa tymosyyttejä fluoresens-25 si-intensiteetin ollessa voimakkaampi. OKT4, joka reagoi 75 %:n kanssa tymosyyttejä, sijoittuu fluoresenssi-intensiteetin suhteen OKT9:n ja sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden väliin, joiden fluoresenssi-intensiteetti on voimakkaampi .

30 Lisäksi kuviosta 1 ilmenee, että noin 15 % tymo syyteistä voidaan todeta OKT3:lla käyttämällä epäsuoraa immunofluoresenssimenetelmää. 0KT1, joka reagoi tymosyyt-tiien kanssa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla kuin OKT3, ei tällöin tule esiin. Myös kuviossa 1 esitetyn reak-35 tiivisuuskaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT8 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

75059

Taulukosta 2 ilmenee erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden määrittelemien antigeenien jakaantuminen ihmisen perifeerisiin T-soluihin ja lymfosyytteihin; jakaantuminen on määritetty sarjalla hajotuskokeita esimer-5 kissä 3 kuvatulla tavalla. Koska ainoastaan OKT3, OKT4 ja OKT8 olivat komplementin sitovia monoklonaalisia vasta-aineita, näitä kolmea käytettiin määrityksessä.

Taulukosta 2A ilmenee, että koko T-solupopulaatio reagoi OKT3:n kanssa, kun taas OKT4, OKT5 ja OKT8 reagoi-10 vat 60 %:n, 25 %:n ja 34 %:n kanssa T-soluja. Hajotus OKT4:llä ja komplementilla vähensi solujen kokonaislukumäärää 62 %:lla ja tuhosi spesifisesti OKT4+-populaation. Lisäksi OKT5+- ja OKT8+-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, mutta OKT5+- ja OKT8+-solujen kokonaismäärä ei muuttunut.

15 Tästä kokeesta voitiin päätellä, että 0KT4+-populaatio erosi OKT5+- ja OKT8+-populaatioista. Lisää tukea tälle olettamukselle saatiin kokeesta, jossa T-soluja hajotettiin OKT8:lla ja komplementilla. Tällöin OKT4+- T-solujen prosentuaalinen osuus kasvoi, kokonaislukumäärä pysyi samana, 20 ja 0KT8+- ja OKT5+-populaatiot tuhoutuivat. Lisäksi nämä kokeet osoittivat, että OKT8+-populaatio oli vastakkainen OKT4+-populaatiolle sisältäen koko OKT5+-T-solujakeen.

Samanlaiset ihmisen tymosyyteillä suoritetut kokeet antoivat erilaisia tuloksia. Taulukosta 2B ilmenee, että 25 noin 75 % tymosyyteistä oli OKT4-positiivisia tai 0KT8-po-sitiivisia. Sitä paitsi hajotettaessa soluja OKT4:llä tai OKT8:lla ainoastaan 25 % tymosyyteistä jäi jäljelle. Suurin osa jäljelle jääneistä tymosyyteistä reagoi OKT3:n kanssa, kun taas pieni osa niistä reagoi OKT6:n kanssa.

30 Nämä havainnot osoittavat, että suurimmalla osalla ihmisen tymosyyteistä on OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-pinta-anti-geenit samassa solussa. Lisäksi taulukosta 2 ilmenee, että käsiteltäessä soluja OKT8:lla ja OKT4:llä OKT3-antigee-nin sisältävien kypsien tymosyyttien määrä kasvaa huomatta-35 vasti. Täten suurin osa 0KT3:n kanssa reagoivista tymosyyteistä on jo erottunut OKT4+- ja OKT8+-jakeiksi, koska suurin osa soluista, jotka eivät reagoineet OKT4:n ja OKT8:n kanssa, olivat OKT3-positiivisia. Jos OKT3+-alapopulaatio 13 75059 olisi sekä OKT4-positiivinen että OKT8-positiivinen, hajotus jommalla kummalla monoklonaalisella vasta-aineella olisi tuhonnut 0KT3:n kanssa reagoivat tymosyytit.

Jotta saataisiin edelleen selville OKT3:n kanssa 5 reagoivien tymosyyttialapopulaatioiden suhde muiden mono-klonaalisten vasta-aineiden määrittelemiin tymosyyttifrak-tioihin, käsiteltiin tymosyyttejä OKT3:lla ja komplementil-lä ja käsittelyssä jäljelle jääneitä soluja verrattiin sitten käsittelemättömiin tymosyyttipopulaatioihin. Taulukos-10 ta 2B ilmenee, että OKT3 ja komplementti poisti 25 % tymo-syyteistä. Sen sijaan OKT4-, OKT5-, OKT6- ja OKT8-vasta-aineiden kanssa reagoivat populaatiot pysyivät käytännöllisesti katsoen muuttumattomina. Näistä havainnoista voidaan päätellä, että suurin osa OKT6-markkerin sisältävistä tymo-15 syyteistä kuuluu OKT3 -populaatioon. Lisäksi tuloksista voidaan päätellä, että tymosyytit, jotka samanaikaisesti ilmentävät OKT4:n, OKT5:n ja OKT8:n määrittelemät antigeenit, rajoittuvat samalla tavalla OKT3 -populaatioon. On myös huomattava, että OKT9:n kanssa reagoiva tymosyytti-20 populaatio ei vähentynyt käsiteltäessä fraktioimattomia tymosyyttejä OKT3:lla ja komplementilla, mikä osoittaa, että OKT9+-alapopulaatio rajoittuu suurimmaksi osaksi OKT3 -tymosyyttipopulaatioon.

Näiden tulosten pohjalta on ollut mahdollsita mää-25 rittää ihmisen tymosyyttien kehitysvaiheet kateenkorvassa.

Kuviosta 2 ilmenee, että käytännöllisesti katsoen kaikissa tymosyyteissä on OKTIO-markkeri. Lisäksi tymosyytit saavat varhaisessa vaiheessa OKT9-antigeenin (Thyl ja Thy2). Tämä vaihe käsittää vain pienen osan tymosyyteistä, 30 ja siihen kuuluu noin 10 % ei-fraktioidusta populaatiosta.

14 75059

Sen jälkeen ihmisen tymosyytit saavat OKT6:n määrittelemän tymosyyttiantigeenin ja samanaikaisesti ne ilmentävät OKT4:n, OKT5:n jaOKT8:n (Thy4). Jälkimmäinen alapopulaatio edustaa valtaosaa tymosyyteistä, ja 5 siihen kuuluu yli 70-80 % tymosyyttipopulaatiosta. Tymo-syyttien edelleen kypsyessä niiden 0KT6-reaktiivisuus häviää, ne tulevat reaktiivisiksi OKT3:n (ja 0KTl:n) kanssa ja erottuvat OKT4+- ja OKT5+/OKT8+-jakeiksi (Thy7 ja Thy8). Näyttää siltä, että viimeisessä vaiheessa tyraosyyttien ir-10 rotessa kateenkorvasta perifeeristen T-solujen joukkoon, niiden OKTIO-markkeri häviää, sillä tämä antigeeni puuttuu käytännöllisesti katsoen kaikilta perifeerisiltä T-lymfo-syyteiltä. Näiden kolmen pääkehitysvaiheen välisiä mahdollisia siirtymävaiheita on merkitty kuviossa 2 Thy3:lla, 15 Thy5:llä ja Thy6:lla.

Koska akuutin T-solujen lymfoblastileukemian on arveltu johtuvan epäkypsistä tymosyyteistä, määritettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyjen kas-vainsolujen ja mainittujen oletettujen tymosyyttien kehi-20 tysvaiheiden välinen suhde. Määrityksessä käytettiin T-ALL-leukemiaa sairastavista henkilöistä eristettyä 25 kasvain-solupopulaatiota ja kolmea T-solulinjaa, jotka oli etukäteen tutkittu tavanomaisilla anti-T-solureagensseilla ja E-rosetoinnilla. Taulukosta 3 ilmenee, että suurin osa 25 T-ALL-leukemiasoluista reagoi joko pelkän OKT10:n tai OKT9:n ja OKTIOrn kanssa, mutta solut eivät reagoineet muiden mo-noklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Täten 15/25 tutkituista tapauksista näytti sisältävän varhaisen tymosyyttivai-heen antigeenejä (vaihe 1).

30 Sitä vastoin 5/25 tapauksista reagoi OKT6:n kanssa, mistä voidaan vetää se johtopäätös, että ne ovat peräisin kypsemmästä tymosyyttipopulaatiosta (vaihe 2). Tämä T-ALL-ryhmä reagoi eri tavoin OKT4:n, OKT8:n ja OKT9:n kanssa, kuten taulukosta 3 ilmenee. Kahdella viidesosalla potilaista

II

15 75059 oli sellaisia kasvainsoluja, jotka sisälsivät suurimman osan tavallisista tymosyyttiantigeeneista, mukaan lukien OKT4, 0KT6 ja OKT8. On huomattava, että OKT5 ei esiinny yhdessäkään näistä viidestä vaiheen 2 kasvaimesta, vaikka-5 kin OKT8-reaktiivisuutta havaittiin. Tästä jälkimmäisestä tuloksesta voidaan selvästi vetää se johtopäätös, että OKT5 ja 0KT8 määrittelevät eri antigeenejä tai eri determinantteja samassa antigeenissä. Lopuksi 1/25:11a potilaista oli sellaisia kasvaimia, jotka olivat peräisin kypsästä tymo-10 syyttipopulaatiosta (vaihe 3) OKT3-reaktiivisuuden perusteella määritettynä. Tämän henkilön kasvain oli lisäksi reaktiivinen OKT5:n, OKT8:n ja OKT10:n kanssa. Tutkituista 25 leukemiapopulaatiosta ainoastaan neljä oli sellaista, joita ei voitu selvästi luokitella. Näistä kolme oli 15 oKT4- ja OKT8-positiivisia, mutta ne eivät reagoineet OKT3:n eikä OKT6:n kanssa, jolloin ne olivat todennäköisimmin Thy4:n ja Thy7, 8:n välisiä siirtymävaiheita. Yksi 25 tapauksesta osoittautui olevan Thy3:n ja Thy4:n välinen siirtymävaihe, sillä se oli reaktiivinen OKT8:n ja OKTIOrn 20 kanssa.

Myös T-ALL-kasvainpopulaatioista peräisin olevissa T-solulinjoissa oli soluja, jotka edustivat tiettyä tymo-syyttien kehitysvaihetta. Taulukosta 4 ilmenee, että HSB-2 reagoi yksinomaan OKT9:n ja OKT10:n kanssa, ja täten se 25 määrittelee vaiheesta 1 peräisin olevan kasvainpopulaation. Sitä vastoin CEM-T-solulinja reagoi OKT4:n, OKT6:n, OKT9:n ja OKTIOin kanssa ja se osoittautui olevan peräisin vaiheen 2 tymosyyteistä. Lopuksi solulinja MOLT-4 on ilmeisesti HSB-2:n ja CEM:in välillä oleva leukemiatransformaatio, 30 sillä se ekspressoi OKT6:n, OKT8"n, OKT9:n ja OKTIOrn.

Koska myöhempien vaiheiden (esim. vaiheen II) T-so-lujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien henkilöiden on todettu parantuvan täydellisemmin kuin vaiheen I ALL-leukemiaa sairastavien, OKT8-vasta-aineen avulla voi-35 daan vetää johtopäätöksiä T-solujen ALL-leukemiaa sairastavan henkilön prognoosista.

16 75059

Taulukosta 5 ilmenee perifeeristen T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuuksien ja eri tautitilojen välinen suhde. Näitä suhteita voidaan käyttää diagnostisiin tarkoituksiin (esim. akuutin mononukleoosi-infektion toteami-5 seen) ottamalla verinäyte henkilöstä, jonka epäillään sairastavan jotakin näistä taudeista ja määrittämällä näytteestä T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuudet. Näitä suhteita voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituksiin tautitilan aiheutuessa jonkin T-solujakeen kohonneesta pitoisuu-10 desta (esim. tyyppiä I oleva agammagblobulinemia). Tällöin potilaalle, jolla esiintyy ylimäärin jotakin T-solujaetta, annetaan sopivaa monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin ylimäärä saadaan vähenemään tai kokonaan poistetuksi.

Myös taulukoissa 2-5 esitettyjen suhteiden avulla 15 OKT8-vasta-aine voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista

Kyseisen vasta-aineen OKT8 havaittiin kuuluvan IgG2a~alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat 20 toisistaan ns. "kiinteiltä” alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglubuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla 25 on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin

IgG^-IgG2a, IgG^b tai IgG^ tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyy-teen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine 30 reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

I) 75059

Esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää tymosyyt-tien erilaistumisen toteamiseen ja tutkimiseen, kuten kuviossa 2 on esitetty. Lisäksi esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää eri tautitilojen diagnoosiin taulukossa 5 5 esitetyllä tavalla. Tällöin voidaan käyttää OKT8-vasta-ainetta sellaisenaan tai OKT8:n ja muiden vasta-aineiden yhdistelmää (esim. OKT3 - OKTIO). Reaktiivisuuskaavojen avulla, jotka on saatu annettaessa useiden eri vasta-aineiden reagoida T-solujen ja T-solujakeiden kanssa, tietyt 10 tautitilat pystytään toteamaan tarkemmin kuin käytettäessä tunnettuja diagnostisia menetelmiä.

Diagnostiset koostumukset, jotka muodostuvat vaikuttavista määristä OKT8-vasta-ainetta ja diagnostisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista, kuuluvat myös esillä olevan 15 keksinnön suojapiiriin.

Taulukko 1

Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus 20 ihmisen lymfoidipopulaatioiden kanssa

Monoklonaalinen Perifeerinen Luuydin (6) Kateenkorva (22) vasta-aine veri E+ E" 25 OKT6 0 % 0 % 0 % 70 % OKT8 30 % 0 % <2 % 30 3 OKT9 0 % 0 % 0 % £10 % OKTIO 45 % 10 % £20 % 95 % 30 Suluissa olevat luvut merkitsevät tutkittujen näytteiden määrää; %-arvot ovat keskiarvoja.

18 Λ 75059 Ρ 0)

CU

G <*> 0) “

Ui o

•H CO fÖ iH

E G tn tn •5 C <n Ä lii oi m m ιο c H > C O θ' h to to :nj

H G ·(« (M

M -H Ai 2 u ti t- 2 tn m

P G *frt OI

0) Φ (1) ^ II) CO VO ιΛ (N «V

•H S S ° 1—1 H H

S M ^ dl Ή

§ G G 0O CU O

•P 0) -H Eh ττιηο Ln ui o o CC

5 H?7 ϊόΓοσι η- m en racy <τ) G 1 O Λ c lö h nj S .5 •X O P § g cö tn tn 10 3 5

i~> to Eh 000 m o n (n -PO

m>^ VO H r-l 00 O -m £ 0 p rt (U Ό G Q) x; •H H Q) w a.

G (U P m c <1) Gtn Eh m o o o m o o 4Jm

cU :G -h ^ m r-» n» 00 00 4JC

Cn :G H O >, .H .

4J iH nj

ti 2 ^ CO -H 4J

C O G ^ s- rrt ti

<N fÖ Ή0 H 00<N LH O LH O QtQ)(D

Ή Ή ^ VO (Ti r- vov^ rv n O G O * O ;rOM^ * O -m O 3 , **

M H H C □ .L

C E :G O £ ^HW4J

-HO i“o £ E-; oomm o o m o ui G H λ σι <n <n m 00 00 s., n SS ° δ » § ·+* ij k>

-P ;f0 (0 CO

U m .£ G H P

S .3 C a f ” ;

6 S a ·“ I S -S B

>1 :G G .X vo 10 vo vovovovo (ötn G >1 -n 1—I G 000 0000 -Pr-in (Utn OH H >—I r-t H 1—I f—I r-1 QJ>lT3 Ό 0 O) tn tn £ω

ml. XXX x X X X G O

0) H H G G I) Q, 4J

G P (DCJC O (N (N o o m O ·Η φ •H ·η Ό o ^ a M Ui « m h h M m m en -h 3 .v

l-nncGOO HfM P 0) O

3 ^ C ^ G H H

-P G (fl s_ n

tn tn 3 3r Z

G tn -P 3 □ H

> H O 3 a « - CH p oxj jo a-t!w

ti » « 2 * * :G :G .H .H

•H EH G 0) (U e * J2 p

H CU P -P p -OGGC

GIG 0 <u -u -P SmGO

g tn CU tn h -f. p . h p^al e tn h h tn - - h tn - - - :G^mo OH Ό P IG υ O P :G O u U E P P h

H tn H G) Ai >, Ai GG O

-X h o 0) + + >, + + + h S a e OP H HC tn e o E tn o CO) E H G^roo O G^room POW^ O 0) >1 PEEHEHEE^^g-, J h -h S ^ d O H « * > H « £ £ tai 11 Ο,μΟΟΕηΙηοοΟ ω E h . :G O G - « « * M 2 11 19 7505 9

+* I

QJ ·Η (fl

T3 +> φ I

3 I (0 U) :ifl

3 .J Ο Ή rH

to >j · Qj ra >, Η < P »H +) <3 i 3 <u x: c £ E-ι Ai jC Ο (Ο ·η •H 3 4J 0) E C I—I u"i 3 U) U) O (1) (N +> Ή 3 (3

<3 ·Γ~> C „ H >, (0 .H

±i 3 0) II I- 00 * O +> 4J (0 C +> +) Ή r-t ΓΜ ,H I—i rH > ·Η (fl

Ή D M C l<NU) dP C

ft Ή 3- Ή X φ a: (3 cj >i o ui +) α. (Η φ <3 3 (3 <3 C w u •H Eh +) 4J o 0 E -Η -H 3

(U Ο Ή I—I rH

A! o Tl -U O >+-l 3 I f—i + £ · Φ ·Η E-t + * ·Η -H !(3 (3 —I «3 ϋ ++ 4. . , , , Φ0 10+)(0 •HIO + + + + + +1(0 (OCOui

+ (3 £ -H c -A -H

(0 +) Ή +( O 144 O

(3 (0 <Xi (0 Φ (0 -H -H

Ή Π3 E-* > + Φ (0 (0

-Q > Ai |+ +111 , WAi S-IOJC

0 o +111 I (3(13 ΟΟιφ Αί +ι 3 (0 Oj E Φ <3 rH to >1+00 <3 Αί l+i CO 3 O rH (0 C-, +) O (0 Αί ·Ηϋ I· ,,,, 3C C T-i 3

AiC^o ++1+ + 3 Φ 0) rH

3Φ(3 E Ό C - O

Ή ·(—i ri -H -h —-(0

3 3 C i+) )(3 ·Η Ή I C

(0 rH O E-i ·(—' £ -H -- -H

^OrH^ || . . , , , 1-1 <0 3J

m M o + + + + I (I rj (UC> 1 O £ (0 CL, φ to H £ to to C (3 0 m to ο -H a; •Hg Eh to -(-1 (0 > + -4 I I 1 I I i , >< Ο -H :(3 + (0(30 llll + E · ·η·Η+) 3 3 (0 :f3 +) (fl

3 3 (0 Ή ή » fl (I

4 U C 3+) —»Oi(fl (3 ή Γ3 Η Ή (0 + (11 y “ ^ g 11 + + 1 , I l 2 “ = if £ *h c a: c -h ·/—) Φ +) φ · (N Q) rH +| Π ϋΌ n £ to £0:(3 3 (3 -H Eh -H SS c -H > 'HQJtU^i l| liii . H O>(0(3 OKCO llll + 10· 0-HD+) uj 0, rn -h -h 3 ui <3 ++) 3 1 > + (0 3 •H — U) ™ Ή 3 -Η -H (3 p I—1 (3 £·^α:ιο>+)

ω >ι (0 .H m C O H

-4 J3 -H Xl + H (3 O. -H C

j ~ -G >, + W 4J -H Λί (8

+* JhC Ή +> ,h (3 P

® -H (3 w < O -H O <u nj

+» +) > n -h i .£ -H M +J

to +1 2 + E-· -H > U) 4J

(3 SHGS, Γ ? 3(3o to >, -H ^ £> :(B3 (HIh •h Ul+I rH *H >i +) (0 o E O >, C (0 H (3 +) C -H » 3 E >1-H Q) Q > + + Ή > (3 >,

>1 l/) f\| e ^ ^ h d) -H H 4J

•h " .s gir - - Ä f ? (h j ϋ 5 .tj ä u -s ti, ΐ -s . . -s > h y· ^-H^a w > < ® > S E £ t t 5 H M +> H + Ή Λ + + 20 7 5 0 5 9

Taulukko 4

Solulinjojen reaktiivisuus monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa

Solulinja OKT3 OKT4 OKT5 OKT6 OKT8 OKT9 OKTIO

5 HSB-2 -X - - - - + + CEM - + - + + + + MOLT-4 --- + + + + xKriteerit (-)- ja (+)-reaktiivisuudelle olivat samat kuin taulukossa 3.

21

Taulukko 5 75059

Perifeeristen T-solujen pitoisuudet eri tautitiloissa 5 Tautitila T-solujen pitoisuudet 0KT3+ ΟΚΤ4~Γ OKT5+ 0KT8+ 0KT6 +

Primäärinen maksa- kirroosi (2) N +

Multippeliskleroosi 10 (pitkälle edennyt) (8) ” N - - _

Myasthenia Gravis (ei hoidettu varhaisessa O O 0 O o vaiheessa) (3)

Akuutti elinsiirto (3) o ··- - 0 + + 15

Agammaglobulinemia

Tyyppi 1 + ivyppi II 0 20 Hyper IgE (4) - N 0···“ o··· -

Akuutti mononukleoosi-

+ O * * * — ++ -t-+ O

infektio (4)*

Hodgkinsin tauti

Vaiheet τ t τ τ m .«

25 l&IIN M N NO

Vaiheet III & IV — N N N O

Psoriasis (3/5) N +...++ n N O

30 N = normaali pitoisuus O = puuttuu + = normaalia suurempi ++ = huomattavasti normaalia suurempi - = normaalia pienempi 35 — = huomattavasti normaalia pienempi *) Nämä pitoisuudet palaavat normaaleiksi noin viikkoa aikaisemmin kuin kliiniset oireet häviävät

Suluissa olevat luvut ilmaisevat tutkittujen potilaiden lukumäärän

Claims (3)

22 75059

1. Diagnostinen menetelmä 0KT8+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä, tunnettu 5 siitä, että annetaan potilaasta otetun T-solunäytteen reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 8014, ja joka vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaa-10 lien heikentäjä-T-solujen kanssa, alle 2 %:n kanssa ihmi sen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen eikä nollasolujen kanssa, ja määritetään, kuinka suuri osa koko perifeerisestä T-solupolulaatiosta reagoi mainitun vasta-aineen kanssa.

2. Diagnostinen ainekoostumus OKT8+-solujen puut teen tai ylimäärän toteamiseksi, tunnettu siitä, että se koostuu diagnostisesti hyväksyttävästä kantajasta ja OKT8+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseen tarvittavasta määrästä hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jo-20 ta tuottaa hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 8014, ja joka vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien heikentäjä-T-solujen kanssa, alle 2 %:n kanssa ihmisen normaaleja luuydinsoluja eikä lainkaan ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen eikä 25 nollasolujen kanssa.

3. Menetelmä akuutin mononukleoosi-infektion toteamiseksi ihmisistä, tunnettu siitä, että annetaan potilaasta otetun T-solunäytteen reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa ainakin yhtä monoklonaa-30 lista vasta-ainetta, joka on joko OKT3, OKT4, OKT6 tai OKT8, joita tuottaa hybridoma ATCC CRL 8001, ATCC CRL 8002, ATCC CRL 8020 tai vastaavasti ATCC CRL 8014, ja määritetään se perifeerisen T-solupopulaation prosentuaalinen osuus, joka reagoi kunkin mainitun vasta-aineen kans-35 sa. Il