FI75435C - Diagnostiskt foerfarande, vid vilket man utnyttjar en ny monoklonal antikropp specifik mot maenniskans t-cellers antigen och i foerfarandet anvaendbar komposition. - Google Patents

Description

75435

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään hyväksi uutta ihmisen T-solujen antigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta ja menetelmässä käyttökelpoinen ainekoostumus 5

Jakamalla erotettu hakemuksesta 810026

Keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään 0KT11+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisistä se-10 kä menetelmässä käyttökelpoiseen ainekoostumukseen. Menetelmässä käytetään hyväksi monoklonaalista vasta-ainetta pinta-antigeenille, joka on löydetty käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-so-luista ja noin 95 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä.

15 Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla.

Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin /.Nature 256 (1975) 495-497/, jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja ho-20 mogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybri-domien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: Current Topics in 25 Microbiology and Immunology, vol. 81 - "Lymphosyte Hybri-domas", toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et al., Cell 14 (toukokuu 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; 30 Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, vol. 2, toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybrido-35 meistä monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy 2 75435 paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybrido-maa siinä onnistutaan ja että tässä onnistuttaessa hybri-doma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella 5 vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hybridoman eristämisestä käytetystä selektiotekniikasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain 10 harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81, 66-69 ja 164-169.

Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfo-syyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybri-15 domat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä hybridomeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttila-jille spesifistä vasta-ainetta.

Äskettäin on esitetty julkaisuja, joissa on kuvat-20 tu sellaisten hybridomien valmistus ja testaus, jotka tuottavat tietyille T-solujen antigeeneille spesifistä vasta-ainetta. Katso esim. Reinherz, E.L., et ai., J. Immunol. 123, 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 4061-4065 (1979); ja Kung, P.C., et ai., Science, 25 206, 347-349 (1979).

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilaistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista. Ka-30 teenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymo-syyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti 35 spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin 75435 (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen) . Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryh-mä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen 5 itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immunologisissa järjestelmissä säätelevästi. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin 10 oleviin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kantasoluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabri-15 cius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-20 soluiksi, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimen-25 tai Medicine 145 (1977) 221-232 ja L. Chess ja S.F. Schloss-man - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja O. Stutman, Plenum Press 1977, vol. 7, 363-379.

30 Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregula-toristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvain-muotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne 35 lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää 4 75435 pystytään erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", 5 toimittajat S. Thierfelder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85.

Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa, pahanlaatuisissa tautitiloissa ja agammaglobulinemias-10 sa T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon.

On ehdotettu, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "hei-kentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas agammaglobuli-nemiaan liittyy tiettyjen "heikentäjä"-T-solujen ylimää-15 rä tai "auttaja"-T-solujen puute. Pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin. Joissakin leukemiamuodoissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnostinen onnistuminen voi täten riippua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai 20 ylimäärä havaitsemaan tai määrittämään, mitä kehitysvaihetta esiintyy ylimäärin. Katso esimerkiksi: J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", vol. 20, Springer-Verlag 1977, 17-23 ja jul-25 kaisun sisältämät viitteet sekä E.L. Reinberg et al., J. Clin. Invest. 64 (1979) 392-397.

Agammaglobulinemiaan, tautitilaan, jossa immuno-globuliinia ei muodostu, kuuluu ainakin kaksi eri tyyppiä. Tyypissä I immunoglobuliinia ei muodostu, koska heikentäjä-30 T-soluja esiintyy ylimäärin, kun taas tyypissä II tämä aiheutuu auttaja-T-solujen puutteesta. Molemmissa tyypeissä potilaan B-solut eli lymfosyytit, jotka vastaavat vasta-aineen varsinaisesta erityksestä, ovat täysin normaaleja eikä niistä esiinny puutetta, sen sijaan näiden B-solujen toimin-35 taa joko heikennetään tai niitä "ei auteta", mikä vähentää huomattavasti immunoglobuliinin tuotantoa tai keskeyttää 5 75435 tuotannon kokonaan. Agammaglobulinemiatyyppi voidaan siten määrittää sen perusteella, esiintyykö heikentäjä-T-soluja ylimäärin vai onko auttaja-T-soluista puutetta.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa auto-5 immuunista tautia tai pahanlaatuisia tauteja sairastaville potilaille vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä ylimäärin esiintyvälle T-solulajille, vasta-aineet voivat vaikuttaa taudin kehitykseen edullisesti. Esimerkiksi auttaja-T-so-lusyöpää (tiettyjä ihon T-soluimukudoskasvaimia ja tietty-10 jä T-solujen akuutteja lymfoblastileukemiamuotoja) voidaan hoitaa antamalla potilaalle auttaja-T-soluantigeenille spesifistä vasta-ainetta. Autoimmuunista tautia, joka aiheutuu auttaja-solujen ylimäärästä, voidaan myös hoitaa samalla tavalla. Sellaisia tauteja lesim. pahanlaatuisia tautitilo-15 ja tai tyyppiä I olevaa agammaglobulinemiaa), jotka aiheutuvat heikentäjä-T-solujen ylimäärästä, voidaan hoitaa antamalla potilaalle vasta-ainetta, joka on spesifinen heikentä jä-T-soluantigeenille.

Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-so-20 luihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobuliini eli ATG), ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja.

Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimis-25 mekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring", Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viit-30 teet, ja Wechter et ai., "Manufacture of Antithymocyte

Globulin for Clinical Trials", Transplantation 28 (4) (1979) 303-307.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähänasti käytetty spontaaneja autovas-35 ta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä antiseerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen 6 75435 T-soluilla, poistamalla elämistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisilla. ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-haluttu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien 5 valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunoin-10 tia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden muodostumisen useita antigeenilajejavastaan, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä 15 valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10**.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mai-20 nittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News”-leh-dessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

25 Nyt on keksitty uusi hybridoma (OKT 11), joka pystyy tuottamaan uutta monoklonaalista vasta-ainetta pinta-antigeenille, jota on löydetty käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista ja noin 95 %:lta ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta jota ei ole 30 löydetty ihmisen normaaleista B-soluista eikä nollasoluista. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien T-solujen pinta-antigeenideter-minantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin vas-35 toin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoi- 7 75435 vat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa), ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen tymosyytin antigeenille) . Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-ai-5 neen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

10 Sekä esillä olevasta hybridomasta että sen tuottamas ta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKTll", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoitetaan. Esillä oleva hybridoma on talletettu 13.12.1979 laitokseen "the American Type Culture Collection", 12301 15 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8027.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 810026.

Esillä olevan keksinnön mukaiselle diagnostiselle 20 menetelmälle, jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että annetaan potilaasta otetun lymfosyyttinäytteen reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletus-25 numero on CRL 8027 ja joka vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymo-syyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen eikä nollasolujen kanssa, ja määritetään mainitun vasta-ai-30 neen kanssa reagoivan populaation prosentuaalinen osuus.

Esimerkki 1 OKTll-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttikantojen eristäminen

Terveiden vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-35 40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointi- 8 75435 menetelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH), Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest.

21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-Ig (B)- ja pinta-Ig~- (T- ja nol-5 lasolu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2~pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974). T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig -populaatio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, 10 Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypa-que-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH4Cl:lla (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2 % risesti EAC-rosettipositiivinen ja >95 % risesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmillä 15 määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig (nollaso-lu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5 % risesti E-positiivinen ja < 2-%risesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+ (B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä eluoimalla normaalilla 20 ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%risesti pinta-Ig-positiivinen ja <5-%risesti E-positiivinen.

B. Tymosyyttien eristäminen

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin poti-25 lailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199(Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiöseeru-mia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla 30 ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%risesti elinkykyisiä ja _> 90-%risesti E-rosettiposi-35 tiivisia.

9 75435

Esimerkki 2

Solufluorografinen analyysi ja solujen erotus

Monoklonaalisten vasta-aineiden ja kaikkien solupopulaatioiden reaktiotuotteiden solufluorografinen analyysi 5 suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimenetelmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä (G/M FITC) (Meloy Laboratories) , analyysiin käytettiin solufluorogragia FC200/4800A

g (Ortho Instruments). Tällöin 1 x 10 solua käsiteltiin 10 0,15 ml:11a vasta-ainetta OKT5 laimennuksen ollessa 1:500, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä 15 solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografiällä, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuusmalli oli samanlainen laimennuksella 1:10 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktioita ei tapahtunut. Taustavärjäyksen 20 intensiteetti määritettiin 0,15 ml:lla suhteessa 1:500 laimennettuna vesivatsanestettä, joka oli saatu intraperitone-aalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidusta CAF^-hiirestä.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorograafista saatu fluo-25 resenssispektri normaaleille ihmisen tymosyyteille ja perifeerisille E+- ja E -soluille, joiden on annettu reagoida OKTll:n ja muiden monoklonaalisten vasta-aineiden (laimennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Taustafluoresenssivärjäys määritettiin lisäämällä kuhunkin populaatioon suhteessa 30 1:500 laimennettua vesivatsanestettä hiirestä, johon oli in jektoitu ei-tuottavaa kloonia, ja inkuboimalla seosta.

Taulukosta 1 ilmenee monoklonaalisten vasta-aineiden OKT1, OKT3-6 ja OKT8-11 reaktiivisuus ihmisen eri lymfoidi-solupopulaatioiden kanssa. Muun muassa tämän reaktiivisuus-35 kaavan avulla esillä oleva vasta-aine OKT11 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

10 75435

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri ihraisen normaaleille tymosyyttisuspen-sioille sekä perifeerisille E+- ja E -soluille, joiden on annettu reagoida vasta-aineiden 0KT11, OKTIO ja 0KT8 (lai-5 mennus 1:500) sekä G/M FITC:n kanssa. Päinvastoin kuin OKT1- ja OKT3-T-soluantigeenit (joiden määrä lisääntyy tymosyyttien kypsyessä perifeerisiksi T-soluiksi), 0KT11-antigeenin määrä samanaikaisesti pienenee. Muun muassa kuvion 1 mukaisen reaktiivisuuskaavan avulla esillä oleva 10 vasta-aine OKT11 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista .

Taulukossa 2 on esitetty ihmisen T-lymfosyyttien an-tigeenifenotyypit käyttäen vasta-ainetta OKT11 ja muita monoklonaalisia vasta-aineita. Myös tämän fenotyyppikaavion 15 avulla vasta-aine OKT11 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Taulukosta 3 ilmenee perifeeristen T-solujen sekä T-solujakeiden pitoisuuksien ja eri tautitilojen välinen suhde. Näitä suhteita voidaan käyttää diagnostisiin tar-20 koituksiin (esim. akuutin tarttuvan mononukleoosin toteamiseen) ottamalla verinäyte potilasta, jonka epäillään sairastavan jotakin näistä taudeista ja määrittämällä näytteestä T-solujen ja T-solujakeiden pitoisuudet. Myös taulukossa 3 esitettyjen suhteiden avulla vasta-aine OKTll 25 voidaan todeta ja erottaa muista vasta-aineista.

Diagnostisia menetelmiä, joissa käytetään muita monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia samojen hakijoiden valmistamia hybridomeja (OKT1, OKT3, OKT4 ja OKT5 sekä OKT6, OKT8, OKT9 ja OKTIO) on kuvattu FI-patenttihakemuksissa 30 84 4703, 84 4705, 84 4704 ja 84 4706 sekä 84 4707, 85 0062, 85 0063 ja 85 0061.

Kyseisen vasta-aineen OKTll havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toi-35 sistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns.

11 75435 "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin 5 IgG1 - IgG2a, IgG2b tai IgG^ tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyy-teen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplemen- 10 tin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Esillä olevaa vasta-ainetta voidaan käyttää eri tautitilojen diagnoosiin, kuten taulukossa 3 on esitetty. Tällöin voidaan käyttää OKTll-vasta-ainetta sellaisenaan tai OKTll:n ja muiden vasta-aineiden yhdistelmää (esim.

15 OKT3 - OKTIO). Reaktiivisuuskaavojen avulla, jotka on saatu annettaessa useiden eri vasta-aineiden reagoida T-solu-jen ja T-solujakeiden kanssa, tietyt tautitilat pystytään toteamaan tarkemmin kuin käytettäessä tunnettuja diagnostisia menetelmiä.

20 Diagnostiset koostumukset, jotka muodostuvat vaikut tavista määristä OKTll-vasta-ainetta ja diagnostisesti hyväksyttävistä kantaja-aineista, kuuluvat myös esillä olevan keksinnön suojapiiriin.

12 754 35

Taulukko 1 OKT-antiqeenien jakaantuminen soluihin ja kudoksiin Monoklonaalinen vasta-aine ig-tyyppi Perifeerinen Perna Luuydin Kateenkoiva veri (15)x (4) (6) (15) 5 ________ E~ 0KT1 IgGi 100** o 29+9 <5 18+8 OKT3 IgG2a 100 0 31+8 <5 21+8 10 “ O KT 4 IgG2b 64±4 0 16+3 <5 75+10 OKT5 IgGi 25+4 0 15+4 <5 77+8 OKT6 IgGi 0 0 0 <5 68+8 15 OKT8 IgG2a 34±3 0 17+4 <5 81+7 OKT9 IgGi 0 0 0 <5 4+3 OKTIO IgGi 5+3 13+4 10+5 16+4 96+4 OKTll++ IgGi loo 0 NT+ NT 95+3 20 x tutkittujen näytteiden määrä - IS.D.

+ ei määritetty ++ tutkittiin viisi näytettä perifeerisestä verestä ja viisi kateenkorvanäytettä.

75435 13 Ή Ή Ε-< !++. + + + +

X

Ο σ Η Ε" + + + + + ιι

X

Ο σ\| Ε- g I +| +| I I it οο V ** •H * I I + I + I + a ° >1 >ί +j c £ a) t-·

Ή X I I + I I II

Ή w a a> a) O' CN ·Η in X § § 11 + ,+ I +

X

3 c h a>

3 -H

fl 4J __ B l

>1 * I + + + I + I CO

n O to o a <« Φ g co & — — <u V s = 2. 8 E- § I , I + + + + 3 C Ή a) o co _ a Ϊ * * * 1 H g I I » + + + + .3

sS H j * „ Is I

^ H Jj|, ft 8^1 I

siis IIII 1 sIä t fe I s s

Is si 1 ss In i. s 14 75435

H

s · + + I 7 I + O ' z I 2 + 2

P

<D

<y • p 3 “ H + w w 0

2 S + I , . + 3 3 P

"n jj O + ++ O O 2 3 3 « *

0 t! U<JZW0)«C

-j OJ ·Ρ P ρ »0

\H. ^ o o C P

^ 2 -p P -H aO

‘•“j 3 Ή *H *H aO

α 04 5 i <0 O E-1 Ή -H ^ ^ ^ Ϊ . Q< 0< C 3

•POI I 0+ I _ _ Ej g P P

p a VJ+ ΙΟ O o O <B S 3 ^ r. P C At 3 <1) 3 3 <d <jj

<U 3 Ή CO

P r-> oo , » D. p P

<U 3 f* I g (0

'O p · it it £ H

3 O q ι ι ,— , * P P <11 P

301 1 ° + · + z z — r-4 H ' (0 -P

01 ^ + ZZZ<0<0PO

•hc o it « «a o <u g g At p -p p S -h ö P 01 £ O O (0 0) O· -h £ I c c o ρ $$ <0 3

C <0 O I I o o · . __ II II OP

¢) fl u + · + Z 2 2 At P

•n 0) * + + I At P

3 p o -PA! Ή M ° rip 03+ , 3 οι oi > 3

tl fi v I + <0 3 3 P

^OE-i I +<0333

fncc^ + 2 0 . _ _ · s οι οι p P

Φ O O z O 1 ° z · 2 2 * Ο P P O <0 OPS · · At O O C >

At 01 ΟΡΡΟ) a; ρ O . x p p p at 3 p I + α λ o) p P <0 . 3 Λ <0 3 <0 3 Ρ Ρ P g

<00)2 . , p cu a ω nH

H p £ 2 1 O · 1+ 2 2 -2 e β d ·ρ · ZIZgQjQjnj 30 O 3 P 3 3 +» s ~ a 3 <u g 3 O <n 3 -p p > s il oi o< 0 3

ο ςτ c rP

g a> K 0 <o <0 ., ,

»P (/] P -H P P

S -H Ö fP ip [0 (0 0 p afl 2 <0 <0 > >

P CO .14 5 <0 <0 <0 <D

01 OP £ «1 g g <0 P

•P Ο Ρ > ·Ρ >3ppi-j0 p p a-» „ w h 3 0 0 5>

Q) P 00 H O HOICCOj/O

0 -p -p ^ a o h «8 *ρ οι

Ή Ai 01 So- <U 0-P-P-3M

•P <0 0 <0 01 oi P*2 <P P «a η λ p p p(D-P

P (0 OH-p-H Pe A! P m m p tn m O 3

a» a: p p > S p k .. 3 3HH\o<mm3H

01 <0 <1) P <0 -fi -p Ϊ 3 <0 m >>33 g Ρ P P <3 0) KHH ^ O P PP-P « ld»IO) a; p o > c j . . ^ c oio ppp-p 3 013 „ P d η Ti w Ο C 0) 9> <0 Ρ P 0 ·

0) P <0 <0 rj p non ,, 6 -l .S.B0><O<Oifl+i+J

<0 3 HP p 5 <U ”8 ft ft w oi-P-P-pggg-PoO

Ρ P 0) 3¾ tP-P 3 OO® P O 0^*> •P P ΟιΡΟ'Ο P i CC1 H +1 ·Ρ >>3 O 3 3 — pao α>ιχ;·ρ| pg*^^ , p a: ρβλχι^-η paO P3pQp2 P3Xt7> P g> P 6 P 3 01 -V 3 i 2 3 13 O II II II *2 :2 3-P-,P<U3.p 39 CUAt^O 01 zx: 3 M N 3 Ό >1 (1) Ai S. >P < 'i· Ä 0( 2 + I „

Hft—soS'-'rt;^ * ^ +i*

Claims (2)

15 75435

1. Diagnostinen menetelmä OKTll+-solujen puutteen tai ylimäärän toteamiseksi ihmisissä, tunnettu 5 siitä, että annetaan potilaasta otetun lymfosyyttinäyt-teen reagoida diagnostisesti vaikuttavan määrän kanssa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybri-disolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8027 ja joka vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien 10 ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen eikä nollasolujen kanssa, ja määritetään mainitun vasta-aineen kanssa reagoivan populaation prosentuaalinen osuus.

2. Diagnostinen ainekoostumus, jolla voidaan tode ta OKTll+-solujen ylimäärä tai puute, tunnettu siitä, että se koostuu diagnostisesti hyväksyttävästä kantaja-aineesta ja 0KTll+-solujen ylimäärän tai puutteen toteamiseen tarvittavasta määrästä hiiren monoklonaalista 20 vasta-ainetta, jota tuottaa hybridisolulinja, jonka ATCC-talletusnumero on CRL 8027 ja joka vasta-aine reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja noin 95 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, mutta ei reagoi ihmisen normaalien B-solujen 25 eikä nollasolujen kanssa.