FI75058C - Diagnostiskt foerfarande foer bestaemning av proportionen av t-celler i cirkulerande lymfocyter samt foer paovisande av kutan-t-cellymfoma under anvaendning av en ny komplement-bindande monoklonal antikropp. - Google Patents

Description

1 75058

Diagnostinen menetelmä T-solujen osuuden määrittämiseksi kiertävistä lymfosyyteistä sekä ihon T-soluimukudoskasvai-men toteamiseksi käyttäen uutta komplementin sitovaa mono-klonaalista vasta-ainetta 5

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta nro 801342.

Keksintö kohdistuu diagnostisiin menetelmiin T-solujen osuuden määrittämiseksi kiertävistä lymfosyyteistä sekä 10 ihon T-soluimukudoskasvaimien toteamiseksi käyttäen komplementin sitovaa, monoklonaalista, ihmisen kaikkien normaalien T-solujen ja ihon T-imukudoskasvainsolujen pinnalta löydetylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Vasta-ainetta valmistetaan uuden hybridisolulinjan avulla.

15 Kohler ja Milstein yhdistivät vuonna 1975 hiiren myeloomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin (Nature 256 (1975) 495-497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns."monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi.

20 Tämän jälkeen erilaisten hybridisolujen (ns. hybridomien) valmistamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esim. Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81 - "Lymphosyte Hybridomas", 25 toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet? C.J. Barnstable et al., Cell 14 (toukokuu 1978) 9-20? P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399?

Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, volyymi 2, 30 toimittaja D.M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25? ja

Chemical and Engineering News, tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomeis-ta monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä 35 periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy paljon ja jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybridomaa siinä onnistutaan 2 75058 ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigeenilajista ja halutun hybridoman eristämi-5 sessä käytetystä selektiotekniikasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81, 66-69 ja 164-169.

10 Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfosyyt-tileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hybridomat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä hybri-15 domeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttilajille spesifistä vasta-ainetta.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) eri-20 laistuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista. Ka-teenkorvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymo-syyteiksi". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertä-25 vistä pienistä lymfosyyteistä. Ne ovat immunologisesti spesifisiä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esim. elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka T-solut eivät eritä vasta-aineita elimistön nesteisiin, toi-30 nen myöhemmin käsiteltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-soluja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-solulajit toimivat toisissa immunologisissa toiminnoissa säätelevästi. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

35 Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin ole viin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kanta-soluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista.

Il 3 75058

Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettäväisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

5 T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja"-, "heikentäjä"- ja "tappaja"-T-soluik-si, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tappavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin 10 niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai., Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232, ja L. Chess ja S.F. Schlossman -"Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", teoksessa 15 "Contemporary Topics in Immunobiology", toimittaja O. Stutman, Plenum Press 1977, volyymi 7, 363-379.

Eri T-solulajien tai -alalajien identifiointi tai niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregulato-risten häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

20 Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvain- muotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioitaessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää pystytään erottamaan toisistaan. Katso esim. A.C.Aisenberg ja 25 D.C.Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D.Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas" toimittajat S.Thierfelder et al., Springer, Heidelberg, 1977, 33-45; ja D.Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85. Tietyissä 30 tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa ja tietyissä leukemiamuodoissa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On mahdollista, että autoimmuunisissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, kun taas 35 pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentäjä"-T-soluja esiintyy ylimäärin. Tietyissä leukemiamuodoissa muodostuu ylimäärin pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia 4 75058 T-soluja. Diagnoosin onnistuminen voi täten riippua siitä, .pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan.

Katso esim. J Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa 5 "Haematology and Blood Transfusion", volyymi 20, Springer-Verlag 1977, 17-24 ja julkaisun sisältämät viitteet.

Terapeuttisella puolella on ehdotettu, että annettaessa ylimäärin esiintyvälle T-solujen alaryhmälle spesifisiä vasta-aineita autoimmuunisia tai pahanlaatuisia sai-10 rauksia poteville potilaille, nämä vaikuttavat sairauden kehitykseen edullisesti. Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymo-syyttiglobuliini eli ATG),ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoisiksi hoidettaessa potilaita, joille on suori-15 tettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimispro-sessia. Katso esim. Cosimi et ai., "Randomized Clinical 20 Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: Importance of T Cell Monitoring" Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaaneja auto-25 vasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä anti-seerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluille, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologi-silla ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistami-30 seksi, joilla on ei-haluttu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio-ja puhdistusvaiheessa. Adsorboidut ja puhdistetut anti-seerumitkin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi 35 sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunoin-tia T-soluilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden 11 75058 muodostumisen useita antigeenilajeja vastaan, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluista. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä 5 valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/10.

Katso esim. Chessin ja Schlossmanin edellä mainittua 10 artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "The Chemical and Engineering News"-lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

Nyt on keksitty uusi hybridoma (nimeltään OKT3), 15 joka pystyy tuottamaan uutta komplementin sitovaa mono- klonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista ja ihon T-imukudoskasvainsoluista löydetylle pinta-antigeenille. Näin muodostunut vasta-aine on mono-20 spesifinen yhdelle ainoalle ihmisen normaalien T-solujen ja ihon T-imukudoskasvainsolujen pinta-antigeenidetermi-nantille eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päinvastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnos-25 taan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka reagoivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesi-fisiä yhdelle ainoalle ihmisen T-solun antigeenille). Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuotta-30 miseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuottamiseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisissa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

35 Sekä esilläolevasta hybridomasta että sen tuotta masta vasta-aineesta käytetään tässä yhteydessä nimitystä "OKT3", asiayhteydestä ilmenee, kumpaa kulloinkin tarkoi- 6 75058 tetaan. Esilläoleva hybridoma on talletettu 26.4.1979 laitokseen "The American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, ja sille on annettu ATCC-talletusnumero CRL 8001.

5 Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 801342.

Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, jossa edellämainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään, on tunnusomaista, että sekoitetaan kiertävistä lymfosyyteis-10 tä otettuun näytteeseen IgG-luokaan kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRC 8001 ja joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja ihon T-imuku- 15 doskasvainsolujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä mak-rofagien kanssa, b) reagoi 5 - 10%:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, 20 c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastLleukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa, nolla-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa eikä B-solujen kroonista lymfaattista leukemiaa sairastavien ihmisten 25 leukemiasolujen kanssa, d) reagoi heikosti ihmisen T-solulinjan HJD-1 kanssa, mutta ei reagoi lainkaan T-solulinjojen CEM,

Laz 191 eikä HM1 kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoi-30 tujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa ja f) sitoo komplementin, ja määritetään, kuinka suuri osa kiertävistä lymfosyyteistä reagoi mainitun vasta-aineen kanssa, jolloin rea-35 goivat lymfosyytit ovat T-soluja.

Il 7 75058

Esimerkki 1 OKT3-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen

Terveiden vapaaehtoisten verenluovuttajien (ikä 15-40 5 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointimenetel-mällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH) Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (suppl 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotet- 10 tiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig (T- ja nolla-solu)-populaatioiksi käyttämällä Sephadex G-200 anti-F(ab')2-pylväs-kromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974) 1113. T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig -populaatio 5%:11a lam-15 paan punasoluja (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clrllä

Q

(10 ml 10 solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2-%:isesti EAC-rosettipositiivinen ja >95-%:isesti E-roset-20 tipositiivinen standardimenetelmillä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig“ (nollasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli <5-%risesti E-positiivinen ja <2-%risesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+ (B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylväästä 25 eluoimalla normaalilla ihmisen gammaglobuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%risesti pinta-Ig-positiivinen ja <5-%:isesti E-positiivinen.

Normaalit ihmisen makrofagit erotettiin yksitumaisesta populaatiosta kiinnittämällä ne polystyreeniin. Tällöin 30 yksitumaiset solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen vil-jelyvällaineeseen (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES [4-(2-hydroksi-etyyli)-1-piperatsiinipropaanisulfonihappojpuskuria, 200 mM L-glutamiinia ja penisilliini-streptomysiiniä sekä 20 % kuumentamalla inaktivoitua ihmisen AB-seerumia) solujen määrän 35 ollessa 2x10^ solua ja niitä inkuboitiin muovisissa pet-rimaljoissa (100 x 20 mm) (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon, Exnard, CA) 37°Crssa yön yli. Petrimaljat pestiin 8 75058 huolellisesti kiinnittymättömien solujen poistamiseksi ja muoviin kiinnittynyt populaatio irrotettiin pesemällä voimakkaasti kylmällä 2,5mM EDTA:ta sisältävällä liuoksella, jossa ei ollut seerumia ja silloin tällöin raapimalla 5 petrimaljaa kertakäyttöisen injektioruiskun kumikärjellä.

Yli 85% solupopulaatiosta pystyi käyttämään ravinnokseen lateksihiukkasia ja Wright-Giemsa-värjäyksellä niillä havaittiin morfologisesta olevan monosyyttien tunnusmerkit.

B. Normaali kateenkorva 10 Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin poti lailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Kateenkorvarauhanen paloiteltiin ja palaset asetettiin heti 199 (Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiöseerumia, 15 ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi solut sentri-fugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat > 95-%:i-20 sesti elinkykyisiä ja * 90-%:isesti E-rosettipositiivisia.

C. Solulinjat

Neljästä terveestä yksilöstä saatuja Epstein-Barr-viruksella (EBV) transformoituja B-solulinjoja (Laz 007,

Laz 156, Laz 256 ja SB) valmistettiin aikaisemmin kuvatulla 25 tavalla·Leukemiapotilaista saadut T-solulinjat CEM, HJD-1, Laz 191 ja HM1, toimitti tohtori H. Lazarus, Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA.

D. T-solujen akuutin lymfoblastileukemian (T-ALL) solut ja T-solujen kroonisen lymfaattisen leukemian (T-CLL) 30 solut

Leukemiasolut saatiin 12:lta akuuttia lymfoblasti-leukemiaa sairastavalta potilaalta. Näiden yksilöiden solujen oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu olevan T-soluja, koska ne muodostivat spontaanisti rosetteja lam- 35 paan punasolujen kanssa (>20% E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten heteroantiseerumien, anti-HTL (anti- B.K.)-ja A99-antiseerumin kanssa, kuten Schlossman et ai. ovat aikaisemmin kuvanneet, Proc. Nat. Acad.

Il 9 75058

Sei. 73 (1976) 1288. Kolmen yksilön kasvainsolut reagoivat aktiivisesti (TH^) kaniinin ja/tai hevosen anti-Tt^sn kanssa, mutta yhdeksän muun yksilön solut eivät näiden kanssa reagoineet. Käytettiin myös kahdesta Ti^-T-CLL-5 leukemiaa sairastavasta potilaasta saatuja leukemiasoluja. Sekä akuutin että kroonisen T-solujen leukemian soluja kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa dimetyylisulfoksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumissa, kunnes ne karakterisoitiin pinnal-10 taan. Analysoidut kasvainpopulaatiot olivat >90-%:isesti blasteja Wright-Giemsa-morfologialtaan kaikissa tapauksissa .

Esimerkki 2

Solufluorografinen analyysi 15 Kaikkien solupopulaatioiden solufluorografinen analyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluoresenssimene-telmällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla anti-hiiri-IgG:llä (G/M FITC)(Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solufluorografia 20 FC200/4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1-2 x 10^ solua käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta OKT3 laimennuksen ollessa 1:1 000, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 25 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kolme kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorografilla, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeus-analysaattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennuk-30 sella 1:100 000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Taustavärjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:11a suhteessa 1:1 000 laimennettua vesi-vatsanestettä, joka oli saatu intraperitoneaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidusta Balb/cJ-35 hiirestä.

10 75058

Kuviossa 1 on esitetty solufluorografista saatu fluoresenssispektri ihmisen normaaleille perifeerisille T-soluille, joiden on annettu reagoida OKT3:n (laimennus 1:1 000) ja G/M FITC:n kanssa.

5 Vertailun vuoksi samoissa olosuhteissa monoklonaa- lisia vasta-aineita OKTl ja OKT4 käyttämällä saadut tulokset on esitetty kuvioissa 1-5.

Kuviossa 2 on esitetty solufluorografista saatu fluo-resenssispektri ihmisen tymosyyteille, joiden on annettu 10 reagoida OKT3:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 3 on esitetty solufluorografista saatu fluo-resenssispektri B-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavista potilaista saaduille leukemiasoluille, joiden on annettu reagoida OKT3:n ja G/M FITC:n kanssa.

15 Kuviossa 4 on esitetty solufluorografista saatu fluo- resenssispektri ihmisen T-solulinjan HJD-1, jonka on annettu reagoida OKT3:n ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 5 on esitetty solufluorografista saatu fluo-resenssispektri ihmisen T-solulinjalle CEM, jonka on annettu 20 reagoida OKT3:n ja G/M FITCrn kanssa.

Kuvioissa 1-5 esitetyt tulokset sekä lisätietoja OKT3:lle (myös OKTl:lie ja OKT4:lle) on koottu taulukkoon I.

Kuten kuviosta 1 ilmenee, normaalin yksilön kaikki perifeeriset T-verisolut reagoivat OKT3:n kanssa, mutta 25 samasta yksiköstä eristetyt B-solut, nollasolut ja makro-fagit eivät reagoi lainkaan OKT3:n kanssa. Samanlaiset tulokset saatiin 15 muusta normaalista yksilöstä eristetylle lymfosyyttipopulaatiolle. Monoklonaaliselle vasta-aineelle on siten tunnusomaista, että se reagoi käytännöllisesti 30 kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen pinnalta löydetyn antigeenin kanssa, mutta se ei reagoi kolmen muun mainitun solutyypin minkään pinta-antigeenin kanssa. Tätä reaktiivisuuseroa voidaan käyttää kyseisen vasta-aineen OKT3 toteamiseen ja erottamaan se muista vasta-35 aineista.

Il 11 75058

Kuviosta 2 ilmenee, että suurin osa kuuden kuukauden ikäisen lapsen normaaleista tymosyyteistä ei reagoi lainkaan OKT3:n kanssa, jolloin vain 5-10 % tymosyyteistä on reaktiivisia. Tästä voidaan tehdä se johtopäätös, että siinä 5 erilaistumisprosessissa, jossa kantasolut kehittyvät kypsiksi T-soluiksi, tymosyytit saavat jossakin vaiheessa saman pinta-antigeenin, joka on löydetty T-soluista ja joka reagoi OKT3:n kanssa. On todennäköistä, että näitä tymosyyttejä esiintyy myöhemmissä erilaistumisvaiheissa juuri ennen kuin 10 ne irtoavat kateenkorvasta verenkiertoon. Samanlaisia tuloksia (5-10 % aktiivisuus) saatiin käytettäessä kuutta muuta kateenkorvanäytettä,jotka oli saatu normaaleista yksilöistä, joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 19 vuoteen. Kuvion 2 reaktiivisuuskaavan avulla on myös mahdollista todeta ky-15 seinen vasta-aine 0KT3 ja erottaa se muista vasta-aineista.

Esillä olevan vasta-aineen avulla voidaan myös määrittää T-solujen osuus kiertävistä lymfosyyteistä. Taulukosta I ilmenee, että 95 % kaikista T-soluista reagoi OKT3-vasta-aineen kanssa. Esillä olevan keksinnön suojapiiriin 20 kuuluu täten menetelmä, jolla määritetään T-solujen osuus kiertävistä lymfosyyteistä sekoittamalla 0KT3-vasta-ainetta lymfosyyttinäytteeseen ja määrittämällä, kuinka suuri osa lymfosyyteistä on OKT3-positiivisia eli T-soluja.

Esillä olevaa vasta-ainetta OKT3 voidaan edelleen 25 karakterisoida sen perusteella, miten se reagoi erilaisten ihmisen T-solulinjojen kanssa, tätä on havainnollistettu kuvioissa 4 ja 5. Kuvioista nähdään, että kyseisen antigeenin reaktiivisuus ihmisen T-solulinjojen kanssa vaihteli, solu-linjan HJD-1 kanssa reaktio oli heikko ja solulinjojen CEM, 30 Laz 191 ja HM1:n kanssa reaktiota ei tapahtunut lainkaan. Tämän erilaisen reaktiivisuuden avulla on myös mahdollista karakterisoida OKT3.

Taulukosta I ilmenee, että ihmisen B-solulinjat Laz 007, Laz 156, Laz 256 ja SB eivät reagoi OKT3:n kanssa. Tä-3 5 rnä tukee edelleen sitä käsitystä, että OKT3 ei reagoi ihmisen perifeerisestä verestä otettujen normaalien B-solujen 12 75058 kanssa, minkä avulla on edelleen mahdollista karakterisoida 0KT3 ja erottaa se muista vasta-aineista.

OKT3:n spesifistä reaktiota ihon T-soluimukudos-kasvaimien antigeenien kanssa on havainnollistettu taulu-5 kossa II, josta myös ilmenee, miten 0KT3 eroaa tässä suhteessa 0KTl:stä ja OKT4:stä. Esillä olevaa vasta-ainetta voidaan täten käyttää reagenssina ihon T-soluimukudos-kasvaimien toteamisessa.

Kyseisen vasta-aineen OKT3 havaittiin kuuluvan 10 IgG2~alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen 15 riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisen sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG, IgG2:a, IgG2b tai IgG^ tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luokkiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät 20 vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-vasta-aineiden kanssa.

Esillä olevan vasta-aineen avulla on mahdollista 25 todeta ihon T-soluimukudoskasvaimia sekoittamalla imu- kudoskasvaimesta otettu T-solunäyte diagnostisesti vaikuttavaan määrään OKT3-vasta-ainetta. Jos tällöin tapahtuu reaktio, potilaalla on ihon T-soluimukudoskasvain. Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluvat lisäksi diagnostiset 30 koostumukset, jotka sisältävät diagnostisesti vaikuttavan määrän OKT3-vasta-ainetta diagnostisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen sekoitettuna.

Il 13 75058

Taulukko I

Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus ja ominaisuudet

Monoklonaaliset vasta-aineet 5 Reaktiivisuus proentteina 0KT1 0KT3 0Icr4 seuraavien solutyyppien kanssa:

Perifeeriset T-solut (10 näytettä) >95% >95% 55%

Perifeeriset B-solut (10 näytettä) <2% <2% <2%

Perifeeriset nollasolut (10 näytettä) <2% <2% <2% 10 Tymosyytit x (8 näytettä) 5-10% 5-10% 80%

Reaktiivisuus seuraavien solujen ja solulinjojen kanssa T-solujen klooninen lymfaattinen leukemia (3 tapausta) + +(1)/-(2) T-solujen akuutti lymfaattinen leukemia 15 (8 tapausta) - -

Nollasolujen akuutti lymfaattinen leukemia (15 tapausta) - - A-solujen krooninen lymfaattinen leukemia (6 tapausta) +(4),--(2) B-solulinjat + (4) “ T-solulinjat+ HJD.l + CEM + _ +

Laz 191 + - - HM1 + - - ^ IgG-alaluokka I'?GX J9G2 IgG2

Komplementin sitcmiskyky “ + + x Saatu potilailta, joiden ikä vaihteli 2 kuukaudesta 18 vuoteen.

+ Saatu tohtori H. Lazarukselta, Sidney, Farber Cancer Center. B-solulinjat Laz 256, 156, 007 ja SB saatu transformoimalla Epstein-Barr-viruksella, 30 ihmisen perifeerisiä B-soluja ja T-solulinjat HJD-1, CEM, Laz 191 ja HM1 saatu leukemiaa sairastavista potilaista.

7505 8 1¾ (O τ tn E-· I + I + C «

<d O

CM :<d (U -n

-PC <U

in in <u -P

3 -Η Ό co -P

3 H -H fn >1 III 3 0 ^ + + + + ΪΡ •Η Id C O in

> C -H O

-H O <d +· Ή rl I g -p λ; <i3 >< M O -P Ή id c tn -h

<U O <d E-< C

os g > « + i + + <u O u 0) > in :<d

O I -H

Ό -H tn >i 3 -p -h e m in -H -H Pi 3 3 in in <d >i

h g γη o O <U M

Μ -H J3 Ο Ο Ή id 3 Μ Λ! -H ip

Ο Ή C >1 >1 PC

Μ O -P ID g g 0) >i

in tn C ·Η -H CL, iH

3 ICO -H TJ Ό

r-H E-< -H O P -Η -H *H

3 <dC id in Ο >i O >, >1 II II

<d c>tr> «Ή cnG σ> g g E-· o in <d N-HCi c i i P3 ild-H 0) p 3 >i 3 >i >1 CQ>1

η ϋ Q cn^CM^: fe r'· M (¾ E

x: ΪΡ ·· :<d

P

<U

•H CL, g 3 •H ,¾

C (U >1 O rH

Ό <U C Id

C Ή rH O

<0 p i c

Id CQ O <H (U

rH CJ Id -Γ-Ι -32^6+1 3 -P O O C Ή

Ο · · Ό O O

(¾ w u O S ΙΛ ii

Claims (3)

15 75058

1. Menetelmä, jolla määritetään yksilöstä T-solu-jen osuus kiertävistä lymfosyyteistä, tunnettu 5 siitä, että sekoitetaan kiertävistä lymfosyyteistä otettuun näytteeseen igG-luokkaan kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridoma, jonka talletus-numero on ATCC CRL 8001 ja joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmi-10 sen normaalien perifeeristen T-solujen ja ihon T-imuku- doskasvainsolujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä mak-rofagien kanssa, b) reagoi 5 - 10%:n kanssa ihmisen normaaleja 15 tymosyyttejä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastLleukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa, nolla-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa eikä B-solujen 20 kroonista lymfaattista leukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi heikosti ihmisen T-solulinjan HJD-1 kanssa, mutta ei reagoi lainkaan T-solulinjojen OEM, Laz 191 eikä HMl kanssa, 25 e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoi tujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa ja f) sitoo komplementin, ja määritetään, kuinka suuri osa kiertävistä lymfosyy-30 teistä reagoi mainitun vasta-aineen kanssa, jolloin reagoivat lymfosyytit ovat T-soluja.

2. Menetelmä, jolla määritetään T-solujen osuus kiertävistä lymfosyyteistä, tunnettu siitä, että sekoitetaan kiertävistä lymfosyyteistä otettuun näyt- 35 teeseen IgG-luokkaan kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainetta, jota tuottaa hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 8001 ja joka on valmistettu yhdistämällä ihmisen T-soluilla immunisoidun hiiren pernasoluja hiiren myelooma- 75058 solulinjaan, ja joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja ihon T-imuku-doskasvainsolujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaa- 5 lien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä makro-fagien kanssa, b) reagoi 5 - 10%:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileuke- 10 miaa sairastavien leukemiasolujen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa, nollasolujen akuuttia lymfoblastileukemiaa eikä B-solujen kroonista lymfaattista leukemiaa sairastavien ihmisten leukemia-solujen kanssa, 15 d) reagoi heikosti ihmisen T-solulinjan HJD-1 kanssa, mutta ei reagoi lainkaan T-solulinjojen CEM, Laz 191 eikä HMl kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 20 eikä SB kanssa ja f) sitoo komplementin, ja määritetään, kuinka suuri osa kiertävistä lymfosyyteistä reagoi mainitun vasta-aineen kanssa, jolloin reagoivat lymfosyytit ovat T-soluja.

3. Menetelmä ihon T-soluimukudoskasvaimien totea miseksi, tunnettu siitä, että sekoitetaan potilaan imukudoskasvaimen T-solunäytettä sellaiseen määrään IgG-luokkaan kuuluvaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka riittää aiheuttamaan reaktion ihon imukudoskasvaimen T- 30 solujen ja mainitun vasta-aineen välille, ja jota vasta-ainetta tuottaa hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 8001 ja joka vasta-aine a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen ja ihon T-imu- 35 kudoskasvainsolujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen eikä mak-rofagien kanssa, I! 17 75058 b) reagoi 5 - 10%:n kanssa ihmisen normaaleja tymosyyttejä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileuke-miaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta 5 ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa, nolla-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa eikä B-solujen kroonista lymfaattista leukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi heikosti ihmisen T-solulinjan HJD-1 10 kanssa, mutta ei reagoi lainkaan T-solulinjojen CEM, Laz 191 eikä HMl kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr-viruksella tranformoi-tujen ihmisen B-solulinjojen Laz 007, Laz 156, Laz 256 eikä SB kanssa ja 15 f) sitoo komplementin. 75058 18