FI75229B - Diagnostiskt foerfarande, vid vilket man anvaender en ny monoklonal antikropp specifik mot maenniskans t-celler. - Google Patents

Description

1 75229

Diagnostinen menetelmä, jossa käytetään uutta monoklonaa-lista ihmisen T-soluille spesifistä vasta-ainetta

Jakamalla erotettu hakemuksesta 800 846 5

Keksinnön kohteena on diagnostinen menetelmä, jonka avulla pystytään erottamaan T-solujen akuuttia lymfoblasti-leukemiaa (T-ALL) sairastavat potilaat T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa (T-CLL) sairastavista potilaista ja 10 jossa käytetään monoklonaalista, ihmisen kaikkien normaalien T-solujen pinnalta löydetylle antigeenile spesifistä vasta-ainetta. Vasta-aine valmistetaan uuden hybridisolulinjän avulla.

Kohler ja Milstein yhdistävät vuonna 1975 hiiren mye-15 loomasoluja immunisoitujen hiirien pernasoluihin (Nature 256 (1975) 495-497), jolloin ensimmäisen kerran havaittiin, että oli mahdollista valmistaa jatkuva solulinja homogeenisen (ns. "monoklonaalisen") vasta-aineen tuottamiseksi. Tämän jälkeen erilaisten hydridisolujen (ns. hybridomien) valmis-20 tamista on yritetty monin tavoin ja näiden hybridomien tuottamaa vasta-ainetta yritetty soveltaa tieteelliseen käyttöön. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81 - "Lymphosyte Hybridomas", toimittajat F. Melchers, M. Potter ja N. Warner, Springer-Verlag 1978 ja 25 julkaisun sisältämät kirjallisuusviitteet; C.J. Barnstable et al., Cell 14 (toukokuuta 1978) 9-20; P. Parham ja W.F. Bodmer, Nature 276 (1978) 397-399; Handbook of Experimental Immunology, 3. painos, volyymi 2, toimittaja D. M. Wier, Blackwell 1978, kappale 25; ja Chemical and Engineering News, 30 tammikuu 1 (1979) 15-17.

Näissä viitteissä on esitetty saavutetut tulokset ja esiintyneet vaikeudet yritettäessä valmistaa hybridomeista monoklonaalista vasta-ainetta. Vaikka valmistusmenetelmä periaatteessa tunnetaan hyvin, vaikeuksia esiintyy paljon ja 35 jokainen tapaus on erilainen. Ei voida etukäteen taata, että yritettäessä valmistaa haluttua hybridomaa siinä onnistutaan 75229 ja että tässä onnistuttaessa hybridoma tuottaa vasta-ainetta tai että näin muodostuneella vasta-aineella on haluttu spesifisyys. Onnistuminen riippuu pääasiassa käytetystä antigee-nilajista ja halutun hybridoman eristämisessä käytetystä 5 selektiotekniikasta.

Monoklonaalista ihmisen lymfosyyttien pinta-antigeeneille spesifistä vasta-ainetta on yritetty valmistaa vain harvoissa tapauksissa. Katso esimerkiksi: Current Topics in Microbiology and Immunology, volyymi 81, 66-69 ja 164-169.

10 Näissä kokeissa käytetyt antigeenit olivat viljeltyjä ihmisen lymfoblastoidileukemiasolulinjoja ja kroonisen lymfo-syyttileukemian solulinjoja. Monet näin valmistetut hydri-domat tuottivat vasta-ainetta, joka vaikutti kaikkien ihmisen solujen erilaisiin pinta-antigeeneihin. Mikään näistä 15 hybridomeista ei tuottanut tietylle ihmisen lymfosyyttila-jille spesifistä vasta-ainetta.

Ihmisen ja eläinten elimistön immunologisiin toimintoihin osallistuu kaksi lymfosyyttien pääryhmää. Näistä toinen (kateenkorvasta peräisin oleva solu eli T-solu) erilais-20 tuu kateenkorvassa hemopoieettisista kantasoluista. Kateen-korvassa olevia erilaistuvia soluja nimitetään "tymosyyteik-si". Kypsät T-solut irtoavat kateenkorvasta ja joutuvat sen jälkeen verenkiertoon, kudoksiin ja imukudokseen. Nämä T-solut muodostavat suuren osan elimistössä kiertävistä pienistä 25 lymfosyyteistä. Ne ovat Immunolgisesti spesifisä ja osallistuvat efektorisoluina suoraan solujen välityksellä tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (esimerkiksi elinsiirtojen yhteydessä esiintyvä hylkiminen). Vaikka T-solut eivät eritä vasta-ainetta elimistön nesteisiin, toinen myöhemmin käsi-30 teltävä lymfosyyttiryhmä tarvitsee eräissä tapauksissa T-solu ja pystyäkseen itse erittämään vasta-aineita. Eräät T-so-lulajit toimivat toisissa immuunijärjestelmän toiminnoissa säätelevästi. Tämän solujen yhteistoimintamuodon mekanismia ei vielä täysin tunneta.

35 Toiseen lymfosyyttiryhmään (luuytimestä peräisin ole viin soluihin eli B-soluihin) kuuluvat ne, jotka erittävät 3 75229 vasta-aineita. Ne kehittyvät myös hemopoieettisista kanta-soluista, mutta kateenkorva ei säätele niiden erilaistumista. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvalle analogisessa elimessä, joka on nimeltään "Bursa of Fabricius". Imettä-5 väisistä ei kuitenkaan ole löydetty vastaavaa elintä, ja täten B-solujen arvellaan erilaistuvan luuytimessä.

T-solut jakaantuvat ainakin kolmeen alalajiin, joita nimitetään "auttaja-", "heikentäjä-" ja "tappaja"-T-soluk-si, nämä joko nopeuttavat tai hidastavat reaktiota tai tap-10 pavat (liuottavat) vieraita soluja. Nämä alaluokat ovat hyvin tunnettuja hiirien elimistössä, mutta vasta äskettäin niiden toimintaa on kuvattu ihmiselimistössä. Katso esimerkiksi: R.L. Evans et ai. Journal of Experimental Medicine 145 (1977) 221-232, ja L. Chess ja S.F. Schloss-15 man - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dirrefentiation Antigens", teoksessa "Contemporary Topice in Immunobiology", toimittaja 0. Stutman, Plenum Press 1977, volyymi 7, 363-379.

Eri T-solulajien tai alalajien identifiointi tai 20 niiden heikentäminen on tärkeää erilaisten immunoregula-tooristen häiriöiden diagnoosissa ja hoidossa.

Esimerkiksi tiettyjen leukemia- ja imukudoskasvain-muotojen prognoosi on erilainen sen mukaan, ovatko ne lähtöisin B- tai T-soluista. Täten taudin prognoosia arvioi-25 taessa on tärkeää, että nämä kaksi lymfosyyttiryhmää täytyy pystyä erottamaan toisistaan. Katso esimerkiksi: A.C. Aisenberg ja J.C. Long, The American Journal of Medicine 58 (1975) 300; D. Belpomme et ai., teoksessa "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lym-homas", toimittajat S.

30 Thiefelder et al., Springer, Heidelberg 1977, 33-45; ja D. Belpomme et al., British Journal of Haematology 38 (1978) 85. Tietyissä tautitiloissa (esim. nuorten nivelreumassa ja tietyissä leukemiamuodoissa) T-solujen alaryhmät ovat joutuneet epätasapainoon. On ehdotettu, että autoimmuuni-35 sissa sairauksissa yleensä "auttaja"-T-soluja esiintyy ylimäärin ja tietyistä "heikentäjä"-T-soluista on puutetta, 4 75229 kun taas pahanlaatuisissa tautitiloissa yleensä "heikentä-jä"-T-soluja esiintyy ylimäärin. Tietyissä luekemiamuo-doissa pysähtyneessä kehitysvaiheessa olevia T-soluja muodostuu ylimäärin. Diagnoosin onnistuminen voi täten riip-5 pua siitä, pystytäänkö tämä epätasapaino tai ylimäärä havaitsemaan. Katso esimerkiksi: J. Kersey et ai., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses", teoksessa "Haematology and Blood Transfusion", volyymi, 20, Springer-Verlag 1977, 17-24, ja julkaisun si-10 sältämät viitteet.

On havaittu viitteitä siitä, että annettaessa ylimäärin esiintyvällä T-solujen alaryhmälle spesifisiä vasta-aineita autoimmuunisia tai pahanlaatuisia sairauksia poteville potilaille nämä vaikuttvat sairauden kehitykseen 15 edullisesti. Antiseerumit, jotka vaikuttavat ihmisen kaikkiin T-soluihin (ns. ihmisen vastainen tymosyyttiglobulii-ni eli ATG), ovat osoittautuneet terapeuttisesti käyttökelpoiseksi hoidettaessa potilaita, joille on suoritettu elintensiirtoja. Koska T-solut vaikuttavat solujen välityksellä 20 tapahtuviin immunologisiin reaktioihin (siirrettyjen elinten hylkimismekanismi), T-soluille spesifisen vasta-aineen saaminen estää tai hidastaa tätä hylkimisprosessia. Katso esimerkiksi: Cosimi et ai., "Randomized Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal Allgraft Recipients: "Importance of 25 T Cell Monitoring" Surgery 40 (1976) 155-163, ja julkaisun sisältämät viitteet.

Ihmisen T-solulajien ja -alalajien identifiointiin ja heikentämiseen on tähän asti käytetty spontaajea autovasta-aineita tai ihmisen T-soluille selektiivisiä anti-30 seerumeja, jotka on valmistettu immunoimalla eläimiä ihmisen T-soluilla, poistamalla eläimistä veri seerumin saamiseksi ja adsorboimalla antiseerumi esimerkiksi autologisil-la ei-allogeenisilla B-soluilla vasta-aineiden poistamiseksi, joilla on ei-toivottu reaktiivisuus. Näiden antiseerumien 35 valmistus on erittäin vaikeaa erikoisesti adsorptio- ja puhdistusvaiheissa. Adsorboidut ja puhdistetut antiseerumit- 75229 kin sisältävät halutun vasta-aineen lisäksi useista syistä monia epäpuhtauksia. Eräs syy on se, että seerumi sisältää miljoonia vasta-ainemolekyylejä jo ennen immunointia T-so-luilla. Toiseksi immunointi aiheuttaa vasta-aineiden muo-5 dostumisen, jotka vaikuttavat useisiin antigeenilajeihin, joita on löydetty kaikista injektoiduista ihmisen T-soluis-ta. Ei pystytä selektiivisesti tuottamaan tietylle antigeenille spesifistä vasta-ainetta. Kolmanneksi näillä menetelmillä valmistetun spesifisen vasta-aineen tiitteri 10 on tavallisesti melko alhainen (esim. laimennusten ollessa suurempia kuin 1:100 vasta-aine on inaktiivinen) ja spesifisen ja ei-spesifisen vasta-aineen suhde on pienempi kuin 1/106.

Katso esimerkiksi Chessin ja Schlossmanin edellä mai-15 nittua artikkelia (sivulta 365 eteenpäin) sekä edellä mainittua artikkelia "the Chemical and Engineering News"-lehdessä, näissä on kuvattu tähän asti käytettyjen antiseerumien puutteellisuuksia ja monoklonaalisen vasta-aineen etuja.

20 Nyt on keksitty uusi hybridoma, joka pystyy tuotta maan uuden monoklonaalisen vasta-aineen, joka on spesifinen käytännöllisesti katsoen kaikista ihmisen normaaleista perifeerisistä T-soluista löydetylle pinta-antigeenille. Näin muodostunut vasta-aine on monospesifinen yhdelle 25 ainoalle ihmisen normaalien T-solujen pinta-antigeenideter-minantille, eikä se sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan muita ihmisen vastaisia immunoglobuliineja, päin vastoin kuin tähän asti tunnetut antiseerumit (jotka sisältävät luonnostaan epäpuhtauksina vasta-aineita, jotka rea-30 goivat hyvin monien ihmisen antigeenien kanssa) ja tähän asti tunnetut monoklonaaliset vasta-aineet (jotka eivät ole monospesifisiä yhdelle ainoalle ihmisen T-solun antigeenille) . Lisäksi tätä hybridomaa voidaan viljellä vasta-aineen tuottamiseksi, jolloin eläinten käyttö vasta-aineen tuotta-35 miseen ei ole välttämätöntä eikä myöskään tarvita monimutkaisia adsorptio- ja puhdistusvaiheita, jotka tähänastisis- 75229 sa epäpuhtaidenkin antiseerumien valmistusmenetelmissä ovat olleet välttämättömiä.

Esillä olevasta hybridomasta on talletettu näyte ATCC-talletuslaitokseen, 12301 Parklawn Drive, Rockville, 5 MD, 20852, maaliskuun 13 päivänä vuonna 1979 ATCC-talletus-numerolla CRL 8000.

Hybridoman ja sen tuottaman vasta-aineen valmistus, on kuvattu FI-patenttihakemuksessa 800 846.

Keksinnön mukaiselle diagnostiselle menetelmälle, 10 jossa edellä mainittua hybridomaa ja vasta-ainetta käytetään on tunnusomaista, että sekoitetaan jompaa kumpaa tautia sairastavan potilaan leukemiasoluja monoklonaaliseen vasta-aineeseen, jota tuottaa hybridoma, jonka talletus-numero on ATCC CRL 8000, ja tarkkaillaan tapahtuuko reak-15 tiota, jolloin käytetylle monoklonaaliselle vasta-aineelle on tunnusomaista, että se a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta ei reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nollasolujen 20 eikä makrofagien kanssa, b) reagoi 5-10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymo-syyttejä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta ei 25 reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi kuviossa 4 esitetyllä tavalla ihmisen T-solulinjojen HJD-1, CEM ja HSB-2 kanssa, e) ei reagoi Epstein-Barr -viruksella transformoi-30 tujen ihmisen B-solulinjojen kanssa.

Esimerkki 1 OKTl-vasta-aineen reaktiivisuuden karakterisointi A. Lymfosyyttipopulaatioiden eristäminen

Normaalien vapaaehtoisten verenluovottajien (ikä 15-35 40 vuotta) verestä erotettiin perifeeriset yksitumaiset verisolut Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugointime- 75229 netelmällä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH)

Boyumin esittämällä tavalla, Scand. J. Glin. Lab. Invest.

21 (suppl. 97) (1968) 77. Fraktioimattomat yksitumaiset solut erotettiin pinta-Ig+ (B)- ja pinta-Ig” (T- ja nolla-5 solu) populaatioiksi käyttämällä Sepahdex G-200 anti-F(ab')2-pylväskromatografiaa menetelmällä, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet Chess et ai., J. Immunol. 113 (1974) 1113. T-solut otettiin talteen E-rosetoimalla Ig”-populaatio 5 %:lla lampaan punasoluja (Microbiological Associates, 10 Bethesda, MD). Rosetoitu seos sentrifugoitiin Ficoll-

Hypaque-sentrifugissa ja talteenotettu E+-pelletti käsiteltiin 0,155-m NH^Clrlla (10 ml 10® solua kohti). Näin saatu T-solupopulaatio oli <2-%:isesti EAC-rosettipositiivinen ja >95-%:isesti E-rosettipositiivinen standardimenetelmil-15 lä määritettynä. Lisäksi rosetteja muodostamaton Ig” (nol-lasolu)-populaatio erotettiin Ficoll-rajapinnalta. Tämä jälkimmäinen populaatio oli >5-%:isesti E-positiivinen ja 12-%risesti slg-positiivinen. Pinta-Ig+(B)-populaatio erotettiin Sephadex-G-200-pylvästä eluoimalla ihmisen gamma-20 globuliinilla, kuten aikaisemmin on kuvattu. Tämä populaatio oli >95-%risesti pinta-Ig-positiivinen ja <5-%risesti E-positiivinen.

Normaalit ihmisen makrofagit erotettiin yksitumaisesta populaatiosta kiinnittämällä ne polystyreeniin. Tällöin 25 yksitumaiset solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen viljelyväliaineeseen (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES /.4-(2-hydr-oksietyyli)-l-piperatsiinipropaanisulfonihappo7 puskuria, 200 mM L-glutamiinia ja penisilliini-streptomysiiniä sekä 20 % kuumentamalla inaktivoitua ihmisen AB-seerumia) solu-30 jen määrän ollessa 2 x 10® solua, ja niitä inkuboitiin muovisissa petrimaljoissa (100 x 200 mm) (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon, Exnard, CA) 37°Crssa yön yli. Petrimal-jat pestiin huolellisesti kiinnittymättömien solujen poistamiseksi, ja muoviin kiinnittynyt populaatio irrotettiin 35 pesemällä voimakkaasti kylmällä 2,5 mM EDTArta sisältävällä liuoksella, jossa ei ollut seerumia, ja silloin tällöin 8 75229 raapimalla petrimaljaa kertakäyttöisen injektioruiskun kumikärjellä. Yli 85 % solupopulaatiosta pystyi käyttämään ravinnokseen lateksihiukkasia, ja Wrigt-Giemsa-värjäyksel-lä niillä havaittiin morfologisesti olevan monosyyttien 5 tunnusmerkit.

B. Normaali kateenkorva

Normaali ihmisen kateenkorvarauhanen saatiin potilailta, joille oli tehty korjaavia sydänleikkauksia ja joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 14 vuoteen. Ka-10 teenkorvarauhanen paloiteltiin, ja palaset asetettiin heti 199 (Gibco)-väliaineeseen, jossa oli 5 % vasikan sikiösee-rumia, ne hienonnettiin huolellisesti pihdeillä ja saksilla, ja sen jälkeen muodostettiin yhtä solulajia sisältävä suspensio puristamalla seos terässeulan läpi. Seuraavaksi 15 solut sentrifugoitiin Ficoll-Hypaque-sentrifugissa ja pestiin kohdassa A kuvatulla tavalla. Näin saadut tymosyytit olivat >95-%:isesti elinkykyisiä ja i90-%risesti E-rosetti-positiivisia.

C. Solulinjat 20 Neljästä terveestä yksilöstä saatuja Epstein-Barr- viruksella (EBV) transformoituja B-solulinjoja valmistettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla. T-solulinjat CEM, HSB-2 ja HJD-1 toimitti tohtori H. Lazarus, Sideny Farber Cancer Institute, Boston, MA.

25 D. T-solujen akuutin lymfoblastileukemian (T-ALL) so lut ja T-solujen kroonisen lymfaattisen leukemian (T-CLL) solut

Leukemiasolut saatiin kahdeltatoista akuuttia lymfo-blastileukemiaa sairastavalta potilaalta. Näiden yksilöi-30 den solujen oli aikaisempien kokeiden perusteella todettu kuuluvan T-soluihin, koska solut muodostivat spontaanisti rosetteja lampaan punasolujen kanssa (>20 % E+) ja koska ne reagoivat T-soluille spesifisten heteroantiseerumien, anti-HTL (anti-B.K.)- ja A99-antiseerumin kanssa, kuten 35 Schlossman et ai. ovat aikaisemmin kuvanneet, Proc. Nat.

Acad. Sei. 73 (1976) 1288. Kolmen yksilön kasvainsolut rea- 75229 goivat aktiivisesti (TH2+) kaniinin ja/tai hevosen anti-TH2:n kanssa, mutta yhdeksän kuun yksilön solut eivät näiden kanssa reagoineet. Käytettiin myös leukemiasoluja, jotka oli saatu kahdelta TH2_-T-CLL-leukemiaa sairastavalta 5 potilaalta. Sekä akuutin että kroonisen T-solujen leukemian soluja kylmäsäilytettiin -196°C:ssa nestemäisen typen höyryfaasissa 10-%:isessa dimetyylisulfoksidissa ja 20-%:isessa ihmisen AB-seerumissa, kunnes ne karakterisoitiin pinnaltaan. Analysoidut kasvainpopulaatiot olivat 10 >90-%:isesti blasteja Wright-Giemsa-morfologialtaan kaikissa tapauksissa.

Esimerkki 2

Solufluorograafinen analyysi ja solujen erotus

Kaikkien solupopulaatioiden solufluorograafinen ana-15 lyysi suoritettiin epäsuoralla immunofluororesenssimenetel-mällä, jossa solut värjättiin fluoresiiniin liitetyllä vuohessa valmistetulla antihiiri-IgG:llä /G/M FITC) (Meloy Laboratories), analyysiin käytettiin solufluorograafia FC200/4800A (Ortho Instruments). Tällöin 1-2 x 10^ solua 20 käsiteltiin 0,15 ml:11a vasta-ainetta 0KT1 laimennuksen ollessa 1:1000, soluja inkuboitiin 4°C:ssa 30 minuutin ajan ja pestiin kahdesti. Solujen annettiin sen jälkeen reagoida 0,15 ml:n kanssa G/M FITC (laimennus 1:40) 4°C:ssa 30 minuutin ajan, reaktiotuote sentrifugoitiin ja pestiin kol-25 mer kertaa. Nämä solut analysoitiin sen jälkeen solufluorograaf illa, jossa kunkin solun aiheuttama fluoresenssi-intensiteetti rekisteröitiin pulssinkorkeusanalysaattorilla. Reaktiivisuus oli samanlainen laimennukselle 1:30000, mutta suuremmilla laimennuksilla reaktiota ei tapahtunut. Tausta-30 värjäyksen intensiteetti määritettiin 0,15 ml:11a suhteessa 1:1000 laimennettua vesivatsanestettä, joka oli saatu intra-peritoneaalisesti ei-tuottavalla hybridikloonilla immunisoidusta BAlb/cJ-hiirestä.

Kokeissa, joiden tarkoituksena oli erottaa 0KT1+- ja 35 OKTl~-solut toisistaan, 100 x 10^ fraktioimatontayksitumaista solua tai tymosyyttia merkittiin 4 ml:11a suhteessa 10 75229 1:1000 laimennettua vasta-ainetta OKTl ja kehitettiin G/M FITC:llä. Samanlaista värjäysmenetelmää käytettiin ihmisen T-solujen preparoinnissa, jotka oli eristetty esimerkissä IA kuvatulla tavalla. Käyttämällä fluoresenssiaktivointiin 5 perustuvaa solulajittelijaa (FACS-1) (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) lymfosyytit jaettiin 0KT1+- ja OKTl”-populaatioiksi ja/tai T-solut fraktioitiin heikosti reagoiviksi OKTl+-T-soluiksi (fluoresenssi alle 20 %) ja voimakkaasti reaktiivisiksi OKTl+-soluiksi (fluoresenssi yli 10 20 %). Lajien elinkykyisyys oli >95 % Trypan-sinisellä mää ritettynä kaikissa tapauksissa. Kaikkien erotettujen populaatioiden puhtausaste oli 2.95 %.

Esimerkki 3

Solujen toiminnan tutkiminen 15 Fraktioimattomien ja FACS:illa fraktioitujen lymfaso- lujen mitogeenista vastetta tutkittiin mikroviljelmässä optimaalisilla annoksilla Concanavalin A:ta (Con A) (Cal-biochem, La Jolla, CA) ja fythemaqlutiinia (PHA) Chessin et ai. kuvaamalla menetelmällä. Alloantigeeninen proli-20 feratiivinen vaste määritettiin samanaikaisesti näille samoille populaatioille käyttäen stimulanttina mitomysiinil-lä käsiteltyä Laz 156:a, EBV:llä transformoitua ihmisen B-lymfoblastodisolulinjaa, jonka oli toimittanut tohtori H. Lazarus. Proliferaatio tetanus-toksoidin läsnäollessa 25 (Massachusetts Department of Public Healt Biological Laboratories, Boston, MA) testattiin Evansin et ai. kuvaamalla menetelmällä (J. Immunol. 129 (1978) 1423) käyttämällä loppukonsentraatiota 10 /um/ml. 5 % edellä kuvatulla menetelmällä saatuja makrofageja lisättiin kaikkiin polylaa-30 tioihin aloitettaessa kasvattaa in vitro-viljelmiä. Mito-geenilla stimuloituja viljelmiä käsiteltiin neljän päivän kuluttua 0,2 ^iCi:11a tritioitua tymidiiniä (ominaisaktii-visuus 1,9 Ci/mM, Schwartz-Mann Division of Becton-Dickinson, Orangeburg, NY), ja tuotteet erotettiin 18 tunnin ku-35 luttua MASH II-laitteistolla (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Tritioidun tymidiiniyhdisteen aktiivisuus U 75229 mitattiin Packard-tuikelaskurilla (Packard Instrument Company, Downer'a Grove, IL). Taustan tritioidun tymidiini-yhditeen aktiivisuus mitattiin korvaamalla mitogeeni väliaineella. Tetanus-toksoidilla ja alloantigeenilla stimu-5 loidut viljelmät käsiteltiin viiden päivän kuluttua tri-tioidulla tymidiinillä 18 tunnin ajan, tuotteet erotettiin, ja aktiivuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla.

Kuviossa 1 on esitetty solufluorograafista saatu fluo-resenssispektri solupopulaatioille, joiden on annettu rea-10 goida OKTlrn (laimennus 1:1000) ja G/M FITCrn kanssa.

Kuviossa 2 on esitetty solufluorograafista saatu fluorensenssispektri ihmisen tymosyyteille, joiden on annettu reagoida OKTlrn ja G/M FITC:n kanssa.

Kuviossa 3 on esitetty solufluorograafista saatu fluo-15 resenssispektri sekä akuuttia lymfoblastileukemiaa että kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavista potilaista saaduille leukemiasoluille, joiden on annettu reagoida OKTl:n ja G/M FITCrn kanssa.

Kuviossa 4 on esitetty solufluorograafista saatu fluo-20 resenssispektri ihmisen T-solulinjoille, joiden on annettu reagoida OKTlrn ja G/M FITCrn kanssa.

Kuviossa 5 on esitetty solufluorograafista saatu fluoresenssispektri B-lymfoblastoidiosolulinjalle Laz 007, jonka on annettu reagoida OKTlrn ja G/M FITCrn kanssa.

25 Kuten kuviosta 1 ilmenee, normaalin ihmisen kaikki perifeeriset T-verisolut reagoivat OKTlrn kanssa, mutta samasta yksilöstä eristetyt B-solut, nollasolut ja makro-fagit eivät reagoi lainkaan OKTlrn kanssa. Samanlaiset tulokset saatiin viidestätoista muusta normaalista yksilöstä 30 eristetyille lymfosyytitpopulaatioille. Monoklonaaliselle vasta-aineelle on siten tunnusomaista, että se reagoi käytännöllisesti kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen pinnalta löydetyn antigeenin kanssa, mutta se ei reagoi kolmen muun mainitun solutyypin minkään pinta-anti-35 geenin kanssa. Tätä reaktiivisuuseroa voidaan käyttää kyseisen vasta-aineen OKT1 toteamiseen ja erottamaan se muista vasta-aineista.

75229 12

Kuviosta 2 ilmenee, että suurin osa kuuden kuukauden ikäisen lapsen normaaleista tymosyyteistä ei reagoi lainkaan OKTl:n kanssa, jolloin vain 5-10 % tymosyyteistä on reaktiivisia. Tästä voidaan vetää se johtopäätös, että 5 siniä erilaistumisprosessissa, jossa kantasolut kehittyvät kypsiksi T-soluiksi, tymosyytit saavat jossakin vaiheessa saman pinta-antigeenin, joka on löydetty T-soluista ja joka reagoi OKTl:n kanssa. On todennäköistä, että siinä tymo-syyttejä esiintyy myöhemmissä erilaistumisvaiheissa juuri 10 ennen kuin ne irtoavat kateenkorvasta verenkiertoon. Samanlaisia tuloksia (5-10 % aktiivisuus) saatiin käytettäessä kuutta muuta kateenkorvanäytettä, jotka oli saatu normaaleista yksilöistä, joiden ikä vaihteli kahdesta kuukaudesta 19 vuoteen. Kuvion 2 reaktiivisuuskaavan avulla on myös 15 mahdollista todeta kyseinen vasta-aine 0KT1 ja erottaa se muista vasta-aineista.

Esillä oelvan vasta-aineen käyttöä diagnostisiin tarkoituksiin on havainnollistettu kuviossa 3, josta ilmenee, että akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden 20 leukemiasaolut eivät reagoineet OKTl:n kanssa, mutta kroonista lymfoblastileukemiaa sairastavien potilaiden leuke-miasolut reagoivat. Kyseisen vasta-aineen avulla on siten mahdollista erottaa nämä kaksi leukemiamuotoa toisistaan. Koska näitä leukemiamuotoja on tietyissä vaiheissa vaikeaa 25 erottaa toisistaan ja koska niiden prognoosi ja hoitomenetelmät eroavat olennaisesti, on selvää, että tämä yksinkertainen menetelmä näiden kahden leukemiamuodon erottamiseksi esillä olevaa vasta-ainetta käyttäen on merkittävä edistysaskel.

30 Esillä olevaa vasta-ainetta 0KT1 voidaan edelleen

karakterisoida sen perusteella, miten se reagoi erilaisten ihmisten T-solulinjojen kanssa, tätä on havainnollistettu kuviossa 4. Kuviosta nähdään, että kyseisen antigeenin reaktiivisuus ihmisen T-solulinjojen kanssa vaihteli, solu-35 linjan HJD-1 kanssa reaktio oli voimakas, solulinjan CEM

kanssa lievä ja solulinjan HSB-2 kanssa reaktiota ei tapah- 13 75229 tunut lainkaan. Tämän erilaisen reaktiivisuuden avulla on myös mahdollista karakterisoida 0KT1.

Kuviosta 5 nähdään, että 0KT1 ei reagoi ihmisen B-so-lulinjan Laz 007 kanssa. Samalla tavalla käyttäytyivät myös 5 muut tutkitut EBVrllä transformoidut B-solulinjat. Tämä tukee edelleen sitä käsitystä, että OKTl ei reagoi normaalin yksikön perifeerisen veren B-solujen kanssa, ja myös tällä tavalla on mahdollista karakterisoida OKTl ja erottaa se muista vasta-aineista.

10 Kyseisen vasta-aineen toimintaa tutkittiin lymfodipo- pulaatioilla, jotka oli fraktioitu fluoresenssimittaukseen perustuvalla solujen lajitteilijalla (FACS). Tulokset on esitetty taulukossa I-III, jotka tukevat edelleen edellä esitettyjä esillä olevan monoklonaalisen vasta-aineen karak-15 terisointituloksia.

Taulukosta 1 ilmenee, että käytännöllisesti katsoen kaikki sekalymfosyyttiviljelmän (MLC) solut, jotka reagoivat PHA:n, Con A:n, liukoisten antigeenien ja alloantigee-nien kanssa, kuuluvat solupopulaatioon, joka reagoi OKTl:n 20 kanssa. Populaatio, joka ei reagoinut 0KTl:n kanssa, ei saanut aikaan mitään näistä T-solujen toiminnoista, vähäinen positiivinen reaktio aiheutti mahdollisesti siitä, että populaatio sisälsi epäpuhtauksina OKTl+-soluja. Nämä toimintaa koskevat tutkimukset havainnollistavat edelleen si-25 tä, että 0KTl:n kanssa reagoiva antigeeni esiintyy ainoastaan T-soluissa, koska positiivisesti reagoiva populaatio toimii T-solujen tavoin, mutta negatiivisesti reagoivasta populaatiosta ei ole löydetty mitään T-solujen toimintoja. Taulukosta II nähdään, että mitogeenin tai alloantigeenin 30 läsnäollessa FACS:illa fraktioitujen OKTltn kanssa voimakkaasti reagoivien ja OKTl:n kanssa heikosti reagoivien T-solujen välillä ei ole mitään toiminnallista eroa. Molemmat populaatiot lisääntyivät samalla tavalla kuin fraktioimaton T-solupopulaatio. Taulukosta III voidaan päätellä, että 35 OKTl:n kanssa reagoiva pinta-antigeeni esiintyy ainoastaan täysin kehittyneissä tymcsyyteissä, koska koko tymosyytti- 75229 14 sarjan aktiivisuus MLC-analyysissä aiheutuu lähes täysin siitä tymosyyttipopulaation osasta, joka reagoi OKTl:n kanssa. Taulukosta III nähdään myös OKTl+-lymfosyyttien ja perifeeristen OKTl+-T-solujen väliset toiminnalliset erot, 5 koska edellinen ei reagoi mitogeenin läsnäollessa.

Kyseisen vasta-aineen 0KT1 havaittiin kuuluvan IgG^-alaluokkaan, joka on yksi hiiren IgG:n neljästä alaluokasta. Nämä immunoglobuliini G:n alaluokat eroavat toisistaan ns. "kiinteiltä" alueiltaan, vaikkakin tietylle antigeenille) le spesifisen vasta-aineen rakenteessa on ns. "vaihtuva" alue, joka on toiminnallisesti samanlainen riippumatta siitä, mihin immunoglobuliini G:n alaluokkaan se kuuluu. Toisin sanoen monoklonaalinen vasta-aine, jolla on edellä kuvatut tunnusmerkit, voi kuulua alaluokkiin IgG-^, IgG2a, 15 IgG2b tai IgG3 tai luokkiin IgM tai IgA tai muihin Ig-luok-kiin. Näiden luokkien tai alaluokkien erot eivät vaikuta vasta-aineen reaktiivisuuden selektiivisyyteen, mutta ne voivat vaikuttaa siihen, miten vasta-aine reagoi myöhemmin muiden aineiden, esimerkiksi komplementin tai anti-hiiri-20 vasta-aineiden kanssa.

15 oc^nvoco 75229 oo vo ro ro o i c. £. s

o oo ο 'Τ I—I

I >-( r—I

rH

G H +1+1 +1 +1 +1 Ή « •H O CO IA Is to m in cn cn m -P Ή- O r-H r-t r~

P

Φ σ oo oo (N

> q co ro vo ro ΓΙΟ oo -rj· vo vo oo C O O VO LT)

G

•H + VO rH CN

·§ Eh +I+I+I+I+I

0 «

p o Γ~ f- LT) Tr CO

ld r~ n co co C LT) oo CN i—i vn Φ -h ro σ oo o -P ΓΟ CN vf ΓΟ -p i—i r—i

i“H

>1 tn 0 MH +1 >i

g Φ -P

>i ins-POi-Hvovom rH •Η'Ν.φΟΗΐηίΝνΟ I ta vo -p vo ro O tn

I 6 -H

r-H 3+OlrorOrHrH

EH +1 :<0 « -H H Λί +1 +1 +1 +1 +1 ho tn Eh ,Μ«:φσνθιΗΐθΓΝ O <0 >iOH CN (N N* in ro Λί -ΓΗ 'r· r-H <N CO H r-~ r~ Λί -rl ·· q I Λί-Pr^r^vovooo

rH + λ: G u ro ro ro (N

q rH -Hi—I Eh i—I i—( rrt eh to O h

Eh « « tn Cu o G +> φ φ vo σο in cn vo

-P 0) m in rH ro rH

o: -h m vo ro η •H (0 p 6 H CN CN Ν'

Φ G

φ -p +1+1 +1 +1 +1

4n -H

•H tn CN H 00 H CN

p Λί ro o tn cn oo Φ >ι o o σ oo h- a -H VO CN CN in q Λί -P n- ro cn cn

φ Λί G rH rH

-ro -H iH

G Φ o -p «tn

•H I

O 3

•H «H

4J *H -H

^1 T3 Cd aj 0 -h +>

p -H OP

4h -P -h tn φ <a -P λ; >

HJ to -P O

H P G +> Φ rH φ co tn q φ -H H rH G -H q ·. -H G < G (0 φ cn H g ttj -H φ υ o-h Gi<u-p.-iq < p+j o K PJ Φ ttö -h

Cu A* tn U C+ S Eh > rfl g g 75229 16 I in w ® in

H roomt^· rl H ui (N

0 t— o r-π in ro ro m fO en h in n c/i ro n io cn tu -P un tn oo h g ^ 3 •0 Ή +1+1 +1 +1 +1 +| +| +| 3 λ; -h o h -p en oo r- o rg n oi m m •h e tn i t^intno m to ^ <3 ·· O Eh 'f oo ιο Tf M3 ,—i .—i ro +* rH Ai

P Eh -H -p N* O O Γ' CN

Q) !*5 <D <0 in cp o rH vo n*

r> O *3 ^ rH rH

e

Π3 I

C (0 C Φ io io m m ro to ro ro

•H P +> 1^ rH ΓΟ CN rH CN rO rO

g rtl 3 O r~ ro (N (N ro

•H tn -H rH

O tn-PO to ro m i-· cn oo +» e tn tn Ιΰ (0 I +1 +1 +1 +1 +1 -H +1 +1 C Ai Π3 En Φ Ai in vo in oo h oo oi in

•ΓΟ CMiJ ITI H1 O 00 rH O O CN

3 ·· cO <0 o m ιο ^ to rH o ro rH h g > O Ε-Ι·Γ-)·ιΗ (N Dl oi ro m tn «00 ie h h <P r- m

H I O > tP i—li—I

H Eh

O e I

Ai 0) -P + :ctj

Ai -rl CtJ Ai Γ" 00 i—l tO rH ro CN to 3 > E h tn tt o •'T in to o

rH-Η OE-lttO OrOO O'! rH rH

3 O -M X rH

(0 tr>+>OrH ro LO CN i—| ID (N

EH CtJ CtJ " · rH

φ ε r-r +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

P -rl *· U

0Ph>iiD N in OI rH CO CP CN

•rl •H3H+l^,rHVDtn O CN CP

P PiHhHn^rroro cn oo <p cn tn Ai O Q) O d ui 2 H to to r- in in

Ai P l \ -h uo o o o to ro

Ή (+ E" O M rH rH rH

0) Ä +) HJ et) cp O ro cn ro in to oo

TO £ CP rH tO (N CO rH Γ-- CN

O to on to h to t'' •rl +1

+>+> CP in N· CN CN LO

tn co <0 g +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 3 -rl

Ai 0+ oi in h m ro in to r-~

Ai -H 3 cp to to to oroepin

CtJ +JrH N* O CN ro tO CN O rH

g Ai O

rl n) ui <ptom oo oi oi OPI uOrHCP cd h n

> fe EH rH

tn +j tn , c S tö Cö

•e Cö rH

p 3 Φ Q) _ ,<u ε e e C HH -rl -rl -rl *’ -H +> ^ (0 ^ id rH rH U) -rl -rl

En oo C < U H C<UrH

« p -H -H , O tn PJ :cö O K J-3 :n3 O (+ -p -p 1UCHS> U OH S -> - - 75229 17

CU CU

0 0 « « +>

•H

-p Oro-^rH rHCM^rvo

>1 rH rH 00 m H

>1 I cn +1+1 +i +i +i +i +i +i rH 0

Eng N< VO H U1 m I"· CN O

W>1 Ν’ Γ0 in VO cn vo cn o

O +> CN N* CN

ON CN CN W (N Ί1 CO

00 Γ0 CN r-H

+J OM CN

Ή +i +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 >1 >1 VOCOCNO l— O CN o

+ (Λ U0 CO CN rH (N O 1· CO

I—I O LO Γ"** r—I 1—4

Eh g W >i vo in H o -p

M

H

+ I

Ο -H

λ; rH w

λ: +1 Eh :nJ

3 co χ λ;

ή E O

3 O ^ :co ro CN o o ro o n* cn

CtJ+JrH CN rH rH CN rH rH

Eh 4-) *» rH 00 VO

CO +1 ·· g -H r- +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

•H HJ O

O >1 Eh n· n< vo co r- o r-

Η ϊ>ι M CM m CO H1 Γ- Ν' VO VO

+) tn >1 CN pv λ: o +> (0 g S rH VO Ν’ u >ι\ cu h +> u +> +)

cO

e o M rHOvoin cNooN’m

4-1 O rH r- rH

c0 +) σν r- E -h H HJ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 O >1 -iH>, inootno mvovoo HJ en co oo in Ν’ rH n· vo co X O o oo c0 g

Vh >i r» oo

Ph Eh f

cO

cO I

Vh 3 CD CU

CD E G G

VM -rl -rl -rl -rl H +> +1 <C <t <r cö

.-H W HJ -H ^ -M

p9£ u e < d u e <C ^ vc -rj CO 1-H o K Cp iJ O E ;!° PHHJrH SUOj*5, S U PH ·>

Claims (1)

18 Patenttivaatimus 7 5 2 2 9 Diagnostinen menetelmä, jonka avulla pystytään erottamaan T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa (T-ALL) 5 sairastavat potilaat T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa (T-CLL) sairastavista potilaista, tunnettu siitä, että sekoitetaan jompaa kumpaa tautia sairastavan potilaan leukemiasoluja monoklonaaliseen vasta-aineeseen, jota tuottaa hybridoma, jonka talletusnumero on ATCC CRL 10 8000, ja tarkkaillaan tapahtuuko reaktiota, jolloin käy tetylle monoklonaaliselle vasta-aineelle on tunnusomaista , että se a) reagoi käytännöllisesti katsoen kaikkien ihmisen normaalien perifeeristen T-solujen kanssa, mutta ei 15 reagoi ihmisen normaalien perifeeristen B-solujen, nolla-solujen eikä makrofagien kanssa, b) reagoi 5-10 %:n kanssa ihmisen normaaleja tymo-syyttejä, c) reagoi T-solujen kroonista lymfoblastileukemiaa 20 sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, mutta ei reagoi T-solujen akuuttia lymfoblastileukemiaa sairastavien ihmisten leukemiasolujen kanssa, d) reagoi kuviossa 4 esitetyllä tavalla ihmisen T-solulinjojen HJD-1, CEM ja HSB-2 kanssa, 25 e) ei reagoi Epstein-Barr -viruksella transformoi tujen ihmisen B-solulinjojen kanssa.