NO159887B - Monoklonalt antistoff. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonalt antistoff

til et antigen som finnes i alle normale humane T-celler.

Sammensmelting eller fusjon av myelomceller hos mus til miltceller fra immunisert mus ifølge Kohler og Milstein i 1975 (Nature 256, 495-497 (1975)) demonstrerte for første gang at det var mulig å oppnå en kontinuerlig cellelinje for dannelse av homogent antistoff (såkalt "monoklonalt" antistoff. Etter dette innledende arbeid har man konsen-

trert seg meget om fremstilling av forskjellige hybridceller (betegnet "hybridomer") og bruken av antistoffet fremstilt

ved hjelp av disse hybridomer for forskjellige vitenskapelige undersøkelser. Se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, volum 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter og N. Warner, utgiver Springer-Verlag, 1978, og deri angitte referanser; C. J. Barnstable et al., Cell, 14, 9-20 (mai 1978); P. Parham og W. F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978); Handbook of Experimental Immunology, 3. utgave, volum 2, D. M. Wier, utgiver Blackwell, 1978, kapittel 25; og Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15-17. Disse referanser indikerer samtidig vellykkede resultater og komplika-sjoner i forbindelse med forsøk på å produsere monoklonalt antistoff fra hybridomer. Selv om den generelle teknikk er godt forstått, møter man på mange vanskeligheter og variasjoner som er nødvendig i hvert spesifikke tilfelle. Forut for forsøk på å fremstille et gitt hybridom har man ingen forsikring om at det ønskede hybridom vil bli oppnådd, at det vil produsere antistoff dersom det oppnås, eller at det dannede antistoff vil ha den ønskede spesifisitet. Et heldig utfall avhenger hoved-sakelig av den type antigen som anvendes, og den utvelgelses-teknikk som benyttes for å isolere det ønskede hybridom.

Forsøk på å fremstille monoklonalt antistoff til lymfocyttcelle-overflateantigener hos mennesker har bare i få tilfeller vært rapportert, se f.eks. CurrentTopics inMicrobiology and Immunology, ibid. 66-69 og 164-169.Antigenene som er be-nyttet i disse rapporterte forsøk, var dyrkede humane lymfo- Forsøk på å fremstille monoklonalt antistoff til humane lymfocyttcelle-overflate antigener er bare rapportert i noen få tilfeller. Se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De antigener som ble brukt i de rapporterte eksperimenter var dyrkede humane lymfoblastoid leukemi og humane kroniske lymfocytiske leukemicellelinjer. Mange av de hybridcellelinjer som ble fremstilt syntes å fremstille antistoff til forskjellige antigener på alle humane celler. Ingen av hybridcellelinjene produserte antistoff mot en forutbestemt eller på forhånd definert gruppe av humane lymfocytter.

I den senere tid har man beskrevet fremstilling og prøving av hybridcellelinjer som fremstiller antistoff til visse T-celleantigener. Se f.eks. Reinherz, E.L., et al., J. Immunol. 123. 1312-1317 (1979); Reinherz, E.L., et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 76, 4061-4065 (1979); og Kung, P.C., et al., Science, 206, 347-349 (1979).

Det skal understrekes at det er to prinsipielle grupper av lymfocytter som inngår i immunsystmet hos mennesker og dyr. Den første av disse (thymus-avledede celler eller T-celler) differensieres i thymus fra haemopoietiske stamceller. Mens de er inne I thymus kalles de defferensierende celler vanligvis "thymocytter". De modne T-cellene skilles ut fra thymus og sirkulerer mellom vev, lymfekjertlene og blod-strømmen. Disse T-cellerie utgjør en stor del av de resirku-lerende små lymfocytter. De har immunologisk spesifisitet og er direkte involvert i den celle-styrte immunreaksjon (f.eks. ved avstøtning av transplanterte organer) som effektorceller.

Skjønt T-celler ikke skiller ut humorale antistoffer, så er de enkelte ganger nødvendig for at disse antistoffer skal kunne skilles ut av den andre gruppe av lymfocytter som er beskrevet i det etterfølgende. Noen typer T-celler spiller en regulerende rolle når det gjelder andre deler av immun- systemet. Mekanismene når det gjelder dette celle-samarbeidet er Ikke helt ut forstått.

Den andre gruppen av lymfocytter (benmarg-avledede celler eller B-celler) er de som skiller ut antistoff. De utvikles også fra haemopoietiske stamceller, men deres differensiering er ikke bestemt av thymus. Hos fugler blir de differensiert i et organ som er analogt med thymus og som kalles Fabricius Bursa. Hos pattedyr har man imidlertid ikke oppdaget noe tilsvarende organ og man antar at B-cellene differesieres inne i benmargen.

Det er nå anerkjent at T-cellene kan inndeles i flere undergrupper eller undertyper ofte kalt "hjelper"-, "suppressor"- ("undertrykker"-) og "dreper"-T-celler som henholdsvis virker slik at de fremmer en reaksjon, undér-trykker en reaksjon eller dreper (eller oppløser) fremmede celler. Disse undergrupper er godt forstått hos mus, men de er bare nylig blitt beskrevet hos mennesket. Se f.eks. Evan, et al., Journal of Experimental Medicine, vol. 145, 221-232, 1977; og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-cell Subsets Bearing Unique Dlfferen-tiation Antigens", i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, utg., Plenum Press, 1977, vol. 7, 363-379.

Evnen til å kunne identifisere eller å undertrykke grupper og undergrupper av T-celler er viktig for diagnose av forskjellige immunreglerte lidelser eller tilstander.

Visse typer leukemi og lymfekreft har f.eks. forskjellig prognose avhengig av hvorvidt de er av T-celle eller B-celle opprinnelse. Bedømmelsen av sykdomsprognosen er således avhengig av evnen til å kunne skille mellom disse to gruppene av lymfocytter. Se f.eks. A.C. Aisenberg og J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (mars 1975); D. Belpomme, et al., i "Immunological DIagnosis of Leukemias and Lymphomas", S.Thlerfelder, et al., utg., Springer,

Heidelberg, 1977, 33-45; og D. Belpomme, et al., British Journal of Haematology, 1978, 38, 85

Visse sykdomstilstander (f.eks. ungdommelig reumatisk artritis, ondartede svulster og agammmaglobulinemi) er forbundet med en ubalanse mellom undergruppene av T-celler. Det har vært foreslått, at autoimmune sykdommer generelt, er forbundet med et overskudd av "hjelper^-T-celler eller et underskudd på visse "undertrykker'1'- eller "snppressor"-T-celler, mens agammaglobulinemi er forbundet med et overskudd av visse "undertrykker"-T-celler eller et underskudd av "hjelper"-T-celler. Ondartede svulster er generelt forbundet med et overskudd av "undertrykker"-T-celler.

I visse typer leukemi blir det produsert et overskudd av T-celler på stillestående stadier i utvikllingen. Diagnosen vil således være avhengig av evnen til å påvise denne ubalanse eller overskudd for å kunne bestemme hva som er i overskudd. Se f.eks.: J. Kersey. et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i Haematology and Blood Transfusion, volum 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24; E.L. Reinherz, et al., J. Clin. Invest., 64, 392-397

(1979).

Medfødt agammaglobulinemi, en sykdom hvor det ikke fremstilles noe immunglobulin, innbefatter minst to distinkte typer. I type I skyldes manglende produksjon av Immunglobulin et overskudd av undertrykker-T-celler, mens type II skyldes en mangel på hjelper-T-celler. I begge typer synes det ikke å være noen defekt eller mangel på pasientens B-celler, dvs. de lymfocytter som er ansvarlig for den virkelige utskillelsen av antistoffet. Imidlertid, disse B-celler blir enten undertrykt eller ikke hjulpet, noe som resulterer i sterkt nedsatt eller totalt manglende produksjon av immungloubulin. Type av medfødt agammaglobulinemi kan således bestemmes ved å undersøke om det finnes et overskudd av undertrykker-T-celler eller et fravær av hjelper-T-celler.

Identifikasjon og undertrykking av grupper og undergrupper av humane T-celler har tidligere vært utført ved hjelp av spontane autoantistoffer eller selektive antisera for humane T-celler. De sistnevnte er oppnådd ved å immunisere dyr med humane T-celler, tappe blodet for å oppnå serum og så absorbere nevnte antiserum med (f.eks.) autologe, men ikke allogene B-celler for å fjerne antistoffer med uønsket reaksjon. Fremstilling av disse antisera er meget vanskelig, spesielt gjelder dette absorpsjon og rensning. Selv de absorberte og rensede antisera inneholder mange urenheter i tillegg til det ønskede antistoff av mange grunner. For det første, serumet inneholder millioner av antistoffmolekyler selv før T-celleimmuniseringen. For det andre, immuniseringen frembringer produksjon av antistoffer mot en rekke antigener som finnes på alle de injiserte humane T-celler. Det er ingen selektiv produksjon av antistoff mot et enkelt antigen. For det tredje, styrken på det spesifikke antistoff som fremstilles ved slike fremgangsmåter er vanligvis ganske lav (dvs. inaktiv ved fortynninger på mer enn 1:100) og forholdet spesifikt til ikke-spesifikt antistoff er mindre enn 1:10<6>. Se f.eks. ovennevnte artikkel av Chess og Schlossman (side 365 og etterfølgende) og ovennevnte artikkel fra Chemical and Engineering News. Det er der angitt ulempene ved tidligere kjente antisera samt de fordeler man kan oppnå ved å kunne fremstille monoklonalt antistoff.

Man har nå oppdaget en ny hybridcellelinje eller hybridom (0KT9) og som er i stand til å produsere nytt monoklonalt antistoff mot et antigen som finnes på ca. 1056 av de normale humane thymocytter, men ikke på normale humane perifere lymfoide celler) (T-celler, B-celler eller null-celler) eller benmargceller. Disse thymocytter som 0KT9 reagerer med, betegnes "tidlige thymocytter".

Det antistoff som fremstilles er monospesifIkt for en enkelt determinant på ca. 105É av de normale humane thymocytter og inneholder i alt vesentlig ikke noe annet antihumant immun globulin, noe som står i kontrast til tidligere kjente antisera (som alltid var forurenset med antistoff som var reaktivt overfor tallrike humane antigener), og tidligere kjente monoklonale antistoffer (som ikke var monospesifikke for et enkelt humant thymocyttantigen). Videre kan denne hybridcellelinjen dyrkes slik at man får fremstilt antistoff uten at det er nødvendig å immunisere og drepe forsøksdyr, fulgt av en arbeidskrevende adsorpsjon og rensning som var nødvendig for å oppnå de tidligere kjente urene antisera.

Det er følgelig en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe nye antistoffer mot et antigen som finnes på ca. IO56 av de normale humane thymocytter.

Ved diagnose av sykdommer eller for identifikasjon av T-celler eller thymocyttgrupper anvendes dette antistoff.

Andre hensikter og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebrakt et monoklonalt antistoff av IgG-klassem for bruk som diagnostisk middel til påvisning av sykdomstilstander som Innebærer mangel på eller overskudd av 0KT9<+->celler, kjennetegnet vett at det reagerer med ca. 10% av normale humane tnynrocytter, men ikke med normale humane perifere T-celler, H-celler, null-celler eller benmargceller.

Ovennevnte monoklonale antistoff kan fremstilles ved at man: i) fortynner og dyrker de sammensmeltede cellene som er oppnådd ved at imms har blitt immunisert med humane leukemiske T-ALL-celler; deres milter har blitt fjernet og en suspensjon avmiltceller dannet, og ved at nevnte miltceller deretter har blitt sammensmeltet med muse-myelomceller I nærvær av en sammensmeltingspromotor,

idet nevnte fortynning og dyrking foretas i separate brønner i et medium som ikke vil understøtte de ikke-sammensmeltede cellene;

ii) bedømmer supernatanten i hver brønn inneholdende en hybridom for nærvær av antistoff til E-rosett positive

rensede T-celler eller humane thymocytter;

iii) selekterer og kloner et hybridomproduserende antistoff som reagerer med ca. 10% av normale humane thymocytter, men ikke med normale humane perifere T-celler, B-celler, , null-celler eller benmargceller; og

iv) utvinner antistoffer fra supernatanten over nevnte kloner, eller overfører nevnte kloner intraperitonealt i mus og innhøster de ondartede asciter eller serum fra nevnte mus.

Hybridcellelijen eller hybridomen som produserer foreliggende antistoff ble fremstilt ved at man i alt vesentlig brukte fremgangsmåten til Milstein og Kohler. Etter immunisering av mus med leukemiske celler fra en pasient med T-celler akutt lymfoblastisk leukemi, så ble miltcellene fra de immuniserte mus smeltet sammen med celler fra en musemyelomllnje, og de resulterende hydride celler ble undersøkt med hensyn til hvilke overliggende væsker som Inneholdt antistoff som ga selektiv binding til normale E-rosett positive humane T-celler og/eller thymocytter. De ønskede hybridcellelinjer ble så klonet ogkarakterisert. Som et resultat av dette fikk man en hybridcellelinje som ga et antistoff (0KT9) mot et antigen på ca. 105É av de normale humane thymocytter. Ikke bare reagerer dette antistoff med ca. 10% av de normale humane thymocytter, men det reagerer også med normale perifere blodlymfoide celler eller benmargceller.

På bakgrunn av de vanskeligheter man tidligere har hatt med hensyn til å bruke ondartede cellelinjer som antigenet, så var det overraskende at foreliggende fremgangsmåte ga den ønskede hybridcellelinje. Det skal understrekes at på grunn av hybridcellefremstillingens uforutsigbare resultater, så kan man ikke kan ekstrapolere fra et antigen eller et cellesystem til et annet. Mån har i virkeligheten- således oppdaget at bruken av en T-celle ondartet cellelinje eller rensede antigener utskilt fra celleoverflaten som antigen, generelt ikke ga noe tilfredsstillende resultat.

Hybridomen og antistoffet som fremstilles av denne identifiseres her ved betegnelsen "0KT9". Den aktuelle hybridcellelinje ble innlevert 21. november 1979 til the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 og er gitt ATCC aksesjonsnummer CRL 8021.

Fremstillingen og karakteriseringen av hybridcellelinjen og det resulterende antistoff vil fremgå av det nedenstående og de etterfølgende eksempler.

Fremgangsmåten for fremstilling av hybridcellellnj>en innbefatter generelt de følgende trinn: A. Immunisering av mus med leukemiske celler fra en pasient med T-celle ALL. Skjønt det er foretrukket å bruke CAFj,-hunnmus, så kan man også bruke andre musestammer. Selve immuniseringen og thymocyttkonsentrasjonen må være slik at man får fremstilt brukbare mengder av egnede reaktive splenocytter. En effektiv behandling er tre immuniseringer med fjorten dagers mellomrom med 2 x IO<7>celler/mus/injek-sjon i 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning.

B. Fjerning av milten fra de immuniserte mus og fremstilling av en miltsuspensjon I et passende medium. Ca. 1 ml medium pr. milt er tilstrekkelig. Denne eksperimentteknlkk er velkjent. C. Sammensmeltning av de suspenderte miltceller med muse-myelomceller fra en egnet cellelinje ved hjelp av en egnet forbindelse som fremmer en slik sammensmeltning. Det foretrukne forhold er ca. 5 miltceller pr. myelomcelle. Man har funnet at det er passende med et totalt volum på ca 0,5-1,0 ml sammensmeltningsmedium for ca. 10<8>splenocytter. Mange musemyelomcellelinjer er kjente og er vanligvis tilgjengelige fra forskningslaboratorier og forskjellige kulturinstitutter, såsom the Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA. Den cellelinje som brukes bør fortrinnsvis være en såkalt "legemiddel-resistent" type, slik at de usammensmeltede myelomceller Ikke vil overleve i et selektivt medium, mens hybridene vil overleve. Den mest vanlige typen er en såkalt 8-aza-guanin-resistent cellelinje, idet denne mangler enzymet hypoxantinguaninfosforibosyl-transferase, og vil følgelig ikke kunne overleve i et HAT (hypoxantin, aminopterin og thymidin)-medium. Det er også generelt foretrukket at myelomcellelinjen bør være en såkalt "ikke-utskillende" type, dvs. at den ikke i seg selv fremstiller noe antistoff, skjønt man også kan bruke utskillende typer. I visse tilfeller er det imidlertid foretrukket å bruke utskillende myelomlinjer. Skjønt den foretrukne forbindelse for å fremme sammensmeltningen er polyetylenglykol med en midlere molekylvekt på fra 1000 til ca. 4000, så kan man også bruke andre velkjente forbindelser. D. Fortynning og dyrkning i separate beholdere, blandingen av usammensmeltede miltceller, usammensmeltede myelomceller og sammensmeltede celler i et selektivt medium som ikke vil fremme vekst av de usammensmeltede myelomceller, i et tilstrekkelig langt tidsrom til at de usammensmeltede cellene dør (dette tar ca. en uke). Fortynningen kan være av en såkalt begrensende type, dvs. hvor volumet av fortynningsmidlet er statistisk beregnet slik at man får isolert et visst antall celler (fra ca. 1-4) i hver enkelt beholder (f.eks. hver brønn i en titreringsplate). Mediet er vanligvis ett (f. eks. et HAT-medium) som ikke vil fremme vekst av de legemiddel-resistente (f.eks. 8-azaguanin-resistenté) usammensmeltede myelomcellene, og disse cellene vil således etter hvert dø ut. Ettersom de usammensmeltede miltcellene er ikke-ondartede, så vil disse bare ha et visst antall generasjoner. Etter et visst tidsrom (vanligvis en uke), så vil disse usammensmeltede miltcellene ikke lenger reprodusere seg. De sammensmeltede celler på den annen side vil fortsette å reprodusere ettersom de har den ondartede kvaliteten fra myelom-opphavet, og dessuten evnen til å overleve I det selektive mediet fra miltcelle-opphavet.

E. Bedømmelse av supernatanten i hver beholder (brønn)

inneholdende en hybrid for et nærvær av antistoffet til E-rosett positive rensede humane T-celler eller thymocytter.

F. Seleksjon (f.eks. ved begrensende fortynning) og kloning av hybridcellelinjer som fremstiller det ønskede antistoff.

Så snart den ønskede hybridom er valgt ut og klonet, så kan det resulterende antistoff fremstilles på en av to måter. Det reneste monoklonale antistoff fremstilles ved en in vitro-dyrkning av den ønskede hybridcellelinjen 1 et egnet medium i tilstrekkelig langt tidsrom, hvoretter man innvinner det ønskede antistoff fra supernatanten. Egnet medium og egnet dyrkningstid er kjent eller kan lett bestemmes. Denne in vitro-teknikk gir i alt vesentlig monospesifikt monoklonalt antistoff, i alt vesentlig fritt for andre spesifikke antihumane immunglobuliner. Det er tilstede en mindre mengde av annet immunglobuliner ettersom mediet inneholder xenogent serum (f.eks. kalvefosterserum). Denne in vitro-fremgangsmåte gir imidlertid ikke tilstrekkelige mengder eller konsentrasjon av antistoff for visse formål, ettersom konsentra-sjonen av monoklonalt antistoff bare er ca. 50 yg/ml.

For å fremstille en langt større konsentrasjon av noe mindre rent monoklonalt antistoff, kan den ønskede hybridcellelinjen injiseres i mus, fortrinnsvis syngenisk eller semi-syngenisk mus. Hybridcellene vil der frembringe en dannelse av antistoff produserende svulster etter en egnet inkubasjonstid, og dette vil resultere I en høy konsentrasjon av det ønskede antistoff (ca. 5-20 g/ml) i blodstrømmen og i det peritoneale eksudat (ascites) i vertmusen. Skjønt disse vertmus også har normale antistoffer i sitt blod og ascites, så vil konsentra-sjonen av disse normale antistoffer bare være ca. 55é av konsetrasjonen av det monoklonale antistoff. Ettersom disse normale antistoffer ikke er antihumane i sin spesifisitet, så vil det monoklonale antistoff som oppnås fra lnnhøstede ascites eller fra serum, i alt vesentlig være fritt for et eventuelt forurensende antihumant Immunglobulin. Dette monoklonale antistoff har høy konsentrasjon (aktiv ved for-.~tynnlnger på 1:50000 eller høyere) og et høyt forhold mellom spesifikt til ikke-spesifIkt immunglobulin (ca. 1/20). Det fremstilte immunglobulin som innbefatter de lette myelom-kjedene er ikke-spesifikke, "nonsense"-peptider, som bare fortynner det monoklonale antistoff uten å svekke dets spesifisitet.

EKSEMPEL I

Fremstilling av monoklonale antistoffer

A. Immuniserlng og somatisk cellehvbridiserlng

CAF^-hunnmus (Jackson Laboratories, 6-8 uker gamle) ble immunisert intraperitonealt med 2 x IO<7>T-ALL-leukemiske celler (pasient J.F.) i 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning med 14 dagers mellomrom. 4 dager etter tredje Immuniserlng ble milten tatt ut av nevnte mus, og man fremstilte en enkelt cellesuspensjon ved å presse vevet gjennom et nett av rustfritt stål.

Cellesammensmeltning ble utført ved hjelp av den fremgangsmåte som er utviklet av Kohler og Milsteln. 1 x 10<8>splenocytter ble i 0,5 ml av et sammensmeltnlngsmedium bestående av 35# polyetylenglykol og 5# dimetylsulfoksyd i RPMI 1640-medlum smeltet sammen med 2 x IO7 P3X63Ag8Ul myelomceller som man fikk fra dr. M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Disse myelomceller utskiller IgG^k lette kjeder.

B. Seleksjon og vekst av hvbridceller

Etter cellesammensmeltning ble cellene dyrket i et HAT-medium (hypoxantin, aminopterin og thymidin) ved 37" C med 5# CO2i en fuktig atmosfære. Flere uker senere ble 40 til 100 pl av supernatanten fra kulturer inneholdende hybridcellene tilsatt til en pellet av 10^ perifere lymfoytter som var utskilt i E-rosett positive (E<+>) og E-rosett negative (E<+>) populasjoner, og disse var fremstilt fra blodet fra friske pasienter slik det er beskrevet av Mendes (J. Immunol. 111:860, 1973). Påvisning av musehybridcelle-antlstoffer som binder seg til disse celler, ble bestemt ved indirekte immunofluorescens. Celler inkubert med kultursupernatanter ble merket med et fluorescerende geit-anti-mus IgG (G/M FITC), F/p = 2,5) og de fluorescerende antistoffbelagte celler ble deretter analysert på en Cytofluorograf FC200/4800A, slik det er beskrevet i eksempel III. Hybrid-cellekulturer som inneholdt antistoffer som reagerte spesifikt med E<+->lymfocytter (T-celler) og/eller thymocytter, ble så tatt ut og klonet to ganger ved begrensende fortynnings-metoder i nærvær av understøttende celler. Deretter ble klonene overført intraperitonealt ved å injisere 1 x 10<7->celler av en gitt klon (0,2 ml volum) i CAF^-mus som var injisert 2,6,10,14-tetrametylpentadekan. Ondartet ascites fra disse mus ble så brukt for å karakterisere lymfocytter slik det er beskrevet i eksempel II. Det foreliggende hybrld-antistoff 0KT9 ble så påvist ved standardteknlkk til å tilhøre undergruppen IgG^ .

EKSEMPEL II

Karakterisering av 0KT9- reaktlvitet

A. Isolering av lvmfocyttpopulas. loner

Humane perifere blodmononukleære celler ble isolert fra friske pasienter (alder 15-40) ved hjelp av Ficoll-Hypaque tetthetsgradientsentrifugering idet man brukte Bøyums teknikk, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97): 77, 1968. Ufraksjonerte mononukleære celler ble utskilt i overflate Ig<+>(B) og lg" (T pluss null) populasjoner ved hjelp av Sephadex® G-200 anti-F(ab')2-kolonnekromatografi slik det er beskrevet av Chess et al., J. Immunol. 113:1113

(1974). T-cellene ble utvunnet ved såkalt E-rosettdannelse av Ig~-populasjonen med 5$ saue-erytrocytter. Den rosettdannende blandingen ble overlagt Ficoll-Hypaque og den utvunnede E<+->pellet ble behandlet med 0,155 molar NH4C1 (10 ml pr. 10<8->celler). Den oppnådde T-cellepopulasjonen var mindre enn 2% EAC-rosett positivt og mer enn 9556 E-rosett positivt slik det kunne bestemmes ved kjente fremgangsmåter. I tillegg til dette så ble den ikke-rosettdannende Ig~ (null-celle) populasjonen innhøstet fra Ficoll-lnterflaten. Denne sistnevnte populasjon var mindre enn 556 E<+>og lik 256 slg<+>. Overflate Ig<+>(B) populasjonen ble oppnådd fra Sephadex® G-200-kolonnen etter eluering med normalt humant gammaglobulin slik det er beskrevet tidligere. Denne populasjonen var mer enn 9556 overflate Ig<+>og mindre enn 556 E<+>.

Normale humane benmargceller ble oppnådd fra hoftekammen hos normale pasienter ved utsuging ved hjelp av en sprøyte.

B. Isolering av thymocytter

Normale humane thymuskjertler fikk man fra pasienter hvis alder var fra 2 måneder til 14 år og som var underkastet hjertekirurgiske operasjoner. Nylig oppnådde porsjoner av thymusk jer telen ble umiddelbart plassert i 556 kalvefosterserum i medium 199 og finfordelt med saks og skapell og deretter opparbeidet til en enkelt cellesuspensjon ved pressing gjennom et fint nett. Cellene ble deretter opp arbeidet til en enkelt cellesuspensjon ved pressing igjennom et fint nett. Cellene ble deretter overlagt Ficoll-Hypaque og så spunnet og vasket som beskrevet tidligere i avsnitt A ovenfor. De oppnådde thymocytter var mer enn 9556 levende og lik eller mer enn 9056 E-rosett positive.

C. Cellelinjer av T- opprinnelse og T- akutte lymfoblastlske

leukemiceller

T-cellelinjene CEM, HSB-2 og MOLT-4 ble tilveiebragt av dr. H. Lazarus (Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA). Leukemiske celler ble oppnådd fra 25 pasienter med en diagnose på T-celle-ALL. Disse individuelle svulster var på forhånd bestemt å være av T-celle-avstamning på grunn av sin spontane rosettdannelse med saue-erytrocytter (>2056 E<+>) og deres reaktivitet med T-celle-spesifikt heteroantisera anti-HTL (B.K.) og A99, slik det er beskrevet tidligere. Svulst-populasjoner ble bevart i kulden ved -196°C i dampfase-væskenitrogen med 1056 DMSO og 2056 AB humant serum Inntil de skulle overflatekarakteriseres. Alle de analyserte svulstpopulasjonene var mer enn 9056 blastiske slik det kunne påvises ved Wright-Glemsa-morfologl av cytosentrifuge-preparater.

EKSEMPEL III

Cytofluorograflsk analyse og celleseparaslon

Cytofluorografisk analyse av monoklonale antistoffer med alle cellepopulasjoner ble utført ved indirekte immunofluorescens med fluorescein-konjugert geit-anti-mus IgG (G/M FITC) idet man brukte en cytofluorograf FC200. Kort beskrevet så ble

1 x 10<6->celler behandlet med 0,15 ml 0KT5 ved en fortynning på 1:500, inkubert ved 4°C i 30 minutter og vasket to ganger. Cellene ble så reagert med 0,15 ml av en 1:40-fortynning G/M FITC ved 4°C i 30 minutter, sentrifugert og vasket tre ganger. Cellene ble så analysert på cytofluorografen og fluuorescens-inteniteten pr. celle ble så observert ved hjelp av en pulshøydeanalysator. Et lignende reaktivitetsmønster kunne ses ved en fortynning på 1:10000, men ytterligere fortynning ga et tap av reaktivitet. Bakgrunnsfarging ble oppnådd ved å erstatte en 0,15 ml porsjon av 1:500 ascites fra en CAF^-mus som var intraperitonealt injisert med en ikke-produserende hybridklon.

I eksperimenter hvori der inngikk antistoff og komplement-styrt lymfolyse, så ble thymocyttene og perifere T-celler dyrket over natten etterfulgt av en selektiv oppløsning og så deretter analysert på cytofluorografen.

EKSEMPEL IV

Oppløsning av lvmfoide populasjoner med monoklonalt antistoff og komplement

40 x IO<6>perifere T-celler eller thymocytter ble plassert I et 15 ml plastrør. Cellepellet ble inkubert med 0,8 cm<5>0KT3, 0KT4, 0KT8 eller en normal ascites-kontroll fortynnet 1:200 i PBS, resuspendert og inkubert ved 20° C i en time. Deretter ble 0,2 cm<5>fersk kaninkomplement tilsatt de antistoff-behandlede populasjoner, resuspendert og ytterligere inkubert ved 37° C 1 et ristebad 1 en time. Deretter ble cellene spunnet ned og levende celler talt ved hjelp av Trypan-blått-utelukkelse. Etter telling ble cellene vasket to ganger til i 556 FCS og så plassert i et sluttmedium (RPMI 1640) inneholdende 2056 AB<+>humant serum, 156 penicillin-streptomycin, 200 mM L-glutamln, 25 mM HEPES-buffer og 0 , 556 natrium-bikarbonat og inkubert over natten i en fuktig atmosfære med 556 C02ved 37° C. Figur 1 viser det f luorescensmønsteret man fikk på cytofluorografen etter å ha reagert normale humane thymocytter med 0KT9 og annet monoklonalt antistoff ved en fortynning på 1:500 og G/M FITC. Bakgrunns-fluorescensfarging ble oppnådd ved å inkubere hver populasjon med en 1:500 fortynning av ascitisk væske fra en mus og Injisert med en ikke-produserende klon. Figur 2 viser de forskjellige trinn ved en intrathymisk

differensiering hos menneske.

Fremstillingen av hybridcellelinjen og fremstillingen og karakteriseringen av det resulterende monoklonale antistoff ble utført som beskrevet i de ovennevnte eksempler. Skjønt store mengder av foreliggende antistoff ble fremstilt ved å injisere hybridcellelinjen Intraperitonealt i mus og deretter innhøste ondartet ascites, så. er det klart at hybridcellelinjen også kan dyrkes in vitro ved velkjent teknikk og at antistoffet kan fjernes fra supernatanten.

Tabell 1 viser reaktiviteten for 0KT6, 0KT8, 0KT9 og OKT10 med forskjellige humane lymfoide cellepopulasjoner. Nevnte 0KT9-monoklonalt antistoff er reaktivt med ca. 1056 av de normale humane thymocytter og ikke med andre prøvede lymfoide celler. Dette reaktivitetsmønsteret er en prøve ved hjelp av hvilken foreliggende antistoff 0KT9 kan påvises og skilles fr andre antistoffer.

Figur 1 viser et representativt fluorescensmønster som ble oppnådd på cytofluorografen etter at man hadde reagert normale humane thymocyttsuspensjoner med en 1:500 fortynning av 0KT3, 0KT4, 0KT5, 0KT6, 0KT8, 0KT9, OKT10 og G/M FITC. Lignende reaktivitetsmønstre ble sett med ytterligere 12 normale humane thymocyttpopulasjoner. Det fremgår at det eksisterer betydelige forskjeller både med hensyn til prosentvis reaktivitet og fluorescensintensitet med hver av disse monoklonale antistoffer. F.eks. reagerer 0KT9 med ca. 1056 av thymocyttene med lav f luorescensintensitet, mens 0KT5, 0KT6, 0KT8 og OKT10 reagerer med ca. 7056 av thymocyttene med høyere f luorescensintensitet. 0KT4, som reagerer med ca. 7556 av thymocyttene er intermediær med 0KT9 og de monoklonale antistoffer som gir et mønster med større fluorescensintensitet. I tillegg viser figur 1 at ca. 1556 av thymocyttene kan påvises med 0KT3 ved indirekte immunofluorescens. 0KT1 er ikke vist, fordi dennes reaktivitetsmønster i alt vesentlig er identisk med 0KT3 på thymocytter. Reakti-vitetsmønsteret på figur 1 er en annen prøve ved hjelp av hvilken foreliggende antistoff 0KT9 kan påvises og skilles fra andre antistoffer.

Tabell 2 viser fordelingen av antigener definert ved hjelp av forskjellige monoklonale antistoffer på humane perifere T-celler og lymfocytter, slik dette ble bestemt ved en serie oppløsningseksperimenter av den type som er beskrevet I eksempel IV. Ettersom bare 0KT3, 0KT4 og 0KT8 var komplement-fikserende monoklonale antistoffer, så ble disse tre anvendt.

Som vist i tabell 2A, så reagerer hele T-cellepopulasjonen med 0KT3, mens 0KT4, 0KT5 og 0KT8 reagerer med henholdsvis 6056 , 2556 og 3456 av T-cellene. Oppløsning med 0KT4 og komplement nedsatte det totale tall med 6256 og i alt vesentlig fjernet hele 0KT4<+->populasjonen. I tillegg til dette øket prosenten av 0KT5<+->og 0KT8<+->cellene, men det var ingen effekt på det absolutte tall av 0KT5<+->og 0KT8<+->T-celler. Disse eksperimenter antyder at 0KT4<+>var forskjellig fra 0KT5<+->og 0KT8<+->populasjonene. Ytterligere, støtte for denne konklusjon ble oppnådd ved en oppløsning av T-cellene med 0KT8 og komplement. I dette tilfellet økte prosenten av 0KT4<+->T-celler, mens det absolutte tall forble det samme, mens 0KT8<+->og 0KT5<+->populasjonene ble eliminert. Disse resultatene viser videre at 0KT8<+->populasjonen var resiprok med hensyn til 0KT4<+->populasjonen og inneholdt hele 0KT5<+->T-celle-undergruppen.

Lignende eksperimenter med humane thymocyttpopulasjoner ga forskjellige resultater. Som vist i tabell 2B, var 7556 av thymocyttene 0KT4<+>eller 0KT8<+>. Etter en oppløsning med enten 0KT4 eller 0KT8 så var bare 2556 av thymocyttene igjen. Hovedmengden av de gjenværende thymocytter var reaktive med 0KT3, mens bare en mindre del var reaktive med 0KT6. Disse resultatene viser at den større del av de humane thymocytter bærer 0KT4, 0KT5, 0KT6 og 0KT8-overflateantigener på den såmme cellen. I tillegg demonstrerer tabell 2 at etter behandling med 0KT8 eller 0KT4, så var det en markert økning i modne thymocytter som var 0KT3-antigenet. Hovedmengden av 0KT3-reaktive thymocytter var således allerede skilt i undergruppene 0KT4<+>og 0KT8<+>, ettersom hovedmengden av de gjenværende celler etter 0KT4 eller 0KT8-oppløsning var 0KT3<+>. Hvis 0KT3<+->subpopulasJonen var både 0KT4<+>og 0KT8<+>, så skulle oppløsning med begge typer monoklonalt antistoff ha fjernet de 0KT3-reaktive thymocyttene.

For ytterligere å bestemme forholdet mellom 0KT3-reaktive thymocytt-subpopulasjoner i forhold til andre monoklonalt antistoff-definerte thymocyttfraksjoner, så ble thymocyttene behandlet med 0KT3 og komplement, og de gjenværende celler ble så sammenlignet med ubehandlede thymocyttpopulasjoner. Som vist I tabell 2B så fjernet 0KT3 og komplement ca. 2556 av thymocyttene. Det var videre intet større tap av 0KT4, 0KT5, 0KT6 og 0KT8 reaktive populasjoner. Disse resultatene antyder at hovedmengden av thymocyttene som har 0KT6-reaktivitet, forefinnes i 0KT3~-populasjonen. I tillegg antyder resultatene at de thymocytter som samtidig uttrykker antigener definert ved 0KT4, 0KT5 og 0KT8, på lignende måte er begrenset til 0KT3~-populasjonen. Det skal også bemerkes at den 0KT9-reaktive populasjonen av thymocyttene ikke ble svekket etter en behandling med 0KT3 og komplementbehandling av de ufraksjonerte thymocyttene, noe som viser at 0KT9<+->subpopulasjonen i alt vesentlig er begrenset til 0KT3--thymocyttpopulasjonen.

Basert på disse resultatene har det vært mulig å beskrive de forskjellige trinn under den intrathymiske utviklingen av humane thymocytter. Som vist på figur 2 har nesten alle thymocyttene OKTlO-markør. I tillegg så oppnår thymocyttene på et tidlig trinn 0KT9-markøren (Thyl og Thy2 henholdsvis). Dette trinn definerer en mindre mengde av thymocyttene og utgjør ca. 1056 av den uf raks jonerte populasjonen. Deretter oppnår de humane thymocyttene et thymocytt-enestående antigen definert 0KT6 og deretter uttrykker de 0KT4, 0KT5 og 0KT8 (Thy4). Den sistnevnte subpopulasjonen utgjør hovedtyngden av thymocyttene og er ca. 70-8056 av den thymiske populasjonen. Med ytterligere modning mister thymocyttene 0KT6-reaktivitet, oppnår 0KT3 (og 0KT1) reaktivitet, og skiller seg i 0KT4<+>og 0KT5<+>/0KT8<+->undergrupper (Thy7 og Thy8). Til slutt syntes det som om thymocyttene skilles over i den perifere T-celledelen, taper sin OKTlO-markør ettersom dette antigen mangler på nesten alle perifere T-lymfocytter. Mulige overgangstrinn mellom disse tre hovedtrinn av den thymiske utviklingen er betegnet med Thy3, Thy5 og Thy6 på figur 2.

Ettersom akutt lymfoblastisk leukemi av T-opprinnelse antas å være avledet av umodne thymocytter, så bestemte man forholdet mellom svulstceller fra disse individer med T-ALL og de nevnte foreslåtte trinn av den intrathymiske differensieringen. 25 svulstcellepopulasjoner fra individer med T-ALL og 3 T-cellelinjer som på forhånd var undersøkt med vanlige antl-T-celle-reagenser og E-rosettdannelse, ble undersøkt. Soro vist, 1 tabell 3 så var hovedmengden av T-ALL-leukemiske celler reaktive med enten OKT10 alene eller 0KT9 og OKT10, men reagerte Ikke med andre monoklonale antistoffer. 15 avde 25 tilfeller som således ble undersøkt syntes å ha et tidlig thymocyttantigen (trinn I).

I motsetning til dette var 5 av 25 tilfeller reaktive med 0KT6, noe som antyder en avledning fra en mer moden thymus-populasjon (trinn II). Denne T-ALL-gruppe var I seg selv heterogen med hensyn til 0KT4, 0KT8 og 0KT9 henholdsvis, noe som er vist i tabell 3. Cellene fra 2 ut av 5 pasienter har de fleste vanlige thymocyttantigener såsom 0KT4, 0KT6 og 0KT8. Det er verd å merke seg at 0KT5 ikke var tilstede i noen av de nevnte 5 trinn II svulstene, selv når man kunne observere 0KT8-reaktivitet. Dette sistnevnte resultat antyder klart at 0KT5 og 0KT8 definerer forskjellige antigener eller forskjellige determinanter på det samme antigen. Hos 1 av de 25 pasientene så stammet svulsten fra en moden thymocytt- populasjon (trinn III), slik dette kunne defineres ved dens reaktivitet mot 0KT3. Dette individs svulst var i tillegg reaktiv med 0KT5 0KT8 og OKT10. Av de 25 leukemiske populasjoner som ble analysert, var det bare 4 svulster som ikke klart kunne katalogiseres. Tre var positive mot 0KT4 og 0KT8, men manglet 0KT3 og 0KT6, og representerte høyst sannsynlig-vis overganger fra Thy4 og Thy7/8. Et av de 25 tilfellene syntes å være en overgang fra Thy3 til Thy4 ettersom del hadde 0KT8- og OKTlO-reaktivitet.

T-cellelinjer avledet fra T-ALL-svulstpopulasjonene represen-terer også celler fra et spesifikk trinn av den intrathymiske differensieringen. Som vist i tabell 4, var HSB reaktiv utelukkende med 0KT9 og OKT10, og kunne derfor definere er svulstpopulasjon avledet fra trinn I. I motsetning til dette var CEM reaktiv med 0KT4, 0KT6, 0KT8, 0KT9 og OKT10, o| syntes å være avledet fra en trinn-II thymocytt. Til sluti syntes MOLT-4 å representere en leukemisk transformasjon på et trinn mellom HSB-2 og CEM, ettersom den uttrykte 0KT6, 0KT8, 0KT9 og OKT10.

De forhold som er vist i tabellene 2-4 er en annen måte vec hjelp av hvilken 0KT9-antistoffet kan påvises og skilles fr? andre antistoffer.

Man har kunnet observee t 30-5056 av de perifere T-cellene ble 0KT9<+>etter mitogen-stimulering. Denne egenskapen tilveiebringer en annen fremgangsmåte ved hjelp av hvilken 0KT9-antistoff kan påvises og skilles fra andre antistoffer.

Andre monoklonale antistoffproduserende hybridcellelinjer son er tilveiebragt (0KT1, 0KT3, 0KT4 og 0KT5) er beskrevet I de følgende norske patentsøknader 800793; 801214; 801216 of 802751. Andre monoklonale antistoffproduserende hybridcellelinjer som er fremstilt av foreliggende søker (betegnet 0KT6, 0KT8 og 0KT10) er beskrevet i NO-PS 803658, 803659 og 803660,

Skjønt det bare er beskrevet en enkelt hybridcellelinje eller hybridom som produserer et enkelt monoklonalt antistoff mot et humant thymocyttantigen, så er det underforstått at foreliggende oppfinnelse Innbefatter alle monoklonale antistoffer som viser de egenskaper som er beskrevet. Det ble bestemt at foreliggende antistoff 0KT9 hører til undergruppen IgGi, som er en av de fire undergrupper av muse-IgG. Disse undergrupper av immunglobulin G skiller seg fra hverandre ved såkalte "fikserte" områder, skjønt et antistoff til et spesifikt antigen vil ha et såkalt "variabelt" område, som er funksjonelt identisk uten hensyn til hvilken undergruppe av immunglubulln G det tilhører. Dette betyr at monoklonalt antistoff som viser de egenskaper som er vist her, kan være av undergruppene IgG^, IgG2a, IgG2b eller IgG^eller av gruppene IgM, IgA eller andre kjente Ig-grupper. Forskjellene mellom disse gruppene eller undergruppene vil ikke påvirke selektiviteten med hensyn til antistoffets reaksjonsmønster, men kan påvirke ytterligere reaksjon med antistoffet og andre forbindelsr såsom (f.eks.) komplement eller anti-mus-antistoffer. Skjønt det foreliggende antistoff er spesifikt IgG^, så er det underforstått at antistoffer med det reakti-vitetsmønster som er vist her, Inngår i foreliggende oppfinnelse uansett hvilken immunglobulingruppe eller undergruppe de tilhører.

Skjønt det i det ovenstående bare er beskrevet et eksempel på en hybridcellelinje eller hybridom, så er det underforstått at etter immuniserlng, sammensmeltning og seleksjon slik det er beskrevet her, kan fremstille andre hybridcellelinjer som er i stand til å fremstille antistoffer som har de samme reaktivitetsegenskaper som er beskrevet her. Ettersom den individuelle hybridcellelinjen som er fremstilt fra en kjent musemyelomcellelinje og miltceller fra en kjent rase av mus, ikke kan ytterligere identifiseres uten med henvisning til det antistoff som fremstilles av hybridcellelinjen, så er det underforstått at alle hybridcellelinjer som fremstiller antistoff med de reaktivitetsegenskaper som er beskrevet ovenfor, inngår i foreliggende oppfinnelse, så vel som fremgangsmåter for fremstilling av disse antistoffer hvor man anvender hybridcellelinjen.

Ved diagnose av sykdommer anvendes det monoklonale antistoff 0KT9 eller et annet monoklonalt antistoff som har samme reaktivitetsmønster. Det foreliggende antistoff kan brukes for å påvise og studere intrathymisk differensiering slik det er vist på figur 2. Unormale tilstander i trinn I differensieringen kunne således påvises ved et avvik fra nevnte ca. 10% aKT9i<+->thymocytter. Videre kan foreliggende antistoff brukes for å diagnostisere sykdomstilstander som innbefatter et underskudd eller et overskudd av 0KT9<+->celler. Denne teknikk kan brukes ved hjelp av 0KT9-antistoffet alene eller i kombinasjon med andre antistoffer (f.eks. 0KT3 - 0KT10). Reaktivitetsmønsteret for en rekke antistoffer til T-celler og T-celleundergrupper vil kunne gi en mer presis påvisning av visse sykdomstilstander enn det som er mulig ved å bruke tidligere kjente diagnostiske fremgangsmåter.

Claims (1)

1. i1.

   Monoklonalt antistoff av IgG-klassen for bruk som et in-vitro diagnostisk middel til påvisning av sykdomstilstander som innebærer mangel på eller overskudd av 0KT9<+->celler,karakterisert vedat det reagerer med ca. 10% av normale humane thymocytter, men ikke med normale humane perifere T-celler, B-celler, null-celler eller benmargceller. 2.

   Monoklonalt antistoff ifølge krav 1,karakterisert vedat det er produsert av en hybridom ATCC CRL 8021 (0KT9) som er dannet ved fusjon av celler fra en musemyelomlinje og miltceller fra en mus som på forhånd er immunisert med humane leukemiske T-ALL-celler.