NO159883B - Monoklonalt antistoff. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår monoklonalt antistoff

til et antigen som finnes på alle normale humane hjelper-. T-celler.

Sammensmeltingen eller fusjonen av musemyelomceller til miltceller fra immuniserte mus av Kohler og Milstein i 1975 (Nature 256, 395-497) (1975) viste for første gang at det var mulig å oppnå en kontinuerlig cellelinje for fremstilling av homogent (såkalt "monoklonalt") antistoff. Etter dette epokegjørende arbeid har det vært gjort store undersøkelser for å finne frem til fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige hybridceller (også betegnet "hybridomer") samt bruken av antistoff fremstilt ved hjelp av disse hybridceller for forskjellige vitenskapelige undersøkelser. Se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, vol. 81 - "LymphOcyte Hybridomas" av F. Melchers, M. Potter og N. Warner, redaktører, Springer-Verlag, 1978, og referanser angitt der, C. J. Bernstable,

14, 9-20 (mai 1978); P. Parham og W. F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978); Handbook of Experimental Immunology, tredje utgave, vol. 2, D. M. Wier, redaktør, Blackwell 1978, kapittel 25; og Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15-17.

Ovennevnte arbeider viser på samme tid hvilke muligheter

som foreligger samt de komplikasjoner og vanskeligheter som oppstår når man ønsker å fremstille monoklonale antistoff fra hybridceller. Skjønt teknikken er velkjent og godt forstått rent teoretisk, så er det mange praktiske vanskeligheter som oppstår i hvert enkelt tilfelle. Før man har forsøkt å fremstille en gitt hybridcelle, kan man i virkeligheten ikke på forhånd være sikker på at man vil oppnå den ønskede hybridcelle, og at den vil fremstille det antistoff som er ønskelig, eller at dette har den ønskede spesifisitet. Hvorvidt man er heldig eller ikke, er i alt vesentlig avhengig av den type antigen som brukes, samt den seleksjonsteknikk som brukes for å isolere den ønskede hybridcelle.

Forsøk på å fremstille monoklonalt antistoff til humane lymfocyttcelle-overflateantigener har bare vært angitt i et par tilfeller. Se f.eks. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De antigener som ble brukt i de angitte eksperimenter, var dyrkede humane lymfoidblastoid-leukemiceller og humane kroniske lymfocyttiske leukemiceller. Mange hybridceller som ble oppnådd på den måten, synes å gi antistoff til forskjellige antigener på alle humane celler. Ingen av de fremstilte hybridcellene ga antistoff mot en forutbestemt gruppe av humane thymocytter.

Det tør være velkjent at det er to prinsipelle typer av lymfocytter involvert i immunsystemet i mennesker og dyr. Den første type (thymus-avledet celle eller T-celle) blir differensiert i thymuskjertelen fra hemopoeitiske stammeceller. Så lenge disse celler befinner seg inne i thymuskjertelen, blir de gjerne betegnet "thymocytter". Den modne T-cellen blir så skilt ut fra thymuskjertelen og sirkulerer mellcm vevet, lymfekjertlene og blodstrømmen. Disse T-cellene utgjør en større del av de resirkulerende små lymfocytter. De har immunologisk spesifisitet og er alle direkte involvert i cellestyrte immunreaksjoner (såsom en avstøtning ved transplantasjon) som såkalte effektorceller. Skjønt T-cellene ikke utskiller humoralt antistoff, så er de i visser tilfeller nødvendige for å få en utskillelse av disse antistoffer ved hjelp av en annen gruppe av lymfocytter som er beskrevet nedenfor. Andre typer av T-celler har en regulerende funksjon i andre deler av immunsystemet. Selve mekanismen ved denne prosessen hvor man har et samarbeid mellom celler, er ikke fullt ut forstått.

Den annen type lymfocytter (benmargavledede celler eller B-celler) er de som utskiller antistoff. De utvikles

også fra hemapoeitiske stammeceller, mens deres differensiering ikke er bestemt ved hjelp av thymuskjertelen. Hos fugler blir de utskilt i organer som er

analoge til thymuskjertelen, ofte kalt Bursa- eller Fabricius-kjertelen. Hos pattedyr har man ikke opp-

daget noe tilsvarende organ, og det er vanligvis antatt at disse B-celler differensieres inne i benmargen.

Det er nå kjent at T-cellene kan deles i flere undergrupper betegnet "hjelper"-, "suppressor"- og "dreper"-T-celler, som henholdsvis har en funksjon til å fremme

en reaksjon, undertrykke en reaksjon eller å drepe (oppløse) fremmede celler. Disse underklasser er relativt godt kjent fra mus, men er bare nylig blitt beskrevet i forbindelse med mennesker. Se f.eks. R. L. Evans et al., Journal of Experimental Medicine, vol. 145, 221-232, 1977, og L. Chess og S. F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell subsets Bearing Unigue Differentiation Anti-gens", og Contemporary Topics in Immunobiology", av 0. Stutman, redaktør, Plenum 1977, vol. 7, 363-379.

Evnen til å kunne identifisere eller å undertrykke klasser eller undergrupper av T-celler er meget viktig for diagnose eller behandling av forskjellige immunregulerte lidelser eller sykdommer.

F.eks. har visse typer leukemi og lymfoidlidelser forskjellige prognoser hvorvidt de er av B-celle- eller T-celle-opprinnelse. Således vil en bedømmelse av sykdommens prognose være avhengig av hvorvidt man kan skille mellom disse to typer lymfocytter. Se f.eks. A. C. Aisen-berg og J. C. Long, "The American Journal of Medicine", etc. mars 1975; D. Belpomme et al, i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphcmas", S. Thierfelder et al., redaktør Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Belpomme et al., "British Journal of Haemotology", 1978, 38, 85.

Visse sykdomstilstander (f.eks. tidlige stadier av reu-matiske lidelser, visse typer leukemi og agammaglobulinemi) er forbundet med en ubalanse med hensyn til T-celleundergruppene. Det har vært antatt og foreslått at auto-immune lidelser er forbundet med et overskudd av hjelper-T-celler, eller et underskudd av visse suppressor-T-celler, mens agammaglobulinemi er forbundet med et overskudd av visse suppressor-T-celler eller et underskudd på hjelpe-T-celler. Ondartede svulster er vanligvis forbundet med et overskudd av suppressor-T-celler .

I visse typer leukemi blir overskudd av T-celler frem-

stilt på et stillestående stadium av sykdommens utvikling. Diagnosen kan således være avhengig av evnen til å påvise denne ubalanse eller overskudd. Se f.eks. J. Kersey et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i Haemotology and Blood Transfusion, vol. 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24, med de referanser som er angitt deri.

Ervervet agammaglobulinemi, en sykdomstilstand hvor der ikke fremstilles noe immunglobulin, innbefatter i det minste to distinkte typer. I type I skyldes mangelen på produksjon av immunglobulin et overskudd av suppressor-celler, mens det i type II skyldes en mangel på hjelper-T-celler. I begge typer synes det ikke å være noen mangel på eller en defekt på pasientens B-celler, dvs. de lymfocytter som er an-svarlige for en utskillelse av antistoffer, men nevnte B-celler blir imidlertid enten undertrykket eller "ikke hjulpet", noe som resulterer i en sterkt nedsatt eller et fravær av immunglobulinfremstilling. Denne typen av ervervet eller medfødt agammaglobulinemi kan således bestemmes ved å undersøke overskudd av suppressor-T-celler eller fravær av hjelper-T-celler.

Identifikasjonen og undertrykking av human T-celleklassene

og underklassene har tidligere vært utført ved å bruke spontane autoantistoffer eller selektive antisera for humane T-celler, noe som kan fremstilles ved å immunisere dyr med humane T-celler, tappe dyrene for blod for å opp-

nå serum og absorbere antiserumet med (f.eks.) autologe,

men ikke-allogene B-celler for derved å fjerne antistoff

som har uønsket reaktivitet. Fremstillingen av disse typer antisera er meget vanskelig, da spesielt absorpsjon og rensing. Selv når man har fremstilt, absorbert og renset antisera, så kan dette inneholde urenheter i tillegg til det ønskede antistoff av flere årsaker. For det første vil serumet inneholde millioner av antistoffmolekyler selv før T-celleimmunisering. For det annet vil immuniseringen frembringe en produksjon av antistoffer mot en rekke antigener som finnes i alle de injiserte humane T-cellene. Det er ingen selektiv produksjon av antistoff mot et

enkelt antigen. Videre er den titreringsverdi man finner for spesifikt antistoff ved en slik fremgangsmåte relativt lav (de er f.eks. inaktive ved fortynninger på mer enn 1:100) og forholdet spesifikt/ikke-spesifikt antistoff er

g

mindre enn 1/10 .

Se f.eks. Chess og Schlossman's artikkel som det er vist til ovenfor (sidene 365 og etterfølgende), og nevnte artikkel som er angitt fra Chemical and Engineering News, hvor ulempene ved tidligere kjente antisera og fordelene ved såkalt monoklonalt antistoff er beskrevet.

Man har nå oppdaget en ny hybridcelle eller hybridom (betegnet OKT4) som er i stand til å produsere nytt monoklonalt antistoff mot et antigen som i alt vesentlig finnes på

alle normale humane perofere hjelper-T-celler (ca. 55%

av normale humane perifere T-celler). Det antistoff som fremstilles, er monospesifikt for en enkelt determinant på normale humane hjelper-T-celler og inneholder i alt vesentlig intet annet anti-humant immunglobulin, noe som står i motsetning til tidligere kjente antisera (som alltid var forurenset med antistoff som var reaktivt overfor en rekke humane antigener), og i motsetning til tidligere kjente monoklonale antistoffer (som ikke var monospesifikke for et humant hjelper-T-celleantigen). Videre har man funnet at nevnte hybridceller kan dyrkes, slik at man kan fremstille antistoff uten at man trenger å immunisere og avlive prøvedyr fulgt av meget omfattende absorpsjons-

og rensingstrinn som heller ikke da førte til annet enn urent antisera.

Det er følgelig en hensikt med foreliggende oppfinnelse

å tilveiebringe antistoffer mot et antigen som i alt vesentlig finnes på alle normale humane hjelper-T-celler.

Ved diagnose av lidelser anvendes nevnte antistoffer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et monoklonalt antistoff av IgG2~klassen for bruk som diagnostisk middel for påvisning av T-cellelymfomer, kjennetegnet ved at det reagerer med vesentlig alle normale humane perifere hjelper-T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager, og ikke reagerer med leukemiske celler fra mennesker med kronisk lymfoblastisk T-celle-leukemi.

Fremstilling av nevnte monoklonale antistoff kan hensikts-messig foretas ved at man

i) immuniserer mus med E-rosett-positive, rensede

humane T-celler;

ii) fjerner miltene fra nevnte mus og danner en

suspensjon av miltceller;

iii) sammensmelter nevnte miltceller av musemyelomceller i nærvær av en sammensmeltingspromotor;

iv) fortynner og dyrker de sammensmeltede cellene i separate brønner i et medium som ikke vil under-støtte de usammensmeltede myelomcellene;

v) bedømmer supernatanten i hver brønn inneholdende en hybridom for nærvær av antistoff til E-rosett-positive rensede T-celler;

vi) selekterer og kloner hybridomer som reagerer

med vesentlig alle normale humane perifere hjelper-T-celler (som er ca. 55% av alle normale humane perifere T-celler), men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager, og som ikke reagerer med leukemiceller fra mennesker med kronisk lymfoblastisk T-celleleukemi; og

vii) utvinner antistoffet fra supernatanten over nevnte kloner eller overfører nevnte kloner intraperitonealt i mus og innhøster den ondartede ascites eller serum fra nevnte mus.

Hybridcellene eller hybridomene ble fremstilt i alt vesentlig ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet av Milstein og Kohler. Etter en immunisering av mus med normale E-rosett-positive humane T-celler, blir miltceller i de immuniserte mus koblet sammen med celler fra en musemyelomcelle, og de resulterende hybridceller blir så undersøkt med hensyn til hvorvidt væsken inneholder det antistoff som ga en selektiv binding til normale E-rosett-positive humane T-celler. De ønskede hybridceller blir deretter klonet og karakterisert. Som et resultat av dette får man en hybridcelle som er i stand til å gi antistoff (betegenet 0KT4) mot et antigen som i alt vesentlig finnes på alle normale humane hjelper-T-celler. Ikke bare reagerer dette antistoff i alt vesentlig med alle normale humane perifere hjelper-T-celler, men noe som er meget viktig, det reagerer ikke med andre normale perifere blodlymfoidceller, såsom ikke-hjelper-T-celler. Det celle-overflateantigen som reagerer med et antistoff, kan videre påvirkes i ca. 80% av normale-humane thymocytter.

Pasienter med nedarvet type II agammaglobulinemi ble

påvist ved hjelp av OKT4 antistoff i en blindprøve. Det foreliggende antistoff reagerer også med ca. 55% av de perifere T-cellene hos Rhesus-aper.

Sett på bakgrunn av de vanskeligheter som man tidligere har hatt i å bruke onartede svulstcellelinjer som antigenet, så var det relativt overraskende at foreliggende fremgangsmåte skulle gi den ønskede hybridcelle. Det skal understrekes at den uforutsigbare natur på hybridcelle-prepareringen ikke gjør det mulig å ekstrapolere fra et antigen eller cellesystem til en annen. Man har i virkeligheten oppdaget at det å bruke en T-cellelinje fra ondartet svulst som antigenet, bare ga en dannelse av hybridcelle som ikke ga det ønskede antistoff. Forsøk på

å bruke renset antigen fremstilt fra celleoverflatene var heller ikke vellykket.

Hybridcellen og foreliggende antistoff som fremstilles

ved hjelp av denne, identifiseres her med betegnelsen "0KT4", og denne betegnelse vil bli brukt i det etter-følgende. Hybridcellen OKT4 ble deponert hos The American Type Culture Collection, 12301, Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, den 26. april 1979, og er blitt gitt aksesjons-nr. CRL 8002.

Fremstilling og karakterisering av den angitte hybridom eller hybridcelle og det resulterende antistoff vil fremgå fra det nedenstående.

Fremgangsmåten for fremstilling av den benyttede hybridom innbefatter generelt følgende trinn: A. Immunisering av mus med E-rosett-positivt renset normale humane perifere T-celler. Skjønt man har funnet at CAF^ hunnmus er foretrukket, så kan man også bruke andre musestammer. Immuniseringen og T-cellekonsentrasjonen bør være slik at man får brukbare mengder av egnede splenocytter. Man.har funnet det effektivt å utføre tre immuniseringer med 14 dagers mellomrom med to ganger 10^ celler/ mus/injeksjon i 0,2 ml fosfatbufret salt-oppløsning.

B. Fjerning av milten fra de immuniserte mus og lager en miltsuspensjon i et passende medium. Ca. 1 ml medium/milt er tilstrekkelig. Denne type eksperimentteknikk er velkjent.

C. Sammensmelting eller fusjon av de suspenderte miltcellene med musemyelomceller fra en egnet cellelinje ved hjelp av en egnet sammensmeltings-fremmende forbindelse. Det foretrukne forhold er ca. 5 miltceller/myelomceller. Man har funnet at det er passende med et totalt volum fra 0,5 til 1,0 ml sammensmeltingsmedium for omkring 10g splenocytter. Der er tilgjengelig i mange

musemyelomcellelinjer, vanligvis fra forskjellige universiteter og cellebanker, såsom The Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, CA. Den cellelinje som brukes, bør være såkalt "legemiddel-resistent", slik at de usammensmeltede myelomceller ikke vil overleve i et selektivt medium, mens hybriden vil overleve. Den mest vanlige typen er 8-azaguaninresistente cellelinjer som mangler enzymet hypoxantinguanin-fosforibosyltransferase, og vil følgelig ikke bli understøttet av HAT (hypoxantin, aminopterin og thymidin)-medium. Det er også vanligvis foretrukket at den myelomcellelinje som brukes, er en såkalt "ikke-utskillende type", det vil si at den ikke i seg selv frembringer noe antistoff, skjønt man også kan bruke utskillende typer. I visse tilfeller vil det imidlertid være foretrukket å bruke utskillende myelomlinjer. Skjønt den foretrukne sammen-smeltingsfremmende forbindelse er polyetylenglykol med en midlere molekylvekt fra 1000 til 4000 (kommersielt tilgjengelig som PEG 1000 etc.), så kan man også bruke andre forbindelser som er velkjente.

D. Fortynning og dyrking i separate beholdere, blandingen av usammensmeltede miltceller, ikke-sammensmeltede myelomceller og sammensmeltede celler i et selektivt medium som ikke vil under-støtte de ikke-sammensmeltede myelomceller, i et tilstrekkelig tidsrom til at man er sikker på at alle de ikke-sammensmeltede celler er døde (ca. 1 uke). Fortynningen kan være av en begrensende type, hvor volumet på for-tynningsmiddelet er statisk beregnet til å isolere et visst antall celler (f.eks. 1-4) i hver separate beholder (f.eks. i hver grop i en mikrotitreringsplate). Mediet er et (f.eks. et HAT-medium) som ikke vil understøtte den legemiddel-resistente

(f.eks. 8-azaguanin-resistente), ikke-sammensmeltede myelomcellelinje. Ettersom de ikke-sammensmeltede miltcellene er ikke-ondartede, har de bare et visst antall generasjoner. Således vil de etter et visst tidsrom (ca. 1 uke) ikke lenger reprodusere seg selv, og dø ut. De sammensmeltede cellene vil på den annen side fortsette å reprodusere seg ettersom de har samme ondartede kvalitet som myelomstamcellen, og følgelig en evne til å overleve i det selektive medium for miltstamcellen.

E. Bedømmelse av supernatanten i hver beholder (brønn), som inneholder en hybridcelle for nærvær av antistoff til E-rosett-positivt rensede humane T-celler.

F. Seleksjon (f.eks. ved begrensende fortynning) og kloning av hybridceller som produserer det ønskede antistoff.

Så snart den ønskede hybridcelle er valgt og klonet, kan det resulterende antistoff fremstilles på en av to måter. Man får det reneste monoklonale antistoff ved in vitro dyrking av den ønskede hybridcelle i et egnet medium i et egnet tidsrom, fulgt av en utvinning av det ønskede antistoff fra supernatanten. Et egnet medium og egnet tidsrom for dyrkingen er vanligvis kjent og kan lett bestemmes. Denne in vitro teknikk gir et i alt vesentlig monospesifikt antistoff, i alt vesentlig fri for andre spesifikke antihumane immunglobuliner. Det er en mindre mengde av andre immunglobuliner til stede ettersom mediet inneholder xenogent serum (f.eks. serum fra kalvefoster). Denne in vitro-metode vil imidlertid ofte ikke gi en tilstrekkelig mengde eller konsentrasjon av antistoff for visse formål, ettersom konsentrasjonen av monoklonalt antistoff bare er ca. 50^ug/ml.

For å fremstille en langt større konsentrasjon av noe mindre rent monoklonalt antistoff kan den ønskede hybridcelle injiseres i mus, fortrinnsvis syngenisk eller semi-syngenisk i mus. Hybridcellen vil frembringe en dannelse av antistoff-fremstillende svulster etter en egnet in-kuberingstid, og dette vil resultere i en høy konsentrasjon av det ønskede antistoff (5-20 mg/ml) i blodstrømmen og det peritoneale eksudat (ascites) i vertmusen. Skjønt disse vertmus også har normale antistoffer i sitt blod og sitt peritoneale eksudat, så vil konsentrasjonen av disse normale antistoffer bare være ca. 5% av konsentrasjonen av det monoklonale antistoff. Ettersom disse normale antistoffer videre ikke er antihumant i sin spesifisitet,

så vil det monoklonale antistoff man oppnår fra den opp-samlede ascites eller fra nevnte serum, i alt vesentlig være fritt for eventuelt forurensende antihumant immunglobulin. Dette monoklonale antistoff har høy aktivitet (aktiv ved fortynninger på 1:50.000 eller høyere), og har høyt forhold mellom spesifikt til ikke-spesifikt immunglobulin (ca. 1/20). Det fremstilte immunglobulin som innbefatter K-lette myelomkjeder, er ikke-spesifikt, "nonsense"-peptider som bare fortynner monoklonalt antistoff uten at det svekker dets spesifisitet.

Eksempel I

Fremstilling av monoklonalt antistoff

A. Immunisering og somatisk cellehybridisering

CAF, hunnmus (Jackson Laboratories, 6-8 7uker gamle) ble immunisert intraperitonealt med 2 x 10 E-rosett-renset T-celler i 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning med 14 dagers mellomrom. Fire døgn etter den tredje injiseringen ble milten tatt ut av musene, og det ble fremstilt en enkelt cellesuspensjon ved å presse vevet gjennom en sikt av rust-fritt stål.

Cellesammensmelting ble utført ved hjelp av en fremgangs-

8

måte som var utviklet av Kohler og Milstein. 1 x 10 splenocytter ble koblet i-0,5 ml fusjonsmedium som inn-befattet 35% polyetylenglykol (PEG 1000) og 5% dimetyl-sulfoksyd i RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island,

NY) med 2 x 10 <7>P3X63Ag8Ul myelomceller levert av dr.

M. Scharff, Albert Einstein College of Medicine, Bronx,

NY. Disse myelomceller utskiller IgG-^ K-lette kjeder.

B. Seleksjon og vekst av hybridceller

Etter cellesammensmelting eller fusjon ble cellene dyrket

i et HAT medium (hypoxantin, aminopterin og thymidin) ved 37°C og 5% C02 i en fuktig atmosfære. Flere uker senere ble fra 40 til 100yUl av supernatanten fra kulturene inneholdende hybridcellene tilsatt en pellet av 10^ periferielle lymfocytter utskilt i E-rosett-positivt (E<+>) og E-rosett-negativt E~) populasjoner som var fremstilt fra blodet hos friske pasienter slik det er beskrevet av Mendes (J. Immunol. 111:860. 1973). Påvisning av at musehybridcelleantistoff var bundet til disse celler ble bestemt ved en radioimmunprøve og/eller indirekte immunoflucrescens. I den første metoden ble cellen først

125

omsatt med 100 / /u cl affinitetsbegrenset 1 geit-

antimus IgG (10 cpm/^ug, 500^g/yUl). (Detaljer med hensyn til inkorporeringen av iod i geit-anti-mus IgG er beskrevet av Kung et al., J. Biol. Chem. 251 (8): 2399, 1976). Alternativt blir cellene inkubert med kulturvæsken og ble merket med en fluorescerende geite-anti-mus IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories, Springfield, VA, F/p = 2,5),

og de fluorescerende antistoffbelagte celler ble så analysert på en Cytofluorograf FC2000/4800A slik det er beskrevet i eksempel III. Hybridcellekulturer som inneholdt antistoffer som reagerte spesifikt med E<+> lymfocytter (T-celler) ble så valgt ut og klonet. Deretter ble klonene overført intraperitonealt ved injisering av 1 x 10^ celler av en gitt klon (0,2 ml volum) inn i CAF^ mus som på forhånd var behandlet med 2,6,10,14-tetrametylpentadekan ("Pristine"). De ondartede ascites fra disse mus ble så brukt for å karakterisere lymfocytter slik som beskrevet i eksempel II. Hybridantistoff OKT4 ble vist ved hjelp av standardteknikk til å være IgC^ underklassen og til å fiksere komplement.

E ksempel II

^ Karakterisering av OKT4- reaktivitet

A. Isolering av lymfocyttpopulasjoner

Humane perifere blodmononukleære celler ble isolert fra friske, frivilllige (alder 40-50) ved en såkalt Ficoll-Hypaque-tetthetsgradientsentrifugering idet man brukte

den teknikk som er beskrevet av Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. SA) 77, 1968. Ufraksjonerte mononukleære celler ble separert i overflate Ig<+> (B) og lg (T pluss null) populasjoner ved hjelp av en Sephadex G-200 anti-F (ab')2 kolonne, noe som på forhånd er beskrevet av Chess et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). T-cellene ble

så utvunnet ved en såkalt E-rosetting av lg populasjonen

med 5% saueerytrocytter. Selve rosettblandingen ble så lagt over Ficoll-Hypaque, og den utvundne E<+> pellet ble behandlet med 0,155M NH4C1 (10 ml pr. IO<8> celler). Den oppnådde T-cellepopulasjonen var mindre enn 2% EAC-rosett-positiv og mer enn 95% E-rosett-negativ slik dette kunne bestemmes ved standard teknikk. I tillegg ble ikke-rosetterende Ig~(null-celle) populasjon innhøstet fra Ficoll-grenseflaten. Den sistnevnte populasjonen var mindre enn 5% E+ og mindre enn 2% slg+. Overflate Ig+ (B) populasjonen ble oppnådd fra Sephadex G-200 kolonne fulgt av en eluering med normalt humant gammaglobulin

slik den er beskrevet tidligere. Denne populasjon var mer enn 95% overflate Ig<+> og mindre enn 5% E<+>.

Normale humane makrofager ble oppnådd fra den mononukleære populasjon ved tilfesting til polystyren. De mononuklære celler ble således resuspendert i det endelige kulturmedium (RPMI 1540, 2,5 mM HEPES [4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazin-propansulfonsyre]buffer, 0,5% natriumkarbonat, 200 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin supplementert med 20% varmeinaktivert humant AB-serum) ved en konsentrasjon på 2 x 10 celler og inkubert i plastpetriskåler (100 x 20 mm) ved 37°C natten over. Etter inngående vasking for å fjerne ikke-tilfestede celler, ble den tilfestede populasjonen løsnet ved kraftig vasking med halvt serumfritt serum inneholdende 2,5 mM EDTA og eventuelt med skraping med gummispissen på en engangspipette. Mer enn 85% av cellepopulasjonen var i stand til å innta latekspartikler og hadde morfologiske egenskaper av samme type som man finner i monocytter, noe som ble påvist ved Weight-Giemsa-farging.

B. Normal thymus

Normale menneskethymuskjertler ble oppnådd fra pasienter

hvis alder varierte fra 2 måneder til 14 år som var under-kastet korrigerende hjertekirurgi. Nylig oppnådde deler av thymuskjertelen ble umiddelbart plassert i 5% serum fra

kalvefoster i medium 199, og ble finfordelt med pinsetter og kniver, og deretter opparbeidet til en enkelt cellesuspensjon med pressing gjennom et fint nett. Cellene ble så lagt over Ficoll-Hypaque og sentrifugert og vasket som beskrevet i avsnitt A ovenfor. De oppnådde thymocytter var mer enn 95% levende og. lik eller mer enn 90% rosett-

positive.

C. Cellelinje

Epstein-Barr-virus (EBV) omdannede B-celler fra fire normale pasienter (Laz 007, Laz 156, Laz 256 og SB) og T-celle-

linjer CEM, HJD-1, Laz 191 og HMl fra leukemiske pasienter ble tilveiebragt av dr. H. Lazarus, Sidney Farber Cancer Institute, Boston, MA.

D. Akutte lymfoblastiske leukemi (T-ALL)-celler og kroniske

lymfatisk leukemi ( T- CLL) T- celler

Leukemiceller ble oppnådd fra 12 pasienter med T-ALL. Disse celler var på forhånd blitt bestemt til å være T-celle-opprinnelse p.g.a. sin spontane rosett-dannelse med saueerytrocytter ( <>> 20% E<+>) og reaktivitet med T-celle-spesifikt heteroantisera, anti-HTL (anti-B.K.) og A99, slik det er beskrevet av Schlossman et al. Proe. Nat. Acad. Sei. 73, 1288 (1976). Svulstceller fra tre pasienter var reaktivt (TH2<+>) med kanin og/eller hest anti-TH2, mens celler fra de gjenværende ni pasienter var ikke-reaktiv (TH2 ). Leukemiceller fra to pasienter med TH2 -T-CLL ble også brukt.

Både akutte og kroniske T-celleleukemiceller ble ultra-dypfryst med 196°C i flytende nitrogen i 10% dimetyl-sulfoksyd og 20% AB menneskeserum inntil de skulle overflatekarakteriseres. I alle tilfeller var de svulst-analyserte populasjoner mer enn 90% (blasts), noe som ble bestemt ved Wright-Giemsa-morfologi.

Eksempel III

Cytofluorografisk analyse og celleseparasjon

Cytofluorografisk analyse av alle cellepopulasjoner ble utført ved indirekte immunofluorescens med fluorescein-konjugert geit-anti-mus (G/M FITC) (Meloy Laboratories)

på en Cytofluorograf FC200/4800A. Kort fortalt ble 1-2

x IO<6> celler behandlet med 0,15 ml OKT4 ved en 1:1000 fortynning, inkubert ved 4°C i 30 min. og vasket to ganger. Cellene ble omsatt med 0,15 ml av en 1:40 fortynning G/M FITC ved 4°C i 30 min., sentrifugert og vasket tre ganger. Disse celler ble så analysert på cytofluorografen og intensiteten på fluoresceringen pr. celle ble målt på en puls-høydeanalysator. Et lignende mønster med hensyn til reaktivitet ble observert ved en fortynning på 1:50.000,

men ytterligere fortynning ga et tap av reaktivitet. Bak-grunnsfarging ble oppnådd ved å bruke en 0,15 ml porsjon av 1:1.000 ascites fra en Balb/cJ mus som var intraperitonealt immunisert med en ikke-produsrende hybridklon.

I eksperimenter som ble utformet for å skille OKT4+ og

OKT4<-> celler, ble 100 x 10 ufraksjonerte mononukleære celler eller thymocytter merket med 4 ml av en 1:1000 fortynning av OKT4 og utviklet G/M FITC. En identisk farging ble brukt for å fremstille humane T-celler isolert som beskrevet i eksempel IIA ovenfor. Idet man brukte en fluorescensaktivert cellesortering (FACS) (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) ble lymfocyttene skilt i en OKT4<+> og OKT4 populasjon. Levedyktigheten etter sortering var mer enn 95% bestemt ved hjelp av Trypan-blått-utelukkelse i alle tilfeller. Renheten på alle de utskilte populasjoner var mer enn 95%.

Eksempel IV

Analyse av PACS utskilte 0KT4<+> og 0KT4 celler med heste-anti- TH2

0KT4<+> og 0KT4~ T-celler blit utskilt på FACS og plassert i en kultur i en mengde på 2 x 10^ celler pr. ml RPMI

1640 (Grand Island Biological Company), inneholdende 20% humant AB serum, 1% penicillin-streptomycin, 200 mM L-glutamin, 25 mM HEPES buffer og 0,5% natriumkarbonat.

Etter 24 timer i en 5% C09 fuktig atmosfære ved 37°C

ble 1-2 x 10 6 celler av hver populasjon omsatt rned heste anti-TH2 og farget med fluorescein-konjugert IgG fraksjon kanin anti-hest lg (Cappel Laboratories, Downington, PA), slik det er beskrevet av Reinherz og Schlossman, J. Immunol, 122:1355-1341 (1979). Bakgrunnsfargen ble bestemt ved å anvende normalt heste-IgG for spesifikt antistoff og farging som beskrevet ovenfor.

Eksempel V

Funksjonelle studier

A. Proliferative studier

Den mitogene reaksjon på useparerte og FACS-separerte lymfoid-celler ble prøvet i .mikrokultur under optimale og sub-optimale doser av Concanavalin A (Con A) og fyto-hemaglutinin (PHA). Den allo-antigene proliferative respons ble målt samtidig for disse populasjoner ved å bruke mito-mycin c behandlet Laz 156, en EBV transformert human B-lymfoblastoid cellelinje som substans. Formering i forhold til tetanus toksoid (Massachussets Department of Public Health Biological Laboratories, Boston, MA) ble prøvet ved å bruke 10^ug/ml endelig konsentrasjon. Herpes-Zoster antigen ble tilveiebragt av dr. John Zaia (Harvard Medical School, Boston, MA) og brukt i en 1:6 fortynning.

5% makrofager oppnådd på samme måte ble tilsatt alle populasjoner ved begynnelsen av in vitro-kulturen. De mitogenstimulerte kulturer ble etter 4 døgn tilsatt 0,2 ^uCi <3>H-thymidin (<3>H-TdR), (1,9 Ci/mM spesifikk aktivitet)

(Schwarz-Mann, Division of Becton, Dickinson, Organeburg, NY) og høstet 18 timer senere ved hjelp av et MASH II ap, parat (Microbiological Associates). <3>H-TdR inkorporering ble målt i en Packard Scintillation Counter (Packard

3 Instrument Company, Downer's Grove, IL). Bakgrunn H-TdR inkorporering ble oppnådd ved å bruke medium i stedet for mitogen. Oppløselig antigen og allo-antiqenstimulerte kulturer ble behandlet etter fem døgn med <3>H-TdR i 18 timer, høstet og målt som nevnt ovenfor.

B. Cytotoksisitetsundersøkelser

Sensitiveringskulturer for cellestyrt lymfolyse (CML) ble etablert ved å plassere ufraksjonerte T-celler, FACS-separte OKT4<+> og OKT4~ celler, eller forskjellige forhold mellom rekombinert OKT4<+> og OKT4 T-celler med mitomycin-behandlede stimulatorceller, alle i en konsentrasjon på

2 x 10 celler pr. ml i brønnene i en mikrotitreringsplate. Etter fem døgn ble ikke-levende celler fjernet ved Ficoll-Hypaque-sentrifugering. Disse ufraksjonerte og fraksjonerte T-celle-populasjoner ble så tilsatt til Cr natriumkromat-merkede måleceller, og spesifikk kromfrigjøring ble bestemt etter seks timers celleinkubering. I andre eksperimenter ble ufraksjonerte T-celler sensitivert med mitomycin-behandlede stimulatorceller som beskrevet ovenfor, og så fraksjonert i OKT4<+> og OKT4~ T-celler på FACS etter fem døgn i MLC, og spesifikk kromfrigjøring ble bestemt. Prosentvis cytotoksisitet ble bestemt ved hjelp av følgende formel: 51 51 <51> Cr frigjort ved eksperiment - Cr 51 frigjo rt, spontant X ,n Cr frigjort ved fryseopptinning - Cr frigjort spontann

Alle prøver ble utført i tre paralleller or resultatet uttrykt som et middel. Spontan frigjøring var mindre enn 20% av maksimal oppløsning i alle tilfelle. Fig. 1 viser det fluorescensmønster man fikk på en cytofluorograf etter å ha reagert normale humane perifere T-celler med OKT4 i en 1:1000 fortynning og G/M FITC. For sammenligning er resultater med monoklonalt antistoff 0KT1 og OKT3 vist under tilsvarende betingelser på fig. 1-5. Fig. 2 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorografen etter å ha reagert humane thymocytter med OKT4 og G/M FITC. Fig. 3 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorografen etter å ha reagert leukemiske celler fra B-cellekroniske lymfoblastiske leukemipasienter med OKT4 og

G/M FITC.

Fig. 4 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorografen etter å ha reagert den humane T-cellelinje HJD-1 med OKT4 og G/M FITC. Fig. 5 viser det fluorescensmønster man fikk på cytofluorografen etter å ha reagert den humane T-cellelinjen CEM med OKT og G/M FITC. Fig. 6 viser resultatene ved en reaksjon mellom T-cellepopulasjonen og anti-TI^ serum fra hest. Fig. 7 viser den cytotoksiske kapasiteten på ufraksjoinerte T-celler og T-cellefraksjoner. Prosent spesifikk lysis er vist på ordinaten og effektor/mål (E/T) forholdet er vist på abscissen.

Fremstillingen av hybridcellen og fremstillingen og karakterisering av det resulterende monoklonale antistoff ble ut-ført som beskrevet i ovennevnte eksempler.

Skjønt store mengder av det foreliggende antistoff ble fremstilt ved injeksjon av nevnte hybridcelle intraperitonealt i mus og høsting av de ondartede ascites, så er det klart at hybridcellen også kan dyrkes in vitro ved velkjent teknikk, hvoretter antistoffet fjernes fra reaksjonsmediet.

Som vist på fig. 1 er ca. 45% av den humane perifere blod-T-cellepopulasjon for en gitt pasient reaktivt med 0KT4,

mens hele B-celle-, null-celle- og makrofagpopulasjon isolert fra samme pasient er ureaktivt med 0KT4. Lignende resultater ble oppnådd på populasjoner av lymfocytter fra femten andre normale individer. Det monoklonale antistoff er således karakterisert ved at det er reaktivt med et antigen som foreligger på overflaten av ca. 55% av normale humane perifere T-celler, men som er reaktivt med eventuelle andre antigener på overflaten av de andre tre celletyper som er beskrevet ovenfor. Slik det vil bli nevnt nedenfor, så er 0KT4<+->

delen av de humane perifere T-cellene i underklassen av såkalte hjelper-T-celler. Denne differensielle reaktivitet er en prøve ved hjelp av hvilken foreliggende antistoff 0KT4 kan påvises og skilles fra andre stoffer antistoff.

Som vist på fig. 2 er ca. 80% av normale humane thymocytter fra et seks måneder gammelt spedbarn reaktivt med 0KT4. Lignende resultater (ca. 80% reaktivitet) ble oppnådd ved å bruke seks ytterligere thymusprøver fra normale individer hvis alder varierte fra 2 måneder til 19 år. Reaktivitets-mønsteret på fig. 2 gir en annen fremgangsmåte for å på-

vise foreliggende antistoff OKT4 og skille dette fra antistoff .

Som vist på fig. 2 vil foreliggende antistoff være ureaktivt med leukemiceller oppnådd fra en B-celle kronisk lymfoblastisk leukemi.

En ytterligere karakterisering av det foreliggende antistoff OKT4 er vist ved dets reaktivitet overfor forskjellige T-cellelinjer slik dette er vist på fig. 4 og 5. Det frem-går av figurene at reaktiviteten ved foreliggende antistoff på humane T-cellelinjer var heterogen, idet det var sterkt for linjen CEM, og ikke eksisterende for linjen HDJ-1. Det var heller ingen reaktivitet med cellelinjene Laz 191 og HMl. Denne differensielle reaktivitet på 0KT4 på forskjellige lett tilgjengelige humane T-cellelinjer gir en ytterligere fremgangsmåte for å karakterisere og beskrive foreliggende antistoff. Fig. 6 illustrerer reaktiviteten på 0KT4 utskilte undergrupper med anti-TH2. Ca. 25% av den ufraksjonerte T-cellepopulasjon er reaktivt med anti-TH2. I motsetning tii dette vil 0KT4 populasjonen inneholde noen celler som er reaktive ved anti-TH_, mens en normal 0KT4 populasjon i alt vesentlig er TH2 + og inneholder alle de TH2 + celler som finnes i en ufraksjonert T-cellepopulasjon. Dette indi-kerer at TH2<+> og 0KT4<+> undergruppene er resiproke og distinkte . Fig. 7 viser den cytotoksiske kapasiteten på ufraksjonerte 0KT4<+> og 0KT4 T-celler. 0KT4<+> populasjonen var bare minimalt cytotoksisk, mens graden av dreping styrt ved hjelp av 0KT4 populasjonen er større enn den man finner for ufraksjonert T-cellepopulasjon. Denne differensielle reaktivitet på 0KT4 + og 0KT4 — T-cellepopulasjonene som er vist på fig. 6 og 7, er en ytterligere mulighet for å karakterisere det foreliggende antistoff.

De resultater som er vist på fig. 1-5, er summert opp og tilført ytterligere data i tabell I nedenfor. Denne tabell sammenligner monoklonale antistoffer fremstilt ved hybridceller betegnet 0KT1, 0KT3 og 0KT4 (den sistnevnte er den som inngår i foreliggende- oppfinnelse). I tillegg til data på fig. 1-5 viser tabell I også at 0KT4 er ureaktiv med normale humane perifere T-celler, null-celler og makrofager, så vel som leukemiske celler fra pasienter med T-celle-og null-celle-akutt lymfoblastisk leukemi, og EBV trans-formerte B-cellelinjer. I motsetning til 0KT1 reagerer ikke 0KT4 med leukemiske celler fra T-cellekroniske lymfoblastiske leukemipasienter.

Funksjonelle studier ble utført på lymfoide populasjoner som var utskilt på en fluorescensaktivert celleseparator (FACS). Resultatene er vist i tabell II til IV og gir ytterligere underlag for den forannevnte karakterisering av det foreliggende monoklonale antistoff.

I disse undersøkelser ble en ufraksjonert T-celle-populasjon behandlet med en 1:1.000 fortynning av OKT4 og G/M FITC og utskilt på FACS i OKT4<+> og OKT4~ grupper. Med den gitte renhet på populasjonene (mer enn e±ler lik 95%) ble 5% makrofager tilsatt de separerte populasjoner før en in vitro-kultur. Den ufraksjonerte T-cellepopulasjon og isolerte OKT4<+->og OKT4~-T-cellegruppene ble så stimulert med PHA, Con A, oppløselige antigener og allo-antigener for å bedømme deres in vitro-formerende reaksjon.

Den proliferative respons til de ufraksjonerte T-celle-populas jonene til PHA og Con A er vist i tabell II. Man fikk maksimal proliferativ respons hos den ufraksjonerte T-cellepopulasjonen med l^ug PHA pr. 10^ celler og svekket reaksjon ved 0,5^,ug og 0,l^ug PHA pr. 10^ celler. Behandling av ufraksjonerte T-celler med OKT4 og geit-mis FITC uten etterfølgende fraksjonering endret ikke denne proliferative respons. I motsetning til dette oppnådde man differensiert reaksjon overfor PHA med nevnte utskilte OKT4<+> og OKT4 T-cellegrupper. 0KT4<+> populasjonen av celler reagerte alle på doser med PHA på lignende måte som useparerte T-celle-populas joner . Imidlertid, den proliferative respons til OKT4 cellene var betydelig mindre ved alle doser som

ble undersøkt. Ved en dose PHA på 0,l^ug pr. 10 celler formerte ikke OKT4~ T-cellene seg i det hele tatt, mens 0KT4+ cellegruppen og de ufraksjonerte celler reagerte ved denne dose. Den proliferative respons til disse undergrupper på Con A var på den annen side helt lik, og de to undergrupper av celler kunne ikke skilles fra hverandre og

heller ikke den ufraksjonerte T-cellepopulasjon. Man under-søkte deretter reaksjonen på allo-antigen i MLC og oppløselige antigener. Som vist i tabell III reagerte den ufraksjonerte T-cellepopulasjonen, den ufraksjonerte T-cellepopulasjon behandlet 0KT4 og G/M FITC, og både 0KT4<+> og 0KT4~ T-celle-gruppene på lignende måte i MLC mot Laz 156. Det skal imidlertid bemerkes at 0KT4- cellene fra to av de seks individer som ble prøvet, skjønt de viste en betydelig formering i MLC, inkorporeres i mindre <3>H-TdR enn deres 4.

respektive 0KT4 undergruppe (data ikke vist). I motsetning til dette var de formerende reaksjoner overfor oppløselige antigen den klareste distinksjon mellom undergruppene.

I alle de tilfeller som ble prøvet, viste 0KT4<+> T-celleundergruppen meget god formering i forhold til oppløselige antigener, tetanustoksoid og Herpes-Zoster, mens 0KT4 T-celleundergruppene var helt ureaktiv.

Tabell IV viser at 0KT4<-> undergruppen av T-celier ikke kan frembringe noe cytolyse når den blir sensitivert alene i MLC. Skjønt 0KT4~ T-cellene blir cytotoksiske effektorer

i ufraksjonerte allo-sensitiverte T-cellepopulasjoner, kan det ikke som sådan alene bli indusert til å styre CML til tross for sin reaksjon i MLC, Videre kunne man påvise at når 0KT4<+> populasjonen ble sensitivert i MLC eller et fravær av 0KT4~ T-celler, så kunne de styre en moderat, men betydelig lysis i MLC. Imidlertid viste det seg at den rekombinerte blanding av 0KT4<+> og OKT4 T-celler ga en maksimal cytolyse, noe som står i sterk motsetning til det man fant for en useparert T-cellepopulasjon. Dette viser klart at 0KT4 undergruppen ikke kan frembringe en maksimal cytotoksisk reaksjon alene, men krever hjelp av 0KT4+ populasjonen. Denne T-T interaksjonen er analog til det man finner for T-cellehjelp man får fra TH ~ T-celleundergruppeb til TH2 T-celleundergruppen ved utvikling av maksimal cytotoksisitet.

Skjønt man bare har beskrevet en enkelt hybridcelle som gir et enkelt monoklonalt antistoff mot human hjelper-T-celleantigen, så er det underforstått at foreliggende oppfinnelse også innbefatter alle monoklonale antistoffer som viser de egenskaper som er beskrevet her. Det ble bestemt at foreliggende antistoff 0KT4 hører til undergruppen IgG2, som er en av de fire undergruppene for IgG fra mus. Disse undergrupper av immunglobulin G skiller seg fra hverandre i de såkalte "fikserte" områder, skjønt et antistoff til et spesifikt antigen vil også ha et såkalt "varia-belt" område som er funksjonelt identisk uten hensyn til hvilken undergruppe av immunglobulin G-stoffet hører til. Dette betyr at monoklonalt antistoff som viser de egenskaper som er beskrevet her, kan være av underklassene IgG-^, IgG^a, IgG2b eller IgG3 eller av klasse IgM, IgA eller andre kjente Ig-klasser. Forskjellene mellom disse klasser eller underklasser vil ikke påvirke selektiviteten på reaksjonsmønsteret og antistoffet, men kan påvirke ytterligere reaksjon mellom antistoffet og andre materialer, såsom (f.eks.) komplement eller anti-mus-antistoffer. Skjønt det foreliggende antistoff er spesifikk IgG2, så er det underforstått at antistoffer med samme relativitetsmønster som vist her, inngår i foreliggende oppfinnelse uten hensyn til hvilken immunglobulinklasse eller underklasse de hører til.

Skjønt bare ett eksempel på en hybridcelle er gitt her, er det underforstått at man lett etter immunisering, sammensmelting og celleseleksjon slik det er beskrevet her, kan oppnå andre hybridceller som er i stand til å fremstille antistoffer som har de reaktivitetsegenskaper som er beskrevet her. Ettersom individuelle hybridceller fremstilt fra en kjent musemyelomcellelinje og miltceller fra en kjent art mus ikke kan ytterligere identifiseres bortsett fra det antistoff som fremstilles av hybridcellen, så er det underforstått at alle hybridceller som gir antistoff med samme reaktivitetsegenskaper som beskrevet ovenfor, inngår i foreliggende oppfinnelse, så vel som fremgangsmåte for fremstilling av dette antistoff når man bruker nevnte hybridcelle.

Ved diagnose for lidelser eller sykdommer brukes monoklonalt antistoff 0KT4 eller et annet monoklonalt antistoff som viser samme reaktivitetsmønster. Det foreliggende antistoff kan brukes for å påvise type II av nedarvet eller ervervet agammaglobulinemi ved å reagere en T-celle-sammensetning fra et individ med 0KT4 antistoff. Et fravær eller et underskudd av hjelper-T-celler kan påvises ved nærvær av mindre enn 55% av den totale perifere T-celle-populas jon som reagerer med 0KT4. Denne prøve kan også brukes for å påvise hjelper-T-celledefekter eller overskudd generelt. Behandling av hjelper-T-cellekreft kan også oppnås ved å tilføre en terapeutisk effektiv mengde av 0KT4 antistoff til et individ som trenger en slik behandling. Ved en selektiv reaksjon med hjelper-T-celleantigen vil den effektive mengde av 0KT4 antistoff redusere overskuddet av hjelper-T-celler, hvorved man svekker effekten av hjelper-T-celleondartethet. Diagnostiske preparater innbefatter

en effektiv mengde av 0KT4 antistoff i blanding med diagnostiske bærestoffer.

Claims (2)

1. Monoklonalt antistoff av IgG2~klassen for bruk in-vitro som diagnostisk middel for påvisning av T-cellelymfomer, karakterisert ved at det reagerer med vesentlig alle normale humane perifere hjelper-T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, null-celler eller makrofager, og ikke reagerer med leukemiske celler fra mennesker med kronisk lymfoblastisk T-celleleukemi.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er produsert med en hybridom med deponeringsnr. ATCC CRL 8002 (OKT4) som er dannet ved sammensmelting av celler fra en musemyelomlinje og miltceller fra mus som på forhånd er immunisert med humane T-celler.