DK154087B - Monoklonalt antistof, fremstilling heraf, hybrodimacellelinie til anvendelse ved fremstilling heraf, fremgangsmaade til anvendelse heraf samt diagnostisk praeparat indeholdende antistoffet - Google Patents

Description

i

DK 154087 B

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof, fremstillingen heraf, en hybridomacellelinie til anvendelse ved fremstillingen heraf, en fremgangsmåde til anvendelse heraf samt et diagnostisk præparat indeholdende antistoffet.

5 Fusionen af muse-myeloma-celler til milt-celler fra immunicerede mus af Kohier og Milstein i 1975 (Nature 256, 495-497 (1975)) viste for første gang, at det var muligt at opnå en kontinuert celle-linie, der fremstiller homogent (såkaldt "monoklonalt") antistof. Siden dette grundlæggende arbejde har der været udfoldet store anstrengelser på at 10 fremstille forskellige hybride celler (kaldet "hybridomas") og på at anvende det ved hjælp af disse hybridomas fremstillede antistof til forskellige videnskabelige undersøgelser. Der henvises fx. til Current Topics in Microbiology and Immunology, bind 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Melchers, M. Potter og N. Warner, Editors, Springer-15 Verlag, 1978 og de deri angivne referencer, C.J. Barnstable, et al.,

Cell, 14, 9-20 (maj 1978), P. Parham og W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978), Handbook of Experimental Immunology, 3. udgave, bind 2, D.M. Wier, Editor, Blackwell, 1978, kapitel 25, og Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15-17. Disse referencer indikerer 20 samtidig belønningerne og komplikationerne ved at forsøge at fremstille monoklonalt antistof ud fra hybridomas. Selvom den almene teknik forstås principielt godt, mødes mange vanskeligheder og variationer kræves for hvert specifikt tilfælde. I virkeligheden er der ingen sikkerhed, forud for forsøget på at fremstille et givet hybridoma, for at det ønskede 25 hybridoma vil blive opnået, at det, hvis opnået, vil producere antistof eller at det således fremstillede antistof vil have den ønskede specificitet. Graden af success påvirkes principalt af den anvendte antigen-type og den til isolering af det ønskede hybridoma anvendte udvælgelsesteknik.

30 Den tilstræbte fremstilling af monoklonalt antistof for humane lymfocyt celle-overflade antigener er kun blevet rapporteret i nogle få tilfælde. Se fx. Current Topics in Microbiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De i disse rapporterede forsøg anvendte antigener var dyrkede humane lymfoblastoide leukaemia og humane kroniske lymfo-35 cytiske leukæmia celle-linier. Mange opnåede hybridomas syntes at danne antistof over for forskellige antigener på alle humane celler. Ingen af disse hybridomas dannede antistof over for en forud defineret klasse af humane lymfocyter.

2

DK 154087 B

Det bør forstås, at der findes to principielle klasser af lymfo-cyter, som er involveret i immunsysternet hos mennesker og dyr. Den første af disse (den thymus-afledte celle eller T-celle) differentieres i thymus fra hæmopoietiske stam-celler. Hens de befinder sig i 5 thymus, kaldes de differentierende celler for "thymocyter". De modne T-celler forlader thymus og cirkulerer mellem væv, lymfekar og blodbaner.

Disse T-celler udgør en stor andel af mængden af recirkulerende små lymfocyter. De har immunologisk specificitet og er direkte involveret i celle-medierede immun-reaktioner (såsom transplantationsafvisning) som 10 effektor-celler. Selvom T-celler ikke sekreterer humorale antistoffer, kræves de under tiden for udskillelsen af disse antistoffer af den nedenfor omtalte anden klasse af lymfocyter. Nogle typer af T-celler har en regulerende funktion ved andre aspekter af immun-systemet. Mekanismen for denne proces ved celle-samvirke forstås endnu ikke fuldt ud.

15 Den anden klasse af lymfocyter (de benmarvs-afledte celler eller B-celler) er de som udskiller antistof. De dannes også fra hæmopoietiske stam-celler, men deres differentiering bestemmes ikke af thymus. I fugle differentieres de i et med thymus analogt organ, kaldet Bursa Fabricii.

I pattedyr har man imidlertid ikke oplevet et ækvivalent organ og det 20 antages, at disse B-celler differentierer i benmarven.

Det anerkendes nu, at T-celler kan opdeles i mindst adskillige undertyper, kaldet "hjælpe", "suppressor", og "dræbe" T-celler, der har den funktion (hhv.) at fremme en reaktion, undertrykke en reaktion eller dræbe (lysere) fremmede celler. Disse underklasser forstås godt inden 25 for musefamilien, men er kun for nyligt blevet beskrevet for humane systemer. Se fx. R.L. Evans, et al., Journal of Experimental Hedicine, bind 145, 221-232, 1977 og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation Antigens", i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, Editor, 30 Plenum Press, 1977, bind 7, 363-379.

Evnen til at identificere klasser eller underklasser af T-celler er vigtig for diagnosen af forskellige immuno-regulatoriske uregelmæssigheder eller tilstande.

Fx. har visse leukæmi typer og lymfomas forskellig prognose i 35 afhængighed af, om de er af B-celle eller T-celle oprindelse. Således afhænger vurderingen af sygdomsprognosen af, at man kan skelne mellem disse to klasser af lymfocyter. Se fx. A.C. Aisenberg og J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (marts 1975), D. Belpomme, et al., 3

DK 154087 B

i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, et al., eds, Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Bel pomme, et al., British Journal of Haematology, 1978, 38, 85.

Visse sygdomstilstande (fx. juvenil rheumatoid arthritis, visse 5 leukæmityper og agammaglobulinæmi) hænger sammen med en ubalance af T-celle underklasser. Det er blevet foreslået, at autoimmune sygdomme i almindelighed hænger sammen med et overskud af "hjælpe" T-celler eller mangel på visse "suppressor" T-celler, mens agammaglobulinæmi hænger sammen med et overskud af visse "suppressor" T-celler. I almindelighed 10 hænger maligne tilstande sammen med et overskud af "suppressor" T-celler.

I visse leukæmityper produceres overskud af T-celler på et hæmmet udviklingsstade. Diagnosen kan derfor afhænge af muligheden for at påvise sådan ubalance eller overskud. Se. fx. J. Kersey, et al., 15 "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i Haematology and Blood Transfusion, bind 20, Springer-Verlag, 1977, 17-24 og de deri anførte referencer.

Erhvervet agammaglobulæmi, som er en sygdomstilstand, hvor der ikke produceres immunt globulin, omfatter mindst to forskellige typer. I type 20 I skyldes manglen på at producere immunt globulin et overskud af suppressor T-celler, mens den i type II skyldes en mangel på hjælpe T-celler. I begge typer synes der ikke at være nogen defekt eller mangler i patienternes B-celler, lymfocyterne som er ansvarlige for den aktuelle sekretion af antistoffet. Imidlertid er disse B-celler enten undertrykte 25 eller "ikke hjulpne", hvilket fører til stærkt formindsket eller manglende immungiobul in-produktion. Typen af erhvervet agammaglobulinæmi kan således bestemmes ved at teste for et overskud af suppressor Tceller eller et fravær af hjælpe T-celler.

Identifikationen og undertrykkelsen af humane T-celle klasser og 30 underklasser er tidligere sket ved anvendelse af spontane autoantistoffer eller selektive antisera for humane T-celler opnået ved immunisering af dyr med humane T-celler, tapning af dyrene til opnåelse af serum og adsorption af antiserum med (fx.) autologe, men ikke allogene B-celler til fjernelse af antistoffer med uønskede reaktiviteter.

35 Fremstillingen af disse antisera er særdeles vanskelig, især i adsorptions-og rensningstrinnene. De adsorberede og rensede antisera kan endog indeholde mange urenheder foruden det ønskede antistof, af adskillige grunde. For det første indeholder serum millioner af 4

DK 154087 B

antistof-molekyler, selv før T-celle-immuniceringen. For det andet bevirker immuniceringen dannelse af antistoffer mod en lang række antigener, som findes på alle injicerede humane T-celler. Der er ingen selektiv dannelse af antistof over for et enkelt antigen. For det tredje 5 er titeren af specifikt antistof opnået ved sådanne metoder sædvanligvis meget lav (fx. inaktiv ved fortyndinger på mere end 1:100) og forholdet mellem specifikt og non-specifikt antistof er mindre end 1/106, se fx. den ovenfor omtalte artikel af Chess og Schlossman (side 365 og følgende) og den ovenfor omtalte artikel i Chemical and Engineering 10 News, hvor manglerne ved hidtil kendte antisera og fordelene ved mono-klonalt antistof er beskrevet.

Der er nu fundet en ny hybridomacellelinie, som er i stand til at producere et hidtil ukendt monoklonalt antistof kaldet 0KT4 over for et antigen, som findes på i det væsentlige alle normale humane perifere 15 hjælpe T-celler (ca. 55% af normale humane perifere T-celler). Det således dannede antistof er monospecifikt for en enkelt determinant på normale, humane hjælpe T-celler og indeholder i det væsentlige ingen anden antihuman immungi obul in, i modsætning til tidligere kendte antisera (som nødvendigvis er kontamineret med antistof, der er reaktivt 20 over for talrige humane antigener) og til hidtil kendte monoklonale antistoffer (der ikke er monospecifikke for et humant hjælpe T-celle antigen). Endvidere kan denne hybridomacellelinie dyrkes til fremstilling af antistof uden nødvendigheden af at immunicere og dræbe dyr, efterfulgt af de trivielle adsorptions- og rensningstrin, som er 25 nødvendig for at opnå blot de urene antisera ifølge den kendte teknik.

Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen af klasse IgG er i overensstemmelse hermed ejendommeligt ved, at det er identisk med det monoklonale antistof, der fremstilles af hybridomacellelinien ATCC nr.

CRL 8002, og at det 30 a) reagerer med i det væsentlige alle normale humane perifere hjælpe T-celler (ca. 55% af alle normale humane perifere T-celler), men ikke med normale humane perifere B-celler, nul-celler eller makrofager, b) reagerer med ca. 80% af normale humane thymocyter, 35 c) ikke reagerer med leukæmiske celler fra mennesker med T-celle kronisk lymfoblastisk leukæmi, B-celle kronisk lym-foblastisk leukæmi, T-celle akut lymfoblastisk leukæmi eller nul-celle akut lymfoblastisk leukæmi, 5

DK 154087 B

d) reagerer med human T-celle-linie CEM (ATCC nr. CCL 119) e) ikke reagerer med Epstein-Barr vi rus-transformeret human B-celle-linie SB (ATCC nr. CCL 120), f) reagerer med ca. 55% af rhesusabe-perifere T-celler, og 5 g) fikserer komplement.

Hybridomacellelinien ifølge opfindelsen til anvendelse ved fremstillingen af nævnte monoklonale antistof er ejendommelig ved, at den er hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8002.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af nævnte mono-10 klonale antistof er ejendommelig ved, at man dyrker hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8002 in vitro i et egnet medium eller indfører den intra-peritonealt til mus og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af hjælpe T-celle 15 mangel eller overskud i et individ, fortrinsvis erhvervet type II agammaglobulinæmi, er ejendommelig ved, at et T-celle præparat fra det pågældende individ omsættes med en diagnostisk effektiv mængde af det omhandlede antistof, og at den procentuelle mængde af den totale perifere T-celle population, som reagerer med antistoffet, bestemmes.

20 Det diagnostiske præparat ifølge opfindelsen til påvisning af hjælpe T-celle mangel er ejendommeligt ved, at det i blanding med en diagnostisk acceptabel bærer omfatter det omhandlede antistof i en mængde, som er effektiv til påvisning af hjælpe T-celle mangel.

En prøve af det omhandlede hybridoma deponeredes hos American Type 25 Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, HD, 20852 d. 26. april 1979 og har fået tildelt ATCC nummer CRL 8002.

Den omhandlede hidtil ukendte hybridomacellelinie ATCC nr. CRL 8002 er fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Milstein og Kohier. Efter immunicering af mus med normale E-roset positive humane T-30 celler, fusioneredes de immunicerede mus' milt-celler med celler fra en muse-myeloma-linie og de resulterende hybridomas screenedes for sådanne med supernatanter indeholdende antistof, som gav selektiv binding til normale E-roset positive humane T-celler. De ønskede hybridomas blev derefter klonet og karakteriseret. Som resultat opnåedes hybridoma-35 cellelinien ATCC nr. CRL 8002, som danner antistof (kaldet 0KT4) over for et antigen på i det væsentlige alle normale humane hjælpe T-celler.

Dette antistof reagerer ikke alene med i det væsentlige alle normale humane perifere hjælpe T-celler, men reagerer heller ikke med andre 6

DK 154087 B

normale perifere blod-lymfoide celler, inklusive ikke-hjælpe T-celler. Endvidere påvises det celle-overfladeantigen, som erkendes af dette antistof, på omkring 80% af normale humane thymocyter. Patienter med type II erhvervet agammaglobulinæmi påvistes ved hjælp af 0KT4 i et kon-5 trolforsøg. Det pågældende antistof reagerer også med ca. 55% af rhesusabe-perifere T-celler.

I betragtning af de anførte vanskeligheder ved den kendte teknik og manglen på success, som er rapporteret ved anvendelse af maligne cellelinier som antigen, var det, selvom hybridomacellelinien er opnået på i 10 og for sig kendt måde, ikke til at forudsige, om det var muligt at tilvejebringe det ønskede hybridoma. Det skal understreges, at den uforudsigelige natur af hybrid-celle fremstilling ikke gør det muligt at ekstrapolere fra et antigen eller celle system til et andet. Det har endda i forbindelse med den foreliggende opfindelse vist sig, at 15 anvendelse af en T-celle malign celle-linie som antigen bevirkede dannelse af hybridomas, som ikke dannede det ønskede antistof. Forsøg på at anvende rensede antigener adskilt fra celle-overfladerne, var også uden gunstigt resultat.

Fremstillingen og karakteriseringen af det omhandlede hybridoma og 20 det resulterende antistof vil blive nærmere forklaret i det følgende.

Fremgangsmåden til fremstilling af det omhandlede hybridoma omfatter følgende trin: A. Nan immunicerer mus med E-roset positive rensede, normale, 25 humane, perifere T-celler.

B. Hiltene fjernes fra de immunicerede mus og der fremstilles en milt-suspension i et passende medium.

30 C. De suspenderede milt-celler fusioneres med muse-myeloma— celler fra en passende celle-linie ved anvendelse af en passende fusionspromoter.

D. Man fortynder og dyrker i separate beholdere blandingen 35 af ufusionerede milt-celler, ufusionerede myeloma-celler og fusionerede celler i et selektivt medium, som ikke nærer de ufusionerede myeloma-celler i et tidsrum, som er tilstrækkelig til at de ufusionerede celler dør.

7

DK 154087 B

E. Nan vurderer supernatanten i hver beholder (fordybning), som indeholder et hybridoma, for tilstedeværelsen af antistof mod E-roset positive rensede humane T-celler.

5 F. Nan udvælger (fx. ved begrænsningsfortynding) og kloner hybridomas, som producerer det ønskede antistof.

Det monoklonale antistof kan dannes ved in vitro dyrkning af det omhandlede hybridoma i et egnet medium i et passende tidsrum efterfulgt 10 af udvinding af det ønskede antistof fra supernatanten. Det egnede medium og den egnede dyrkningstid kendes eller kan let bestemmes. Denne in vitro metode danner i det væsentlige monospecifikt monoklonalt antistof, der er i det væsentlige frit for andet specifikt antihuman immungi obul in. Der er en lille smule andet immun-globulin til stede eftersom 15 mediet indeholder xenogent serum (fx. foetalt kalveserum). Denne in vitro metode kan imidlertid ikke producere en tilstrækkelig mængde eller koncentration af antistof til visse formål, eftersom koncentrationen af monoklonalt antistof kun er ca. 50 pg/ml.

Til fremstilling af en meget større koncentration af en smule 20 mindre rent monoklonalt antistof kan det omhandlede hybridoma injiceres i mus, fortrinsvis syngeniske eller semi-syngeniske mus. Hybridomaet vil bevirke dannelse af antistof-producerende tumorer efter en passende inkubationstid, som vil resultere i en høj koncentration af det ønskede antistof (ca. 5-20 mg/ml) i blodbanerne og peritonealt exudat (ascites) 25 hos værtsmusene. Selvom disse værtsmus også har normale antistoffer i deres blod og ascites, er koncentrationen af disse normale antistoffer kun ca. 5% af den monoklonale antistof-koncentration. Da disse normale antistoffer endvidere er ikke antihumane med hensyn til deres specificitet, er det fra udvundet ascites eller fra serum opnåede 30 monoklonale antistof i det væsentlige fri for noget forurenende antihumant immun-globulin. Dette monoklonale antistof har høj titer (aktiv ved fortyndinger på 1:50.000 eller mere) og højt forhold mellem specifikt og non-specifikt immun-globulin (ca. 1/20). Immun-globulin produceret under inkorporering af de såkaldte *k light" myeloma-kæder 35 er non-specifikke "nonsens" peptider, som blot fortynder det monoklonale antistof uden at nedsætte dets specificitet.

8

DK 154087 B

Eksempel 1

Fremstilling af monoklonale antistoffer A. Immunicering oo somatisk celle-hvbridicering 5 CAF.-mus af hunkøn (Jackson Laboratories, 6-8 uger gamle} immuni- * 7 ceredes intraperitonealt med 2 x 10 E-roset rensede T-celler i 0,2 ml fosfat-forpufret saltopløsning med 14 dages intervaller. Fire dage efter den tredje immunicering fjernedes miltet fra musene og en enkelt cellesuspension fremstilledes ved at presse vævet gennem et rustfrit stålnet.

10 Celle-fusion foretoges iht. den af Kohier og Milstein udviklede

O

metode. 1 x 10 splenocyter fusioneredes i 0,5 ml fusionsmedium indeholdende 35% polyethylenglycol (PE6 1000) og 5% dimethyl sulfoxid i "RPMI 1640" medium (Gibco, Grand Island, HY) med 2 x 107 P3X63Ag8Ul myeloma-celler leveret af Dr. M. Scharff, Albert Einstein College of 15 Medicine, Bronx. NY. Disse myeloma-celler sekreterer IgGj κ light kæder.

B. Udvælgelse og vækst af hvbridoma

Efter celle-fusion dyrkedes celler i HAT medium (hypoxanthin, 20 aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% C02 i en fugtig atmosfære.

Adskillige uger senere tilsattes 40 til 100 /il supernatant fra kulturer g indeholdende hybridomas til en tablet af 10 perifere lymfocyter adskilt i E-roset positiv (E+) og E-roset negativ (E~) populationer, som var fremstillet ud fra blod af sunde humane donorer som beskrevet af Mendes 25 (J. Immunol. 111:860, 1973). Påvisning af muse-hybridoma-antistoffer, som binder til disse celler, bestemtes ved radioimmunoundersøgelse og/eller indirekte immunofluorescens. Ved den første metode omsattes ipc g cellerne først med 100 /il affinitets-renset I gede-anti-muse IgG (10 cpm//ig, 500 jug//il). (Detaljer vedrørende iodering af gede-anti-mus blev 30 beskrevet af Kung, et al., J. Biol. Chem. 251(8): 2399, 1976).

Alternativt stænkedes celler inkuberet med dyrknings-supernatenter med et fluoresceret gede-anti-muse IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories,

Springfield, VA, F/p = 2,5) og de fluorescerende antistof-belagte celler analyseredes dernæst på cytofluorograf "FC200/4800AM (Ortho Instruments, 35 Westwood, MA) som beskrevet i eksempel 2. En hybridomakultur ATCC nr CRL 8002 indeholdende antistoffer, der reagerede specifikt med E+ lymfocyter (T-celler) udvalgtes og klonedes. Derefter overførtes klonerne intraperitonealt ved injektion af 1 x 107 celler af en given klon (0,2 ml 9

DK 154087 B

volumen) i CAFj-mus, der var forbehandlet med 2,6,10,14-tetramethyl-pentadecan leveret af Aldrich Chemical Company under navnet "Pristine".

De maligne ascites fra disse mus anvendtes dernæst til karakterisering af lymfocyter som beskrevet nedenfor i eksempel 2. Det pågældende 5 hybrid-antistof 0KT4 blev ved standardteknik påvist at være af IgG2 underklasse og at fiksere komplement.

Eksempel 2

Karakterisering af 0KT4 reaktivitet 10 A. Isolering af lymfocyt-populationer

Humane perifere blod-mononukleære celler isoleredes fra raske frivillige donorer (alder 15-40) ved hjælp af "Ficoll-Hypaque" densitetsgradient-centrifugering (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) 15 efterfulgt af teknikken beskrevet af Boyum i Scand. J. Cl in. Lab.

Invest. 21 (Suppl. 97):77, (1968). Ufraktionerede mononukleære celler opdeltes i overflade Ig+ (B) og Ig" (T plus nul) populationer ved hjælp af "Sephadex G-200" anti-F(ab')2 søjlekromatografi som tidligere beskrevet af Chess, et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). T-celler blev 20 vundet ved E-rosettering af Ig" populationen med 5% fåre-erythrocyter (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Den rosetterede blanding lagdeltes over Picoll-Hypaque og den vundne E+-tablet behandlet med 0,155M NH^Cl (10 ml per 108 celler). Den således opnåede T-celle population var mindre end 2% EAC-roset positiv og mere end 95% E-roset 25 positiv bestemt ved standardmetoder. Endvidere blev den non-rosetterende Ig" (nul-celle) population udvundet fra Ficoll-interfladen. Denne sidstnævnte population var mindre end 5% E+ og mindre end eller lig 2% slg+. Overflade Ig+ (B) populationen opnåedes fra "Sephadex G-200" kolonnen efter eluering med normal human gamma-globulin som tidligere beskrevet.

30 Denne population var mere end 95% overflade IG+ og mindre end 5% E+.

Normale humane makrofager opnåedes fra den mononukleære population ved vedhæftning til polystyren. Således resuspenderedes mononukleære celler i siut-kulturmedier (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinpropan-sulfonsyre] puffer, 0,5% natriumbicarbonat, 200 mM 35 L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin, tilsat 20% varme-inaktiveret

C

humant AB serum) ved en koncentration på 2 x 10 celler og inkuberedes i formstof-petri skåle (100 x 20 mm) (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon,

Oxnard, CA) ved 37°C natten over. Efter grundig udvaskning til fjernelse

DK 154087 B

10 af ikke vedhsftende celler, frigjordes den vedhæftende population ved rigelig udvaskning med koldt serum-frit medium indeholdende 2,5 mH EDTA og lejlighedsvis skrabning med gummi-spidsen af stemplet for en éngangssprøjte. Here end 85% af celle-populationen var i stand til at indtage 5 latex-partikler og havde monocytes-morfologiske egenskaber ved Wright-Giemsa pletning.

B. Normal thvmus

Normal human thymus-kirtel opnåedes fra patienter med en alder 10 mellem 2 måneder og 14 år, som var under korrektiv kardial-kirurgi.

Frisk opnåede portioner af thymus-kirtlen anbragtes straks i 5% foetalt kalve-serum i medium "199" (Gibco) fint parteret med forceps og saks, og tildannedes derefter til enkeltcelle-suspensioner ved presning gennem trådnet. Cellerne lagdeltes dernæst over Ficoll-Hypaque og spunnet og 15 vasket som beskrevet i afsnit A ovenfor. De således opnåede thymocyter var mere end 95% levende og mere end eller lig 90% E-roset positiv.

C. Celle-linier

Epstein-Barr Virus (EBV) transformerede B-celle-linier fra normale 20 individer (SB deponeret under accessionsnummer ATCC CCL 120) og T-cellelinie CEH (deponeret under accessionsnummer ATCC CCL 119) fra leukemi-patienter leveredes af Dr. H. Lazarus, Sidney Farber Cancer Institute,

Boston, HA.

25 D. T akut lvmfoblastisk leukæmia fT-ALLl celler oo T kronisk Ivmfatisk leukæmia (T-CLLl celler

Leukæmia-celler opnåedes fra 12 patienter med T-ALL. Disse individers celler var forud bestemt af hver af T-celle-linie ved deres spontane roset-dannelse af fåre-erythorcyter (mere end 20% E+) og 30 reaktivitet med T-celle specifikke hetero-antisera, anti-HTL (anti-B.K.) og A99, som tidligere beskrevet af Schlossman, et al., Proc. Nat. Acad.

Sci. 73:1288 (1976). Tumor-celler fra tre individer var reaktive (THg+) med kanin- og/eller heste-anti-THg, mens celler fra de resterende ni var non-reaktive (THg"). Leukæmi ske celler fra to patienter med THg’ T-CLL 35 anvendtes også. Både akute og kroniske T-celle leukæmia-celler kryo-præserveredes i -196°C dampfase flydende nitrogen i 10% dimethyl sul foxid og 20% AB humant serum indtil tidspunktet for overfladekarakterisering.

De analyserede tumor-populationer var mere end 90% biastomer ved Wright- 11

DK 154087 B

Giemsa morfologi i alle tilfælde.

Cvtofluorografisk analyse og celledeling

Cytofluorografisk analyse af alle celle-populationer foretoges ved 5 indirekte immunofluorescens med fluorescein-konjugeret gede-anti-muse IgG (G/H FITC) (Meloy Laboratories) på en cytofluorograf "FC200/4800A"

C

(Ortho Instruments). I korte træk behandledes 1-2 x 10 celler med 0,15 ml 0KT4 ved 1:1000 fortynding, inkuberedes ved 4°C i 30 minutter og vaskedes to gange. Cellerne reagerede dernæst med 0,15 ml af en 1:40 10 fortynding G/M FITC ved 4°C i 30 minutter, centrifugeredes og vaskedes 3 gange. Disse celler analyseredes dernæst på cytofluorografen og fluorescens-intensiteten per celle registreredes på en impulshøjde-analysator. Et tilsvarende reaktivitetsmønster iagttoges ved en fortynding på 1:50.000, men yderligere fortynding bevirkede tab af 15 reaktivitet. Baggrundspietning opnåedes ved at substituere en 0,15 ml portion 1:1000 ascites fra en Balb/cJ mus, der var intraperitonealt immuniceret med en non-producerende hybrid klon.

I forsøg, der var udformet til at skille 0KT4+ og 0KT4" celler, c mærkedes 100 x 10 ufraktionerede mononukleære celler eller thymocyter 20 med 4 ml af en 1:1000 fortynding af 0KT4 og udvikledes med G/M FITC. En identisk pletningsmetode anvendtes til at fremstille humane T-celler, der var isoleret som i eksempel 2A ovenfor. Under anvendelse af fluorescens-aktiveret celle-sorterer (FACS-I) (Becton-Dickinson,

Mountain View, CA) deltes lymfocyter i 0KT4+ og 0KT4' populationer.

25 Levedygtigheden efter sortering var mere end 95% ved Trypan-blå eksklusion i alle tilfælde. Renheden af alle separerede populationer var mere end eller lig 95%.

Analyse af FACS-seoarerede 0KT4- og 0KT4- delmængder med heste anti-THg 30 0KT4+ og 0KT4" T-celler separeredes på FACS og anbragtes i kultur

med 2 x 106 celler per ml i RPMI 1640 (Grand Island Biological Company) indeholdende 20% humant AB-serum, 1% penicillin-streptomycin, 200 mM L-glutamin, 25 mM HEPES puffer (Microbiological Associates) og 0,5% natriumbicarbonat. Efter 24 timer i en 5% C09 fugtig atmosfære ved 37°C

C t 35 reageredes 1-2 x 10 celler af hver population med heste anti-THg og plettedes med fluorescin-konjugeret IgG fraktion kanin anti-heste Ig (Cappel Laboratories, Downington, PA) som beskrevet af Reinherz og Schlossman, J. Immunol. 122:1335-1341 (1979). Baggrunds-pletning

DK 154087 B

12 bestemtes ved substituering af normal heste IgG for specifikt antistof og pletning som ovenfor.

Funktionelle studier 5 A. Formeringsstudier

Den mitogene reaktion af de useparerede og FACS-fraktionerede lymfoide celler testedes i mikrokultur for optimale og suboptimale doser af Concanavalin A (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) og fytohæmag-10 glutinin (PHA) (Burroghs-Wellcome Company, Greenville, NC). Alloantigen proliferativ reaktion måltes samtidig for disse samme populationer under anvendelse af mitomycin-c behandlet Laz 156, en EBV-transformeret human B lymfoblastoid celle-linie som en stimulus. Proliferering med tetanus-toxoid (Massachusetts Department of Public Health Biological 15 Laboratories, Boston, MA) testedes under anvendelse af en 10 /jg/ml slutkoncentration. Herpes-Zoster antigen stilledes venligst til rådighed af Dr. John Zaia (Harvard Medical School, Boston, MA) og anvendtes i en fortynding på 1:6. 5% makrofager opnået på den ovenfor beskrevne måde sattes til alle populationer ved initieringen af in vitro kulturer.

20 Mitogen-stimulerede kulturer impulseredes efter 4 dage med 0,2 pCi af ^H-thymidin (^H-TdR) (1,9 Ci/mM specifik aktivitet) (Schwartz-Mann,

Division of Becton, Dickinson, Orangeburg, NY) og udvalgtes 18 timer 3 senere på et "MASH II" apparat (Microbiological Associates). H-TdR inkorporering måltes på en "Packard Scintillation Counter" (Packard 3 25 Instrument Company, Downer's Grove, IL). Baggrunds H-TdR-inkorporation opnåedes ved at substituere medium for mitogen. Opløselige antigen- og 3 allogen-stimulerede kulturer impulseredes efter 5 dage med H-TdR i 18 timer, udvalgtes og taltes som beskrevet ovenfor.

30 B. Cvtotoxiske studier

Sensitiviseringskulturer for celle-medieret lymfolysis (CML) etableredes ved at anbringe ufraktionerede Tceller, FACS-separerede 0KT4+ og 0KT4” T-celle-delmængder eller forskellige forhold af rekombinerede 0KT4+ og 0KT4" T-celler med mitomycin-behandlede stimulator-celler, alle 35 med 2 x 10® celler per ml, i et antal mikrotiter plade-fordybninger.

Efter 5 dages forløb fjernedes ikke-levedygtige celler ved Ficoll-

Hypaque centrifugering. Disse ufraktionerede og fraktionerede T-celle 51 populationer sattes dernæst til Cr natriumchromat-mærkede angrebs- 13

DK 154087 B

celler og specifik chrom-frigørelse bestemtes efter 6 timers celle-inkubation. I andre forsøg sensibiliseredes ufraktionerede Tceller med mitomycin-behandlede stimulator-celler som ovenfor og fraktioneredes dernæst i 0KT4+ og 0KT4" T-celle delmængder på FACS efter 5 dage i MLC 5 og specifik chrom-frigørelse bestemtes. Den procentuelle cytotoxicitet bestemtes ved hjælp af følgende formel:

51Cr frigjort ved forsøg - ^Cr frigjort spontant χ 10Q

51Cr frigjort ved frysetøning - 51Cr frigjort spontant 10

Alle prøver foretoges i 3 eksemplarer og resultaterne udtryktes som gennemsnittet. Den spontane frigørelse var mindre 20% af maksimal lysis i alle tilfælde.

Der henvises i det følgende til tegningen.

15 Figur 1 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af normale humane, perifere T-celler med 0KT4 ved 1:1000 fortynding og G/M FITC. Til sammenligning er resultater med monoklonale antistoffer 0KT1 og 0KT3 vist under ækvivalente betingelser i figur 1-5.

Figur 2 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster 20 efter reaktion af humane thymocyter med 0KT4 og G/N FITC.

Figur 3 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af leukæmi ske celler fra patienter med B-celle kronisk lymfoplastisk leukæmi, med 0KT4 og G/M FITC.

Figur 4 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster 25 efter reaktion af den humane T-celle-linie HJD-1 med 0KT4 og G/M FITC.

Figur 5 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af den humane T-celle-linie CEM med 0KT4 og G/M FITC.

Figur 6 viser resultaterne af reaktion af T-celle populationer med heste anti-THg serum.

30 Figur 7 viser den cytotoxiske kapacitet af ufraktionerede T-celler og T-celle-delmængder. Procentuel specifik lysis er vist på ordinaten og effektor/angrebs-forhold (E/T) er vist på abscissen.

Som vist i figur 1 er omtrentlig 45% af den humane perifere blod T-celle population hos et givet normalt individ reaktiv med 0KT4, mens 35 hele mængden af B-celle, nul-celle og makrofag populationer isoleret fra samme individ, er ureaktive med 0KT4. Tilsvarende resultater opnåedes på populationer af lymfocyter fra 15 andre normale individer. Det monoklonale antistof er derfor karakteriseret ved, at det er reaktivt med et 14

DK 154087 B

antigen indeholdt på overfladen af ca. 55% af normale humane perifere Τεεί ler, men ureaktivt med alle antigener på overfladen af de tre andre ovenfor omtalte celle-typer. Som det vil blive omtalt nedenfor, er 0KT4+-andelen af den humane perifere T-celle population delmængden af 5 hjælpe T-celler. Denne differentielle reaktivitet udgør én test ved hjælp af hvilken det omhandlede antistof 0KT4 kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Som vist i figur 2, er omkring 80% af normale humane thymocyter fra et 6 måneder gammelt barn reaktive med 0KT4. Tilsvarende resultater (ca.

10 80% reaktivitet) opnåedes ved anvendelse af seks yderligere thymus-prøver fra normale individer af en alder på to måneder til 19 år. Reaktivitetsmønsteret i figur 2 giver en anden fremgangsmåde til påvisning af det omhandlede antistof 0KT4 og til at skelne det fra andre antistoffer.

15 Som vist i figur 3 er det pågældende antistof ikke reaktivt med leukæmiceller fra B-celle kronisk lymfoblastisk leukæmi.

En yderligere karakterisering af det pågældende antistof 0KT4 er vist ved reaktiveten over for forskellige humane T-celle-linier belyst i figur 4 og 5. Som det kan ses, var reaktiviteten af det pågældende 20 antigen over for humane T-celle-linier heterogen, nemlig stærk for linien CEN og ikke til stede for linien HDJ-1. Der var heller ingen reaktivitet med celle-linierne Laz 191 og HM1. Denne differentielle reaktivitet af 0KT4 over for forskellige let tilgængelige humane T-celle-linier tilvejebringer yderligere en metode til at karakterisere og 25 beskrive det pågældende antistof.

Figur 6 belyser reaktiviteten af 0KT4-separerede delmængder med anti-TH2. Ca. 25% af den ufraktionerede T-celle population er reaktiv med anti-TH2. I modsætning hertil indeholder 0KT4+-populationen ingen celler, som er reaktive med anti-TH2, mens 0KT4~-populationen over-30 vejende er TH2+ og indeholder alle de TH2+ celler, som findes i den ufraktionerede T-celle population. Dette viser, at TH2+- og 0KT4+-delmængderne er reciproke og forskellige fra hinanden.

Figur 7 belyser den cytotoxiske kapacitet af ufraktionerede 0KT4+ og 0KT4" T-celler. 0KT4+ populationen er kun minimalt cytotoxisk, mens 35 graden af udryddelse, som medieres af 0KT4" populationen, er større end for den ufraktionerede T-celle population. De differentielle reaktiviteter af 0KT4+ og 0KT4" T-celle populationer som vist i figur 6 og 7, tilvejebringer et yderligere middel til karakterisering af det 15

DK 154087 B

pågældende antistof.

De i figur 1-5 viste resultater er sammenfattet og diskuteret med yderligere data i tabel I nedenfor. Tabellen sammenligner monoklonale antistoffer betegnet 0KT1, 0KT3 og 0KT4 (produceret ved hjælp af hybri-5 domacellelinierne ATCC nr. CRL 8000, nr. CRL 8001 og nr. CRL 8002).

Foruden resultaterne i figur 1-5 viser tabel I også, at 0KT4 er ikke reaktiv med normale humane perifere Tceller, nul-celler og makrofager samt leukæmicell er fra patienter med T-celle og nul-celle akut lymfo-blasti sk leukæmi og EBV-transformerede B-celle-linier. I modsætning til 10 0KT1 reagerer 0KT4 ikke med leukæmicel ler fra patienter med T-celle kronisk lymfoblastisk leukæmi.

Funktionelle studier foretoges på lymfoide populationer, som var blevet adskilt på en fluorescens-aktiveret celle-separator (FACS). Resultaterne af disse studier er vist i tabel II til IV nedenfor og 15 giver yderligere basis for den tidligere beskrevne karakterisering af det pågældende monoklonale antistof.

Ved disse studier behandledes en ufraktioneret T-celle population med en 1:1000 fortynding af 0KT4 og G/M FITC og separeredes på FACS i 0KT4+ og 0KT4"-delmængder. Med renheden af de opnåede populationer givet 20 (mere end eller lig 95%) sattes 5% makrofager til de separerede populationer før dyrkning in vitro. Den ufraktionerede T-celle population og de isolerede 0KT4+ og 0KT4" T-celle delmængder stimuleredes dernæst med PHA, Con A, opløselige antigener og all oantigener til bestemmelse af deres in vitro formeringsreaktioner.

25 Formeringsreaktionen af de ufraktionerede T-celle populationer på PHA og Con A er vist i tabel II. En maksimal formeringsreaktion hos den ufraktionerede T-celle population opnås med 1 øg per 106 celler med

C

formindskede reaktioner ved 0,5 øg og 0,1 øg PHA per 10 celler. Behandling af de ufraktionerede T-celler med 0KT4 og gede-muse FITC uden 30 efterfølgende fraktionering ændrede ikke formeringsreaktionen. I modsætning hertil opnåedes forskelle i reaktionen på PHA med de separerede 0KT4+ og 0KT4" T-celle delmængder. 0KT4+ populationen reagerede på alle doser af PHA på tilsvarende måde som den useparerede T-celle population. Formeringsreaktionen af 0KT4" celler var imidlertid signifikant mindre 35 ved alle testede doser af PHA. Endvidere formerede 0KT4‘ T-cellerne sig c overhovedet ikke ved en PHA dosis på 0,1 øg per 10 celler, hvorimod 0KT4+ T-celle delmængden og de ufraktionerede celler stadig reagerede. Formeringsreaktionen for disse delmængder på Con A var derimod ens og de 16

DK 154087 B

to delmængder af celler kunne ikke skelnes fra hinanden eller fra den ufraktionerede T-celle population.

Reaktionerne på alloantigen i HLC og på opløselige antigener undersøgtes dernæst. Som vist i tabel III reagerede den ufraktionerede T-5 celle population, den med 0KT4 og G/M FITC behandlede ufraktionerede T-celle population og både 0KT4+ og 0KT4” T-celle delmængderne på ens måde i MLC over for Laz 156. Det skal imidlertid bemærkes, at 0KT4" cellerne fra to af seks testede individer, selvom de formerede sig signifikant i MLC, inkorporerede mindre 3H-TdR end den respektive 0KT4+-delmængde 10 (data ikke vist). I modsætning hertil gav formeringsreaktioner på opløselige antigener den klareste skelnen mellem disse delmængder. I alle undersøgte tilfælde formerede 0KT4+ T-celle delmængden sig godt over for opløselige antigener, tetanustoxoid og Herpes-Zoster, hvorimod 0KT4” T-celle delmængden var praktisk taget ikke reagerende.

15 Tabel IV viser, at 0KT4”-delmængden af T-celler ikke kan udvikle megen om overhovedet nogen cytolysis, når den sensibiliseres alene i MLC. Selvom 0KT4~ T-cellerne blev cytotoxiske/effektorer i den ufraktionerede allosensibiliserede T-celle population, kunne de derfor ikke induceres til at mediere CML til trods for deres reaktion i MLC. Når 20 0KT4+ populationens sensibiliseredes i MLC i fravær af 0KT4’ T-celler, kunne de endvidere mediere en moderat, men signifikant lysis i MLC. Den rekombinerede blanding af 0KT4+ og 0KT4" T-celler bevirkede imidlertid en maksimal cytolysis, som ikke var forskellig fra den for den usepa-rerede T-celle population. Disse resultater viser, at 0KT4‘-delmængden 25 ikke kan bevirke en maksimal cytotoxisk reaktion alene, men kræver hjælp af 0KT4+ populationen. Denne T-T interaktion er analog med T-celle hjælpen, som tilvejebringes ved hjælp af TH2‘T-celle delmængden på TH2+ T-celle delmængden ved udvikling af maksimal cytotoxicitet.

Det blev påvist, at det omhandlede antistof 0KT4 hører til under-30 klassen IgG2, som er én af de fire underklasser af murin IgG. Disse underklasser af immunoglobulin G afviger fra hinanden i de såkaldte "fikserede" områder, idet dog et antistof for et specifikt antigen vil have et såkaldt "variabelt" område, som er funktionelt identisk uanset hvilken underklasse af immungi obul in G det tilhører.

35 17

DK 154087 B

Tabel I

Honoklonalt antistof reaktivitet oa egenskaber

Honoklonale antistoffer 5 0KT1 0KT3 0KT4 % reaktivitet med: perifere T-celler (10 prøver) >95% >95% 55% perifere B-celler (10 prøver) <2% < 2% < 2% perifere nul-celler (10 prøver) < 2% < 2% < 2% 10 thymocyter* (8 prøver) 5-10% 5-10% 80% reaktivitet med: T-kronisk lymfatisk leukæmi (3 tilfælde) + +(l);-(2) - T-akut lymfatisk leukæmi (8 tilfælde) - - - 15 nul-akut lymfatisk leukæmi (15 tilfælde) - - B-kronisk lymfatisk leukæmi (6 tilfælde) +(4),--(2)-B-celle-linier+ (4) - T-celle-linier+ HJD-1 + (±) CEM + - + 20 Laz 191 + - - HM1 + - -

IgG underklasse IgGj IgG2 IgG2 komplement fiksering - + + 25 * Fra patienter med en alder fra 2 måneder til 18 år + Opnået fra Dr. H. Lazarus, Sidney Farber Cancer Center. B-celle-linier Laz 256, 156, 007 og SB opnået fra Epstein-Barr virus-transformation af humane perifere B-celler og HJD-1, CEM, Laz 191 og 30 HM1 tilført fra leukæmi-patienter.

DK 154087 B

18 S- ø Ό O) c.

r -f o cm r- ω <3· in cm ® 03 r- ΙΟ CO r- V CO 'yt r- r- μ

0 O tO CO

n cvi U M +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 1 i Jr i_ — r- in cm cm σ> cm cd “ μ ?> m- oo μ σ> cn to (U^Uoo r- σ> r- 00 "O O b co co 't cm <»

P CM μ CO CO

ø S- 3 co co μ cn cn o oo Q. O μ r- 00 r- CD O CO CO CO O ΓΙΟ i. . ...

Ør- CM CD M· O = g μ u +i +i +i +i +i +i +i +j^L_co cm o) o co σι μ

CO1-^ O O) CO O CM CO

Π3 CO CM σ> LD O CO r- •p σι tn Μ- <r> μ σ> — -= Or- lo <55 'ΐ c ø O u jQ b /° 2 +j i. m co co co o co co b £ 0 r- CM CM LO oo r- 0 — ^ <D CO in CM μ 00 c \ in cm <3- co μ O) ro O r- ° ® σ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 tu -O 0 o co μ co co μ Is- £-,-,.00 CM ?- in CO r- in ø φ p μ co c- co co

μ CM CM CM

S u O m r- σ> σ> lo

JX. I

to μ ό S- 0 f- c 3 r- co cd μ 'ct· in cm co oo oo c- co in '•r o lo co co oo γιο . . ...

_ CO CO tj" 00 CO

OS- £ J +1 +1 +1 +1 +1 +1 +l * ø co cm in o co co co

S O μ co r- r- CM μ CO

r 1 oo o cm co μ co *- μ _ oo oo ^ cn o o *? 03 r- σ> o in <D r- r- O)

2 \ \ /~\ /"-N ✓"N

1 . \ S S· o J m J jo

s 2 ΐ T - T S® £!« S · I

ro 0 tø \L ø C-u ^ υ O-u c

t- 3 i ~ o — o — ,n S

øj \^ø ø ^ ø <r <o <f co cf co 3 u u 0 0 0 0.2 =5 E <tn <to <co C \ C \ C vt Ό

2? 1¾ Jo o o) o O) o σ> I

d (/) CL r- Q. r~ 0- τ— D ZL U 3. UlL ^ 19

DK 154087 B

os ® O) n w co in 05

(\| (O N r O) CM CM

CM r- r-x S- · J.

0) Lf) ^ Ό j? S_ +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 flj . ® 1^·. CO 00 CQ CO CO C7> r- c m· —· co r oo o oo o co co E h-M O LO r- r- ^ CM r- ® * V ^ Ό O h S & Φ τ ο 0 h ω Ό .

(D *7. (fl CO 05 O Λ S_ <D CO O r- r- r- 05 r- φ C . CO CO (O COt-OM· s_ a> ir ... 00 σ> co ® D) +. ϋ M-CMO · ‘

tt 5 μ ω "" ^ CM

S c ^ u +1+1+,+1 +| +1 +1 +1

u_ O Oh f- O LO O LOCVJrCO

n — (O (O 00 CM 5— CM LO σ +j«j o co f"· cm co cm ro n CO ... ...

rco) co ro m r^- r'- in £-o r- m oov-cm * i.

_ +J 0) — J5 ω jj o .S> u ja -*c t o ^ m in m- ro co Γ" ro Onj +jm ro r- o ro in in in l_ c <u cocmco <- co ro go, oS c^com· 1X1 co r- ? ! 10 f +i +i +' +i I +' +' +' « « f i? S55SS is 8 S 8 8 n: g c_<+ u- co cn i"· r- llcoldoocm ϋ( ® Η σΐσΐο oo co cm

'o ττ;^ 'vt-r-M- co r CM

h + S o ^ 4—1 C- .

0) d> h TJ- i. > <0

(o o E

r u c co co Is» co n co r oo N CO CO Γ"· 'tf

._ CO N o CM Cf O CO

+J 0) CM CM · ·

X . CO c- CO

CCJ CO CO

L C.

'P ® +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 cd M" co co co tn co σ r' +- υ om-c-co co in n en CD 1 COO^r- CM 00 CO ΤΙ- ... ...

C O 00 I'» C'· CO CO

0 in r- <tf CO r CM

+3 ^ CD TI C- TI S-

(U 2d) .-<D

C_ OP o ti w > x « x g ? £ e2 n e° n 1 2 “ co g ' «o “ i, |r <D .5 in 3 g m 3 «j 2 s-T τ- C ® ({j f-c^ro E ·~ ;£ (Π U. — fn Q. —

< η E wpC-O M P C TI

o °p TO CL· CD Φ Π] CD CL· 0) u. CLtn —i h I S -J h I !>

20 DK 154087 B

tø > *--7 Φ -1 c o

Ξ S

-J o - Έ. r 5 n s- a U O o M— Q.

4-* h Φ ω \ Ό .ti LU 0) T. °i. ^ « (U tø X o. in r- co co cu lo := 3 0 lvJ t- r- r- m •3 ·§ Ό = υ Ϊ v; cn co > ro — O o 00 lo O 00 Λ\0 n

n3+U-CVJ CM CV] r- CO

E « r- — \n 0\° ^ > .O) « ra ~ O) E ^ S- = s— ίίζ: — L- nj U r- (U φ c o. in i rf n ^ r fli

>£”0» w -^CO

- ω O'P -α ω c

- D) s_ _ <U O

O) c o V, + i- Ω T lu o o "a-coco«"0® ro cm 'er c\jrrc^ H ε i c · <3 Ό Q ^ ;

Il “51 > O O) i. f C ° ® o

Oh « ω ^ +-> \ Ό u .— X. LU "it Γ CD fB |_ £?

j_ (j_ r- <D

3 O ’jH <U φ

c E (- Ό C

“S E = ® 2

T " s + “«I

h N \ +i. ” = *

om ™ U ® g 5 S

a s_ o> ro + tø CO — — -+ , "Π 0) - O 't- 0)0)2 L.c«h 1 1 fe S’ V £ h s = * “ 3 > ^ K0 ‘g- £% 0 & ° ? 2 2 2£®go*giB+<rt.

c 0) <D 0) jj I I m F2 0) tø c c-ftiiii, o> . *” h ό ·- o o— h i- o oi -a * 2 'n 4J Ϊ» "2 i + + ·0)Ο 2 _ c <3· «3- (/)> Q-io ro (o ro u u u il w c i_ s_ ^ Π. ΓΤ Π, Μ 0) m <)- <i- 0) ^ * .

!£ tø DDOOOO + +

Claims (6)

1. Honoklonalt antistof af klasse IgG, KENDETEGNET ved, at det er identisk med det monoklonale antistof, der fremstilles af hybridoma-cellelinien ATCC nr. CRL 8002, og at det 5 a) reagerer med i det væsentlige alle normale humane perifere hjælpe T-celler (ca. 55% af alle normale humane perifere T-celler), men ikke med normale humane perifere B-celler, nul-celler eller makrofager, b) reagerer med ca. 80% af normale humane thymocyter, 10 c) ikke reagerer med leukæmiske celler fra mennesker med T-celle kronisk lymfoblastisk leukæmi, B-celle kronisk lym-foblastisk leukæmi, T-celle akut lymfoblastisk leukæmi eller nul-celle akut lymfoblastisk leukæmi, d) reagerer med human T-celle-linie CEN, ATCC nr. CCL 119, 15 e) ikke reagerer med Epstein-Barr vi rus-transformeret human B-celle-linie SB, ATCC nr. CCL 120, f) reagerer med ca. 55% af rhesusabe-perifere T-celler, og g) fikserer komplement.

2. Hybridomacellelinie til anvendelse ved fremstilling af det mono-20 klonale antistof ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den er hybridoma- cellelinien ATCC nr. CRL 8002.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af det monoklonale antistof ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man dyrker hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8002 in vitro i et egnet medium eller indfører den intra- 25 peritonealt til mus og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at musene er af stamme CAFj.

5. Fremgangsmåde til påvisning af hjælpe T-celle mangel eller 30 overskud i et individ, fortrinsvis erhvervet type II agammaglobulin- æmi, KENDETEGNET ved, at et T-celle præparat fra det pågældende individ omsættes med en diagnostisk effektiv mængde af antistoffet ifølge krav 1 og at den procentuelle mængde af den totale perifere T-celle population, som reagerer med antistoffet, bestemmes.

6. Diagnostisk præparat til påvisning af hjælpe T-celle mangel, KENDETEGNET ved, at det i blanding med en diagnostisk acceptabel bærer omfatter antistoffet ifølge krav 1 i en mængde, som er effektiv til påvisning af hjælpe T-celle mangel.