DK154086B - Monoklonalt antistof, fremstilling deraf, hybridomacellelinie til anvendelse ved fremstilling heraf samt fremgangsmaade til diagnose ved anvendelse heraf - Google Patents

Description

DK 154086 B

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof, fremstillingen heraf, en hybridomacellelinie til anvendelse ved fremstillingen heraf samt en fremgangsmåde til diagnose ved anvendelse heraf.

5 Fusionen af musemyelomaceller til milt-celler fra immunicerede mus af Kohier og Nilstein i 1975 (Nature 256, 495-497 (1975)) viste for første gang, at det var muligt at opnå en kontinuert celle-linie, der fremstiller homogent (såkaldt "monoklonalt") antistof. Siden dette grundlæggende arbejde har der været udfoldet store anstrengelser på at 10 fremstille forskellige hybride celler (kaldet "hybridomas") og på at anvende det ved hjælp af disse hybridomas fremstillede antistof til forskellige videnskabelige undersøgelser. Der henvises fx. til Current Topics in Nicrobiology and Immunology, bind 81 - "Lymphocyte Hybridomas", F. Nelchers, N. Potter og N. Warner, Editors, Springer-15 Verlag, 1978 og de deri angivne referencer, C.J. Barnstable, et al.,

Cell, 14, 9-20 (maj 1978), P. Parham og W.F. Bodmer, Nature 276, 397-399 (november 1978), Handbook of Experimental Immunology, 3. udgave, bind 2, D.N. Wier, Editor, Blackwell, 1978, kapitel 25, og Chemical and Engineering News, 1. januar 1979, 15-17. Disse referencer indikerer 20 samtidig belønningerne og komplikationerne ved at forsøge at fremstille monoklonalt antistof ud fra hybridomas. Selvom den almene teknik forstås principielt godt, mødes mange vanskeligheder og variationer kræves for hvert specifikt tilfælde. I virkeligheden er der ingen sikkerhed, forud for forsøget på at fremstille et givet hybridoma, for at det ønskede 25 hybridoma vil blive opnået, at det, hvis opnået, vil producere antistof eller at det således fremstillede antistof vil have den ønskede specificitet. Graden af success påvirkes principalt af den anvendte antigentype og den til isolering af det ønskede hybridoma anvendte udvælgelsesteknik.

30 Den tilstræbte fremstilling af monoklonalt antistof for humane lymfocyt celle-overflade antigener er kun blevet rapporteret i nogle få tilfælde. Se fx. Current Topics in Nicrobiology and Immunology, ibid, 66-69 og 164-169. De i disse rapporterede forsøg anvendte antigener var dyrkede humane lymfoblastoide leukæmia og humane kroniske lymfo-35 cytiske leukæmia celle-linier. Nange opnåede hybridomas syntes at danne antistof over for forskellige antigener på alle humane celler. Ingen af disse hybridomas dannede antistof over for en forud defineret klasse af humane lymfocyter.

DK 154086 B

2

Det bør forstås, at der findes to principielle klasser af lymfocyter, som er involveret i immunsystemet hos mennesker og dyr. Den første af disse (den thymus-afledte celle eller T-celle) differentieres i thymus fra hæmopoietiske stam-celler. Mens de befinder sig 5 i thymus, kaldes de differentierende celler for "thymocyter". De modne T-celler forlader thymus og cirkulerer mellem væv, lymfekar og blodbaner. Disse T-celler udgør en stor andel af mængden af recirkulerende små lymfocyter. De har immunologisk specificitet og er direkte involveret i celle-medierede immun-reaktioner (såsom transpiantations-10 afvisning) som effektor-celler. Selvom T-celler ikke sekreterer humorale antistoffer, kræves de under tiden for udskillelsen af disse antistoffer af den nedenfor omtalte anden klasse af lymfocyter. Nogle typer af T-celler har en regulerende funktion ved andre aspekter af immun-systemet. Mekanismen for denne proces ved celle-samvirke forstås endnu ikke fuldt 15 ud.

Den anden klasse af lymfocyter (de benmarvs-afledte celler eller B-celler) er de som udskiller antistof. De dannes også fra hæmopoie-tiske stam-celler, men deres differentiering bestemmes ikke af thymus.

1 fugle differentieres de i et med thymus analogt organ, kaldet Bursa 20 Fabricii. I pattedyr har man imidlertid ikke oplevet et ækvivalent organ og det antages, at disse B-celler differentierer i benmarven.

Det anerkendes nu, at T-celler kan opdeles i mindst adskillige undertyper, kaldet "hjælpe", "suppressor", og "dræbe" T-celler, der har den funktion (hhv.) at fremme en reaktion, undertrykke en reaktion eller 25 dræbe (lysere) fremmede celler. Disse underklasser forstås godt inden for musefamilien, men er kun for nyligt blevet beskrevet for humane systemer. Se fx. R.L. Evans, et al., Journal of Experimental Medicine, bind 145, 221-232, 1977 og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T-Cell Subsets Bearing Unique Differentiation 30 Antigens", i "Contemporary Topics in Immunobiology", 0. Stutman, Editor,

Plenum Press, 1977, bind 7, 363-379.

Evnen til at identificere klasser eller underklasser af T-celler er vigtig for diagnosen af forskellige immuno-regulatoriske uregelmæssigheder eller tilstande.

35 Fx. har visse leukæmias og lymfomas forskellig prognose i afhængighed af, om de er af B-celle eller T-celle oprindelse. Således afhænger vurderingen af sygdomsprognosen af, at man kan skelne mellem disse to klasser af lymfocyter. Se fx. A.C. Aisenberg og J.C. Long, The

DK 154086 B

3

American Journal of Medicine, 58:300 (marts 1975), D. Belpomme, et al., i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, et al., eds, Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og D. Bel pomme, et al., British Journal of Haematology, 1978, 38, 85. Visse sygdomstilstande 5 (fx. juvenil rheumatoid arthritis og visse leuksmias) hænger sammen med en ubalance af T-celle underklasser. Det er blevet foreslået, at autoimmune sygdomme i almindelighed hænger sammen med et overskud af "hjælpe" T-celler eller mangel på visse "suppressor" T-celler, mens maligne tilfælde i almindelighed hænger sammen med et overskud af 10 "suppressor" T-celler. I visse leukæmias produceres overskud af T-celler på et hæmmet udviklingsstade. Diagnosen kan derfor afhænge af muligheden for at påvise sådan ubalance eller overskud. Se. fx. J. Kersey, et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses” i Haematology and Blood Transfusion, bind 20, Springer-15 Verlag, 1977, 17-24 og de deri anførte referencer.

Identifikationen og undertrykkelsen af humane T-celle klasser og underklasser er tidligere sket ved anvendelse af spontane autoantistoffer eller selektive antisera for humane T-celler opnået ved immunisering af dyr med humane T-celler, tapning af dyrene til opnåelse 20 af serum og adsorption af antiserum med (fx.) autologe, men ikke allogene B-celler til fjernelse af antistoffer med uønskede reaktiviteter. Fremstillingen af disse antisera er særdeles vanskelig, især i adsorptions-og rensningstrinnene. De adsorberede og rensede antisera kan endog indeholde mange urenheder foruden det ønskede antistof, af 25 adskillige grunde. For det første indeholder serum millioner af antistof-molekyler, selv før T-celle-immuniceringen. For det andet bevirker immuniceringen dannelse af antistoffer mod en lang række antigener, som findes på alle injicerede humane T-celler. Der er ingen selektiv dannelse af antistof over for et enkelt antigen. For det tredje 30 er titeren af specifikt antistof opnået ved sådanne metoder sædvanligvis meget lav (fx. inaktiv ved fortyndinger på mere end 1:100) og forholdet g mellem specifikt og non-specifikt antistof er mindre end 1/10 , se fx. den ovenfor omtalte artikel af Chess og Schlossman (side 365 og følgende) og den ovenfor omtalte artikel i Chemical and Engineering 35 News, hvor manglerne ved hidtil kendte antisera og fordelene ved monoklonalt antistof er beskrevet.

Der er nu fundet en hidtil ukendt hybridomacellelinie, som er i stand til at danne hidtil ukendt monoklonalt antistof over for et

DK 154086 B

4 antigen, som findes på i det væsentlige alle normale humane perifere T-celler. Det saledes dannede antistof er monospecifikt for en enkelt determinant på normale, humane T-celler og indeholder i det væsentlige ingen anden antihuman immungi obul in, i modsætning til tidligere kendte 5 antisera (som nødvendigvis er kontamineret med antistof, der er reaktivt over for talrige humane antigener} og til hidtil kendte monoklonale antistoffer (der ikke er monospecifikke for et humant T-celle antigen). Endvidere kan denne hybridomacellelinie dyrkes til fremstilling af antistof uden nødvendigheden af at immunicere og dræbe dyr, efterfulgt af de 10 trivielle adsorptions- og rensningstrin, som er nødvendig for at opnå blot de urene antisera ifølge den kendte teknik.

Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen af klasse IgG er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at det er identisk med det monoklonale antistof, der fremstilles af hybridomacellelinien ATCC 15 nr. 8000, og at det a) reagerer med i det væsenlige alle normale humane perifere T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, nul-celler eller makrofager, b) reagerer med fra ca. 5% til ca. 10% af normale humane thy- 20 mocyter, c) reagerer med leukæmiske celler fra mennesker med T-celle kronisk lymfoblastisk leukæmi a, men ikke med leukæmiske celler fra mennesker med T-celle akut lymfoblastisk leukæmia, 25 d) udviser et reaktivitetsmønster med de humane T-celle-linier CEM (ATCC nr. CCL 119) og HSB2 (ATCC nr. CCL 120.1), som vist i figur 4, og e) ikke reagerer med Epstein-Barr virus-transformerede humane B-celle-linier.

30 Hybridomacellelinien ifølge opfindelsen til anvendelse ved fremstilling af nævnte monoklonale antistof er ejendommelig ved, at det er hybridomacellelinie ATCC nr. CRL 8000.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til diagnose af hvorvidt patienter har en T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) eller 35 T-celle kronisk lymfoblastisk leukæmi (T-CLL) er ejendommelig ved, at man blander leukæmiske celler fra en patient med én af de nævnte sygdomme med det monoklonale antistof og iagttager, hvorvidt der forekommer en reaktion. Fremgangsmåden ifølge opfindelse til fremstilling af

DK 154086B

5 navnte monoklonale antistof er ejendommelig ved, at man dyrker hybri-domacellelinien ATCC nr. CRL 8000 in vitro i et egnet medium eller indfører den intraperitonealt til mus, og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller 5 serum fra musene.

Den hidtil ukendte hybridomacellelinie ATCC nr. CRL 8000 er blevet fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Mil stein og Kohier. Efter immunisering af mus med normale E-roset positive humane T-celler, fusioneredes de immunicerede mus milt-celler med celler fra en 10 muse-myeloma-linie og de resulterende hybridomas screenedes for sådanne med supernatanter Indeholdende antistof, som gav selektiv binding til normale E-roset positive humane T-celler. De ønskede hybridomas blev derefter klonet og karakteriseret. Som resultat opnåedes hybridomacel lelinie ATCC nr. CRL 8000, som danner antistof (kaldet 0KT1) over for 15 et antigen på i det væsentlige alle normale humane T-celler. Dette antistof reagerer ikke alene med i det væsentlige alle normale humane perifere T-celler, men reagerer heller ikke med andre normale perifere blod-lymfoide celler. Endvidere påvises det celle-overfladeantigen, som erkendes af dette antistof, kun på modne thymocyter og mangler fuld-20 stændigt på mere end 90% af normale humane thymocyter.

I betragtning af de anførte vanskeligheder ved den kendte teknik og manglen på succes, som er rapporteret ved anvendelse af maligne cellelinier som antigen, var det selvom hybridomacellelinien er opnået på i og for sig kendt måde ikke til at forudsige, om det var muligt at 25 tilvejebringe det ønskede hybridoma. Det skal understreges, at den uforudsigelige natur af hybrid-celle fremstilling ikke gør det muligt at ekstrapolere fra et antigen eller celle system til et andet. Det har endda i forbindelse med den foreliggende opfindelse vist sig, at anvendelse af en T-celle malign celle-linie som antigen bevirkede 30 dannelse af hybridomas, som ikke dannede det ønskede antistof. Forsøg på at anvende rensede antigener adskilt fra celleoverfladerne, var også uden gunstigt resultat.

En prøve af det pågældende hybridoma deponeredes hos American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852 d. 13.

35 marts 1979 og har fået tildelt ATCC nummer CRL 8000.

Fremstillingen og karakteriseringen af det omhandlede hybridoma og det resulterende antistof vil blive nærmere forklaret i det følgende.

DK 154086 B

6

Fremgangsmåden til fremstilling af det omhandlede hybridoma omfatter følgende trin: A. Han immunicerer mus med E-roset positive rensede, normale, 5 humane, perifere T-celler.

B. Hiltene fjernes fra de immunicerede mus og der fremstilles en milt-suspension i et passende medium.

10 C. De suspenderede milt-celler fusioneres med muse-myelomacel1er fra en passende celle-linie ved anvendelse af en passende fusionspromoter.

D. Han fortynder og dyrker i separate beholdere blandingen af 15 ufusionerede milt-celler, ufusionerede myeloma-celler og fusionerede celler i et selektivt medium, som ikke nsrer de ufusionerede myeloma-celler i et tidsrum, som er tilstrækkelig til at de ufusionerede celler dør.

20 E. Han vurderer supernatanten i hver beholder (fordybning), som indeholder et hybridoma, for tilstedeværelsen af antistof mod E-roset positive rensede humane T-celler.

F. Han udvælger (fx. ved begrænsingsfortynding) og kloner 25 hybridomas, som producerer det ønskede antistof.

Det monoklonale antistof kan produceres på én af to måder. Det reneste monoklonale antistof dannes ved in vitro dyrkning af det omhandlede hybridoma i et egnet medium i et passende tidsrum efterfulgt 30 af udvinding af det ønskede antistof fra supernatanten. Det egnede medium og den egnede dyrkningstid kendes eller kan let bestemmes. Denne in vitro metode danner i det væsentlige monospecifikt monoklonalt antistof, der er i det væsentlige frit for andet specifikt antihuman immungi obul in. Der er en lille smule andet immun-globulin til stede eftersom 35 mediet indeholder xenogent serum (fx. foetalt kalveserum). Denne in vitro metode kan imidlertid ikke producere en tilstrækkelig mængde eller koncentration af antistof til visse formål, eftersom koncentrationen af monoklonalt antistof kun er ca. 50 /ig/ml.

DK 154086 B

7

Til fremstilling af en meget større koncentration af en smule mindre rent monoklonalt antistof kan det omhandlede hybridoma injiceres i mus, fortrinsvis syngeniske eller semi-syngeniske mus. Hybridomaet vil bevirke dannelse af antistof-producerende tumorer efter en passende 5 inkubationstid, som vil resultere i en høj koncentration af det ønskede antistof (ca. 5-20 mg/ml) i blodbanerne og peritonealt exudat (ascites) hos værtsmusene. Selvom disse værtsmus også har normale antistoffer i deres blod og ascites, er koncentrationen af disse normale antistoffer kun ca. 5% af den monoklonale antistof-koncentration. Da disse normale 10 antistoffer endvidere er ikke antihumane med hensyn til deres specificitet, er det fra udvundet ascites eller fra serum opnåede monoklonale antistof i det væsentlige fri for noget forurenende anti-humant immun-globulin. Dette monoklonale antistof har høj titer (aktiv ved fortyndinger på 1:30.000 eller mere) og højt forhold mellem 15 specifikt og non-specifikt immun-globulin (ca. 1/20). Immun-globulin produceret under inkorporering af de såkaldte "k light" myeloma-kæder er non-specifikke "nonsens" peptider, som blot fortynder det monoklonale antistof uden at nedsætte dets specificitet.

20 Eksempel 1

Fremstilling af monoklonalt antistof A. Immunicerinq og somatisk celle-hvbridicering

Balb/cJ mus af hunkøn (Jackson Laboratories, 6-8 uger gamle) 25 immuniceredes intraperitonealt med 2 x 107 E-roset rensede T-celler i 0,2 ml fosfat-forpufret saltopløsning med 14 dages intervaller. Fire dage efter den tredje immunicering fjernedes miltet fra musene og en enkelt celle-suspension fremstilledes ved at presse vævet gennem et rustfrit stålnet.

30 Celle-fusion foretoges iht. den af Kohier og Milstein udviklede o metode. 1 x 10 splenocyter fusioneredes i 0,5 ml fusionsmedium indeholdende 35% polyethylenglyeol (PEG 1000) og 5% dimethyl sul foxid i "RPMI 1640" medium (Gibco, Grand Island, NY) med 2 x 107 P3X63Ag8Ul myeloma-celler leveret af Dr. M. Scharff, Albert Einstein College of 35 Medicine, Bronx. NY. Disse myeloma-celler sekreterer IgGj κ light kæder.

DK 154086 B

8 B. Udve!gel se og vakst af hvbridoma

Efter celle-fusion dyrkedes celler i HAT medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) ved 37°C med 5% COg i en fugtig atmosfære.

Adskillige uger senere tilsattes 40 til 100 jtil supernatant fra kulturer

C

5 indeholdende hybridomas til en tablet af 10 perifere lymfocyter adskilt i E-roset positiv (E+) og E-roset negativ (E") populationer, som var fremstillet ud fra blod af sunde humane donorer som beskrevet af Hendes (J. Immunol. 111:860, 1973). Påvisning af muse-hybridoma-anti-stoffer, som binder til disse celler, bestemtes ved radioimmuno- 10 undersøgelse og/eller indirekte immunofluorescens. Ved den første 125 metode omsattes cellerne først med 100 øl affinitets-renset I gede- g anti-muse IgG (10 cpm/øg, 500 /ig//tl). (Detaljer vedrørende iodering af gede-anti-mus blev beskrevet af Kung, et al., J. Biol. Chem. 251(8): 2399, 1976). Alternativt stænkedes celler inkuberet med dyrknings-15 supernatenter med et fluoresceret gede-anti-muse IgG (G/H FITC) (Heloy Laboratories, Springfield, VA, F/p * 2,5) og de fluorescerende antistof-belagte celler analyseredes dernæst på cytofluorograf "FC200/4800A" (Ortho Instruments, Westwood, HA) som beskrevet i eksempel 2. En hybridoma-kultur ATCC nr. CRL 8000 indeholdende antistoffer, der 20 reagerede specifikt med E+ lymfocyter (T-celler) udvalgtes og klonedes.

7

Derefter overførtes klonerne intraperitonealt ved injektion af 1 x 10 celler af en given klon (0,2 ml volumen) i Balb/cJ mus, der var forbehandlet med 2,6,10,14-tetramethylpentadecan leveret af Aldrich Chemical Company under navnet "Pristine". De maligne ascites fra disse 25 mus anvendtes dernæst til karakterisering af lymfocyter som beskrevet nedenfor i eksempel 2. Det pågældende hybrid-antistof kaldet 0KT1 dannet af hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8000 blev ved standardteknik påvist at være af IgGj underklasse.

30 Eksempel 2

Karakterisering af 0KT1 reaktivitet A. Isolering af lymfocyt-populationer

Humane perifere blod-mononukleære celler isoleredes fra raske fri-35 villige donorer (alder 15-40) ved hjælp af “Ficoll-Hypaque" densitetsgradient-centrifugering (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) efterfulgt af teknikken beskrevet af Boyum i Scand. J. Cl in. Lab.

Invest. 21 (Suppl. 97):77, (1968). Ufraktionerede mononukleære celler

DK 154086 B

9 opdel tes i overflade Ig+ (B) og Ig" (T plus nul) populationer ved hjælp af "Sephadex G-200" anti-F(ab')2 søjlekromatografi som tidligere beskrevet af Chess, et al., J. Immunol. 113:1113 (1974). T-celler blev vundet ved E-rosettering af Ig" populationen med 5% fåre-erythrocyter 5 (Microbiological Associates, Bethesda, MD). Den rosetterede blanding lagdeltes over Picoll-Hypaque og den vundne E+-tablet behandlet med 0,155M NH^Cl (10 ml per 108 celler). Den således opnåede T-celle population var mindre end 2% EAC-roset positiv og mere end 95% E-roset positiv bestemt ved standardmetoder. Endvidere blev den non-rosetterende 10 Ig" (nul-celle) population udvundet fra Ficoll-interfladen. Denne sidstnævnte population var mindre end 5% E+ og mindre end eller lig 2% slg+. Overflade Ig+ (B) populationen opnåedes fra "Sephadex G-200" kolonnen efter eluering med normal human gamma-globulin som tidligere beskrevet. Denne population var mere end 95% overflade IG+ og mindre end 15 5% E+.

Normale humane makrofager opnåedes fra den mononukleære population ved vedhæftning til polystyren. Således resuspenderedes mononukleære celler i siut-kulturmedier (RPMI 1640, 2,5 mM HEPES [4-(2-hydroxyethyl)- 1-piperazinpropan-sulfonsyre] puffer, 0,5% natriumbicarbonat, 200 mM 20 L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin, tilsat 20% varme-inaktiveret g humant AB serum) ved en koncentration på 2 x 10 celler og inkuberedes i formstof-petri skåle (100 x 20 mm) (Falcon Tissue Culture Dish, Falcon,

Oxnard, CA) ved 37°C natten over. Efter grundig udvaskning til fjernelse af ikke vedhæftende celler, frigjordes den vedhæftende population ved 25 rigelig udvaskning med koldt serum-frit medium indeholdende 2,5 mM EDTA og lejlighedsvis skrabning med gummi-spidsen af stemplet for en éngangssprøjte. Mere end 85% af celle-populationen var i stand til at indtage latex-partikler og havde monocytes-morfologiske egenskaber ved Wright-Giemsa pletning.

30 B. Normal thvmus

Normal human thymus-kirtel opnåedes fra patienter med en alder mellem 2 måneder og 14 år, som var under korrektiv kardi al-kirurgi.

Frisk opnåede portioner af thymus-kirtlen anbragtes straks i 5% foetalt 35 kalve-serum i medium "199" (Gibco) fint parteret med forceps og saks, og til dannedes derefter til enkeltcelle-suspensioner ved presning gennem trådnet. Cellerne lagdeltes dernæst over Ficoll-Hypaque og spunnet og vasket som beskrevet i afsnit A ovenfor. De således opnåede thymocyter

DK 154086 B

10 var mere end 95% levende og mere end eller lig 90% E-roset positiv.

C. Celle-linier

Epstein-Barr Virus (EBV) transformerede B-celle-linier fra fire 5 normale individer fremstilledes som tidligere beskrevet. T-celle-linier CEH, HSB-2 og HJD-1 leveredes af Dr. H. Lazarus, Sidney Farber Cancer Institute, Boston, HA.

P. T akut lvmfoblastisk leukaemia (T-ALL1 celler oq T kronisk_ 10 l.vmfatisk leukaemia ΓΤ-CLLl celler

Leukæmia-celler opnåedes fra 12 patienter med T-ALL. Disse individers celler var forud bestemt af hver af T-celle-linie ved deres spontane roset-dannelse af fåre-erythorcyter (mere end 20% E+) og reaktivitet med T-celle specifikke hetero-antisera, anti-HTL (anti-15 B.K.) og A99, som tidligere beskrevet af Schlossman, et al., Proc.

Nat. Acad. Sci. 73:1288 (1976). Tumor-celler fra tre individer var reaktive (TH2+) med kanin- og/eller heste-anti-TH2, mens celler fra de resterende ni var non-reaktive (TH2"). Leukæmiske celler fra to patienter med TH2“ T-CLL anvendtes også. Både akute og kroniske 20 T-celle leukæmia-celler kryopræserveredes i -196°C dampfase flydende nitrogen i 10% dimethyl sul foxid og 20% AB humant serum indtil tidspunktet for overfladekarakterisering. De analyserede tumor-populationer var mere end 90% biastomer ved Wright-Giemsa morfologi i alle tilfælde.

25

Cvtofluoroorafisk analyse oo celle-separering

Cytofluorografisk analyse af alle celle-populationer foretoges ved indirekte immunofluorescens med fluorescein-konjugeret gede-anti-muse IgG (G/M FITC) (Meloy Laboratories) på en cytof1 uorograf "FC200/ 4800A"

C

30 (Ortho Instruments). I korte træk behandledes 1-2 x 10 celler med 0,15 ml 0KT1 ved 1:1000 fortynding, inkuberedes ved 4°C i 30 minutter og vaskedes to gange. Cellerne reagerede dernæst med 0,15 ml af en 1:40 fortynding G/H FITC ved 4°C i 30 minutter, centri fugeredes og vaskedes 3 gange. Disse celler analyseredes dernæst på cytof1uorografen og 35 fluorescens-intensiteten per celle registreredes på en impulshøjde-analysator. Et tilsvarende reaktivitetsmønster iagttoges ved en fortynding på 1:30.000, men yderligere fortynding bevirkede tab af reaktivitet. Baggrundspietning opnåedes ved at substituere en 0,15 ml

DK 154086B

11 portion 1:1000 ascites fra en Balb/cJ mus, der var intraperitonealt immuniceret med en non-producerende hybrid klon.

I forsøg, der var udformet til at skille 0KT1+ og OKTl" celler, mærkedes 100 x 106 ufraktionerede mononukleære celler eller thymocyter 5 med 4 ml af en 1:1000 fordynding af OKTl og udvikledes med G/M FITC. En identisk pletningsmetode anvendtes til at fremstille humane T-celler, der var isoleret son i eksempel 2 A ovenfor. Under anvendelse af en fluorescens-aktiveret celle-sorterer (FACS-I) (Becton-Dickinson,

Mountain View, CA) deltes lymfocyter i 0KT1+ og 0ΚΤΓ populationer 10 og/eller T-celler fraktioneredes i svagt reaktive 0KT1+ T-celler (mindre end 20% fluorescens) og stærkt reaktive 0KT1+ T-celler (mere end 20% fluorescens). Levedygtigheden efter sortering var mere end 95% ved Trypan-blå eksklusion i alle tilfælde. Renheden af alle separerede populationer var mere end eller lig 95%.

15

Funktionale studier

Den mitogene reaktion af de useparerede og FACS-fraktionerede lymfoide celler testedes i mikrokultur over for optimale doser af 4 Concanavalin A (Con A) (Calbiochem, La Jolla, CA) og fytohæmagglutinin 20 (PHA) som tidligere beskrevet af Chess, et al. All oantigen proliferate reaktion måltes samtidig for disse samme populationer under anvendelse af mitomycin-behandlet Laz 156, en EBV-transformeret human B lymfo-blastoid celle-linie opnået fra Dr. H. Lazarus, som en stimulus.

Proliferering med tetanus-toxoid (Massachusetts Department of Public 25 Health Biological Laboratories, Boston, MA) testedes som tidligere beskrevet af Evans, et al., (J. Immunol. 129:1423, 1978) under anvendelse af en 10 jag/ml slutkoncentration. 5% makrofager opnået på den ovenfor beskrevne måde sattes til alle populationer ved initieringen af in vitro kulturer. Mitogen-stimulerede kulturer impulseredes efter 4 30 dage med 0,2 /tCi tri tieret thymidin (1,9 Ci/mM specifik aktivitet,

Schwartz-Mann Division of Becton-Dickinson, Orangeburg, NY) og udvalgtes 18 timer senere på et "MASH II" apparat (Microbiological Associates,

Bethesda, MD). Tritieret thymidin-inkorporering måltes på en "Packard Scintillation Counter" (Packard Instrument Company, Downer's Grove, IL).

35 Baggrunds-tritieret thymidin-inkorporering opnåedes ved at substituere medium for mitogen. Tetanus toxoid- og alloantigen-stimulerede kulturer impulseredes efter 5 dage med tritieret thymidin i 18 timer, udvalgtes og taltes som beskrevet ovenfor.

DK 154086 B

12

Der henvises i det følgende til tegningen, hvor figur 1 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af de viste celle-populationer med 0KT1 ved 1:1000 fortynding og G/M FITC, 5 figur 2 det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af humane thymocyter med 0KT1 og G/M FITC, figur 3 det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af leukæmi ske celler fra både patienter med akut lymfoplastisk leukæmia og kronisk lymfoplastisk leukæmia med 0KT1 og G/M FITC, 10 figur 4 det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af humane T-celle-linier med 0KT1 og G/M FITC, og figur 5 viser det på cytofluorografen opnåede fluorescens-mønster efter reaktion af den B-celle lymfoblastoide linie Laz 007 med 0KT1 og G/M FITC.

15 Som vist i figur 1 er hele den humane perifere blod T-celle population hos et givet normalt individ reaktiv med 0KT1, mens alle B-celle, nul-celle og makrofag populationerne isoleret fra samme individ, er ureaktive med 0KT1. Tilsvarende resultater opnåedes på populationer af lymfocyter fra 15 andre normale individer. Det monoklonale 20 antistof er således karakteriseret ved, at det er reaktivt med et antigen indeholdt på overfladen af i det væsentlige alle normale humane perifere T-celler, mens det er ikke reaktivt med antigener på overfladen af de andre tre celle-typer, som er vist i figur 1. Denne differentielle reaktivitet udgør én test ved hjælp af hvilken det omhandlede antistof 25 0KT1 kan påvises og skelnes fra andre antistoffer.

Som vist i figur 2, er langt den overvejende del af normale humane thymocyter fra et 6 måneder gammelt barn fuldstændig ikke-reaktive med 0KT1, mens ca. 5 til 10% af thymocyterne er reaktive. Man kan heraf udlede, at thymocyterne, under den differentieringsproces, ved hvilken 30 stam-celler omdannes til modne T-celler, på et vist stade opnår det samme overfladeantigen som findes på T-celler og som er reaktivt med 0KT1. Det antages, at disse thymocyter befinder sig i de senere differentieringsstader lige før afgangen fra thymus til blodbanerne. Tilsvarende resultater (5 til 10% reaktivitet) opnåedes ved anvendelse 35 af seks yderligere thymus-prøver fra normale individer af en alder på 2 måneder til 19 år. Reaktivitetsmønsteret i figur 2 giver en anden fremgangsmåde til påvisning af det omhandlede antistof 0KT1 og til at skelne det fra andre antistoffer.

DK 154086B

13

Figur 3 belyser en diagnostisk anvendelse af det omhandlede antistof, idet det er vist, at leukæmiske celler fra patienter med T-akut lymfoblastisk leukæmia (T-ALL) var ikke reaktive med 0KT1, mens leukæmiske celler fra patienter med T-kronisk lymfoblastisk leukæmia (T-5 CLL) var reaktive med 0KT1. Det omhandlede antistof tilvejebringer derfor en metode til at skelne mellem disse to former for leukæmia. Da det er vanskeligt at skelne mellem visse stader af T-ALL og T-CLL og da både prognosen og behandlingsmåden afviger væsentligt mellem disse to former for leukæmia, kan det indses, at en direkte fremgangsmåde til at skelne 10 mellem disse to tilvejebragt ved brug af det omhandlede antistof har en betydelig fordel.

En yderligere karakterisering af det pågældende antistof 0KT1 er vist ved reaktiveten over for forskellige humane T-celle-linier belyst i figur 4. Som det kan ses, var reaktiviteten af det pågældende antigen 15 over for humane T-celle-linier heterogen, nemlig moderat for linien CEN (ATCC nr. CCL 119) og ikke til stede for linien HSB-2 (ATCC nr. CCL 120.1). Denne differentielle reaktivitet af 0KT1 over for forskellige let tilgængelige humane T-celle-linier tilvejebringer yderligere en metode til at karakterisere og beskrive det pågældende antistof.

20 Figur 5 belyser den manglende reaktion af 0KT1 med den humane lice! le-linie Laz 007. Et identisk mønster opnåedes på de andre testede EBV-transformerede B-celle-linier. Dette understøtter yderligere den manglende reaktivitet af 0KT1 med B-celler opnået fra det perifere blod hos en normal population og tilvejebringer endnu en metode til at 25 karakterisere og skelne det omhandlede antistof 0KT1.

Funktionelle studier foretoges på lymfoide populationer, som var blevet adskilt på en fluorescens-aktiveret celle-separator (FACS).

Resultaterne af disse studier er vist i tabel I til III nedenfor og giver yderligere basis for den tidligere beskrevne karakterisering af det 30 pågældende monoklonale antistof.

Som vist i tabel I ligger i det væsentlige hele reaktionsevnen over for PHA, Con A, opløselige antigener og alloantigen i blandet lymfocytkultur (NLC) i populationen af celler, som reagerer på 0KT1. Populationen som var ikke reaktiv over for 0KT1, syntes ikke at bevirke nogen 35 af disse T-celle-funktioner, idet den ringe reaktion kan tilskrives mulig kontaminering med 0KT1+ celler. Disse funktionelle studier er en yderligere illustration af, at antigenet, hvormed 0KT1 reagerer, kun sidder på T-celler, eftersom populationen, der er så reaktiv, udviser T-

DK 154086 B

14 celle-funktioner, mens populationen, som ikke er så reaktiv, ikke udviser nogen af disse funktioner. Tabel II illustrerer, at der ikke findes funktionelle forskelle i mitogen- eller alloantigen-reaktion mellem de stærkt 0KT1-reaktive og svagt 0KT1-reaktive T-celler adskilt 5 på FACS. Begge populationer prolifererede lige godt og på en måde, der var identisk med den ufraktionerede T-celle population. Tabel III antyder, at overflade-antigenet, hvormed 0KT1 reagerer, kun er til stede på modne thymocyter, idet aktiviteten af hele rækken af thymocyter ved HLC-prøven nssten udelukkende skyldes den del af thymocyt-populationen, 10 som er reaktiv med 0KT1. Tabel III viser også den funktionelle forskel mellem 0KT1+ lymfocyter og 0KT1+ perifere T-celler, idet førstnævnte mangler mitogen-reaktionsevne.

Det blev påvist, at det omhandlede antistof OKU hører til underklassen IgGj, som er én af de fire underklasser af murin IgG. Disse 15 underklasser af immunoglobulin G afviger fra hinanden i de såkaldte "fikserede" områder, idet dog et antistof for et specifikt antigen vil have et såkaldt "variabelt" område, som er funktionelt identisk uanset hvilken underklasse af immungi obul in G det tilhører.

is DK 154086 B

. o cn oo co oo

5- 00 CD 00 00 O

0) O 00 O ^ T- u 'r- o (- +i +1 +1 +1 "Ή E ^ oo ld 't >. O uo lo cm cm tn — 'φ O i— t— t'* <u cn oo oo cm Q) ’s_ <u o 00 oo CD 00 Γ'- CO CO CD too

, O O CD ID

μ + CD r- CM

x: h +i+i +i +i +i O "X. f". Γ" LO "CT ro — O LO 00 00 00

gj LO 00 CM r- LO

o ....

, oo cn oo o + OO CM 'Cf 00 h 0 s_ υ

ω m \~ Or- CD LO

+->(0— Or- CO CM CD

: 41 LL CD 00 UO LO

5 ft · · o — W 3 J> ϋ oo 00 · r- "55 to q (j "c +i +i +i +i +i -£ Λ c , J5 cn CO r- cd <+ ro 0 + -11 CM-CM "Cf uo oo (— U c ro cMoor-n~ r-

<f c r- .Q

i, _ i— r-- cd co oo ω O· oo oo oo cm

E ^ O

a) "δ ^ o5 CD O) UO CM cd _ ro LO LO r- 00 r- o; Φ LO CO O0 r- C v ....

·- j r- CM CM ^ σι C +| +1 +1 +1 +|

·- O

r C CM r- C0 r- CM

m O 00 O LO CM 00 ^ £ o o cn CO <+

E _ CD CM CM LO

Π3 0) 'cf· 00 CM CM

irt .C r- r- "53

C

.2 > S ti i C 2 1/1 (Λ _ £ £ I < c2ro£ 3 E c < U +5 9 x> c 2 Ϊ3 O X -J <D >< CD o

o. w U cl. 2 f— +-> IE

16 DK 154086 B

Ια) 0) >_ oo o m i"- « (o o in P ·- Γ r^oi-to r- i— LO c\j q^i~ r- lo cm η n w Λ o m w oo w cd 'i ro mj Λ S- h ω ^ Έ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 y ^ +» (1) 0 TtS’E co n o ni n æ in m U “ro lo lo o i'* in cn M· y > Ό- co cd cd r r n T> ‘ cn ... ...

ro 1- m- o o i— r^- cvi c in ω o r cd y· 5— Γ-

<D

>

4-i L

(DO) (Π > CD CD 00 00 00 CD 00 00

Q) C r- 00 CM r- CM OO CO

L. § |_ O t-· 00 CM CM cn +j “ «i ^ cd cn in cm co cn ^ “ o ro i_ *- +1+1 +1 +1 +1 +i +i +i ϋ! "5 cd cd in oo co cn cm

m M· O CO r- O O CM

σ “ E CO CM CO 't CO c- O 00 ° +j ^ cm cn cn co lo

ω I— in CDr-r- CD r^· LO

> *“ *- '(-> ro

CD

L

4_i rΛ h OD r- CD r- 00 CM CD

v ~ m cr o m· ldcdo O 00 O O r— r“

Jj ll ro in cm ^ r· cd o] : «> Si i 5 ® O) O) — 1- c r: \ v ·©· +i +i +i +i "g- +i +i +i +i n ^ .22^2 l oo cm to cn J- r cn σ> cm m c: L> 2 , ?? o cr r- (O a O O CM 0> ,ro E jso + -C il n m ro cn il cm oo ® cm t— o ro 1— SS ... ...

ro s_ r- .q cn cn r·' μ· m in

M-l— LO O O O CD OO

V 3 ^ Γ- Γ- <“ ro o "ro

V 00 LO CO CO

L_ ® o cn CM ΟΟτ-r^CVJ

“ © m r CD CM r- CO f"· - TI CD cn CD ...

ra ro ... cm cm in ra £ cn in 'f = +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 . "P .2 2 cn cm r- lo oo lo cd b 4->r cn cd cd cd ooocnio

Dl ^ O CM 00 CO CM O r- cl ro cd m co ro ro ro <t- in t- ro co s oo £3

E

ro tn _ > ro +3 1 2 g 5 j£ 5 < ro < ro C o E C < U Ό C < O tj 3 l X ox-iro o x —i ro ll cl tn O o. Σ Σ U cl Σ Σ

17 DK 154086 B

^ r- CM ^ CO

Is. OOO'M'r- CO CD i— C Q X~ Γ~ μ x +i ~h +i +i v C +1+1 +1 +1 ^ E lo r-s cvi o

O >· if ID r li) C\l CD CM O

r f η in ω *cf c\j 4-) c\j ί α) c o 73 cr> cm 't co CO ( Γ'-· CM CM CM CD CM i- © og cm

3 j_j CD

Q. + -^ +1 +1 +1 +1 0 i- Γ7 +1 +1 +1 +1

Q. μ η Γ"> O CM O

1 O X CO CO CM O N O if CO

4_) ““ E LO CO CM ir* Γ'- i— r-

> O > LO

U JC ' * 1/5

0 4-> CO

E

>

£L

4-» 0) c

TO U

E μ

3 T)£_— CO CM O O -.COO^CTCM

_ -C X £5 U_ ^ '-CM ι-r- ^ CM r-

_ ® +» CX) CO

- +- cn σι m c u \ Ό ©- +i +i +i +l $ +i +' +i +i J s- o o o c s-rf'sfooco L-oor^or^.

•O <u ·£3 E m o cm σν r-» ^ o [s *f ·<ο co TO XI v >< + -C IL TO U-Γ^.

μ TO m Γ 41 1 L Ϊ3 r ϋ CO ^ in q- μ C 3 * 4> π

O) U

4) 0)

f. 0) OJ CO «a- LO

^ "Π i_ ^ O φ ω r-OCOLO £ 4-» S_ 4-> S'- CD ^ _Li +1 +1 +1 ξ 5 O +1 +1 +1 +1 +l

3 0 0 i— CO CO O

LL +3E LO CO LO O - ir CD ®

>s CO CO Λ It CO

ror ° ·

i_ 4-> · CO

q- r-s 3 > +-»

^ TO

O — <r <£ q_ 3 ro ro

^ E U c < Ό Oc<O

c_ TC —i O I 4) -Ιοχω CL w Σ u o. Σ Συο-Σ

Claims (5)

1. Monoklonalt antistof af Klasse IgG, KENDETEGNET ved, at det er identisk med det monoklonale antistof, der fremstilles af hybridomacellelinien ATCC nr. CRL 8000, og at det 5 a) reagerer med i det væsentlige alle normale humane perifere T-celler, men ikke med normale humane perifere B-celler, nul-celler eller makrofager, b) reagerer med fra ca. 5% til ca. 10% af normale humane thy-mocyter, 10 c) reagerer med leukæmiske celler fra mennesker med T-celle kronisk lymfoblastisk leukæmia, men ikke med leukæmiske celler fra mennesker med T-celle akut lymfoblastisk leukæmia, d) udviser et reaktivitetsmønster med de humane T-celle-linier

15 CEM (ATCC nr. CCL 119) og HSB-2 (ATCC Nr. CCL 120.1) som vist i figur 4, og e) ikke reagerer med Epstein-Barr virus-transformerede humane B-celle-linier.

2. Hybridomacellelinie til anvendelse ved fremstilling af det mono-20 klonale antistof ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det er hybridomacellelinien ATCC nummer CRL 8000.

3. Fremgangsmåde til diagnose af hvorvidt patienter har en T-celle akut lymfoblastisk leukæmi (T-ALL) eller T-celle kronisk lymfoblastisk leukæmi (T-CLL), KENDETEGNET ved, at man blander leukæmiske 25 celler fra en patient med én af de nævnte sygdomme med det monoklonale antistof ifølge krav 1 og iagttager, hvorvidt der forekommer en reaktion.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af det monoklonale antistof ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man dyrker hybridoma- 30 cellelinien ATCC nr. CRL 8000 in vitro i et egnet medium eller indfører den intraperitonealt til mus, og udvinder antistoffet fra supernatanten fra in vitro dyrkningen eller fra maligne ascites eller serum fra musene.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at 35 musene er af stammen Balb/cj.