JP2019534891A - Haart安定化患者におけるcd4に対する抗体によるhiv感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解 - Google Patents
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Abstract
Description
1.Deek, S.G., Lewin, S.R., Ross, A.L. et al. “International AIDS Society global scientific strategy: towards an HIV cure 2016.” Nature Medicine.2016. 22:839-850.
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ヒトCD4(分化抗原群4)は、Tヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞の表面に見られる458アミノ酸の糖タンパク質(UniProtKB/Swiss-Prot: P01730.1)である(ウェブサイト:en.wikipedia.org/wiki/CD4)。CD4のアミノ酸配列を、配列表に配列番号22として示す。CD4+Tヘルパー細胞は、ヒト免疫系の必須部分である白血球である。これらはしばしばCD4細胞、Tヘルパー細胞またはT4細胞と呼ばれる。これらは感染粒子を破壊するCD8キラー細胞を含む他のタイプの免疫細胞にシグナルを送るのでヘルパー細胞である。CD4細胞が、例えば未処置のHIV感染症または移植前の免疫抑制の後に枯渇すると、身体は、そうでなければ戦うことができたであろう広範囲の感染症に対して脆弱なままになる。
D1コアドメイン(約アミノ酸(aa)26〜125)は、ジスルフィド結合架橋によって連結されているβ鎖によって形成された2つのβシートからなる。D1のアミノ酸配列は、免疫グロブリン鎖と類似の3つの相補性決定領域(CDR)で免疫グロブリンと相同性を共有する。CDR1−、CDR2−およびCDR3−様領域は、CD4のD1ドメインに位置している。
CD4のD2ドメイン(約aa126〜203)は、その疎水性界面を介してD1と結合する。D2はクラスII MHC分子のための結合部位に寄与する。CD4のD2ドメインを認識するいくつかの抗CD4抗体が製造されている。例えば、イバリズマブ(TMB−355;以前はTNX−355またはHu5A8として知られていた;例えばKuritzkes, D.R., et al., 2004);M−T441(Konig R, et al., 1995)がある。
CD4のD3ドメインは、約aa204〜317に位置している。D2がD1と相互作用するのと同様に、D3はその疎水性界面を介してD4に結合する。抗体OKT4はD3を認識する(例えば、Yuan R, et al., 2016; Moore, et al., 1992)。
D4ドメイン(約aa318〜374)は、膜貫通ドメインの前のCD4分子上の最後の細胞外ドメインである。D2に構造的に似ているD4は、CD4分子の二量体化を介してT細胞およびCD4機能を活性化すると広く信じられている。抗体OKT4およびL120はD4を認識する(例えば、Yuan R, et al., 2016; Moore, et al., 1992)。
膜貫通領域(約aa397〜418)は疎水性である一方で、細胞内/細胞質領域(約419〜458)は、シグナル伝達を媒介するためにリン酸化されている3個のセリン残基(S433、S440およびS456)を有する。これらのセリン残基は、P56lckチロシンリン酸化のレベルを上昇させ、シグナル伝達を調節することができる、Srcチロシンキナーゼ(TK)ファミリーメンバーP56lckと直接結合する。
HIV−1は、CD4を使用して宿主T細胞への侵入を得て、gp120として知られるそのウイルスエンベロープタンパク質を通してこれを達成する。gp120は、成熟HIV−1膜エンベロープ糖タンパク質前駆体gp160の2つのドメインのうちの1つであり、もう1つはgp41である。gp120のCD4への結合は、HIV−1付着の最初のステップを構成し、CD4−gp120相互作用はgp120のコンフォメーションの変化を引き起こし、宿主細胞上で発現されるケモカイン受容体CCR5またはCXCR4に結合するのを可能にする。この二次結合は、HIV−1のgp41(融合ペプチド)分子を宿主細胞膜に挿入することを可能にし、最終的にはウイルスと宿主との膜融合を媒介する。HIV感染症は、CD4を発現するT細胞の数の漸進的な減少をもたらす。
本開示の一面は、CD4に対する抗体、その組成物、ならびにHIV感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のためにこのような組成物を使用する方法に関する。
本開示はまた、HIV感染症の予防、処置および/または機能的治癒に使用することができる医薬製剤に関する。ある態様において、製剤は、CD4に対する抗体を含む。具体的な態様において、本開示は、CD4ドメイン1のCDR2領域内またはその近くの部位に向けられたCD4に対する高親和性モノクローナル抗体を有する医薬組成物に関する。このような抗体の結合活性(EC50)は、HIV gp120エンベロープタンパク質によって示されるCD4結合親和性(gp120についてのEC50=97nM)よりも約2log高い(すなわち、100倍密接な結合)。
本開示はまた、HIV感染症の処置、予防および機能的治癒のための方法において使用することができる抗ウイルス薬を含む。
本開示はまた、HIV感染症の処置、予防および機能的治癒のための方法に関する。ある態様において、製剤は、CD4に対する抗体を含む。
(1)CD4分子に対する抗体であって、該抗体は、CD4分子の細胞外領域に特異的に結合し、該抗体がCD4+細胞の表面上のCD4分子に結合すると、該抗体は、
a)CD4+細胞へのHIV侵入を競合的に阻害する;
b)HIVに感染した静止期CD4+細胞中の潜伏HIV蓄積を活性化する;
d)細胞HIV DNAのレベルを低下させる;および
e)ウイルス量リバウンドなしにHIV感染症の持続的ウイルス学的寛解をもたらす;
上記抗体。
(2)抗体は、HIVの無細胞および細胞間伝達を競合的に阻害する、(1)の抗体。
(3)対象に投与すると、抗体は、制御性T細胞の割合を減少させる、(1)の抗体。
(4)対象に投与すると、抗体は、CD8+細胞の量を増加させる、(1)の抗体。
(6)対象に投与すると、抗体は、HIV感染CD4+細胞を標的化する機能的HIV特異的CD8+CTL細胞を増強する、(1)の抗体。
(7)抗体は、CD4+細胞におけるTNF−α産生を増強する、(1)の抗体。
(8)抗体は、架橋の有無にかかわらず、静止期CD4+細胞を活性化する、(1)の抗体。
(9)抗体は、ウイルス量リバウンドなしに、HIV陽性患者におけるHIVウイルス量を血液1mL当たり50コピー未満に減少させる、(1)の抗体。
(10)抗体は、CD4分子のドメイン1付近の領域に結合する、(1)の抗体。
(11)抗体は、CD4のドメイン1のCDR2領域付近の領域に結合する、(1)の抗体。
配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2および配列番号6のCDR3を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列;を有する、(1)の抗体。
(13)抗体がモノクローナル抗体である、(1)の抗体。
(14)抗体がヒト化モノクローナル抗体である、(1)の抗体。
(15)
配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と;
配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含むヒト化モノクローナル抗体である、(1)の抗体。
(16)抗体は、配列番号10のアミノ酸配列を有する重鎖;及び配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖;を有するヒト化モノクローナル抗体である、(1)の抗体。
(17)抗体は、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖;及び配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖;を有するヒト化モノクローナル抗体である、(1)の抗体。
(18)抗体は、配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖;及び配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖;を有するヒト化モノクローナル抗体である、(1)の抗体。
(19)HPB−ALL細胞上の膜結合CD4に対する絶対結合親和性(Kd)が約3.1×10−11M〜約8.1×10−11Mである、(1)の抗体。
(20)CD4分子に結合した(1)の抗体。
(22)(1)の抗体及び医薬上許容可能な担体を有する医薬組成物。
(23)(1)の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシンおよび0.05%(v/v)ポリソルベート20の溶液を有する医薬組成物。
(24)(1)の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシン、0.05%(v/v)ポリソルベート20および10mMヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
(25)(1)の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシンおよび0.05%(v/v)ポリソルベート20の約1.0mg/mL〜約200.0mg/mLの溶液を有する医薬組成物。
(26)(1)の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシン、0.05%(v/v)ポリソルベート20および10mMヒスチジンの約1.0mg/mL〜約200.0mg/mLの溶液を有する医薬組成物。
(27)(1)の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシンおよび0.05%(v/v)ポリソルベート20の約10.0mg/mLの溶液を有する医薬組成物。
(28)(1)の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシン、0.05%(v/v)ポリソルベート20および10mMヒスチジンの約10.0mg/mLの溶液を有する医薬組成物。
(29)(12)の抗体及び医薬上許容可能な担体を有する医薬組成物。
(30)(16)の抗体及び医薬上許容可能な担体を有する医薬組成物。
(32)抗体をHIVへの曝露前に対象に投与する、(31)の方法。
(33)抗体をHIVへの曝露後に対象に投与する、(31)の方法。
(34)抗体をHIVへの曝露後48時間以内に投与する、(31)の方法。
(35)少なくとも約5mg/kg体重の投与量で抗体を対象に投与する、(31)の方法。
(36)抗体を複数回対象に投与する、(35)の方法。
(37)抗体を毎週、隔週または毎月間隔で対象に投与する、(36)の方法。
(38)抗ウイルス薬を対象に投与するステップをさらに含む、(36)の方法。
(39)抗ウイルス薬が高活性抗レトロウイルス療法(HAART)である、(38)の方法。
(40)HAARTが、プロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤と組み合わせて、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤を有する、(39)の方法。
(41)抗体をHAARTと同時に投与する、(39)記載の方法。
i)第1の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)(i)の第1の期間および第2の期間の間、HAARTを対象に連続的に投与すること;を有する、(39)の方法。
(43)抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
i)毎週、隔週または毎月間隔で、4ヶ月の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて2ヶ月の処置休日;および
ii)(i)の6ヶ月の期間の間、HAARTを対象に連続的に投与すること;を有する、(39)の方法。
(44)対象が2サイクルにわたって処置される、(42)の方法。
(45)対象が2サイクルにわたって処置される、(43)の方法。
(46)抗体をHAARTと同時ではない時に投与する、(39)記載の方法。
(47)抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
i)第1の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)HAARTを対象に第2の期間の間投与し、第1の期間の間投与しないこと
を含む、(39)の方法。
(48)抗体を第1の期間の間、一定の間隔で投与する、(47)の方法。
(49)抗体を第1の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する、(47)の方法。
b)高活性抗レトロウイルス療法(HAART);を有する処置レジメンを対象に投与することを有する、HIV感染症を有する対象を処置する方法。
(51)少なくとも約5mg/kg体重の投与量で抗体を対象に投与する、(50)の方法。
(52)抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
i)第1の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)(i)の第1の期間および第2の期間の間、HAARTを対象に連続的に投与すること;を有する、(50)の方法。
(53)抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
i)毎週、隔週または毎月間隔で、4ヶ月の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて2ヶ月の処置休日;および
ii)(i)の6ヶ月の期間の間、HAARTを対象に連続的に投与すること;を有する、(50)の方法。
(54)対象が2サイクル以上にわたって処置される、(52)の方法。
(55)対象が2サイクル以上にわたって処置される、(53)の方法。
(56)抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
i)毎週、隔週または毎月間隔で、4ヶ月の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて2ヶ月の処置休日;および
ii)(i)の6ヶ月の期間の間、HAARTを対象に連続的に投与すること;を有する、(53)の方法。
(57)(b)のHAARTと同時ではない時に(a)の抗体を投与する、(50)記載の方法。
i)第1の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)HAARTを対象に第2の期間の間投与し、第1の期間の間投与しないこと;を有する、(50)の方法。
(59)抗体を第1の期間の間、一定の間隔で投与する、(58)の方法。
(60)抗体を第1の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する、(58)の方法。
(61) (1)の抗体を細胞に曝露することを有する、CD4+細胞へのHIV侵入を阻害する方法。
(62) (1)の抗体を細胞に曝露することを有する、CD4+細胞へのgp120の結合を阻害する方法。
(63) (1)の抗体を細胞に曝露することを有する、静止期CD4+T細胞を活性化する方法。
(64) (1)の抗体を細胞に曝露することを有する、静止期T細胞中のHIVの潜伏蓄積を活性化する方法。
(65)HIVに感染した細胞の試料中の潜伏HIV蓄積を減少させる方法であって、
a)(1)の抗体を細胞の試料に曝露すること;及び
b)HAARTを細胞の試料に曝露すること;を有する上記方法。
図面および関連する実施例の以下の例示的な説明は、本明細書において、特に実施例において頻繁に使用される一定の用語の理解を容易にするために提供される。説明は便宜上提供されており、本発明を限定するものではない。
MAB B4の免疫学的および機能的特性
モノクローナル抗体B4(mAb B4)またはM2(mAb M2)は、T細胞表面上の複雑なHIV受容体部位(CD4)を認識するモノクローナル抗体である。MAb B4またはM2は、CD4とHIV補助受容体の相互作用に影響を与え、干渉することができる。MAb B4またはM2は、一次HIV−1分離株を優先的に中和した(両抗体は、米国特許第5912176号及び第第6090388号にさらに詳述されている)。
以下の情報は、全て全体が参照により組み込まれる、2つの米国特許(Wangによる第5912176号および第6090388号)およびWang et al.による1999年の雑誌論文から抜粋されたデータを含むマウスmAb B4の発見および予備的特徴付け研究を要約する。
MAb B4は、BALB/cマウスをインタクトな未感染CD4+ヒトHPB−ALL細胞、T−急性リンパ芽球性白血病細胞系で免疫することによって得た。
MAb M2は、BALB/cマウスをPBLから単離したインタクトな未感染CD4+細胞で免疫することによって得た。
細胞表面上のCD4に対する特異性を有し、HIV−1の一次分離株に対して広い中和活性を有する、mAb B4またはM2によって表される新規なクラスの抗CD4抗体を得た。後の議論および実施例で、重要な特性の開示に焦点を合わせることを目的として、Mab B4のみをさらに示し、議論する。
MAb B4は、組換え可溶性CD4(rsCD4)と比較して細胞表面上の膜結合CD4を優先的に認識することが分かった。
HIVの曝露前に膜結合型CD4に結合するMAb B4は、その後のgp120および全ウイルスのCD4への付着を阻止することが示されている。しかしながら、抗体への曝露前にgp120に結合していた膜結合CD4は、依然としてmAb B4に結合することができる。したがって、mAb B4は、膜結合CD4へのgp120の結合に影響を及ぼし得るが、gp120は、CD4へのmAb B4の結合に影響を及ぼさない。
マウスmAb B4は、一般的な定義によれば、中和抗体ではない。代わりに、mAb B4はウイルスに付着することよりもむしろ宿主細胞受容体を被覆することによってウイルス侵入を阻害する。HIV感染症に対するMAb B4の効果は、当分野で使用されているウイルス中和アッセイによって容易に観察することができる(例えば、MT−2マイクロプラーク(Microplaque)中和アッセイ(Sawyer et al., 1994))。マウスmAb B4の中和活性は、本発明者らの共同研究者であるDr.Carl Hanson(カリフォルニア保健局)によって評価され、またDr.Dr.John Mascola(Henry Jackson Foundation, WRAIR)、Dr. David Montefiori(デューク大学)およびDr.Malcolm Martin(NIAID)の実験室でも独立に評価された。1995年〜2010年に広く特徴付けられている以下のHIV中和機能は、mAb B4に関連している:
1.PBMC増殖一次分離株は、T細胞株適合分離株HIV−1IIIBおよびHIV−1MNよりもmAb B4による中和に対して感受性である。
2.mAb B4は、補助受容体使用CCR5/CXCR4(二重)およびCCR5の一次分離株による感染を中和する。
3.mAb B4は、CXCR4補助受容体使用のT細胞株適合HIV−1分離体に対して低い活性を有する。
4.mAb B4は、HIV−1サブタイプA〜Gを表す多様な範囲のシンシチウム誘導(SI)および非シンシチウム誘導(NSI)一次分離株を、90%のエンドポイントおよび最大3logの感染力まで中和する。
5.mAb B4は、二重補助受容体HIV−1エンベロープを有するHIV−2、SIVおよびSHIVを中和する。
6.扁桃組織培養システムでは、mAb B4がHIV−1一次分離株VL135(HIV−1VL135)の感染力を2log減少させる。わずか12.5μg/mLのmAb B4が、多くの抗ウイルス抗体が抗体依存性増強を示す条件である活性ヒト補体の存在下、100 TID50(50%扁桃感染用量)超の単球分離株JR−CSFを完全に中和する。
7.mAb B4は、感染後48時間までに添加するとHIV−1VL135に対して中和活性を発揮し、72時間後までに添加すると著しい抗ウイルス効果を示す。
a.細胞またはウイルスとプレインキュベートしたかどうかにかかわらず、これは等しく有効である。
b.これは侵入後の機構によるよりもむしろ、新たな細胞への広がりから感染巣を阻止することによって作用する。
c.これらのアッセイでは、mAb B4が細胞傷害性に寄与しなかった。
HIV−1の中和および耐性アッセイ
1998年〜2011年に、種々のクレードの複数のHIV分離株について、Dr.Carl HansonおよびMonogram Biosciences,Inc.の実験室で以下のウイルス中和および耐性アッセイを行った。アッセイの詳細な説明を以下に記載する。
試験の各々に示すように血液または抗体試料を採取した。血清または抗体試料を、MT−2マイクロプラークアッセイまたはマイトジェン(PHA)刺激PBMCアッセイのいずれかを使用して、HIV−1分離株のマルチクレード群で評価した。
MT−2マイクロプラークアッセイは、HIVのシンシチウム誘導分離株に限定した。アッセイを96ウェルプレート中で行い、マイクロプラーク上のシンシチウムの蛍光染色により、1ウェル当たり最大25個の小さなプラークを数えることができた。このアッセイでは、感染MT−2細胞が、遠心分離中にゲル化する溶融アガロースを通して遠心分離することによって単層に形成された。このアッセイは高感度であることが分かっており、ダイナミックレンジが何桁にも及ぶ。このアッセイはまた、多数の標本を処理するために比類なく効率的であることも分かった。多数の複製ウェルによって可能になったコンピュータ化統計分析の使用が、他のフォーマットを使用して達成することが困難であった一定程度の品質管理および標準化を提供することが分かった。
PBMCアッセイは、PBMC中のp24抗原の発現を、96ウェルマイクロタイタープレート中で感染細胞を増殖させた後に抗原捕捉ELISAによって定量化する標準的な抗原減少アッセイである。このアッセイの利点は、全てのHIV株および分離株への適用性である。
中和、エキソビボおよびインビボ試験のためのHIV−1ストックを、表3、表5および表6ならびに図1a、図1b、図3、図22および図23に列挙する。亜型A〜GおよびHの一次HIV−1ウイルスは:(a)カリフォルニア州保健局のウイルスおよびリケッチア病研究所、VRDLのサンフランシスコ男性健康調査に参加した男性同性愛者から分離した;(b)世界保健機関のHIV隔離および特性評価ネットワークから入手した、(c)米国軍事HIV研究プログラムから提供された、および(d)国立アレルギー感染症研究所AIDS Research and Reference Reagent Programからの贈り物としてのものであった。チンパンジー末梢血単核球(PBMC)で継代された患者分離株であるDH−12も、国立アレルギー感染症研究所AIDS Research and Reference Reagent Programによって供給された。
B4またはdB4中和活性を、抗体を含有しないコントロールと比較した場合の、ウイルスの示される割合の減少(50〜95%)を提供する抗体濃度として定義した。50%および90%エンドポイントについての抗体濃度を、抗体希釈間の補間によって導き出した。
薬剤耐性を決定するためのPhenoSense HIVエントリーアッセイを、Monogram Biosciences、Inc.(South San Francisco、カリフォルニア)で行った。
ベクタープールから生成した組換えウイルスを用いて、様々な濃度の薬物または抗体(例えば、B4またはdB4)の存在下で細胞を感染させた。試験ベクターのウイルス複製を50%(IC50)又は90%(IC90)阻害するのに必要な薬物の量を決定した。
PhenoSense HIVアッセイで用いられる組換えウイルスを、HIV感染の長期的試験でスクリーニングし、HIV血清陽性として同定した患者から収集した試料から生成した。偶発的HIV感染を有する個体については、臨床および血漿試料を、HIVウイルス量およびCD4細胞数を含む実験室評価のために収集した。最初は血清陰性であったが、約1年の追跡調査後に血清陽性となった個体については、ウエスタンブロット法による2つの酵素免疫測定法によってHIV感染を確認した。
全クレードのHIV分離株に対するMONOGRAM BIOSCIENCE PHENOSENSEアッセイによるMAB B4の中和活性
mAb B4がBクレードの全てのHIVウイルスを中和することは十分に証明されている。ある試験では、クレードA(n=8)、BF(n=1)、C(n=18)、D(n=18)、E(n=4)、EA(n=10)、F(n=8)、G(n=4)、J(N=2)からの合計73種の代表的な非BクレードHIV分離株と3種のコントロールウイルス92HT594、JRCSF、JRFLを組換えウイルスにし、mAb B4に対する感受性についてPhenoSense HIVアッセイで試験した(表3)。組換えウイルスの全部が、平均IC50=0.018μg/mLおよびIC90=0.062μg/mLのこれまでにない低IC50およびIC90濃度で、mAb B4に対して非常に感受性が高いことが分かった。これらのHIV分離株の多くが多剤耐性患者に由来することを見出すことは注目に値し、mAb B4またはそのヒト対応物が既にHIV薬剤耐性である患者を処置するのに非常に効率的であることを明らかに示している。
モノクローナル抗体B4は競合的HIV侵入阻害を仲介する:処置時のHIV耐性変異体の予防を予測する予期せぬ特徴
競合的阻害試験により、CD4上の同じ受容体結合部位についてHIVエンベロープタンパク質と競合し、それによって細胞へのHIVの侵入を阻害する阻害剤(例えば、侵入阻害剤抗体)の能力および有効性を評価することができる。理論研究では、mAb B4はCD4の結合についてHIVエンベロープタンパク質(gp120)と競合する。図1Aは、この試験の予測結果を示しており、各線は異なるウイルス分離株を表す。具体的には、この理論研究から予想される結果は、異なるウイルス分離株はmAb B4に対して異なる感受性(IC50)を有するが、mAb B4が十分な濃度で存在する限り、全てのウイルス分離株の侵入が100%阻害されることを実証している。
抗体B4はHIVの無細胞感染と細胞間伝達の両方を有効に阻害する
HIV粒子は古典的には、ウイルスが血流および局所環境に拡散して細胞に感染する無細胞伝達によって全身に広がる。ウイルスはまた、密接な細胞間接触を必要とする機構によって感染細胞から非感染細胞に直接移動する能力も有する。感染細胞が未感染細胞と安定した接触点を形成し、HIV粒子を未感染細胞に直接伝達すると、このような拡散が起こる。細胞間拡散は、無細胞拡散と比較して、効率的で、速く、血流中での拡散を必要としない。
したがって、処置におけるその潜在的な効果を評価するために、mAb B4およびmAb dB4関連抗体がHIVの細胞間伝達を阻害する能力および効力を評価することが重要である。
1.1 材料および方法
1.1.1 細胞およびウイルス
HIV−1ゲノムに遺伝子操作されたレポーター遺伝子ルシフェラーゼを有するJurkat−inGLucクローン(NIH AIDS Research and Reagents Program)を、表面CD4の発現が低いためにドナー細胞として選択して、標的初代CD4+T細胞を用いた共培養実験でドナー間感染を最小化した。レポーター遺伝子ルシフェラーゼは、感染細胞中で発現することができ、ウイルス感染のためのマーカーとして使用できる。感染細胞中のこれらのウイルス発現レポーターを測定して、HIV−1感染を定量化することができる。初代CD4+T細胞を標的細胞として使用した。クレードDのウイルスUG266およびUG046を試験に使用した。
表4は、抗体B4が、厳格な90%侵入阻害基準によって測定した場合に、HIV(クレードCのウイルス株UG266およびUG046)の細胞間および無細胞伝達を同等に阻害することができたことを示している。具体的には、融合阻害力価が細胞間伝達アッセイにおいてUG266およびUG046ウイルス株について1:140および1:245であることが分かり、これはそれぞれ無細胞伝達中和アッセイにおける1:136および1:234の中和力価に匹敵した。50%侵入阻害基準によって測定した場合、対応する無細胞伝達と比較して、2つの株についてのより高い融合阻害力価が細胞間伝達について観察された。
抗体UB−421(DB4C7またはDB4)はHIV感染個体におけるウイルス複製増強のための静止期PBMCSの再活性化を媒介する
1.背景
HIV−1は静止期末梢血単核球(PBMC)に感染するが、その後の細胞活性化まで不活性のままである。静止PBMCにかくまわれた潜伏HIV−1を模倣する静止期T細胞の非生産的感染を可能にする細胞培養条件およびプロトコルを使用するインビトロモデルを使用して、熱不活性化HIV−1(iHIV−1)またはgpl20−抗gpl20免疫複合体のこれらの静止期PBMCに対する刺激効果を調べた(Briant,L. et al., 1996)。
2.1 mAb B4によるが、逆順ではない、チンパンジーCD4陽性PBMCへのLeu3a結合の競合的逐次結合阻害
2匹の対象(X282およびX301)から単離したチンパンジーPBMC細胞、ならびにmAb B4(FITCによって標識)およびLeu3a(PEによって標識)をこの試験に使用した。PBMCをそれぞれの抗体で順次染色し、サイトフルオログラフィーによって分析した。この実験から得られたデータを表5および図4に報告し、以下で考察する。
完全長組換え可溶性CD4(rsCD4)に対するmAb B4の結合親和性を、CD4ドメイン1のCDR2領域に対する免疫血清を用いた競合的阻害試験を通して評価した。
細胞をmAb dB4で処理し、TNF−α産生、ウイルス量および細胞増殖を監視することによって、mAb dB4が静止期CD4+細胞を活性化する能力を評価した。
1.マウスmAb B4は、抗体Leu3aによって認識される部位(CDR2領域のaa47〜64)に近いCD4上のコンフォメーション部位を認識することが分かった。MAb dB4は、実施例7で報告される比較試験に基づいて、mAb B4についてここで記載されるものと同じ認識特性を有する。
MAB DB4C7および抗HIV RCポリクローナル抗体は、CD4陽性T細胞による抗原誘導性T細胞増殖およびサイトカイン(IL2およびIFN−γ)産生を阻害し、それによって、パイロトーシスのHIV病原性サイクルを破壊する。
1.背景
近年の報告では、HIVが許容活性化CD4+T細胞に感染すると、カスパーゼ−3依存性アポトーシスを介して静かに細胞死が起こることが示されている(Doitsh,G. et al., 2014)。逆に、R5またはX4向性HIVがリンパ系組織からの非許容静止CD4+T細胞に不稔感染すると、これらの細胞はプログラム細胞死の激しい炎症形態であるカスパーゼ−1依存性パイロトーシスによって死滅する。インターフェロン誘導因子16(IFI16)は、カスパーゼ−1の活性化を開始する不完全なHIV逆転写産物を認識する宿主DNAセンサーとして同定されている(Monroe,K.M. et al., 2013)。扁桃腺、リンパ節および脾臓を含むほとんどのヒトリンパ系組織では、細胞の活性化され許容されるサブセットは全CD4 T細胞の5%以下に相当する一方、非許容静止細胞はHIVが遭遇する標的の95%以上に相当する。したがって、カスパーゼ3媒介アポトーシスではなく、カスパーゼ1媒介パイロトーシスが、これらのリンパ系組織のHIV感染後のCD4 T細胞死の駆動を主に担っているように思われる。これらの所見は、R5−向性HIVに感染したコントロールからの新鮮なリンパ節の分析によってさらに支持され、ここではカスパーゼ−1およびIL−1βが静止期CD4 T細胞が豊富である傍皮質帯で検出される一方、カスパーゼ−3活性が生産的に感染した細胞が見られる解剖学的に異なる胚中心で検出される。
mAb dB4が、HIV感染個体における慢性炎症の発生を抑制することによって、パイロトーシスによって引き起こされる病原性サイクルを破壊することができるかどうかを決定するための試験を行った。抗原刺激によって誘因されるサイトカイン産生の阻害は、既に不稔HIV感染症を有する静止期T細胞の多くによるパイロトーシスの負担を軽減するのを助け、よってサイトカイン産生によるCD4陽性T細胞枯渇におけるHIV病理を破壊するだろう。
HIV陽性ART処置未経験ボランティア(n=6)をREACHコホート(San Francisco)から採用した。3人の年齢一致、HIV血清陰性コントロールボランティアも試験に含めた。PBMCを分離し、アッセイ時間まで液体窒素中で凍結保存した。
CD4+Tリンパ球を、それぞれ、最初にmAb dB4C7 IgGまたは抗HIV RCポリクローナル抗体IgG、引き続いてAlexa−ヤギ抗HuIgGまたはAlexa−ヤギ抗モルモットIgGで染色しを用いて間接免疫蛍光試験で染色した。得られた染色細胞を、検出された陽性細胞%についてフローサイトメトリーによって分析した。mAb dB4C7と抗HIV RCポリクローナル抗体の両方を、2倍希釈で50μg/mL〜0.0025μg/mLの間で力価測定した。mAb dB4および抗HIV RC抗体についての抗体力価測定を、CD4結合%対抗体濃度(μg/mL)として決定した。これらの力価測定を、HIV感染個体および正常個体に対して行われたT細胞機能的アッセイに使用する前に評価した。
細胞分裂時のCFDA−SE(カルボキシ−フルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル)染色の喪失を伴うCFSE(カルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル)蛍光アッセイによって細胞増殖を分析した。CFSEを3H−チミジン(増殖)アッセイの代用として使用した。
PBMC(0.5×106個細胞)をSEB Ag(1μg/mL)と共に5%CO2中37℃で2時間インキュベートした。細胞を0.1%FCSを含有するPBS(洗浄緩衝液)で洗浄し、細胞を溶解溶液(BD Biosciences)中に室温で10分間再懸濁することによって固定した。細胞を洗浄緩衝液で1回洗浄し、次いで、0.5mLの透過処理溶液2(BD Biosciences)中に再懸濁することによって透過処理し、室温で10分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、抗IL−2 APC、抗IFN−γ(PE CY7)、および抗CD3(Amcyan)、抗CD4(PE、D2)または抗CD8(Percp CY5.5)(BD Pharmingen)で染色した。1試料あたり4万(40000)個のリンパ球をLSR II(BD Biosciences)を用いて取得し、分析をFLOWJOソフトウェア(TreeStar)によって行った。Ag刺激なしのサイトカイン産生CD4またはCD8 T細胞の割合は0.05%未満であった(陰性コントロール)。結果を、IFN −γまたはIL2を発現するCD4+(またはCD8+)T細胞の%として表した。
統計分析および比較を対応のあるt検定を用いて行った。
このSEB Ag誘導T細胞増殖試験から得られた結果は、HIV ART処置未経験患者と年齢一致正常個体の両方において、mAb dB4C7(1μg/mL)と抗HIV RCポリクローナル抗体(25μg/mL)の両方が、飽和条件下、CD4+T細胞増殖を減少させたが、CD8+T細胞増殖を減少させないことを明らかにした(データは示さず)。
共にCD4ドメイン1のCDR2領域を標的とする抗体mAb dB4C7(UB−421)および抗HIV RCポリクローナル抗体は、CD4陽性T細胞による超抗原SEB誘導T細胞増殖およびサイトカイン(IL2およびIFN −γ)産生を抑制するが、CD8陽性T細胞によるT細胞増殖およびサイトカイン(IL2およびIFN−γ)産生を抑制しないことが分かった。dB4C7および抗HIV RCポリクローナル抗体がCD4+T細胞増殖および関連するサイトカイン(IL2およびIFN−γ)産生を抑制できるという所見は、抗体が、パイロトーシスのHIV病原性サイクルを破壊する可能性を有し、他のCD4陽性細胞関連サイトカイン産生に対して同様の抑制効果を発揮できることを示唆している。
無症候性HIV−1感染成人におけるUB−421の安全性および有効性を検討するための第IIA相、オープン、複数回投与、用量依存性試験
1.試験目的:
1.無症候性HIV−1感染対象における、UB−421の2回投与レジメンの複数回投与の安全性および耐容性を評価すること。
2.これらの対象におけるUB−421の2回投与レジメンの複数回投与の抗ウイルス活性の証拠を得ること。
3.最適なUB−421投与および投与レジメンを決定するために抗ウイルス活性および安全性プロファイルを評価すること。
(臨床試験識別子:NCT01668043)。
これはUB−421の反復静脈内投与によるオープン試験であった。HIV−1について血清陽性で無症候性の対象を適格性についてスクリーニングした。29人(29)の登録対象は、8週間の処置期間にわたって、毎週10mg/kg(コホート1)または隔週25mg/kg(コホート2)の2つの用量レベルのうちの1つで、試験薬物(UB−421)の複数回の静脈内注入を受けた。対象を、場所によりおよび登録順序に基づいて順番に2つの試験コホートのうちの1つに割り当てた。対象を、8週間の処置期間後にさらに8週間の期間追跡した。試験は16週目に終了した。
対象は第IIa相試験に適格となるために以下の基準を満たすことが必要であった:
1.無症候性、抗レトロウイルス療法(ART)未経験、HIV−1血清陽性
2.CD4+T細胞数>350細胞/mm3
3.HIV−1ウイルス量>5000コピー/mL
4.即時療法を必要とする活動性感染症(HIV−1を除く)がない
5.免疫調節薬または全身化学療法を使用していない
6.高活性抗レトロウイルス処置(HAART)の必要がない
UB−421(dB4C7 mAb)を10mg/mL(10mLバイアル中100mg)の濃度で供給した。
各登録対象は、以下の投与量レベルのうちの1つでUB−421の複数回の静脈内注入を受けた:8週間にわたって毎週10mg/kg(コホート1)または隔週25mg/kg(コホート2)。UB−421の適切な量は、指定された用量および対象の体重に基づいていた。各個々の投与量を、コホート内の各個々の対象に同等の注入量の薬物を注入するように滅菌生理食塩水を用いて調整した。注入総量は、10mg/kgについては約100mL、25mg/kgについては200mLであった。各投与の注入時間は約1〜2時間であった。
5.1 主な安全性および有効性のエンドポイント
UB−421の以下の安全性および耐容性パラメータを16週目(試験終了)まで評価した。
1.身体検査(PE)
2.バイタルサイン
3.臨床化学および血液学的検査
4.有害事象(AE)/重篤有害事象(SAE)の発生率
試験期間中(V2〜V12)、各試験コホートについて、UB−421の以下の有効性パラメータを評価した:
1.個々の最大ウイルス量減少
2.平均最大ウイルス量減少
試験期間中(V2〜V12)、以下のウイルス学的反応を評価した:
1.各試験コホート内および間のサブグループによる個々の最大ウイルス量減少および平均最大ウイルス量減少。
2.ウイルス量<50コピー/mLを有する対象の割合;
3.ウイルス量<200コピー/mLを有する対象の割合;
4.ウイルス量減少>0.5log10コピー/mLを有する対象の割合;
5.ウイルス量減少>1log10コピー/mLを有する対象の割合;
6.それぞれコホート1およびコホート2について、最後に完了した試験薬物投与の最大7日および14日後のウイルスリバウンド(最下点からのウイルス量の0.5log10超の増加)を有する対象の割合;
7.抗UB−421抗体の血清濃度(UB−421の免疫原性);
8.CD4+およびCD8+T細胞数の変化;
9.UB−421の薬物動態パラメータ(Cmax、AUC(0→∞)およびAUC(0→last))。
処置意図(ITT)集団:試験薬物の少なくとも1回の投与を受けた29人の対象。コホート1およびコホート2のITT集団はそれぞれ14人の対象および15人の対象であった。
パープロトコル(PP)集団:有効なベースラインおよび少なくとも1つの有効な処置後有効性測定(HIV−1ウイルス量試験)を有し、主要なプロトコル違反を欠く、試験薬物の全ての投与を受けた18人の対象。コホート1およびコホート2のPP集団はそれぞれ7人の対象および11人の対象であった。
安全性および免疫原性集団:処置意図集団に含まれる29人の対象。
薬物動態集団:安全性および免疫原性集団内のサブセット集団に基づいていた。
ベースラインデータおよび安全性のエンドポイントは、安全性および免疫原性集団で分析し、有効性分析はITTとPPの集団の両方で行った。薬物動態分析を薬物動態集団で行った。
スクリーニング期間:<4週間
処置期間:8週間
追跡調査期間:処置期間終了後8週間
来院0は初期スクリーニングを表し、試験中の各来院は1週間の期間を表す。追跡調査期間は通常、1週間間隔で行った。
8.1 試験集団。
合計33人の無症候性HIV感染成人を、台湾の2つの研究施設でスクリーニングした。これらのうち、29人の対象がスクリーニング基準に合格し、試験に選ばれた。29人の適格対象は全員男性であった。
29人の対象全員が試験中に少なくとも1回のAE、合計で128回のAEを経験した。そのうち、114回(全29人の対象において89.06%)が処置下で発現した有害事象(TEAE)であり、14回(5人の対象において10.94%)が処置前AEであった。29人の対象に重篤有害事象(SAE)は観察されなかった。全ての処置前AEはUB−421とは無関係であり、これらの事象のいずれもSAEと見なされなかった。報告されたTEAEの大部分(78.95%)は軽度であり、17.54%は中等度であり、3.51%(1人対象)は重度であった。
UB−421は、臨床試験プロトコルによって指定されているように、73.84%の8週間の処置期間の全体的処置耐容性を有し、試験期間中十分に耐容性を示した
8.3.1 CD4+TおよびCD8+T細胞数。 8週間の処置期間および8週間の追跡調査期間の後、平均CD4+T細胞数はベースラインから55.10±117.97細胞/mm3だけわずかに減少したが、平均CD8+T細胞数はベースラインから193.31±459.34細胞/mm3だけ増加した。コホート1における対象の代表的なCD4+T細胞数および平均CD4 T細胞数を図9aの上部パネルに示す。コホート2における対象の代表的なCD4+T細胞数および平均CD4 T細胞数を図9aの下のパネルに示す。
コホート1で観察された平均AUCは、17300±10000μg×時/mL(来院1〜2)から23900±10700μg×時/mL(来院8〜9)に増加し、その後、来院11〜12でベースラインに戻った。コホート1で観察された平均AUC(0→last)は171000±70300μg×時/mLであった。
コホート2で観察された平均AUCは、56500±19500μg×時/mL(来院1〜3)から61100±20700μg×時/mL(来院7〜9)に増加し、その後、来院11〜12でベースラインに戻った。コホート2で観察された平均AUC(0→last)は、239000±73900μg×時間/mLであった。
これらのデータは、AUC(0→last)によって評価される平均血清薬物濃度が、毎週10mg/kgのUB−421注入(コホート1、171000±70300μgx時/mL)を受けた対象と比較して、隔週25mg/kgのUB−421注入(コホート2、239000±73900μg×時/mL)を投与された対象間で高いことを実証している。
29人(29)のHIV−1感染対象がこの試験に採用され、UB−421の少なくとも1回の投与を受けた(ITT集団)。採用された29人(29)の対象のうち、合計18人(18)の対象が8週間の処置期間を完了し、試験薬物の全ての投与を受けた(PP集団)。試験中の登録された無症候性HIV−1感染対象の個々のおよび平均最大ウイルス量減少を評価することによって、UB−421の複数回投与の有効性を評価し、コホート1および2のITTおよびPP集団についての結果を表7に要約する。
コホート1では、ITTの対象の8/14(57.14%)およびPPの対象の5/7(71.43%)が、200コピー/mL以下のウイルス量を有していた;さらに、ITTの対象の3/14(21.43%)およびPPの対象の3/7(42.86%)が50コピー/mL未満のウイルス量を有していた。
UB−421について本試験で得られた結果を、他者(Jacobson, J.L. et al., 2009; Toma, J. et al., 2011;およびPace,C.S. et al., 2013)によって行われたTMB−355(イバリズマブ、以前はTNX−355)についての同様の試験で得られた結果に対して評価した。図10aは、CD4+細胞が完全に被覆されているUB−421の存在下での、ウイルス量リバウンドなしでの最大3Log10超の優れたウイルス量減少を示している。対照的に、TMB−355による処置を受けている患者は、CD4+細胞の完全な被覆の存在下でさえ、処置からわずか1週間後にウイルスリバウンドに遭遇し、耐性ウイルス変異体の発生を示している(図10b)。
無症候性HIV−1感染対象におけるUB−421による8週間の処置は十分に耐容性を示すことが分かった。さらに、それぞれコホート1(上部パネル)と2(下部パネル)の両方からの平均CD4 T細胞数(図9a)は、監視した2ヶ月間を通して安定したままであった。
HIV−1感染成人における抗ウイルス療法の代替としてのUB−421単独療法を使用した処置様式
図12は、抗レトロウイルス薬の代替としてUB−421単独療法を使用したHAART安定化患者の処置様式を示す。詳細な目的およびプロトコルを以下に記載する。
安定な高活性抗レトロウイルス療法(HAART)によるウイルス抑制を有するHIV−1について血清陽性である対象が、このような処置に適格である。
適格な患者は、最初の4ヶ月間、IV、IMまたはSC経路のいずれかを介して投与されるUB−421を受け、引き続いて別のサイクルのHAART処置を受ける。「HAART−UB−421」交互処置サイクルは、UB−421とHAART療法の両方を中止してウイルスリバウンドが観察されなくなるまで数回繰り返すことができ、それによってHIV感染症に対する機能的治癒をもたらす。
以下の基準の全てを満たす場合、対象をこの処置様式に含めた:
1.HIV−1血清陽性;
2.年齢20歳以上;
3.少なくとも2年間、少なくとも2つのヌクレオシド/ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤(NRTI)+非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤(NNRTI)、インテグラーゼ阻害剤、またはプロテアーゼ阻害剤として定義されるHAART処置を受けた;処置が進行中であり、試験に入る前の1年以内に薬物の変更がない。
4.スクリーニング来院前1年以内にCD4+T細胞数≧500個細胞/mm3またはCD4割合≧28%の2回の測定値を有する;
5.スクリーニング来院前4週間以内またはスクリーニング来院時にCD4+T細胞数≧500個細胞/mm3が得られた;
6.1年あたり少なくとも2回ウイルス量測定して、HIV−1血漿RNAが、スクリーニング来院前少なくとも1年間は検出不能のままである;ウイルス量はまた、スクリーニング来院前4週間以内またはスクリーニング来院時に検出不能である;スクリーニング来院の4週間前に検出可能なHIV血漿RNAエピソードが1回あっても、参加は除外されない。
以下の理由のいずれかのために、対象を処置様式から除外した。
1.即時療法を必要とする活動性感染症(HIVを除く);
2.米国疾病管理予防センター(CDC)のHIV感染分類システムに従って、カテゴリーBおよびカテゴリーCにより以前に診断されるか又は活動性のAIDS定義病;
3.体重80kg超;
4.確認されたCD4+T細胞数<250細胞/mm3、またはスクリーニング前12週間以内のCD4+T細胞割合≦14%。
5.UB−421の第I相もしくは第IIa相試験、または抗UB−421抗体の存在の病歴のいずれかに以前に登録された;
6.試験薬物UB−421の初回投与前の12週間以内でモノクローナル抗体に以前に曝露している;
7.研究者の意見で、対象がこの試験に参加することを妨げるであろうとスクリーニング、病歴および/または身体検査から決定された、精神医学的および行動的問題を含む、(HIV−1感染症以外の)重大な疾患または臨床的に重要な所見;
8.試験薬物の初回投与前8週間以内の予防接種;
9.試験薬物の初回投与前12週間以内の免疫調節療法(インターフェロンを含む)、全身化学療法;
10.平均余命12ヶ月未満;
11.処置薬物の初回投与前12週間以内の違法静注薬物;
12.ウイルス学的応答の欠如、および以前の非ホジキンリンパ腫またはカポジ肉腫のための、HAARTレジメンの2回以上の変更
13.は研究者の意見で、対象が投与および来院スケジュールおよびプロトコル評価を順守する能力を妨げるであろう現在のアルコールまたは違法薬物の使用。
製剤UB−421(dB4C7mAb)を10mg/mL(10mLバイアル中100mg)の濃度で供給した。対象は、静脈内注入によって、8回の毎週10mg/kg用量のUB−421または8回の隔週25mg/kg用量のUB−421のいずれかを受けた。
UB−421の適切な量は、指定された用量および対象の体重に基づいていた。各個々の投与量を、コホート内の各個々の対象に同等の注入量の薬物を注入するように滅菌生理食塩水を用いて調整した。注入総量は、10mg/kgについては約100mL、25mg/kgについては200mLであった。各投与の注入時間は約1〜2時間であった。
5.1 試験集団。
合計29人のHAART安定化HIV患者を台湾の2つの研究施設でスクリーニングした。これらのうち、29人の対象がスクリーニング基準に合格し、試験に選ばれた。29人の適格対象は全員男性であった。
29人の対象全員が試験中に少なくとも1回のAEを経験した。全ての処置前AEはUB−421とは無関係であり、これらの事象のいずれもSAEと見なされなかった。報告されたTEAEのほとんどは軽度であった。最も頻繁に観察されたTEAEは皮膚発疹および蕁麻疹であった。身体検査結果およびバイタルサインは、試験期間中、ほとんど正常または臨床上著しくなかった。
UB−421は、臨床試験プロトコルによって指定されているように、8週間または16週間の処置期間の全体的処置耐容性を有し、試験期間中十分に耐容性を示した
5.3.1 CD4+TおよびCD8+T細胞数。 図13に示すように著しい差がなく(コホート1についてはP=0.331、コホート2についてはP=0.905)、8週間(コホート1)および16週間(コホート2)の処置期間および8週間の追跡調査期間(V12)の後でも、平均CD4+T細胞数は、ベースライン(V1)から、処置および監視期間(V12)の後とほぼ同じままであった一方で、図14に示すように、コホート1(P<0.001)とコホート2(P <0.004)の両方について、平均CD8+T細胞数は、ベースライン(V1)から、処置および監視期間(V12)後に著しく増加した。UB421処置後にHAART安定化患者において観察されるCD8+細胞のこの著しい増加はまた、実施例7、図9a下部パネル、UB421処置を受けている患者の重要な特徴に示されるようにUB421を受けている処置未経験患者においても観察される。
SK431 5’-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT-3’(配列番号15)、
GAG1 5’-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT-3’(配列番号16)、
GAG2 5’-CACTGTGTTTAGCATGGTGTTT-3’(配列番号17)、
GAG3 5’-FAM-ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGA-IBHQ-3’(配列番号18)、
Alb−F 5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3’(配列番号19)、
Alb−R 5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’(配列番号20)、
Alb−P 5’-FAM-GGAGAGATTTGTGTGGGCATG ACAGG-IBHQ-3’(配列番号21)
ウイルスリバウンドを、血清または血漿1mL当たり400HIV−1 RNAコピー超のウイルス量の3回以上の連続検出として定義した。個々の患者について図16に示すように、HAART処置中にHAART安定化患者についてほぼ同じ頻度で時折検出された数回の突然の変化を除いて、400RNAコピー/mL(点線)未満の完全なウイルス抑制が処置期間全体にわたっておよび処置期間を越え維持された。これは、HAARTの代替としてのUB421処置における100%の有効性を示す。
TCRシグナル伝達キナーゼLCKのリン酸化および活性化により検出されるUB421によるCD4+細胞の直接活性化
Lckキナーゼリン酸化を介したCD4+T細胞の活性化に対する、TCR近位シグナル伝達分子であり、CD4細胞内ドメインに直接結合することが知られているUB−421の効果を調べた。Lckリン酸化の程度を、陽性コントロールとしてのUB−421および他の公知のT細胞刺激剤(例えば、OKT3、抗CD3)によって刺激した際のウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析によって評価した。
1.1 初代CD4 + T細胞の調製
健常ドナーの末梢血単核球(PBMC)を、最初にFicoll-Hypaque(GE Healthcare)密度勾配遠心法によって単離した。次いで、精製したPBMCからCD4 T細胞単離キット(Miltenyi Biotec)によって、CD4+T細胞をネガティブ選択した。
200万個(2×106)のジャーカットT細胞または初代ヒトT細胞をRPMIで2回洗浄した。5μg/mlのmAb UB−421または抗CD3(OKT−3、BioLegend)を含む予め加温したRPMI1ml中で全ての細胞を刺激し、次いで、「架橋」試料については10μg/mlのストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)で架橋し、指示された時間間隔で37℃でインキュベートした。1mlの冷PBSを添加し、遠心分離して上清を除去することによって、刺激を停止した。細胞ペレットを直ちに凍結し、溶解するまで−80℃で保存した。
刺激の前に、単離したCD4+T細胞を無血清AIM−5培地中で一晩インキュベートした。CD4+T細胞を氷上に置き、5μg/mLのビオチン化抗CD3抗体(OKT−3、BioLegend)またはUB−421を細胞に添加した後、氷上でさらに10分間インキュベートした。次いで、細胞を37℃で指示された時間架橋の有無にかかわらず刺激した。37℃で指示された時間刺激する前に、精製ストレプトアビジン(BioLegend)をビオチン化抗体に添加することによって架橋を達成した。次いで、細胞をPhosflow Fix Buffer(BD Biosciences)によって37℃で10分間直ちに固定し、次いで、Phosflow Perm/Wash Buffer(BD Biosciences)で透過処理した。細胞を、氷上でPE抗Src(pY418)およびAlexa Fluor 647抗Lck(pY505)(BD Biosciences)で染色した。全ての試料をBD FACSVerseフローサイトメーター(BD Biosciences)で収集した。データ分析はFlowJoソフトウェアV10.0.8(Tree Star Inc., Ashland, OR)で行った。
CD4+T細胞は、約80mLの正常な健康なドナーの血液から得た。血液試料は限られており、CD4+T細胞の数はドナー間で異なっていた。よって、全ての試験条件を同じドナーのCD4+T細胞で行うことができるわけではなかった。いくつかの場合、Lckリン酸化に対するUB−421の効果を、非架橋条件下でしか評価することができなかった。陽性コントロールは架橋条件下で試験した抗CD3(OKT3)であり、陰性コントロールは未処理(培地のみ)試料であった。
ジャーカットT細胞をUB−421で刺激して、Lckリン酸化および下流TCRシグナル伝達事象を誘導するその能力を評価した。T細胞の公知の刺激剤である抗CD3抗体による刺激を陽性コントロールとして使用した。フローサイトメトリーを用いた以前の実験は、ジャーカットT細胞の100%が細胞表面上でCD4受容体を発現することを実証した。
UB−421で刺激された細胞では、Lckはジャーカット細胞において架橋条件下と非架橋条件下の両方でリン酸化され、LckチロシンY394のリン酸化レベルは増強され、15分でピークに達した(図22Cおよび図22D)。
CD4へのUB−421の結合およびTCRシグナル伝達の効果を初代CD4+T細胞で試験した。
CD4+T細胞を単離し、ネガティブ選択により純度約90〜95%まで精製した。陽性コントロールとして、細胞を抗CD3抗体で刺激したところ、Lck Y394のリン酸化レベルは予想通り維持された(図23Aおよび図23B)。
CD4+T細胞のTCRシグナル伝達は、不必要で、制御されていない免疫応答を回避するために厳密に調節されている。TCRシグナル伝達の重要なキナーゼとして、Lck活性は時間的と空間的の両方で調節されている。この試験では、抗CD4抗体であるUB−421が、CD4+T細胞を活性化し、Y394(活性化型)およびY505(阻害型)でLckのリン酸化を誘導することができることが実証されている。Lckは、LckのY394リン酸化を分析することによって、UB−421の架橋なしで、ドナーのCD4+T細胞のほとんどにおいて活性化されている;しかしながら、リン酸化の程度は、架橋を有するUB−421処理の程度と比較して低い。フローサイトメトリー分析により、架橋UB−421では、活性化チロシンが最初にリン酸化され、3分でプラトーに達し、引き続いて阻害型チロシンY505リン酸化が起こり、約10分でプラトーに達することが分かった。これは、Lck活性が最初にY394のリン酸化によって増強され、その後すぐにY505の阻害性リン酸化によって制御されることを示している。
・本試験の結果は、CD4へのUB−421の結合が、健常ドナーから単離された初代CD4+T細胞において、活性化チロシンY394と阻害性チロシンY505の両方でLckのリン酸化を誘導または増強することを実証している。
・Lckのリン酸化は、架橋条件下または非架橋条件下で、UB−421によって活性化される。
・UB−421による処理時のLckリン酸化の程度、ピークまでの時間および持続時間は個々のドナー間で異なる。
・UB−421は強力なHIV侵入阻害剤に加えて免疫調節剤としても作用することができる。
Claims (65)
- CD4分子に対する抗体であって、該抗体は前記CD4分子の細胞外領域に特異的に結合し、前記抗体がCD4+細胞の表面上の前記CD4分子に結合すると、前記抗体は、
a)前記CD4+細胞へのHIV侵入を競合的に阻害する;
b)HIVに感染した静止期CD4+細胞中の潜伏HIV蓄積を活性化する;
d)細胞HIV DNAのレベルを低下させる;および
e)ウイルス量リバウンドなしにHIV感染症の持続的ウイルス学的寛解をもたらす;
上記抗体。 - 前記抗体はHIVの無細胞および細胞間伝達を競合的に阻害する請求項1に記載の抗体。
- 対象に投与すると、前記抗体は制御性T細胞の割合を減少させる請求項1に記載の抗体。
- 対象に投与すると、前記抗体はCD8+細胞の量を増加させる請求項1に記載の抗体。
- 対象に投与すると、前記抗体はHIV gagモチーフペプチド刺激に応答してCD8+増殖細胞を増加させる請求項1に記載の抗体。
- 対象に投与すると、前記抗体はHIV感染CD4+細胞を標的化する機能的HIV特異的CD8+CTL細胞を増強する請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体はCD4+細胞におけるTNF−α産生を増強する請求項1に記載の抗体。
- 架橋の有無にかかわらず、前記抗体は静止期CD4+細胞を活性化する請求項1に記載の抗体。
- ウイルス量リバウンドなしに、前記抗体はHIV陽性患者におけるHIVウイルス量を血液1mL当たり50コピー未満に減少させる請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は前記CD4分子のドメイン1付近の領域に結合する請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体はCD4のドメイン1のCDR2領域付近の領域に結合する請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2および配列番号3のCDR3を有する重鎖可変領域アミノ酸配列;及び
配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2および配列番号6のCDR3を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列;を有する請求項1に記載の抗体。 - 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;及び配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、配列番号10のアミノ酸配列を有する重鎖;及び配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖;を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体は、配列番号9のアミノ酸配列を有する重鎖;及び配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖;を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- 配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖;及び配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖;を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項1に記載の抗体。
- HPB−ALL細胞上の膜結合CD4に対する絶対結合親和性(Kd)が約3.1×10−11M〜約8.1×10−11Mである請求項1に記載の抗体。
- CD4分子に結合した請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体を有する組成物。
- 請求項1に記載の抗体;及び医薬上許容可能な担体;を有する医薬組成物。
- 請求項1に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシンおよび0.05%(v/v)ポリソルベート20の溶液を有する医薬組成物。
- 請求項1に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシン、0.05%(v/v)ポリソルベート20および10mMヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
- 約1.0mg/mL〜約200.0mg/mLの請求項1に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシンおよび0.05%(v/v)ポリソルベート20の溶液を有する医薬組成物。
- 約1.0mg/mL〜約200.0mg/mLの請求項1に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシン、0.05%(v/v)ポリソルベート20および10mMヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
- 約10.0mg/mLの請求項1に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシンおよび0.05%(v/v)ポリソルベート20の溶液を有する医薬組成物。
- 約10.0mg/mLの請求項1に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、20mMグリシン、0.05%(v/v)ポリソルベート20および10mMヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
- 請求項12に記載の抗体;及び医薬上許容可能な担体;を有する医薬組成物。
- 請求項16に記載の抗体;及び医薬上許容可能な担体;を有する医薬組成物。
- 薬理学上有効量の請求項1に記載の抗体を前記対象に投与することを有する、HIVに曝露される対象を処置する方法。
- 前記抗体をHIVへの曝露前に前記対象に投与する請求項31に記載の方法。
- 前記抗体をHIVへの曝露後に前記対象に投与する請求項31に記載の方法。
- 前記抗体をHIVへの曝露後48時間以内に投与する、請求項31に記載の方法。
- 前記抗体を少なくとも約5mg/体重kgの投与量で前記対象に投与する請求項31に記載の方法。
- 前記抗体を複数回前記対象に投与する請求項35に記載の方法。
- 前記抗体を毎週、隔週または毎月間隔で前記対象に投与する請求項36に記載の方法。
- 抗ウイルス薬を前記対象に投与する工程をさらに有する請求項36に記載の方法。
- 前記抗ウイルス薬が高活性抗レトロウイルス療法(HAART)である請求項38に記載の方法。
- HAARTが、プロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤と組み合わせて、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤を有する請求項39に記載の方法。
- 前記抗体をHAARTと同時に投与する請求項39に記載の方法。
- 前記抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
i)第1の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)(i)の前記第1の期間および前記第2の期間の間、HAARTを前記対象に連続的に投与すること;
を有する請求項39に記載の方法。 - 前記抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
i)毎週、隔週または毎月間隔で、4ヶ月の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて2ヶ月の処置休日;および
ii)(i)の6ヶ月の期間の間、HAARTを前記対象に連続的に投与すること;
を有する請求項39に記載の方法。 - 前記対象が2サイクルにわたって処置される請求項42に記載の方法。
- 前記対象が2サイクルにわたって処置される請求項43に記載の方法。
- 前記抗体をHAARTと同時ではない時に投与する請求項39に記載の方法。
- 前記抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
i)第1の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)HAARTを前記対象に前記第2の期間の間投与し、前記第1の期間の間投与しないこと;
を有する請求項39に記載の方法。 - 前記抗体を前記第1の期間の間、一定の間隔で投与する請求項47に記載の方法。
- 前記抗体を前記第1の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する請求項47に記載の方法。
- HIV感染症を有する対象を処置する方法であって、
a)薬理学上有効量の請求項1に記載の抗体;及び
b)高活性抗レトロウイルス療法(HAART);
を有する処置レジメンを前記対象に投与することを有する上記方法。 - 前記抗体を少なくとも約5mg/体重kgの投与量で前記対象に投与する請求項50に記載の方法。
- 前記抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
i)第1の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)(i)の前記第1の期間および前記第2の期間の間、HAARTを前記対象に連続的に投与すること;
を有する請求項50に記載の方法。 - 前記抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
i)毎週、隔週または毎月間隔で、4ヶ月の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて2ヶ月の処置休日;および
ii)(i)の6ヶ月の期間の間、HAARTを前記対象に連続的に投与すること;
を有する請求項50に記載の方法。 - 前記対象が2サイクル以上にわたって処置される請求項52に記載の方法。
- 前記対象が2サイクル以上にわたって処置される請求項53に記載の方法。
- 前記抗体およびHAARTをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
i)毎週、隔週または毎月間隔で、4ヶ月の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて2ヶ月の処置休日;および
ii)(i)の6ヶ月の期間の間、HAARTを前記対象に連続的に投与すること;
を有する請求項53に記載の方法。 - (a)の前記抗体を(b)のHAARTと同時ではない時に投与する請求項50記載の方法。
- (a)の抗体および(b)のHAARTをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
i)第1の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第2の期間にわたって処置休日;および
ii)HAARTを前記対象に前記第2の期間の間投与し、前記第1の期間の間投与しないこと;
を有する請求項50に記載の方法。 - 前記抗体を前記第1の期間の間、一定の間隔で投与する請求項58に記載の方法。
- 前記抗体を前記第1の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する請求項58に記載の方法。
- 請求項1に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、CD4+細胞へのHIV侵入を阻害する方法。
- 請求項1に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、CD4+細胞へのgp120の結合を阻害する方法。
- 請求項1に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、静止期CD4+T細胞を活性化する方法。
- 請求項1に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、静止期T細胞中のHIVの潜伏蓄積を活性化する方法。
- HIVに感染した細胞の試料中の潜伏HIV蓄積を減少させる方法であって、
a)請求項1に記載の抗体を細胞の前記試料に曝露すること;及び
b)HAARTを細胞の前記試料に曝露すること;
を有する、上記方法。
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