TW201808998A - 以cd4抗體於穩定接受haart治療的患者進行hiv感染的治療和持續性的病毒緩解 - Google Patents

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Abstract

本發明是關於用以預防、治療及/或功能性治癒HIV感染的組成物和方法。本發明一範疇是關於針對CD4的單株抗體、其組成物,以及使用此組成物以預防、治療及功能性治癒HIV感染的方法。

Description

以CD4抗體於穩定接受HAART治療的患者進 行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解
本發明是關於針對CD4的抗體,此抗體可替代HAART,用以於穩定接受HAART治療的患者進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解。
HIV/AIDS大流行為現代歷史中最重要的全球健康挑戰。在選擇性地使用聯合抗反轉錄病毒治療(cART)時,可有效控制HIV複製,阻止AIDS發展,延長壽命並降低傳播風險。儘管獲取顯著的成功,但目前的抗反轉錄病毒療法有其限制,原因在於其非治癒性且感染的患者必須無限期地持續治療。由於帶來要對全球超過3500萬HIV感染者提供終身治療的挑戰,因此對發展HIV感染的療法具有強烈興趣。最近的一篇文獻回顧“Global Scientific Strategy:Towards an HIV Cure 2016”描述此領域關鍵的知識鴻溝和研究問題,並被作為本領域先前技術的參考文獻(Deeks,S.G.,et al.,2016)。此文獻回顧的內容透過引用併入本文整體。
治療任何病毒感染的理想結果就是將接受治療的患者體內所有具有複製能力的病毒顆粒完全根除,即所謂的治癒。消除性治癒對於某些病毒感染(例如HIV)來說,是個挑戰及/或難以證明。對於複雜的病毒感染而言,較為務實卻可於臨床上成功的治療結果將是達成持續性地長期病毒緩解。緩解似乎是發展真正HIV治癒的必要前提,且此領域越來越多地利用這觀點指明,在無ART治療下於一段尚未定義的期間(可能數年)以長期病毒血症低於檢測極限為目標。
鑑於當前狀況,亟需可作為HAART替代藥物,達成持續性長期HIV病毒緩解的產品與治療方法。
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在本發明一範疇中,本發明係關於用以於穩定接受HAART治療的患者作為HAART替代藥物進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的抗體、組成物及方法。在本發明一範疇中,本發明係關於針對CD4的抗體、其組成物,以及製造與使用此組成物於穩定接受HAART治療的患者在後續缺乏其他治療(包括cART)的狀況下進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的方法。
在某些實施例中,抗體特異性地結合至CD4 的細胞外位置。在特定實施例中,抗體特異性地結合至CD4,結合位置位於功能區塊1中的CDR2區域或其附近。所揭示的抗體在無細胞(cell-free)和細胞間(cell-to-cell)系統中,通過與CD4結合展現競爭型HIV進入抑制。所揭示抗體以有或無交聯的方式同樣具有能力再活化靜默CD4陽性T細胞,其可增加TNF-α的生成。此抗體,包括,但不限於單株抗體(Mabs),其包括B4、M2及dB4C7(例如Wang,C.Y.1999;Lynn.S.and Wang,C.Y.2009);Leu3a(Than,S.et al.,1997)、ST4(Briant,L,1999);及多株抗體,其包括抗-HIV RC、CD4功能區塊1的CDR2區域(Wang,C.Y.,WO2016/043788)。
在某些實施例中,此抗體為針對並特異性地結合至CD4且功能性地具有下述能力:(1)在無細胞和細胞間傳播模型中阻斷HIV進入,以及(2)再活化HIV感染的靜默CD4 T細胞。在特定實施例中,抗體於體外以交聯或無交聯方式再活化HIV感染的靜默CD4 T細胞,顯現在TNF生成、HIV p24釋放、或透過Lck激酶磷酸化之T細胞活化的增加。在某些實施例中,以本發明抗體治療HIV患者,可導致(1)調節性T細胞(Tregs)的減少;(2)血液中CD8+細胞數的增加;(3)藉由HIV特異性抗原體外刺激時HIV特異性CD8+細胞的增加;及/或(4)血球細胞中HIV DNA水平的減少。
本發明也關於醫藥組成物,其包含具有上述功能特性的抗-CD4抗體(例如單株人類、擬人化、嵌合等), 以及使用此醫藥組成物進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的方法。本發明特定實施例關於製備及/或使用此醫藥組成物於穩定接受HAART治療的患者在後續缺乏cART治療的狀況下進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的方法。
在某些實施例中,製備包含本發明抗體之醫藥組成物,並投予患者,以降低病毒量至低於檢測極限,且無病毒反彈。在某些實施例中,製備醫藥組成物並以每週、每二週或甚至更長的時程表以約10mg/kg或更高的劑量投予患者。在某些實施例中,醫藥組成物是以單一藥物治療或結合其它治療(例如HAART)的方式投予。在某些實施例中,當接受治療之患者中的血清抗體水平為約10μg/mL或更高時,病毒量減少至低於檢測極限,且無病毒反彈。在某些實施例中,此醫藥組成物是以單一藥物治療方式,以每週、每二週或甚至更長的時程表,投予約10mg/kg或更高的劑量,其造成只要接受治療之受試者中的血清抗體水平高於10μg/mL,可降低病毒量至低於檢測極限,且無病毒反彈。
本發明包含針對CD4抗體之醫藥組成物,其可使用於HIV治療:(1)當單獨投予時,作為單一藥物治療;(2)當作為其它療法(例如,cART)的佐藥投予時,作為組合治療;或(3)在利用其他療法(例如,cART)進行替代治療循環時作為間歇性地投予的單一藥物治療。
本發明抗體與治療方法可達成與精英的控制 者或長期無進展者(LTNP)類似的細胞和免疫學的特徵。本發明抗體及治療方法在後續缺乏cART的狀況下可達到HIV感染的持續性病毒緩解,為HIV感染治療的變革。
第1A圖係競爭型HIV進入抑制機制。此曲線圖顯示於競爭型HIV進入抑制模型中所提供理論結果,在此,HIV外套膜蛋白gp120和抑制劑(例如抗體藥物)競爭結合位於一個共同目標表面分子上的相同位置(即CD4功能區塊1的CDR2)。在此模型中,當此抑制劑濃度達到某個閥值時可達成HIV結合/進入的100%抑制。
第1B圖係來自利用mAb B4對在10年間所收集的一組超過850種Env假型HIV病毒株的HIV進入抑制的結果。MAb B4於HIV進入抑制提供了廣泛性與效力,其於所有850種Env假型病毒株具有接近100%最大抑制百分比(MPI),且具有兩個IC50濃度(一個是介於0.01至1μg/mL,且第二個是約10μg/mL)。
第2A圖係非競爭型HIV進入抑制機制。此曲線圖顯示於非競爭型HIV進入抑制模型中所提供理論結果,在此,HIV和抑制劑結合至位於相同目標分子上的不同位置(例如CD4的功能區塊2對於TMB-355)。在此非競爭型抑制模型中,抑制劑可減少HIV結合/進入,但不論抑制劑之濃度為何都無法達成完全抑制。不論藥物濃度為何,作為於%抑制之“高原”反映了HIV對抗體藥物的抗藥性。
第2B圖係來自利用TMB-355對一組涵蓋11個進化支的118種不同HIV-1 Env假型病毒株的HIV-1進入抑制的結果(Pace,G.,et al.,2011)。對每一種病毒而言,黑線是指當以濃度達到10μg/mL之TMB-355處理時的最大抑制百分比(MPI)(請參見左邊的Y軸);而灰線是指相對應的IC50(請參見右邊的Y軸)。TMB-355以50%抑制中和了92%的病毒株,且以95%抑制只中和了31%的病毒株。
第3圖係顯示藉由以下刺激所引發於靜默PBMCs之病毒再活化的長條圖(其乃利用HIV-1 p24 gag製造加以測量),刺激種類包含未受刺激(lane 1)、植物凝集素(PHA)(lane 2)、不活化的HIV(iHIV)溶胞產物(lane 3)、針對CD4功能區塊1之CDR2區域的單株抗體(lane 4)、針對CD4功能區塊1之CDR3區域的單株抗體(lane 5)、針對CD4功能區塊1/2的單株抗體(lane 6)、可溶性CD4存在下之iHIV(lane 7)、可溶性CD4存在下針對CD4功能區塊1之CDR2區域的單株抗體(lane 8)、可溶性CD4存在下針對CD4功能區塊1之CDR3區域的單株抗體(lane 9),以及可溶性CD4存在下針對CD4功能區塊1/2的單株抗體(lane 10),如附圖說明所示(改編自Briant L.,et al.,1999)。
第4圖係顯示抗體B4辨識與抗體Leu3a結合之涵蓋CD4功能區塊1之CDR2區域的構型抗原表位。發現利用單株抗體B4和Leu3a(針對CD4功能區塊1之CDR2區域)可對CD4陽性細胞競爭型結合抑制。此試驗利用來自兩位受試者(X282和X301)之黑猩猩PBMC細胞。利用FITC標誌單 株抗體B4。利用PE標誌抗體Leu3a。PBMC細胞的細胞螢光圖分析指出利用Leu3a-PE(如由左邊算起第二小圖(第2組圖)所示),利用抗體B4-FITC(如由左邊算起第三小圖(第3組圖)所示)的陽性結合,而當PBMCs利用Leu3a-PE進行第一染色之後以抗體B4-FITC染色顯現雙重染色的細胞群體(如由左邊算起第四小圖(第4組圖)所示);然而利用抗體B4-FITC在先結合可阻斷後續Leu3a-PE的結合(如由左邊算起第五小圖(第5組圖)所示),而僅有B4-FITC的結合。此順序性結合抑制試驗指出針對Leu3a-PE之利用抗體B4-FITC的單向抑制,指明抗體B4辨識位於CD4功能區塊1之CDR2區域附近之與CD4陽性細胞相接觸的較大表面面積(利用功能區塊1內從第47-64個胺基酸之胜肽的較短延伸,Leu3a可辨識CD4功能區塊1之CDR2區域)。
第5圖係顯示利用抗-HIV RC多株抗體對生物素化-B4結合至rsCD4之競爭型抑制的圖式,其藉由ELISA加以測量。
第6圖係顯示mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對位在PBMCs上之表面CD4的抗體效價測定圖式。抗體效價測定為%CD4結合對抗體濃度(μg/mL)。
第7A圖至第7G圖係顯示於未使用治療藥物之HIV陽性和HIV陰性受試者以mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原SEB所引起增生CD4+和CD8+ T細胞之細胞激素IL2和IFN-γ製造抑制的分析。對HIV陰性(第7A圖)和HIV陽性(第7B圖)受試者,mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對 由超抗原所引起增生CD4+ T細胞之IL2製造的抑制如圖所示。對HIV陰性受試者和年齡一致的HIV陽性受試者(第7C圖),mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原所引起增生CD8+ T細胞之IL2製造的抑制也如圖所示。對HIV陰性(第7D圖)和HIV陽性(第7E圖)受試者,mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原所引起增生CD4+ T細胞之IFN-γ製造的抑制如圖所示。對HIV陰性(第7F圖)和HIV陽性(第7G圖)受試者,mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體對由超抗原所引起增生CD8+ T細胞之IFN-γ製造的抑制如圖所示。
第8A圖至第8D圖係顯示在第IIa期臨床試驗期間UB-421治療之臨床療效的圖式,如利用病毒量下降(上圖)和UB-421的藥物動力學(如以μg/mL血清濃度加以測定(下圖))所測定。提供了以下代表性患者的相關數據:接受每週10mg/kg UB-421投予的患者1-1-01(第8A圖);接受每週10mg/kg UB-421投予的患者1-1-02(第8B圖);接受每兩週25mg/kg UB-421投予的患者1-2-03(第8C圖);以及接受每兩週25mg/kg UB-421投予的患者1-2-06(第8D圖)。以整個塗滿灰色陰影之區間代表UB-421結合於PBMC CD4+細胞上的持續期間。
第9A和9B圖。第9A圖係顯示在依計劃書執行臨床試驗的群體(Per-protocol(PP)population)(其接受10mg/kg試驗藥物UB-421(左圖)或25mg/kg試驗藥物UB-421(右圖)的所有投予且具有有效基線)具有相對穩定的CD4 T細胞 數量(平均值和標準差)的圖式。第9B圖顯示來自在治療期之前(W1)、在治療結束時(W8)或在治療的監控期之後(W16)之患者的CD3+、CD3+/CD4+細胞的增生百分比,PBMC由接受UB-421的患者所提供,並以抗原(包括超抗原SEB(左圖)或CMV pp65(右圖))刺激。
第10A圖和第10B圖係顯示於使用UB-421之第IIa期臨床試驗所觀察到之病毒量減少對照於由他人所作之TMB-355(ibalizumab,先前稱為TNX-355)類似試驗(Jacobson,J.L.,et al.,2009;Toma,J.,et al.,2011;and Pace,C.S.,et al.,2013)所觀察到之病毒量減少的理論比較圖式。第10A圖概述於以10mg/kg和25mg/kg UB-421治療之受試者所觀察到的病毒量變化,而第10B圖概述於以相同劑量水平TMB-355治療之受試者所觀察到的病毒量變化。
第11圖係顯示來自在以UB-421治療之前(W1)、治療結束時(W8)或治療之後(W16)之患者的CD3+、CD3+/CD4+和CD3+CD8+細胞的增生百分比,PBMC由接受UB-421的患者所提供,並以具有一致性B序列的HIV Gag基序(motif)胜肽刺激。CD3+ T細胞的增生百分比具有統計學上顯著增加(p<0.01),其主要歸因於CD3+/CD8+ T細胞群體(p<0.01)。
第12A至12B圖係顯示利用UB-421單一藥物治療作為於HIV-1感染成年人之抗反轉錄病毒療法之替代藥物治療形式之來自第1劑量組與第2劑量組臨床試驗計劃書設計 的示意圖。
第13圖係顯示在接受10mg/kg試驗藥物UB-421(第1劑量組)或25mg/kg試驗藥物UB-421(第2劑量組)的所有投予之患者中於治療開始(V1)或結束(V12)時具有相對穩定的CD4 T細胞數量(平均值和標準差)的圖式。對第1劑量組(P=0.331)和第2劑量組(P=0.905)二者而言在治療前和後並無統計學上顯著差異。
第14圖係顯示在接受10mg/kg試驗藥物UB-421(第1劑量組)或25mg/kg試驗藥物UB-421(第2劑量組)的所有投予之患者中於治療開始(V1)或結束(V12)時CD8 T細胞數量(平均值和標準差)的圖式。對第1劑量組(P<0.001)和第2劑量組(P=0.004)二者而言在治療前和後具有統計學上顯著差異。
第15A圖和第15B圖係顯示在利用UB-421單一藥物治療作為於HIV-1感染成年人之抗反轉錄病毒療法之替代藥物的第IIa期臨床試驗期間UB-421治療之臨床療效的圖式,如利用平均病毒量下降(HIV RNA copies/mL)和UB-421的藥物動力學(如利用UB-421-alexa488結合細胞的平均百分比測定)所測定。第15A圖為第1劑量組,而第15B圖為第2劑量組。
第16A圖和第16B圖係顯示在利用UB-421單一藥物治療作為於HIV-1感染成年人之抗反轉錄病毒療法之替代藥物的第II期臨床試驗期間UB-421治療之臨床療效的圖式,如利用個別患者病毒量下降(HIV RNA copies/mL)所測 定。第16A圖為第1劑量組,而第16B圖為第2劑量組。將病毒反彈定義為病毒量於兩次連續訪視超過400 RNA copies/mL(虛線)。
第17A圖和第17B圖係顯示在整個試驗中在接受10mg/kg試驗藥物UB-421(第1劑量組,第17A圖)或25mg/kg試驗藥物UB-421(第2劑量組,第17B圖)的所有投予之患者中於每個時間點(隨訪天數)之%Treg細胞(平均值和標準差)圖式(以總CD4+細胞中CD4+CD25+FoxP3+ T細胞%代表%Treg細胞)。
第18圖係顯示於治療期開始(V1)或結束(V8)時,或當來自V8至V12患者回復至原先HAART治療於監控期結束時,在接受10mg/kg或25mg/kg試驗藥物UB-421的所有投予之個別患者中PBMC HIV原病毒DNA含量。每一條線代表來自一個個別患者所提供結果。
第19-1至19-5圖係顯示利用抗HIV gp120廣泛中和抗體VRC01單一藥物治療作為抗反轉錄病毒療法的替代藥物於穩定接受HAART治療的患者中9位患者所顯現病毒血症水平(實心三角形,HIV RNA copies/mL)和VRC01抗體血漿濃度(實心圓,μg/mL)的圖式。儘管呈現高VRC01抗體血漿濃度血清,因為未達到HIV抑制而提前終止此NIH試驗。x軸上方的倒三角形表示VRC01輸注時間點。
第20圖係顯示作為單一藥物治療於HIV病毒抑制維持之療效的比較,單一藥物治療是利用(1)市場上HIV藥物(HAART)或單株抗體、(2)VRC01、(3)針對HIV協同受體 CCR5的Pro140或(4)UB-421,使用4至16週期間。
第21圖係顯示治療時利用UB-421類似抗體調停的細胞機制。細胞機制包括:(1)藉由%Treg細胞減少恢復HIV抗原特異性T細胞活性;(2)在抗體結合後在受感染的細胞中活化潛伏HIV;以及(3)阻斷細胞間和無細胞感染以中止新的HIV感染;所有這些機制都會導致(4)病毒庫的減少或消除,以導致HIV-1感染之持續性病毒緩解。
第22A圖至第22D圖係顯示於Jurkat T細胞中位在酪胺酸394(Y394)和酪胺酸505(Y505)之Lck磷酸化的西方墨點分析。第22A圖是以作為陽性控制組之抗-CD3(OKT3)抗體刺激後之Lck Y394磷酸化(上方)和Y505磷酸化(中間)以及總Lck(下方)蛋白質水平的西方墨點圖。第22B圖為顯示以第22A圖所示每個時間點之總Lck標準化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的圖式。第22C圖為於有或無交聯的狀況下利用UB-421刺激之Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中間)以及總Lck(下方)蛋白質水平的西方墨點圖。第22D圖為顯示以第22C圖所示每個時間點之總Lck標準化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的圖式,在此虛線表示於交聯狀況下所提供的數據,而實線表示於無交聯狀況下所提供的數據。
第23A圖至第23B圖係顯示於來自正常血液捐贈者3之原代CD4+ T細胞利用抗-CD3(OKT-3)刺激之Lck磷酸化的西方墨點分析。第23A圖為利用抗-CD3(OKT3)抗體刺激之Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中間)以及總 Lck(下方)蛋白質水平的西方墨點圖。第23B圖為顯示以第23A圖所示每個時間點之總Lck標準化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的圖式。
第24A-1至24B-2圖和第24C-1至24D-3圖係顯示於來自正常血液捐贈者1、2、4、5、6和7之原代CD4+ T細胞利用UB-421刺激之Lck磷酸化的西方墨點分析。第24A-1至24A-2圖為於健康捐贈者1和2於有或無交聯的狀況下利用UB-421刺激之Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中間)以及總Lck(下方)蛋白質水平的西方墨點圖。第24B-1至24B-2圖為於健康捐贈者4、5、6和7於無交聯的狀況下利用UB-421刺激之Lck Y394磷酸化(上方)、Y505磷酸化(中間)以及總Lck(下方)蛋白質水平的西方墨點圖。第24C-1至24C-3圖和第24D-1至24D-3圖為顯示以第24A-1至24A-2圖和第24B-1至24B-2圖所示每個時間點之總Lck標準化的Lck Y394和Y505磷酸化程度的圖式,在此虛線表示於交聯狀況下所提供的數據,而實線表示於無交聯狀況下所提供的數據。
第25A圖和第25B-1至25B-2圖係顯示在來自健康血液捐贈者8和9之原代CD4+ T細胞之Lck磷酸化的流式細胞儀分析。第25A圖顯示在具有作為陽性控制組之抗-CD3刺激(虛線)或作為陰性控制組無任何處理(實線)之狀況下PE-抗-Lck pY394(左圖)和Alexa647-抗-LckpY505(右圖)的MFI。第25B-1至25B-2圖顯示在交聯狀況下(虛線)或無交聯狀況下(實線)以UB-421刺激在來自健康血液捐贈者 8和9之原代CD4+ T細胞之PE-抗-Lck pY394(左圖)和Alexa647-抗-LckpY505(右圖)的MFI。
本發明係關於用以於穩定接受HAART治療的患者進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的抗體、組成物及方法。在本發明一範疇中,本發明係關於針對CD4的抗體、其組成物,以及製造與使用此組成物於穩定接受HAART治療的患者在後續缺乏其他治療(包括cART)的狀況下進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的方法。
在此使用之章節標題僅作為組織的目的,且並非被解釋作為限制所述之專利標的。為了任何目的,此申請案引用之所有參考文獻或參考文獻之部分透過引用在此明確地被併入本文整體。
CD4
人類CD4(分化群4)為具有458個胺基酸的醣蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot:P01730.1),其位於免疫細胞(例如T輔助細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)的表面(en.wikipedia.org/wiki/CD4)。CD4的胺基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:22所示。CD4+ T輔助細胞為白血球,其為人體免疫系統的重要組成。它們通常被稱為CD4細胞、T輔助細胞或T4細胞。它們為輔助細胞,原因在於它們向其他類型的免疫細胞(包括瓦解感染顆粒的CD8殺手細胞)傳送信號。若CD4細胞耗竭,例如於未接受治療的 HIV感染或在移植前的免疫抑制之後,原本可抵禦廣泛的感染的身體變得容易受到攻擊。
CD4為一協同受體,其可協助T細胞受體(TCR)與抗原呈現細胞之間的聯繫。CD4使用其細胞外功能區塊與抗原呈現細胞表面的第二型主要組織相容性複合體(MHC)分子直接交互作用。細胞外功能區塊使用類免疫球蛋白的β-三明治結構,其在2個β折疊中具有7股。使用其細胞內功能區塊,CD4可藉由吸引酪胺酸激酶Lck放大TCR所產生的信號,其對於激活活化之T細胞的訊息級聯的許多分子組分是必需的。因此,產生各種的T輔助細胞。
CD4的主要結構特徵如序列表所示,並詳述於下。
CD4為免疫球蛋白超家族的成員,並具有四個免疫球蛋白功能區塊(D1至D4),其暴露於細胞的細胞外表面。CD4功能區塊D1和D3類似免疫球蛋白變異(IgV)區;而D2和D4類似免疫球蛋白恆定(IgC)區。
CD4功能區塊1(D1)
D1核心區域(約第26-125個胺基酸)由2個由β-股所形成之β-折疊所組成,其以雙硫鍵橋加以連結。D1的胺基酸序列與免疫球蛋白共有同源性,於其三個互補決定區(CDRs)與免疫球蛋白鏈相似。類CDR1、CDR2及CDR3區域位於CD4的D1功能區塊。
CD4的D1功能區塊直接與抗原呈遞細胞表面 上的第II型MHC分子交互作用,並吸引lck以促進T輔助細胞的活化,以調控特異性免疫反應。發現CD4分子細胞外區域的功能區塊1和功能區塊2均對第二型MHC分子之結合位具有貢獻;然而,發現僅功能區塊1涉及HIV結合與合胞形成(syncytia formation)。特別地,發現HIV外套膜醣蛋白gp120之結合位位於功能區塊1的類CDR-2環(CDR2-like loop)。
已開發出許多辨識CD4之D1功能區塊的抗-CD4抗體。例如,HIV RC、B4、M2及dB4C7(例如Wang,C.Y.1999;Lynn.S.and Wang,C.Y.2009;and Wang,C.Y.,WO2016/043788);Leu3a(Chiba,Y.1992);OKT4A(Jameson,B.D.,et al.,1988);ST4及13B8.2(Briant,L,1999);6H10(例如Moore,et al.,1992);15A7、2D5及2F2(例如Yuan R,et al.,2016);及F91-55及BL4,其辨識位於D1及D2之間的區域(Briant,L,et al.,1999;Celada F,et al.,1990;and Moore,et al.,1992)。
CD4功能區塊2(D2)
CD4之D2功能區塊(約第126-203個胺基酸)通過其疏水性界面與D1連接。D2對第二型MHC分子之結合位具有貢獻。已開發出許多辨識CD4之D2功能區塊的抗-CD4抗體。例如ibalizumab(TMB-355;原先名稱為TNX-355或Hu5A8;例如Kuritzkes,D.R.,et al.,2004);M-T441(König R,et al.,1995)。
CD4功能區塊3(D3)
CD4之D3功能區塊位於約第204-317個胺基酸。D3藉由其疏水性界面連接D4,其類似於D2與D1交互作用的方式。抗體OKT4可辨識D3(例如Yuan R,et al.,2016;Moore,et al.,1992)。
CD4功能區塊4(D4)
D4功能區塊(約第318-374個胺基酸)是CD4分子上在跨膜區域前最後的細胞外區域。D4結構上類似D2,被廣泛認為可透過CD4分子形成二聚體以激活T細胞和CD4功能。抗體OKT4及L120可辨識D4(例如Yuan R,et al.,2016;Moore,et al.,1992)。
CD4-跨膜區域和細胞質區域
跨膜區域(約第397-418個胺基酸)為疏水性,而細胞內/細胞質區域(約419-458個胺基酸)包括3個絲胺酸殘基(S433、S440及S456),其被磷酸化以調停訊息傳遞。這些絲胺酸殘基直接與Src酪胺酸激酶(TK)家族成員P56lck連結,其可增加P56lck酪胺酸磷酸化程度並調控訊息傳遞。
CD4-於HIV感染的角色
HIV-1藉由CD4進入宿主T細胞,此乃透過其 病毒外套膜蛋白(稱為gp120)達成。Gp120是成熟HIV-1細胞膜包膜醣蛋白前體gp160的兩個結構域之一,另一個為gp41。結合gp120至CD4構成HIV-1附著中的第一步,且CD4-gp120交互作用引起gp120構型變化,以允許其結合至表現於宿主細胞上的化學激素受體CCR5或CXCR4。此第二步驟的結合允許HIV的gp41(融合胜肽)分子插入宿主細胞膜,以調停病毒和宿主的細胞膜融合。HIV感染造成表現CD4之T細胞數量逐漸減少。
因此,CD4在HIV-1感染的初期扮演重要的角色。比較gp120與CD4結合及未結合的晶體結構,顯示“連結區(bridging sheet)”-由2個β-髮夾所形成的4股β-折疊-在CD4結合期間,可固定gp120核心之二個密切相關的“內”及“外”結構域的相對位向。CD4 D1功能區塊與這些內和外結構域以及連結區交互作用,導致gp120內結構域的重組。此外,利用與gp120 V3可變環的額外交互作用,連結區暴露出協同受體結合位(例如Yuan R,et al.,2016)。
抗體
在本發明的一範疇中,本發明係關於針對CD4的抗體、其組成物,以及使用此組成物進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的方法。
本發明抗體廣泛地涵蓋完整的抗體分子,其包括完整的多株、單株、單特異性、多特異性、嵌合、去免 疫化、擬人化、人類、靈長類化、單鏈、單結構域、合成及重組抗體。本發明還包括具有所欲活性或功能之完整抗體的部分(例如抗體的免疫片段)。
本發明抗體是針對CD4。在一些實施例中,抗體特異性地結合CD4的細胞外區域。在某些實施例中,抗體特異性地辨識並結合至CD4免疫球蛋白功能區塊(D1至D4)中的至少一個。在某些實施例中,抗體僅結合至CD4免疫球蛋白功能區塊的其中之一(即D1、D2、D3或D4)。在特定實施例中,抗體結合至CD4的D1功能區塊。在某些實施例中,抗體結合至位於CD4功能區塊1中的互補決定區(CDR1、2或3)或其附近。在特定實施例中,抗體結合至CD4 D1功能區塊之CDR2區域或其附近。
本發明的抗體可以任何標準方法製備。在一些實施例中,本發明抗體可以重組CD4蛋白、CD4蛋白的片段、含有CD4免疫部分的融合蛋白及/或CD4類似物或同源物免疫動物(例如,小鼠、狗、天竺鼠、豬、山羊、馬等)加以製造。在其它實施例中,可利用表面表現CD4的細胞免疫動物以產生此抗體。在其它實施例中,可利用化學合成製備此抗體。
在某些實施例中,抗體可以CD4蛋白、CD4蛋白的片段、含有CD4免疫部分的融合蛋白及/或CD4類似物或同源物免疫動物加以製造。在一些實施例中,使用含有全長CD4蛋白的胜肽免疫動物以產生抗體。在其它實施例中,使用含有一部分CD4蛋白的胜肽免疫動物以產生 抗體。例如,胜肽可含有CD4蛋白的一部分,以細胞外區域(例如D1至D4)、免疫球蛋白功能區塊(D1、D2、D3及/或D4)、D1功能區塊內的互補決定區(CDR1、2或3)等作為代表。此抗體可利用包含至少一部分CD4蛋白的單一胜肽或含有CD4胺基酸序列的胜肽組合免疫動物加以製造。在一些實施例中,含有CD4之第39-66個胺基酸的胜肽免疫原(也稱為HIV受體複合體(“HIV RC”)),如同HIV結合至CD4之此部分。在特定實施例中,HIV RC胜肽可藉由雙硫鍵以製造環狀結構。在一些實施例中,可利用環狀HIV RC胜肽免疫動物以製造多株抗體。本發明所述“抗-HIV RC多株抗體”是指針對含有CD4功能區塊1之CDR2區域第39-66個胺基酸的環狀胜肽的免疫血清。
在其它實施例中,以CD4陽性細胞免疫動物可產生抗體。細胞株可為任何表現CD4的細胞株,例如,Jurkat細胞、HPB-ALL細胞、U87MG細胞、NIH-3T3細胞、HOS細胞、CCRF-CEM細胞(ATCC® CCL-119TM)、HuT 78(ATCC® TIB-161TM)、MJ(G11)(ATCC® CRL-8294TM)及其類似物。在某些實施例中,可以完整、未受感染的CD4+人類HPB-ALL細胞(一種T細胞急性淋巴細胞性白血病細胞株(T-acute lymphoblastic leukemia cell line))或純化的周邊血液單核T細胞(PBL T細胞)免疫BALB/c小鼠製造抗體。於Wang發明的美國專利第5,912,176和6,090,388號以及WO/2016/043788,以及Wang等人於1999年發表的期刊論文,對此抗體有更詳細的討論,其均透過引用以併入 本文整體。
在某些實施例中,以化學物質標記或標誌本發明抗體。例如,抗體可以生物素、延伸臂、探針(例如:螢光異硫氰酸鹽(FITC)、藻紅素(PE)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、DyLight Fluors、Alexa、綠色螢光蛋白(GFP)、R-藻紅素(R-Phycoerythrin)、量子點等)、酶結合物,及其結合加以標誌。在具體實施例中,抗體是以生物素或螢光探針標誌。
在具體實施例中,抗體可透過已知的去免疫化過程加以修飾。本發明所述“去免疫化”一般是指用以修飾抗體之部分的過程,藉此使其投予動物時不引起動物體內之免疫反應。具體來說,當此抗體於投予至特定動物時具有免疫原性,去免疫化涉及定位與移除抗體部分胺基酸序列(例如,T細胞抗原表位)的過程。此過程可藉由結合使用免疫學與分子生物學技術達成。此過程先前已揭露(例如Jones,T.D.,et al.2009)。在抗體去免疫化的狀況下,可普遍地引入突變以移除T細胞抗原表位,而未顯著地減少抗體的結合親和力。
本發明所述“擬人化”是指修飾(去免疫化)非人類物種抗體的蛋白質序列,藉此移除當此抗體投予人類時的免疫原性。在某些實施例中,本發明抗體是利用以人類恆定區取代其恆定區及/或利用表現於哺乳類細胞編碼此些抗體的基因以去免疫化供人類使用。
本發明所述“mAb B4”或“B4”或“鼠源 B4”是指鼠源單株抗體,其可辨識CD4及抑制HIV進入。此抗體的結構及功能特徵詳述於以下實施例中。
本發明所述“mAb dB4”或“dB4”是指衍生自mAb B4之人類去免疫化抗體。在一實施例中,mAb B4是利用依據美國7,501,494號和7,872,110號專利所述之方法去免疫化以供人類使用,其透過引用在此併入本文整體。在特殊實施例中,人類去免疫化mAb dB4是藉由移除mAb B4之鼠源抗體恆定區(C H和C κ),並以人類IgG1的恆定區取代,而製造。MAb dB4包含以任何適當之細胞選殖株製造的dB4。在具體實施例中,mAb dB4是由7號選殖株所製造。
本發明所述“mAb dB4C7”或“dB4C7”,是指由包含重組基因B4DIVHv1/VK1CHO#7的7號選殖株所表現的mAb dB4,其先前於Wang發明的美國專利第7,501,494、7,872,110號及WO/2016/043788揭露,這些專利透過引用在此併入本文整體。顯示C7選殖株可製造高產量的mAb dB4抗體。此外,將位於mAb dB4C7位置298之Asn(N)殘基以His(H)取代,以移除N-醣化點,因此消除IgG調停的補體依賴型細胞毒殺作用(CdC),以防止於抗體B4存在下CD4陽性T細胞的耗竭。
本發明所述“UB-421”是指使用於投予人類受試者之合適形式的mAb dB4C7。
此抗體可含有轉譯後修飾,包括醣化、甲基化及/或磷酸化的位置。在某些實施例中,此抗體具有醣類結 合殘基。在特定實施例中,此抗體含有作為醣化點的天門冬醯胺酸(Asn)殘基。在特定實施例中,Asn殘基位於重鏈,且在特定實施例中,Asn位於Fv區域及/或CDR。
本發明抗體也可藉由其有趣且獨特的功能特徵而加以描述。
例如,本發明之抗體可透過其結合至CD4之功能區塊1而發揮有效的競爭型HIV進入抑制。特別是,本發明之抗體於測試的所有Env假型病毒具有接近100%的最大抑制百分比(MPI),具有兩個IC50濃度;一個是介於0.01至1μg/mL,且第二個是約10μg/mL。本發明抗體的結合活性較HIV gp120外套膜蛋白所展現之CD4結合親和力高了約兩個對數(即100倍更緊密的結合)。此外,本發明抗體的平均解離常數(Kd)測得為5.6 x 10-11M(範圍:3.1至8.1 x 10-11M),且最大結合容量(Bmax)測得為1.2 x 106Ab/細胞(範圍:0.93-1.4 x 106)。
於無細胞和細胞間的系統中均顯示本發明抗體的競爭型抑制特性。本發明抗體以較HIV外套膜蛋白gp120MN高至少50倍之親和力結合至CD4受體。並且,本發明抗體以相較於其他市售抗體(例如Leu3a)更高的親和力與特異性結合至CD4。
本發明抗體也可抑制由抗原引起的T細胞增生和CD4陽性T細胞的細胞激素製造(IL2和IFN-gamma),其涉及細胞焦亡的致病循環。此種對CD4具高親和力之單株抗體可抑制抗原(例如超抗原SEB(金黃色葡萄球菌B型 腸毒素(staphylococcal enterotoxin B,SEB))引起的CD4陽性T細胞活化和細胞激素(例如IL2和IFN-γ)製造。此種抗原引起的活化導致HIV感染失敗的靜默CD4+ T細胞產生細胞激素,造成這些靜默CD4+ T細胞和附近正常靜默CD4陽性細胞的細胞焦亡,其導致之後CD4+ T細胞的大量耗竭,因而導致AIDS。
本發明抗體也具有再活化靜默CD4陽性T細胞的能力。此特性對再活化靜默T細胞中的潛伏HIV病毒庫特別有用,可使這些細胞對抗反轉錄病毒藥物治療敏感。此種對CD4高親和力之抗體可活化靜默的HIV感染細胞以釋放HIV。HIV感染的靜默CD4+ T細胞再活化允許在HIV感染患者使用合併本發明抗體與HAART之合併治療,以達成功能性治癒。
於以下實施例提供本發明抗體額外的結構與功能特徵。
劑型
本發明也針對用以預防、治療,及/或功能性治癒HIV感染的藥劑劑型。在某些實施例中,劑型包含針對CD4之抗體。在特定實施例中,本發明關於包含對CD4高親和力之單株抗體的醫藥組成物(此抗體可針對位於CD4功能區塊1之CDR2區域內或附近的位置)。此種抗體的結合活性(EC50)較HIV gp120外套膜蛋白所展現之CD4結合親和力(對gp120之EC50=97nM)高了約兩個對數(即 100倍更緊密的結合)。
抗體蛋白質的藥劑劑型可藉由混合抗體蛋白質與任選的藥物學上可接受的載體而加以製備。藥物學上可接受的載體包含溶劑、分散介質、等滲劑等。載體可為液體、半固體(例如膏狀物)或固體載體。載體的例子包含水、鹽溶液或其他緩衝液(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液)、油類、醇類、蛋白質(例如血清白蛋白、明膠)、碳水化合物(例如單醣、雙醣,以及其他碳水化合物(包含葡萄糖、蔗糖、海藻醣、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝膠、脂質、微脂體、樹脂、多孔基體、黏合劑、充填劑、塗層、安定劑、防腐劑、抗氧化劑(包含抗壞血酸以及甲硫胺酸)、螯合劑(例如EDTA);成鹽的抗衡離子(salt forming counter-ions)(例如鈉);非離子界面活性劑(例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG),或其結合)。
此劑型可包含不止一種的活性物質。例如,劑型可含有用於預防和治療HIV感染之一或多個抗體及/或一或多個具有額外優點的化合物。活性物質可以任何方便使用的方式(例如:混合、溶液、懸浮液、乳化作用、膠囊化、吸附等)與載體結合,且可製成適用於注射、攝取、輸注等的劑型(例如:錠劑、膠囊、粉末(包含冷凍乾燥粉末)、糖漿劑、懸浮液)。亦可製備成緩釋製劑。
在某些實施例中,藥劑劑型包含供人類使用之mAb dB4C7。包含mAb dB4C7之藥劑劑型可配製於適當緩衝液中,包含,但不限於,檸檬酸鹽、磷酸鹽、三羥甲基 氨基甲烷(Tris)、1,3-二[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷(BIS-Tris)等,於介於6.0至7.0之pH值,且可包含賦形劑(例如醣類(50mM至500mM的蔗糖、海藻糖、甘露醇,或其混合))、界面活性劑(例如:0.025%-0.5%的Tween 20或Tween 80),及/或其他試劑。在具體實施例中,劑型包含mAb dB4C7於含有20mM甘胺酸,以及0.05%(v/v)Tween(聚山梨酯20(polysorbate 20))之磷酸鹽緩衝液(PBS)(pH 6.5)中。在其他具體實施例中,也可製備mAb dB4之高濃度劑型以供特定應用(包含皮下注射),其包含10mM組胺酸。
可製備含有不同量抗體的劑型。一般來說,用於投予受試者的劑型包含介於約0.1mg/mL至約200mg/mL。在某些實施例中,劑型可包含介於約0.5mg/mL至約50mg/mL;介於約1.0mg/mL至約50mg/mL;介於約1mg/mL至約25mg/mL;或介於約10mg/mL至約25mg/mL的抗體。在具體實施例中,劑型包含約1.0mg/mL,約5.0mg/mL,約10.0mg/mL,或約25.0mg/mL的抗體。
在具體實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之人類、擬人化或嵌合、單株抗-CD4抗體的醫藥組成物,其展現競爭型HIV進入抑制與CD4+ T細胞活化,作為HIV患者的免疫療法。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合,抗-CD4抗體的醫藥組成物,其作為單一藥物治療使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL,可將病毒量降低至低於檢測極限。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合,抗-CD4抗體的醫藥組成物,其作為單一藥物治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL,將病毒量降低至低於檢測極限,且維持穩定的CD4 T細胞數量。
在某些實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合,抗-CD4抗體的醫藥組成物,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時,此種治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至低於檢測極限。
在另一較佳實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之HIV患者,將達成患者的功能性治癒。
在另一較佳實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予於HAART下具有穩定病毒量的患者,將達成患者的功能性治癒。
抗病毒藥物
本發明內容更包括可用以治療、預防和功能性 治癒HIV感染方法中所使用的抗病毒藥物。
抗病毒藥物包含可於哺乳類動物有效抑制HIV之形成及/或複製的任何藥物(化合物或生物的)。抗病毒藥物的例子包含,但不限於,進入/融合抑制劑(例如:maraviroc、enfuvirtide);核苷類反轉錄酶抑制劑(NRTI)和核苷酸類反轉錄酶抑制劑(NtRTI)(例如:zidovudine、abacavir、didanosine、lamivudine、emtricitabine、stavudine及tenofovir);非核苷類反轉錄酶抑制劑(NNRTI)(例如:nevirapine、efavirenz、etravirine和rilpivirine);整合酶抑制劑(也稱為整合酶鏈轉移抑制劑或INSTIs(例如:raltegravir、dolutegravir、elvitegravir);蛋白酶抑制劑(例如:saquinavir、saquinavir mesylate、fosamprenavir、tipranavir、lopinavir、indinavir、nelfinavir、amprenavir、ritonavir、darunavir、atazanavir、bevirimat、vivecon);病毒成熟抑制劑;針對HIV基因表現的藥物;針對涉及HIV複製之重要宿主細胞基因和基因產物的藥物;以及其他抗-HIV藥物;iRNA藥物;反義RNA(antisense RNA);表現iRNA藥物或反義RNA之載體;肽核酸(PNA)以及抗病毒抗體;及其結合。
抗病毒藥物可以單獨或合併方式使用。以合併方式使用抗病毒藥物稱為抗反轉錄病毒治療(ART),聯合抗反轉錄病毒治療(cART)或高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。抗反轉錄病毒(ARV)藥物藉由藥物抑制反轉錄病毒生命週期的階段而廣泛地被分類。典型的合併使用包含 以兩種NRTIs作為“骨架”,以及以一種NNRTI、PI或INSTI作為“基底”。在某些實施例中,以合併方式使用抗病毒藥物,例如:Combivir、Trizivir、Kaletra、Epzicom、Truvada、Atripla、Complera、Stribild、Triumeq。
HIV感染的治療和持續性的病毒緩解的方法
本發明也針對用以治療、預防,和功能性治癒HIV感染的方法。在某些實施例中,劑型包含針對CD4之抗體。
另一方面,本發明之抗體、任選的藥物學上可接受的載體可於受試者用以治療、預防,及/或功能性治癒HIV感染,以及預防HIV傳播。
本發明所述HIV感染的“治療”是指對HIV感染的有效抑制,藉此延遲發生、延緩病程、減少病毒量,及/或改善由HIV感染所引起之症狀。治療包含對HIV暴露前和暴露後。
本發明所述HIV感染的“預防”是指延遲HIV感染之發生,及/或減少或消除HIV感染的發生率或可能性。本發明所述HIV傳播的“預防”是指減少或消除HIV由一個體傳染至另一個體(例如於懷孕、分娩或生產,或母乳餵養期間由HIV陽性之女性傳至小孩)的發生率或可能性。
本發明所述“受試者”是指任何靈長類受試者,包含人類、恒河猴、狒狒和黑猩猩受試者。
為治療及/或預防HIV感染,對有需求的受試者投予本發明抗體的治療劑量。
本發明所述“治療上有效劑量”是指抑制HIV感染效果所需劑量,藉此治療及/或預防HIV感染。抗體的劑量取決於疾病狀態和其他臨床因素,例如受試者重量和狀況、受試者對此療法的反應、劑型的種類和給藥途徑。作為治療上有效而非有害的精確劑量可由本領域之技術人員所決定。
一般來說,投予成年人類之抗體的適當劑量範圍介於約3至50mg/kg受試者體重,具有範圍介於約5至25mg/kg受試者體重的典型初步範圍可供使用。適當劑量也包含約5.0mg/kg、約10.0mg/kg、或約25.0mg/kg受試者體重。
包含本發明人類單株抗體的治療性組成物可便於靜脈投予(例如藉由單位劑量注射)。單位劑量一般是指本發明之治療性組成物,其進一步是指對受試者適合作為單位劑量之物理上分開的單位,每一單位包含計算用以產生所欲治療效果之活性物質的預定量和所需稀釋劑(即載體或賦形劑)。
以適當劑型之方式與治療上有效劑量投予組成物。給藥量取決於所欲治療的受試者、受試者身體利用活性物質的能力,以及所欲治療效果之程度。需要投予之活性成分的精確劑量取決於醫生之判斷且具有個體的差異性。然而,所揭露供系統性應用之適當劑量範圍取決於給 藥途徑。用於投予的適當治療方案也不盡相同,而是以於初次投予後投予重複劑量作為代表(於一或多個小時之間隔藉由之後的注射或其他投予方式)。另外,考慮在生物治療中持續靜脈輸注以維持血液中的濃度於指定範圍。
於受試者用以治療、預防,及/或功能性治癒HIV感染的方法包含投予受試者有效劑量之含有抗體的劑型。在某些實施例中,以單次投予的方式提供劑型給受試者。在其他實施例中,以多次投予的方式提供劑型給受試者。當以多次投予的方式提供劑型時,劑型可以每天一次、每週一次、每兩週一次(每隔一週),或每月一次投予。在具體實施例中,當治療時程表是以每週一次時,劑型是以約5.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。在另一實施例中,當治療時程表是以每兩週一次時,劑型是以約25.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。
在某些實施例中,當以總共8週,以5mg/kg或25mg/kg劑量以每週為基礎重複投予受試者時,含有單株抗體之劑型顯現高安全係數且耐受性良好。在特定實施例中,單株抗體可以5mg/kg劑量在HIV感染數小時內投予受試者,以提供HIV感染的消除性治癒。在其他實施例中,單株抗體可以5mg/kg劑量於HIV感染後在數天內投予受試者,以提供HIV感染的功能性治癒。
在某些實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合,抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其透過靜脈注射(IV)、肌肉注射(IM)或皮下注 射(SC)給藥途徑投予HIV患者作為免疫療法以減少病毒量。在特定實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之人類、擬人化或嵌合單株抗-CD4抗體的醫藥組成物,其展現競爭型HIV進入抑制與CD4+ T細胞活化,以作為HIV感染之患者的免疫療法。
在其他某些實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過IV、IM或SC給藥途徑投予HIV患者作為免疫療法以減少病毒量。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物,其作為單一藥物治療可使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL,將病毒量降低至低於檢測極限。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物,其作為單一藥物治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高於10μg/mL,將病毒量降低至低於檢測極限,且維持穩定的CD4 T細胞數量。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時,此種治療可於為期12週治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至低於檢測極限。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時,此種治療可使接受治療之受試者的病毒量降低至低於檢測極限,且只要血清抗體水平高於10μg/mL即無病毒量反彈。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之HIV患者,可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予於HAART下具有穩定病毒量的患者,可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以IV、IM或SC給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份,藉此每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始,其如同對於HARRT之下經歷穩定低於檢測極限病毒量之患者的治療假日(treatment holiday),之後接續HAART治療,進行1至4個或更多循環的期間,可達成功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以IV、IM或SC給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份,藉此對於未使用治療藥物之HIV患者每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始,之後接續2至4個月的HAART治療,進行1至4個或更多循環的期間,可達成功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以IV、IM或SC給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份,藉此每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始,其如同對於HARRT之下經歷穩定低於檢測極限病毒量之患者的治療假日,之後接續HAART治療,進行1至4個或更多循環的期間,以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量,可達成功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以IV、IM或SC給藥途徑投予作為於HAART替代療法的關鍵成份,藉此對於未使用治療藥物之HIV患者每治療循環以抗-CD4抗體治療2至4個月作為開始,之後接續2至4個月的HAART治療,進行1至4個或更多循環的期間,以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量,可達成功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結 合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之HIV患者,將達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,其可作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,當以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予於HAART下具有穩定病毒量的患者,將達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以每週或每兩週之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過IV、IM或SC給藥途徑投予對HAART之輔助治療中HAART治療失敗之患者,使病毒進一步減少。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以IV、IM或SC給藥途徑投予作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,於間歇模式中,每循環以2至4個月之治療期作為開始,以及1至2個月之治療假日,進行1至4個或更多循環的期間,對於未使用治療藥物之HIV患者如同於密集HAART治療模式的輔助治療,可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以 IV、IM或SC給藥途徑投予作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,於間歇模式中,每循環以2至4個月之治療期作為開始,以及1至2個月之治療假日,進行1至4個或更多循環的期間,以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量,對於未使用治療藥物之HIV患者如同於密集HAART治療模式的輔助治療,可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株擬人化抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以IV、IM或SC給藥途徑投予作為偕同HAART之輔助治療的關鍵成份,於間歇模式中,每循環以2至4個月之治療期作為開始,以及1至2個月之治療假日,進行1至4個或更多循環的期間,以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量,對HARRT之下經歷穩定低於檢測極限病毒量之患者如同於密集HAART治療模式的輔助治療,可達成患者的功能性治癒。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以IV、IM或SC給藥途徑投予HIV患者作為免疫療法以減少病毒量。
在其他實施例中,本發明關於包含具有上述結合特徵之單株人類、擬人化或嵌合抗-CD4抗體的醫藥組成物,可將其以每週或每兩週之時程表以約5mg/kg或更高之劑量透過IV、IM或SC給藥途徑投予HIV患者作為免疫 療法以減少病毒量。
具體實施例
本發明包含以下具體實施例:
(1)一種針對CD4分子的抗體,其中抗體特異性地結合CD4分子的細胞外區域,且其中當抗體結合位於CD4+細胞之表面上的CD4分子時,抗體:a)競爭型抑制HIV進入CD4+細胞;b)活化位於HIV感染之靜默CD4+細胞的潛伏HIV病毒庫;c)減少細胞HIV DNA的水平;以及d)提供HIV感染之持續性的病毒緩解且無病毒量反彈。
(2)依據(1)的抗體,其中抗體競爭型抑制HIV的無細胞和細胞間傳播。
(3)依據(1)的抗體,其中抗體在投予受試者時可減少調節性T細胞的百分比。
(4)依據(1)的抗體,其中抗體在投予受試者時可增加CD8+細胞的數量。
(5)依據(1)的抗體,其中抗體在投予受試者時可增加對HIV gag基序胜肽刺激反應的CD8+增生細胞。
(6)依據(1)的抗體,其中抗體在投予受試者時可增強靶向HIV感染CD4+細胞的功能性HIV特異性CD8+ CTL細胞。
(7)依據(1)的抗體,其中抗體可增強於CD4+細胞之TNF-alpha的生成。
(8)依據(1)的抗體,其中抗體以有或無交聯的方式活化靜默CD4+細胞。
(9)依據(1)的抗體,其中抗體於HIV陽性患者中可減少HIV病毒量至每毫升血液低於50copies且無病毒量反彈。
(10)(1)的抗體,其中抗體結合至位於CD4分子之功能區塊1附近的區域。
(11)(1)的抗體,其中抗體結合至位於CD4之功能區塊1的CDR2區域附近的區域。
(12)(1)的抗體,其中抗體包含:重鏈可變區胺基酸序列包含:SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2,以及SEQ ID NO:3的CDR3;以及輕鏈可變區胺基酸序列包含:SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2,以及SEQ ID NO:6的CDR3。
(13)(1)的抗體,其中抗體為單株抗體。
(14)(1)的抗體,其中抗體為擬人化單株抗體。
(15)(1)的抗體,其中抗體為擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的重鏈可變區;以及包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的輕鏈可變區。
(16)(1)的抗體,其中抗體為擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的重鏈;以及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的輕鏈。
(17)(1)的抗體,其中抗體為擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的重鏈;以及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的輕鏈。
(18)(1)的抗體,其中抗體為擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的重鏈;以及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的輕鏈。
(19)(1)的抗體對位於HPB-ALL細胞上與膜結合的CD4具有介於約3.1 x 10-11M至約8.1 x 10-11M之絕對結合親和力(Kd)。
(20)(1)的抗體可結合CD4分子。
(21)一種包含(1)之抗體的組成物。
(22)一種醫藥組成物,包含(1)之抗體以及藥學上可接受的載體。
(23)一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中之(1)的抗體。
(24)一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM組胺酸中之(1)的抗體。
(25)一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中約1.0mg/mL至約200.0mg/mL之(1)的抗體。
(26)一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM組胺酸中約1.0mg/mL至約200.0mg/mL之(1)的抗體。
(27)一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中約10.0mg/mL之(1)的抗體。
(28)一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM組胺酸中約10.0mg/mL之(1)的抗體。
(29)一種醫藥組成物,包含(12)之抗體以及藥學上可接受的載體。
(30)一種醫藥組成物,包含(16)之抗體以及藥學上可接受的載體。
(31)一種用以治療暴露於HIV之受試者的方法包含:投予受試者(1)之抗體的藥理學上有效劑量。
(32)依據(31)的方法,其中抗體是於暴露於HIV前投予受試者。
(33)依據(31)的方法,其中抗體是於暴露於HIV後投予該受試者。
(34)依據(31)的方法,其中抗體是於暴露於HIV後48小時內投予。
(35)依據(31)的方法,其中抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。
(36)依據(35)的方法,其中抗體是以多次投予受試者。
(37)依據(36)的方法,其中抗體是以每週、每兩週或每月之間隔投予受試者。
(38)依據(36)的方法,更包含投予受試者抗病毒藥物之步驟。
(39)依據(38)的方法,其中抗病毒藥物為高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
(40)依據(39)的方法,其中HAART包含核苷類似物反轉錄酶抑制劑合併使用蛋白酶抑制劑或非核苷類反轉錄酶抑制劑。
(41)依據(39)的方法,其中抗體是與HAART同時投予。
(42)依據(39)的方法,其中在一循環之期間內投予受試者抗體和HAART,其中此循環包含:i)在第一段期間對受試者投予抗體,之後為第二段期間之治療假日;以及ii)持續地於(i)內之第一段期間和第二段期間對受試者投予HAART。
(43)依據(39)的方法,其中在一循環之期間內投予受試者抗體和HAART,其中此循環包含:i)以每週、每兩週或每月之間隔於4個月之期間對受試者投予抗體,之後為兩個月之治療假日,以及ii)於(i)內之六個月期間持續地對受試者投予HAART。
(44)依據(42)的方法,其中受試者是於二循環之期間治療。
(45)依據(43)的方法,其中受試者是於二循環之期間治療。
(46)依據(39)的方法,其中抗體是於不同於HAART之時間投予。
(47)依據(39)的方法,其中在一循環之期間內投予受試者抗體和HAART,其中此循環包含:i)在第一段期間對受試者投予抗體,之後為第二段期間之治療假日;以及ii)在第二段期間而非第一段期間對受試者投予HAART。
(48)依據(47)的方法,其中抗體於第一段期間是以定期間隔投予。
(49)依據(47)的方法,其中抗體於第一段期間是以每週、每兩週或每月之間隔投予。
(50)一種用以治療HIV感染之受試者的方法,包含給予受試者治療方案,包含: a)(1)之抗體的藥理學上有效劑量;以及b)高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
(51)(50)的方法,其中抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。
(52)依據(50)的方法,其中在一循環之期間內投予受試者抗體和HAART,其中此循環包含:i)在第一段期間對受試者投予抗體,之後為第二段期間之治療假日;以及ii)持續地於(i)內之第一段期間和第二段期間對受試者投予HAART。
(53)依據(50)的方法,其中在一循環之期間內投予受試者抗體和HAART,其中此循環包含:i)以每週、每兩週或每月之間隔於4個月之期間對受試者投予抗體,之後為兩個月之治療假日;以及ii)於(i)內之六個月期間持續地對受試者投予HAART。
(54)依據(52)的方法,其中受試者是在二循環或多個循環之期間治療。
(55)依據(53)的方法,其中受試者是在二循環或多個循環之期間治療。
(56)依據(53)的方法,其中在一循環之期間內投予受試者抗體和HAART,其中此循環包含:i)以每週、每兩週或每月之間隔於4個月之期間對受試者投予抗體,之後為兩個月之治療假日;以及 ii)於(i)內之六個月期間持續地對受試者投予HAART。
(57)依據(50)的方法,其中(a)內之抗體是於不同於(b)內之HAART之時間投予。
(58)依據(50)的方法,其中在一循環之期間內投予受試者(a)內之抗體和(b)內之HAART,其中此循環包含:i)在第一段期間對受試者投予抗體,之後為第二段期間之治療假日;以及ii)在第二段期間而非第一段期間對受試者投予HAART。
(59)依據(58)的方法,其中抗體於第一段期間是以定期間隔投予。
(60)依據(58)的方法,其中抗體於第一段期間是以每週、每兩週或每月之間隔投予。
(61)一種用以抑制HIV進入CD4+細胞的方法,包含:將(1)之抗體暴露於該細胞。
(62)一種用以抑制gp120結合CD4+細胞的方法,包含:將(1)之抗體暴露於該細胞。
(63)一種用以活化靜默CD4+ T細胞的方法,包含:將(1)之抗體暴露於該細胞。
(64)一種用以活化位於靜默T細胞之HIV的潛伏病毒庫的方法,包含:將(1)之抗體暴露於該細胞。
(65)一種用以減少位於HIV感染之細胞樣品的潛伏HIV病毒庫的方法,包含:a)將(1)之抗體暴露於此細胞樣品;以及b)將HAART暴露於此細胞樣品。
除非特別說明,在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出,否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含複數形式。類似地,單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”,除非上下文另有明確說明。因此,“包含A或B”是指包括A,或B,或A和B。更應被理解的是,用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的,並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。所有出版物、專利申請、專利和在此提及的其它參考文獻透過引用在此併入本文整體。在衝突的情況下,以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外,材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。
所提供圖式和相關實施例的以下說明性解釋是用以便於理解在此頻繁使用的某些術語,特別是在實施例中。解釋是為便利性而被提供而非用以限制本發明。
【實施例】
實施例1. MAb B4的免疫和功能特性
單株抗體B4(mAb B4)或M2(mAb M2)為可辨識位於T細胞表面之複合HIV受體位點(CD4)的單株抗體。MAb B4或M2可影響和妨礙CD4和HIV協同受體的交互作用。MAb B4或M2優先地中和原代HIV-1分離株(此兩種抗體於美國專利第5,912,176和6,090,388號有更詳盡的討論)。
以下資訊總結了鼠源mAb B4之發現與初步的特性研究,其包含引用自兩篇美國專利(由Wang所發明的美國5,912,176號和6,090,388號專利)和Wang等人於1999年發表期刊論文的資料,其均透過引用以併入本文整體。
1. 衍生自利用HPB-ALL細胞或純化的PBL T細胞免疫接種的鼠源單株抗體
以完整、未受感染的CD4+人類HPB-ALL細胞(一種T細胞急性淋巴細胞性白血病細胞株)免疫BALB/c小鼠以提供mAb B4。
以由PBL分離出之完整、未受感染的CD4+細胞免疫BALB/c小鼠以提供mAb M2。
所提供之新種類的抗-CD4抗體(以mAb B4或M2表示)對位於細胞表面之CD4具有特異性,且對HIV-1的原代分離株具有廣泛的中和活性。
2. MAb B4辨識位置的特徵
相較於重組可溶性CD4(rsCD4),發現mAb B4優先地辨識位於細胞表面上與膜結合的CD4(membrane-bound CD4)。
於暴露於HIV前之mAb B4結合至與膜結合的CD4顯示可阻斷後續gp120和整個病毒附著至CD4。然而,於暴露於抗體前就已結合至gp120的與膜結合的CD4仍然可結合mAb B4。因此,mAb B4能影響gp120結合至與膜結合的CD4,但是gp120並不影響mAb B4結合至CD4。
3. MAb B4的體外中和活性
透過一般的定義,鼠源mAb B4並非中和性抗體。反而,mAb B4是藉由覆蓋宿主細胞受體,而非藉由附著至病毒,以抑制病毒進入。可藉由於此領域所使用之病毒中和試驗而容易地觀察到mAb B4對HIV感染的效果(例如MT-2微斑中和試驗(MT-2 Microplaque Neutralization Assay)(Sawyer et al.,1994))。鼠源mAb B4的中和活性是由我們的合作者Carl Hanson博士(加州健康服務部)所評估,也於John Mascola博士(亨利傑克遜基金會,WRAIR)、David Montefiori博士(杜克大學)和Malcolm Martin博士(NIAID)的實驗室中獨立地評估。以下HIV中和特性,於1995年至2010年間被廣泛地描繪,其與mAb B4相關:
(1)PBMC生長的原代分離株(PBMC-grown primary isolates)較T細胞株適應的分離株HIV-1IIIB和HIV-1MN對藉由mAb B4的中和作用更加敏感。
(2)MAb B4可中和透過使用CCR5/CXCR4(雙性)和CCR5協同受體之原代分離株的感染。
(3)MAb B4對使用CXCR4協同受體之T細胞株適應的HIV-1分離株具有低活性。
(4)MAb B4可中和代表HIV-1亞型A-G之不同合胞誘導型(Syncytial Inducing(SI))和非合胞誘導型(Non-Syncytial Inducing(NSI))的原代分離株,達到90%終點指標(endpoints)與高達3個對數的感染性。
(5)MAb B4可中和具有雙性協同受體HIV-1外套膜的HIV-2、猿猴免疫不全病毒(SIV)和人猴嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)。
(6)於扁桃體組織培養系統,mAb B4減少了兩個對數之HIV-1原代分離株VL135(HIV-1VL135)的感染性。在活化的人類補體存在下,在此狀況下許多抗-病毒抗體展現抗體依賴性增強作用,少至12.5μg/mL的mAb B4可完全地中和>100 TID50(50%扁桃體感染劑量)的monocytotropic分離株JR-CSF。
(7)當感染後48小時內加入mAb B4,mAb B4於HIV-1VL135展現中和活性;當72小時內加入,則具有顯著的抗-病毒效果。
a. 不論是否與細胞或病毒預培養,其均同樣有效。
b. 它的作用是藉由阻斷感染的病灶傳播至新的細胞,而非藉由進入後的機制。
c. 在這些試驗中,mAb B4並不有助於細胞毒性。
實施例2. HIV-1中和和抗藥性試驗
以下於1998年至2011年期間針對不同進化支之多個HIV分離株的病毒中和和抗藥性試驗是在Carl Hanson博士和Monogram生物科學公司的實驗室中執行。此試驗的詳細說明如以下所述。
1. HIV-1中和試驗
如每一試驗所指明收集血液或抗體樣品。使用MT-2微斑試驗或有絲分裂促進劑(PHA)-刺激的PBMC試驗,於一組含有多個進化支(multi-clade panel)的HIV-1分離株評估血清或抗體樣品。
1.1. MT-2微斑試驗
MT-2微斑試驗限於HIV的合胞誘導型分離株。本試驗於96孔盤上進行,於其藉由在微斑上合胞的螢光染色可計數到高達每孔洞25個微小空斑。在此試驗中,受感染的MT-2細胞藉由透過熔化的瓊脂糖離心形成單層,此熔化的瓊脂糖於離心期間膠化。此試驗被認為具有敏感性並具有遍佈多個數量級數的動態範圍。此試驗也被視為是處理大量樣品時唯一具有效率的方法。利用電腦化統計分析大量複製的孔洞,以提供使用其他方式所難以達成之品質控制與標準化的程度。
1.2. PBMC試驗
PBMC試驗是一種標準的抗原-減少試驗,於此試驗中,在受感染的細胞於96孔微量盤生長後,以抗原-捕獲ELISA定量於PBMCs的p24抗原表現。此試驗的優點在於其適用於所有的HIV病毒株與分離株。
1.3. 病毒原液
用於離體與體內中和試驗的HIV原液列於表 3、表5和表6,以及第1A、1B、3、22和23圖。來自亞型A至G和H之原代HIV-1病毒為:(a)分離自參加病毒和立克次體疾病實驗室(VRDL)加州健康服務部之舊金山男性健康研究的男性同性戀者;(b)由HIV分離和鑑定之世界衛生組織網絡取得,(c)由美國軍方HIV研究計劃提供,以及(d)由國家過敏和傳染病研究所AIDS研究和參考試劑計劃所饋贈。DH-12(由患者分離,於黑猩猩周邊血液單核球細胞(PBMCs)繼代,也是由國家過敏和傳染病研究所AIDS研究和參考試劑計劃所提供。
1.4. B4或dB4中和活性
B4或dB4中和活性定義為相對於不含抗體之控制組可提供指定百分比(50-95%)之病毒減少的抗體濃度。藉由於抗體稀釋物之間的內插法推導出在50%和90%終點指標之抗體濃度。
2. PhenoSense HIV進入試驗
用以測定抗藥性之PhenoSense HIV進入試驗是於Monogram生物科學公司執行(南舊金山,加州)。
利用從載體庫產生的重組病毒於不同濃度之藥物或抗體(例如B4或dB4)存在下感染細胞。測定用以抑制50%(IC50)或90%(IC90)試驗載體之病毒複製所需的藥物量。
2.1. 使用於PhenoSense HIV試驗之重組病毒的產生
PhenoSense HIV試驗使用之重組病毒是由收集自患者的樣本所產生,此些患者是於HIV感染之縱貫性 研究所篩選出,並確定為HIV血清反應陽性者。對於發生HIV感染者,收集臨床和血漿樣品以供實驗室評估(包括HIV病毒量和CD4細胞數量)。對於起初是血清反應陰性但於隨訪約一年後變成血清反應陽性的個體,利用兩個酵素免疫分析法和西方墨點法之確証加以確認HIV感染。
收集來自於血清轉化期間具有亞型A、BF、C、D、E、EA、F、G或J之受試者的樣品(基於先前的HIV亞型分析,其乃利用多個雜交分析而達成),用以建構重組病毒(如表3所示)。由試驗樣品放大HIV env、pol區域,並選殖放大的DNAs進入試驗載體。於GeneSeq HIV,定序載體庫以確定HIV基因型。於PhenoSense HIV試驗,於不同濃度藥物存在下利用從載體庫產生的重組病毒感染細胞。
實施例3. MAb B4對所有進化支之HIV分離株的中和活性(利用Monogram生物科學的PhenoSense試驗)
已證實mAb B4可中和B進化支的所有HIV病毒。於本試驗中共計73個具代表性的非B進化支HIV分離株,將來自進化支A(n=8)、BF(n=1)、C(n=18)、D(n=18)、E(n=4)、EA(n=10)、F(n=8)、G(n=4)、J(n=2),加上三個控制組病毒92HT594、JRCSF、JRFL,製成重組病毒,並於PhenoSense HIV試驗中測試,以分析其對mAb B4的敏感性(請參見表1)。顯示所有重組病毒對mAb B4具有高度敏感性,其具有無先例的低IC50和IC90濃度,具有平均 IC50=0.018μg/mL和IC90=0.062μg/mL。值得注意的是,發現這些HIV病毒分離株中的多個衍生自具多重抗藥性患者,此清楚地表明mAb B4或其人類對應物在已經對HIV藥物產生抗藥性之患者的治療中具有高效率。
實施例4. 單株抗體B4調停競爭型HIV進入抑制:可預測治療後HIV抗藥性突變種之預防的不可預期效果
競爭型抑制試驗可評估抑制劑(例如,進入抑制劑抗體)與HIV外套膜蛋白競爭位在CD4上相同受體結合位點從而抑制HIV進入細胞的能力和功效。理論試驗中,mAb B4和HIV外套膜蛋白(gp120)競爭結合CD4。第1A圖顯示此試驗的預測結果,在此每一條線代表不同的病毒分離株。具體地,從此理論試驗的預期結果證明,雖然不同的病毒分離株對mAb B4具有不同敏感性(IC50),但只要mAb B4存在足夠濃度下可抑制所有病毒分離株的進入,幅度達100%。
透過比較,非競爭型抑制試驗可評估抑制劑(例如,協同受體拮抗劑或結合於CD4之不同部分的抗體)抑制或降低HIV外套膜蛋白結合至CD4從而抑制HIV進入細胞的能力和功效。在理論試驗中,分析非競爭型抑制劑(例如,TMB-355)抑制HIV外套膜蛋白(gp120)結合CD4的能力。第2A圖顯示此試驗的預測結果,在此每一條線代表不同的病毒分離株。具體地,從此理論試驗的預期結果證明,不同的病毒分離株對TMB-355具有不同敏感性 (IC50),且不論TMB-355呈現量為何,至少一些部份的病毒分離株可進入細胞。基於此理論試驗,如同於最大抑制百分比的“高原”,可預期不論IC50為何均可觀察到HIV抗藥性。
TMB-355(原TNX-355,也稱為Ibalizumab)為擬人化IgG4單株抗體,設計其結合恆河猴和人類CD4之細胞外功能區塊2以避免HIV結合後進入CD4+細胞(例如Burkly,LC,et al.,1992;and Kurizkes,DR,et al.,2004)。位於CD4之TMB-355抗體結合位點有別於HIV-1外套膜蛋白gp120結合所需之位點,且有別於與主要組織相容性複合體蛋白質交互作用所需之位點。據此,TMB-355調停非競爭型HIV進入抑制。
已顯示TMB-355對一些HIV-1病毒具有強烈的中和活性,但是當以一組廣泛的HIV病毒株評估時,其抑制活性與中和活性並不一致。第2B圖顯示TMB-355的MPI介於100%至15%(左邊的Y軸),伴隨由0.01μg/mL至10μg/mL之增加的IC50(右邊的Y軸),對一組118種Env假型HIV病毒,以每一長條代表一種病毒分離株(Song,R.,et al.,2013)。於分析的所有進化支中,進化支A和E病毒較非進化支A和E病毒對TMB-355顯著地具有敏感性。此外,發現來自接受TMB-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種於gp120的V5區域具有突變(Toma,J.,et al.,2011;Pace,C.S.,et al.,2013)。以TMB-355(Ibalizumab)所證明之非競爭型抑制效應顯示在抗體治療 期間有發展抗藥性HIV突變種的高度可能性,因為具有低於100%抑制的分離株會發生病毒複製。
相反地,來自一組超過850種Env假型HIV病毒於10年期間收集的結果顯示,mAb B4於HIV進入抑制提供了非預期之廣泛性與效力(第1B圖)。從這些收集的數據可見mAb B4具有接近100%MPI,具有兩個IC50濃度,一個是介於0.01至1μg/mL,且另一個是約10μg/mL。MAb B4之HIV進入抑制曲線具有競爭型抑制機制的典型特性,無論IC50為何,其對每一HIV病毒具有為~100%之MPI。鑑於mAb B4之顯著強烈的競爭型HIV進入抑制特性,故在mAb B4治療期間不大可能會發展出病毒抗藥性突變種。這種嚴密的競爭型抑制,如透過mAb B4所展現者,迄今從未以任何其它測試的HIV抑制劑觀察到。
來自此實施例之MPI和IC50的數據,與顯示衍生自多重抗藥性患者之多個HIV分離株對mAb B4具有高度敏感性的數據(實施例3)相結合,顯示mAb B4或其人類對應物於HAART治療失敗之抗藥性HIV患者治療上具有高效率。由mAb B4所調停之中和模式提供獨特HIV藥物,其可於接受mAb B4或其人類對應相似物(具有相似Fv區域)治療的HIV患者中預防抗藥性病毒突變種的產生。如本發明所述,競爭型HIV結合抑制為一種獨特的特性,可允許抗-CD4抗體於HIV患者治療上展現臨床功效。
實施例5. 抗體B4有效地抑制HIV之無細胞和細胞間 傳播
HIV顆粒典型地藉由無細胞傳播散佈全身,在此病毒擴散於血流和局部環境中以感染細胞。病毒也藉由需要親密細胞間接觸的機制以具有直接地由受感染細胞轉移至未受感染細胞的能力。此種傳播發生於當受感染的細胞與未受感染的細胞形成穩定的接觸點時,並直接地將HIV顆粒傳播給未受感染的細胞。相較於無細胞傳播,細胞間傳播具有較高效率,速度較快,且不需要擴散至血流。
Sigal,A.等人於2011年報導,於抗反轉錄病毒藥物tenofovir存在下,起源於無細胞病毒的感染激烈地下降,而於共培養試驗中涉及細胞間傳播之感染卻顯著地對藥物較不具敏感性。敏感性的降低在藥物的存在下足以阻止多輪感染的終止。作者使用隨機感染模型在臨床藥物濃度的存在下研究來自細胞間傳播的複製,並發現複製是間歇性的,無突變的實質積累。如果細胞間傳播在體內具有相同的特性,它可能具有對免疫系統的不良後果,具有危險因子以導致個體的治療失敗,並可能有助於病毒的持久性,因此,其為治療HIV感染的障礙。
因此,為了評估其於治療上的潛在影響,重要的是評估用以抑制HIV細胞間傳播之mAb B4和mAb dB4相關抗體的能力及效力。
1. 用以測定HIV細胞間傳播之抗體調停抑制的試驗
1.1. 材料和方法
1.1.1. 細胞和病毒
選擇Jurkat-inGLuc選殖株(來自美國國立衛生研究所AIDS研究和參考試劑計劃),其具有利用基因工程置入於HIV-1基因體中的報導基因luciferase,選擇其作為供體細胞(原因在於表面CD4之低度表現),以在與目標原代CD4+ T細胞之共培養試驗中,可使供體間感染減到最少。報導基因luciferase可以在受感染的細胞中表現並作為病毒感染之標誌。可測定於受感染細胞中的這些病毒表現的報導者,以定量HIV-1感染。以原代CD4+ T細胞作為目標細胞。於此試驗中使用進化支D的病毒UG266和UG046。
1.1.2. 病毒細胞間傳播試驗
在本試驗,在與指明的HIV-1病毒株混合之前,將供體與連續稀釋之抗體B4預培養,並於幾天後使用(當~10-75%的細胞為Gag+時)。之後以於200μl中為1.5×106細胞/ml之最終濃度在96孔盤上以1:2比率混合供體和CD4陽性PBMC目標細胞。於48小時後,針對細胞內Gag進行細胞染色並以流式細胞儀分析。利用BioLux Gaussia Luciferase Assay套組(New England Biolabs)和Berthold Technologies冷光測定儀偵測累積於培養上清液中的GLuc。
1.1.3. IC 50 和IC 90 的校正
透過擬合數據至S形的劑量-反應曲線(多變的斜率)繪製劑量-反應抑制曲線。抑制的百分比定義為(未處理之目標細胞的訊號百分比-抗體處理之細胞的訊號百分比)/(未處理之目標細胞的訊號百分比)×100。依此計算 IC50和IC90
2. 結果和討論
表4顯示,當透過嚴格的90%進入抑制標準測定時,抗體B4可等效地抑制HIV(進化支C的病毒株UG266和UG046)之細胞間和無細胞傳播。具體來說,發現於細胞間傳播試驗中對UG266和UG046病毒株的融合抑制效價分別為1:140和1:245,其相當於在無細胞傳播中和試驗中為1:136和1:234之中和效價。當以50%進入抑制標準測定時,相較於相對應之無細胞傳播,在對細胞間傳播觀察到對此兩種病毒株較高的融合抑制效價。
這些結果證明,當與迄今所測定之所有其他針對HIV Env蛋白質的中和單株抗體或其他ART-藥物相比較時,抗體B4於其在抑制HIV之細胞間和無細胞傳播的能力方面均具有獨特的特性。這些結果顯示,只有mAb B4和mAb dB4相關抗體具有資格可在個體中預防HIV病毒的無細胞和細胞間傳播。
實施例6. 抗體UB-421(dB4C7或dB4)調停在HIV感染個體中用於增強病毒複製之靜默PBMCs的再活化
1. 背景
HIV-1感染靜默的周邊血液單核球細胞(PBMCs)卻保持不活化直到後續的細胞活化。利用體外模型(此體外模型是利用細胞培養條件和允許靜默T細胞非增值性感染之方法,模擬藏匿於靜默PBMCs中的靜默 HIV-1),以研究熱滅活的HIV-1(iHIV-1)或gp120-抗-gp120免疫複合物對這些靜默PBMCs的刺激效應(Briant,L.,et al.,1996)。
此證明偕同熱滅活HIV-1(iHIV-1)或gp120-抗-gp120免疫複合物之外套膜醣蛋白的CD4接合(CD4 engagement)足以透過交聯以刺激控制NF-κB(即核轉位)和AP-1活化的訊息傳遞路徑,其依次涉及CD4的細胞外功能區塊1(D1)和細胞質內功能區塊與幾種激酶(Lck、Raf-1、MEK和ERK),以誘導細胞週期進程、促進活化標誌CD25的細胞表面表現,以及刺激原病毒整合和使細胞產生病毒。
由Than等人(Than,et al.,1997)之獨立的科學發現進一步證實,利用抗-CD4單株抗體於gp120結合位之CD4分子的交聯可誘導來自HIV感染患者之潛伏受感染的PBMCs以促進病毒複製。此試驗中使用的抗-CD4 mAb為Leu3a,其可結合CD4之D1的CDR2-環。具體來說,Leu3是針對線性抗原表位,而此線性抗原表位代表具有CD4功能區塊1內之第47-64個胺基酸的胜肽(Chiba,Y.1992)。
此外,發現藉由針對CD4功能區塊1(D1)之CDR2-環的單株抗體可特異性地誘導於靜默PBMCs之病毒的再活化,且此並非藉由針對其他抗原表位(例如位於D1之CDR3或接近D1/D2接合點區域(Briant,L.,et al.,1999))的抗體(參見第3圖,比較第4長條與第5和6長條)。可利用可溶性CD4(sCD4)事先吸附CDR2-環配體以預防此種病毒再活化(參見第3圖,比較第4長條和第8長條)。
因此,重要的是要評估抗體dB4C7(UB-421)(其對CD4功能區塊1附近區域具有高結合親合力)是否可調停在HIV感染個體中用於增強病毒複製之靜默PBMCs的再活化。
2. 位於CD4之D1附近之B4/dB4構型結合位的結構精算
2.1. 藉由mAb B4對Leu3a結合至黑猩猩CD4陽性PBMCs之競爭型順序結合抑制(而非反向順序)
於此試驗中使用分離自二受試者(X282和X301)的黑猩猩PBMC細胞、mAb B4(利用FITC標誌)和Leu3a(以PE標誌)。以個別的抗體順序地染色PBMCs並進行細胞螢光顯影(cytofluorography)的分析。由此實驗所提供之數據如表5和第4圖所描述,並於下文中討論。
於單一標誌的控制組樣品,只利用Leu3a染色的細胞測試呈現Leu3a-PE結合陽性(參見第4圖第2組圖);且只利用mAb B4染色的細胞測試呈現B4-FITC結合陽性(參見第4圖第3組圖)。具體來說,於未受感染之黑猩猩樣品(X282和X301)的CD4+細胞(如利用Leu3a所偵測)分別為25.5%和44.0%,其與那些以mAb B4所偵測者(26.1%和45.5%)相似(表5)。
事先結合Leu3a之後暴露於mAb B4導致雙重染色的(Leu3a+/B4+)PBMC細胞數量(參見第4圖第4組圖)與單獨只利用Leu3a或B4染色之單一標誌的控制組細胞相似(即對X282和X301分別為24.5%和46.7%)(表5)。
相反地,事先結合mAb B4之後暴露於Leu3a導致在單一或雙重染色過程中只有無Leu3a陽性染色之mAb B4染色的PBMCs(參見第4圖第5組圖;表5)。
整體來說,這些結果證明針對Leu3a-PE之藉由抗體B4-FITC的單向抑制。也就是說,藉由事先Leu3a結合未能阻斷B4結合;然而,藉由事先B4結合可阻斷Leu3a結合。結論為mAb B4辨識涵蓋CD4功能區塊1之CDR2區域的構型抗原表位(抗體Leu3a可辨識此區域),且mAb B4以相較於抗體Leu3a之較高的親和力結合CD4的此區域。而這些數據支持此結論。
2.2. 利用針對HIV RC胜肽(第39-66個胺基酸)之免疫血清對B4結合至rsCD4進行競爭型抑制(ELISA方法)
透過利用針對CD4功能區塊1 CDR2區域之免疫血清的競爭型抑制試驗,評估mAb B4對完整重組可溶性CD4(rsCD4)的結合親合力。
2.2.1. 抗-HIV RC多株抗體
利用包含CD4第39-66個胺基酸的環狀胜肽免疫天竺鼠以製備針對CD4功能區塊1之CDR2區域的多株抗體。此環狀胜肽於本試驗中稱為HIV受體複合體胜肽(HIV RC胜肽),且如同先前於Wang等人在2002年所描述之胜肽p2240c。
具體來說,第0週是配製於完全弗氏佐劑者,且第3和6週是配製於不完全弗氏佐劑者,接著在此之後以配製於不完全弗氏佐劑者每月加強,以每劑量0.5ml中 內含100μg者肌肉注射免疫接種4-6週齡的Duncan Hartley天竺鼠後,於特定時間點收集針對HIV RC胜肽之天竺鼠血清。
提供的多株抗體稱為“抗-HIV RC多株抗體”。
2.2.2. 藉由抗-HIV RC多株抗體對B4結合rsCD4進行競爭型抑制
利用每孔洞以體積0.1mL濃度0.08μg/mL之完整rsCD4塗覆的96孔微量盤進行競爭型抑制實驗。在利用生物素化B4-抗體結合前,將天竺鼠血清(在利用針對HIV RC胜肽(CD4的第39-66個胺基酸)之免疫原免疫接種後第0、3、6、9、12、14、16和19週收集天竺鼠血清)以1:30的比例稀釋與孔洞培養,之後利用與接合的卵白素(avidin)-HRP之結合作為示跡劑。也對從整個試驗同期所收集來自未免疫接種之天竺鼠的陰性控制血清(RC同型)進行測試。
第5圖顯示藉由於初次免疫後第6週所提供之抗-HIV RC多株抗體可顯著地抑制生物素化-B4結合至rsCD4,藉由於初次免疫後第9週所提供之抗-HIV RC多株抗體可達到近乎完全的抑制。
此競爭型結合抑制試驗進一步證明mAb B4的結合位是位於CD4功能區塊1的CDR2環附近,雖然藉由mAb B4直接結合至此胜肽並非顯著地是因為mAb B4對與膜結合的CD4之構型結構的偏好性結合。
2.3. 於mAb dB4交聯後在HIV感染個體中用於增強病毒製造之靜默CD4陽性T細胞的再活化
藉由利用mAb dB4處理細胞與觀測TNF-α產量、病毒量和細胞增生,以評估mAb dB4活化靜默CD4+細胞的能力。
在此試驗中,藉由將培養盤與200μL山羊抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch)在37℃下培養1小時,以將人類IgG塗覆於8孔培養盤。將塗覆的培養盤保存於4℃冰箱中直到本試驗進一步使用。
依照標準作法將來自HIV患者之PBMC解凍1.5小時。如下所述,利用mAb dB4(實驗組)、PMA+PHA(陽性控制組)或只有培養液(陰性控制組)處理PBMC,以評估靜默CD4+細胞的活化。
2.3.1. MAb dB4處理
以mAb dB4(濃度為3μg/106細胞/mL)於4℃下處理細胞1小時以引發細胞上CD4的交聯。細胞以mAb dB4處理,之後洗滌,並以RPMI培養液和10%胎牛血清於塗覆的48孔培養盤上培養7天。以未塗覆之孔洞作為陰性控制組。於第0天、第2天和第7天冷凍培養上清液供之後的評估。於4℃處理30分鐘後由細胞移除上清液,以提供作為mAb dB4樣品之時間點第0天。
2.3.2. PMA+PHA處理
以0.1μM植物凝集素(phytohaemagglutinin,PHA)加上15μg/mL豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)(Sigma)(PMA+PHA)於塗覆的48孔培養盤上和RPMI培養液與10%胎牛血清處理細胞7天,作為再活化之靜默CD4+細胞的陽性控制組。利用未塗覆之孔洞作為陰性控制組。於第0天、第2天和第7天冷凍培養上清液供之後的評估。於4℃處理30分鐘後由細胞移除上清液,以提供作為PMA+PHA樣品之時間點第0天。
2.3.3. 只有培養液
如同陰性控制組,於塗覆的48孔培養盤上以RPMI培養液和10%胎牛血清培養細胞7天(只有培養液)。利用未塗覆之孔洞作為額外的陰性控制組。於第0天、第2天和第7天冷凍培養上清液供之後的評估。於4℃下在培養液中培養30分鐘後由細胞移除上清液,以提供作為只有培養液樣品之時間點第0天。
2.3.4. CD4+再活化的分析
藉由評估TNF-α產量、病毒量和細胞增生以測定CD4+細胞的再活化。於表6概述來自本試驗之結果。
使用標準方法分析來自所有樣品之溶液,項目包含:(1)利用定量的ELISA分析TNF-α濃度;(2)利用RT PCR分析HIV病毒量;(3)細胞數量;以及(4)利用錐蟲藍(trypan blue)分析存活率。
具體來說,數據顯示,相較於只有培養液的陰性控制組(低於檢測極限)和以PMA+PHA刺激的細胞(較mAb dB4覆蓋之細胞高約3至5倍),mAb dB4交聯所覆蓋之來自HIV患者的PBMC細胞可引起TNF-α的中度生成。
同樣地,mAb dB4樣品以與只有培養液之陰性控制組相似的速率增生;然而,PMA+PHA刺激的細胞具有相較於以mAb dB4交聯之細胞更大程度的增生(在第7天時,於PMA+PHA培養組別之細胞數量為mAb dB4培養組的5倍高)。
然而,相較於培養液控制組和PMA+PHA刺激的細胞,於以mAb dB4交聯之細胞的HIV病毒量顯著地增加。具體來說,當於第2和7天與只有培養液之陰性控制組相比較時,以mAb dB4交聯之細胞於病毒量分別地具有151%和220%的增加;然而,PMA+PHA培養具有次佳的病毒量產生(於第2和7天分別為55%和78%),儘管其細胞增生有5倍量的增加。
3. 結論
(1)發現鼠源mAb B4可辨識位於CD4上的構型位置,且此構型位置接近抗體Leu3a所辨識的位置(位於CDR2區域第47-64個胺基酸)。基於在實施例7所描述之比較性試驗,mAb dB4具有如同在此所述之對於mAb B4而言相同的辨識特性。
(2)利用多株抗體(此多株抗體是針對含有CD4功能區塊1之CDR2區域第39-66個胺基酸的環狀胜肽(HIV RC胜肽))可抑制鼠源mAb B4對完整rsCD4之結合。這些結果顯示mAb B4辨識CD4第39-66個胺基酸,其對應至CD4之D1的CDR2環。基於在實施例7所描述之比較性試驗,預期mAb dB4具有如同在此所述之對於mAb B4而言相同的辨識特性。
(3)發現CD4與mAb dB4交聯於HIV感染的PBMC CD4+ T細胞可活化病毒製造。具體來說,mAb dB4誘導TNF-α產生,並增強HIV製造,而未誘導細胞增生(如表6所示)。
(4)基於此實施例所提供之結果,mAb dB4(包含UB-421)能調停在HIV感染個體中用於增強病毒製造之靜默PBMCs的再活化。
實施例7. MAb dB4C7和抗-HIV RC多株抗體抑制抗原所引發的T細胞增生和CD4陽性T細胞的細胞激素(IL2和IFN-γ)製造,因此破壞細胞焦亡的HIV致病循環
1. 背景
最近的報告顯示,當HIV感染允許(permissive)、活化的CD4+ T細胞時,細胞死亡透過caspase-3依賴性的細胞凋亡默默地發生(Doitsh,G.,et al.,2014)。相反地,當R5或X4-向性HIV失敗地感染來自淋巴組織之非允許(non-permissive)、靜默的CD4+ T細胞時,這些細胞透過caspase-1依賴性的細胞焦亡而死亡,其為程序性細胞死亡之強烈的炎症形式。被視為宿主DNA感測器的干擾素誘導因子16(IFI16)可識別不完整的HIV反轉錄產物,進而引發caspase-1的活化(Monroe,K.M.,et al.,2013)。在大多數的人類淋巴組織(包含扁桃體、淋巴結和脾臟)中,活化和允許的細胞次群體代表了CD4 T細胞總數 中的5%或更少數量,而非允許靜默細胞則代表了遭遇HIV之目標中的95%或更多數量。因此,Caspase-1調停的細胞焦亡似乎主要地負責在這些淋巴組織感染HIV後驅使CD4 T細胞死亡,而非caspase-3調停的細胞凋亡。分析來自以R5-向性HIV感染之受試者的新鮮淋巴結進一步支持這些發現,其中在富含靜默CD4 T細胞的皮質區可偵測到caspase-1和IL-1β,而發現在解剖學上不同的生發中心(在此發現生產性感染細胞)可偵測到caspase-3活性。
細胞焦亡極可能透過前發炎性細胞激素的釋放和內生性危險訊號,藉由移除細胞內複製的小生境(niches)和增強宿主的防禦反應,促進各種細菌性感染的快速清除。然而,在致病的慢性炎症,例如HIV感染,細胞焦亡不是保護性反應且並不會導致原發性感染的清除。事實上,細胞焦亡似乎製造了惡性的致病循環,在此瀕死CD4 T細胞釋放炎症信號以吸引更多細胞進入受感染的淋巴組織,進而死亡並產生更多的炎症。這些事件建立了炎症的慢性狀態,其刺激病程和組織損傷。慢性炎症也可能促進潛伏HIV病毒庫的維持,而潛伏HIV病毒庫可刺激記憶CD4 T細胞的恒定性增生。
CD4 T細胞的耗竭和慢性炎症的發展是推動疾病進展之HIV致病機制中的特徵過程,且細胞焦亡提供了這兩種疾病-促進過程之間意外的連結。
以上資料顯示,透過抑制由CD4+細胞之抗原刺激所引發的CD4+細胞增生及/或發炎性細胞激素製造的 機制可能可以減輕或減少發生於HIV感染期間在淋巴組織的細胞焦亡。
2. 實驗
進行研究以確定是否mAb dB4可藉由於HIV感染個體抑制慢性炎症發展以破壞由細胞焦亡所引起的致病循環。抑制由抗原刺激所引發之細胞激素製造有助於緩解許多靜默T細胞(靜默T細胞已經有失敗的HIV感染)之細胞焦亡的負擔,從而破壞起因於細胞激素製造所造成於CD4陽性T細胞耗竭的HIV病理。
利用金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)之體外模型評估mAb dB4C7(UB-421)在正常和HIV感染個體中抑制PBMC T細胞增生的能力。SEB是一種超抗原,其具有刺激帶有特定T細胞抗原受體(TCR)之所有T細胞的能力,並可誘導大量的細胞激素製造。
透過與Huyen Cao和Mohamed Elrefaei博士的合作,進行了正常人類供體(n=3)和HIV感染供體(n=6,未使用ART治療的患者,CD4+數量>200,病毒量>10,000)的功能分析,以評估mAb dB4C7(UB-421)或針對CD4之D1的CDR2區域的抗-HIV RC多株抗體(實施例9)是否可以抑制細胞增生和細胞激素(IL2和IFN-γ)的產生。
2.1. 研究對象和樣品
從REACH cohort(舊金山)招募HIV-陽性未使用ART治療的志願者(n=6)。也將三個年齡一致的HIV-血清反應陰性控制組的志願者納入此試驗中。將PBMC分離 並冷凍保存在液態氮中直到試驗的時間。
2.2. 使用mAb dB4C7或純化的抗-HIV RC多株抗體的飽和濃度
首先在間接免疫螢光試驗中分別以mAb dB4C7 IgG或抗-HIV RC多株抗體IgG染色CD4+ T淋巴細胞,之後再用Alexa-山羊抗-HuIgG或Alexa-山羊抗-天竺鼠IgG進行染色。為了偵測陽性細胞百分比,透過流式細胞儀分析所得之染色的細胞。MAb dB4C7和抗-HIV RC多株抗體於2倍稀釋所測得之效價介於50μg/mL和0.0025μg/mL。MAb dB4和抗-HIV RC抗體的抗體效價測定為%CD4結合對抗體濃度(μg/mL)。在於HIV感染和正常個體進行T細胞功能測試使用之前評估這些抗體效價。
第6圖顯示於功能試驗中所使用各試劑的飽和濃度,mAb dB4(dB4C7)為1μg/mL和抗-HIV RC多株抗體為25μg/mL。
2.3. CD4+或CD8+ T細胞的增生
利用羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester,CFSE)螢光試驗分析細胞增生,其在細胞分裂時產生羧基螢光素二乙酸鹽琥珀醯亞胺酯(carboxy-fluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA-SE)染色的減少。利用CFSE作為3H-胸腺嘧啶(增生)測試的代用品。
以mAb dB4C7或純化的抗-HIV RC多株抗體之飽和濃度與PBMCs培養,以覆蓋位於細胞表面上的CD4 受體。細胞也分別與抗-HIV RC同型(濃度為25μg/mL)和PHA(10μg/ml;Sigma-Aldrich)培養作為陰性和陽性控制組。
於PBS中以CFDA-SE(Molecular Probes,Eugene,OR)標誌PBMCs,之後以100%FCS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)進行螢光淬熄。在以PBS洗滌後,將細胞再懸浮於具有10%FCS的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)中。
之後在SEB抗原(1μg/mL)存在下,將細胞於37℃含5%CO2之條件下培養5天,並分析表面標誌的表現。
利用流式細胞儀圈選CD3+(Amcyan)細胞群中CD4+(PE,D2)及CD8+(PercpCY5.5)細胞群進行分析,並針對%CFSE陽性細胞(作為%增生細胞)進一步測定此細胞群。利用LSR II(BD Biosciences,Mountain View,CA)獲得每個樣品四萬(40,000)個淋巴細胞,並利用FLOWJO軟體(TreeStar,San Carlos,CA)分析。結果測定為分裂的CD4(或CD8)T細胞的百分比。所有試驗參與者證明於PHA刺激後之顯著的細胞增生。CD4 T細胞在無SEB抗原刺激下之細胞增生為<0.5%(陰性控制組)。
2.4. 用以測定細胞激素(IL2和IFN-γ)製造的細胞內染色試驗
PBMC(0.5 x 106個細胞)與SEB抗原(1μg/mL)於37℃含5%CO2之條件下培養2小時。以含有0.1%FCS之PBS(洗滌緩衝液)洗滌細胞,將細胞再懸浮於裂解緩衝 液(BD Biosciences)中於室溫下反應10分鐘進行固定。細胞以洗滌緩衝液洗滌一次,之後將細胞再懸浮於0.5mL的膜通透劑2(BD Biosciences)中並於室溫下培養10分鐘進行通透化處理。接著以洗滌緩衝液洗滌細胞,並以抗-IL-2APC、抗-IFN-γ(PE CY7)以及抗-CD3(Amcyan)、抗-CD4(PE,D2)或抗-CD8(Percp CY5.5)(BD Pharmingen)染色。利用LSR II(BD Biosciences)獲得每個樣品四萬(40,000)個淋巴細胞,並利用FLOWJO軟體(TreeStar)分析。在無抗原刺激下之細胞激素-製造CD4或CD8 T細胞的百分比為<0.05%(陰性控制組)。結果表示為表現IFN-γ或IL2之CD4+(或CD8+)T細胞的百分比。
2.5. 統計分析
利用配對t檢定進行統計分析和比較。
3. 結果
此SEB抗原引發之T細胞增生試驗所提供的結果顯示,在未使用HIV ART治療的患者和年齡一致的正常個體中,mAb dB4C7(2μg/mL)和抗-HIV RC多株抗體(25μg/mL)在飽和狀態下均可減少CD4+ T細胞增生,而非CD8+ T細胞增生(數據未示)。
MAb dB4(1μg/mL)和純化的抗-HIV RC多株抗體(25μg/mL)於其個別的飽和PBMC表面CD4結合濃度下,於HIV陰性(第7A圖)和HIV陽性(第7B圖)個體均可抑制由超抗原SEB所引發增生CD4+ T細胞的IL2生成。於來自相同HIV陽性和陰性個體的CD8+ T細胞中則未發 現此種抑制(第7C圖)。
MAb dB4(1μg/mL)和純化的抗-HIV RC抗體(25μg/mL)在其個別的飽和濃度下,於HIV陰性(第7D圖)和HIV陽性(第7E圖)個體也均可抑制由超抗原SEB所引發增生CD4+ T細胞的IFN-gamma生成。於來自相同HIV陰性(第7F圖)和陽性(第7G圖)個體的CD8+ T細胞中則未發現此種抑制。
4. 結論
抗體mAb dB4C7(UB-421)和抗-HIV RC多株抗體,二者針對CD4功能區塊1的CDR2區域,發現可抑制超抗原SEB所引發藉由CD4陽性T細胞的T細胞增生和細胞激素(IL2和IFN-γ)生成,而非藉由CD8陽性T細胞的T細胞增生和細胞激素(IL2和IFN-γ)生成。發現dB4C7和抗-HIV RC多株抗體可抑制CD4+ T細胞增生和相關細胞激素(IL2和IFN-γ)生成,顯示此抗體可能對其他CD4陽性細胞相關的細胞激素生成展現相似的抑制效果,具有破壞細胞焦亡之HIV致病循環的潛力。
在此與先前實施例所觀察到,其對CD4陽性T細胞增生和相關細胞激素(IL2和IFN-γ)生成的抑制效果為高度顯著,其中在此所述之針對CDR2區域的抗體對CD4細胞可能展現同時發生的相反效果,包括:(1)靜默HIV感染之CD4陽性T細胞的再活化,以引發由其潛伏狀態釋出HIV(實施例9);(2)藉由靜默CD4+ T細胞的再活化,競爭型抑制和預防HIV從新釋出的病毒進入未受感染的CD4陽 性T細胞(實施例4和6);以及(3)當(超)抗原刺激時藉由CD4陽性T細胞抑制T細胞增生和細胞激素生成(此實施例)。
針對HIV結合之特定位置(即CD4功能區塊1的CDR2區域)的mAb dB4和抗-HIV RC多株抗體的獨特生物特徵和免疫反應的引發可提供功能性治癒HIV感染所需的特性,即能夠(1)透過進入抑制阻止HIV感染;(2)於靜默T細胞再活化病毒製造;以及(3)直接地改變細胞激素生成。
實施例8. 第IIa期,開放性,多次投予,劑量依賴性試驗以研究UB-421於無症狀HIV-1感染之成年人的安全性和療效
1. 試驗目的
(1)評估於無症狀HIV-1感染受試者之UB-421二劑量治療方案之多次投予的安全性和耐受性。
(2)獲得於這些受試者之UB-421二劑量治療方案之多次投予的抗病毒活性證據。
(3)評估抗病毒活性和安全性概況以確定最佳UB-421給藥和劑量治療方案。
(臨床試驗識別碼:NCT01668043)。
2. 試驗設計
這是利用UB-421之重複靜脈內給藥的開放性 試驗。為了可受試性(eligibility)而篩選對HIV-1血清反應陽性且無症狀之受試者。二十九位納入的受試者接受兩個劑量水平(每週10mg/kg(第1劑量組)或每兩週25mg/kg(第2劑量組))之一的試驗藥物(UB-421)之多次靜脈輸注,共為期8週的治療期。基於收案順序透過地點且輪流地將受試者分配到兩個試驗劑量組之一。在8週的治療期之後隨訪受試者額外的八週。此試驗在第16週結束。
3. 納入的標準
受試者必須滿足以下標準才有資格參與第IIa期試驗:
(1)無症狀,未接受抗反轉錄病毒治療(ART),HIV-1血清反應陽性
(2)CD4+ T細胞數量>350cells/mm3
(3)HIV-1病毒量>5,000copies/mL
(4)無需要立即治療的感染症(HIV-1除外)
(5)無使用免疫調節藥物或全身化療
(6)無需高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
當依據對HIV/AIDS診斷與治療的現行指導方針由試驗總主持人視作必需時,在這項試驗完成後,受試者於門診遵循例行的監測時程表(無抗反轉錄病毒藥物)或接受標準治療之抗反轉錄病毒療法(例如HAART)。允許於使用UB-421之第I期試驗所納入的個體和符合第IIa期試驗之進入標準的個體參與此次試驗。
4. 試驗用藥品
以濃度為10mg/mL(100mg於10mL藥瓶)提供UB-421(dB4C7 mAb)。
每個納入的受試者接受利用以下劑量水平之一的UB-421的多次靜脈輸注:每週10mg/kg(第1劑量組)或每兩週25mg/kg(第2劑量組),為期8週。UB-421的適當體積是基於特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調整每個個別劑量的體積,藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100mL,而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200mL。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。
5. 評估標準:
5.1. 主要安全性和療效終點:直到第16週(試驗結束)評估UB-421的以下安全性和耐受性參數:
(1)生理學檢查(PE)
(2)生命徵象
(3)臨床化學和血液學試驗
(4)不良事件(AE)/嚴重不良事件(SAE)的發生率
在試驗期(從V2至V12)期間對每一個劑量組評估UB-421的以下療效參數:
(1)個別最大病毒量下降
(2)平均最大病毒量下降
5.2. 次要病毒學終點
在試驗期(從V2至V12)期間評估以下病毒學反應:
(1)在每一試驗劑量組內和之間根據次群組的個別最大病毒量下降和平均最大病毒量下降。
(2)具有病毒量<50copies/mL之受試者的比例;
(3)具有病毒量<200copies/mL之受試者的比例;
(4)具有病毒量下降>0.5 log10 copies/mL之受試者的比例;
(5)具有病毒量下降>1 log10 copies/mL之受試者的比例;
(6)分別地對第1劑量組和第2劑量組在最終完成試驗藥物投予後直到7天和14天具有病毒反彈(於病毒量從最低點有超過0.5 log10的增加)之受試者的比例;
(7)抗-UB-421抗體的血清濃度(UB-421的免疫原性);
(8)CD4+和CD8+ T細胞數量的變化;
(9)UB-421的藥物動力學參數(Cmax、AUC(0→∞)和AUC(0→last))。
6. 分析群體
意圖治療(ITT)群體:29個受試者,其接受試驗藥物的至少一次給藥。第1劑量組和第2劑量組的ITT群體分別為14個受試者和15個受試者。
依計劃書執行臨床試驗的群體(Per-protocol(PP)population):18個受試者,其接受試驗藥物的所有給藥,具有有效基準和至少一個有效的治療後療效測定 (HIV-1病毒量試驗),且無重大違反計畫書規定。第1劑量組和第2劑量組的PP群體分別為7個受試者和11個受試者。
安全性和免疫原性群體:將29個受試者納入意圖治療(ITT)群體。
藥物動力學群體:是基於安全性和免疫原性群體中的次群體。
於安全性和免疫原性群體分析基線數據和安全性終點,然而療效分析是在ITT和PP群體二者中進行。在藥物動力學群體進行藥物動力學分析。
7. 試驗期的持續時間
篩選期:<4週
治療期:8週
隨訪期:治療期結束後接著的8週
Visit 0代表初始篩選,而試驗期間的每一次訪視代表1週期間。隨訪期通常以每週間隔執行。
8. 結果的概述
8.1. 試驗群體
在台灣的兩個試驗地點篩選總共33個無症狀之HIV感染的成年人。其中29個受試者通過了篩選標準並被選擇進行試驗。所有符合資格的29個受試者均為男性。
8.2. 安全性和耐受性結果
所有29名受試者在試驗期間經歷至少1件不 良事件,共計128件不良事件。其中,114例(在所有29個受試者中有89.06%)為治療相關緊急不良事件(TEAEs)和14例(在5個受試者中有10.94%)為治療前不良事件。於29個受試者中未觀察到嚴重不良事件(SAEs)。所有治療前不良事件均與UB-421無關,且這些事件中無事件被視為SAEs。報導TEAEs中的大多數(78.95%)為輕度,17.54%為中度,且3.51%(於一個受試者)是重度的。
最常見的(>10%)TEAE是皮疹和蕁麻疹。除了不良事件,在22個受試者中觀察到於血液學(於22個受試者中的154個事件)和生物化學(於6個受試者中的32個事件)之實驗室異常檢測結果。然而,大多數的變化是輕微且不具有臨床意義的。生理學檢查結果和生命徵象在試驗期期間大多為正常或無臨床意義。
如臨床試驗計劃書所說明,UB-421在試驗期期間為耐受性良好的,其於8週治療期的整體治療耐受性為73.84%。
8.3. 藥效學
8.3.1 CD4 + T和CD8 + T細胞數量
在8週治療期和8週隨訪期之後,平均CD4+ T細胞數量從基線略微減少了55.10±117.97cells/mm3,而平均CD8+ T細胞數量從基線增加了193.31±459.34cells/mm3。第1劑量組受試者之代表的CD4+ T細胞數量和平均CD4 T細胞數量如第9A圖左圖所示。第2劑量組受試者之代表的CD4+ T細胞數量和平均CD4 T細胞數量如 第9A圖右圖所示。
8.3.2 以UB-421覆蓋CD4受體
利用螢光結合的UB-421透過流式細胞儀偵測CD4受體覆蓋的程度。從四個代表受試者所提供之結果,來自第1劑量組的兩個患者和來自第2劑量組的兩個患者,分別如第8A至8B圖和第8C至8D圖所示。此試驗的靈敏度為0.15μg/mL。以每週10mg/kg或每兩週25mg/kg重複給藥時,UB-421的臨床療效顯示,當作為單一藥物治療時,於>10μg/mL之UB-421血清水平存在下可使病毒減少至低於檢測極限。只要PBMC CD4+細胞被完全覆蓋(即dB4C7-Alexa結合百分比接近0)就沒有病毒反彈。
在以兩個劑量水平投予UB-421二至三次後可達成以UB-421完全覆蓋位於PBMC上之CD4受體。此外,於整個治療期期間可保持以UB-421完全覆蓋CD4+ T細胞(第8A-8D圖)。在大多數受試者中,如同利用螢光dB4C7 mAb(dB4C7-Alexa)之結合所測定,在最終UB-421輸注的三週內,結合至CD4受體的UB-421減少並回復至基線數值。
評估試驗期間於受試者血清中所呈現之UB-421的濃度,以決定足以達成完全CD4覆蓋和HIV-1病毒抑制之UB-421的血清濃度。基於所獲得的數據,只要UB-421血清濃度維持在高於10μg/mL,則可利用UB-421達成持續的CD4+ T細胞的完全覆蓋和HIV-1病毒抑制(第8A-8D圖)。
8.4. 藥物動力學
在第1劑量組中觀察到平均AUC從17300±10000μg x小時/mL(Visit 1-2)增加至23900±10700μg x小時/mL(Visit 8-9),然後在Visit 11-12回復至基線。在第1劑量組中所觀察到的平均AUC(0→last)是171000±70300μg x小時/mL。
在第2劑量組中觀察到平均AUC從56500±19500μg x小時/mL(Visit 1-3)增加至61100±20700μg x小時/mL(Visit 7-9),然後在Visit 11-12回復至基線。在第2劑量組中所觀察到的平均AUC(0→last)是239000±73900μg x小時/mL。
這些數據證明,如同利用AUC(0→last)所測定,相較於接受每週10mg/kg UB-421輸注者(第1劑量組,171000±70300μg x小時/mL),平均血清藥物濃度以在投予每兩週25mg/kg UB-421輸注的受試者中較高(第2劑量組,239000±73900μg x小時/mL)。
8.5. 療效結果
此試驗招募29個HIV-1感染的受試者,其接受至少一劑的UB-421(ITT群體)。招募的29個受試者中,共計18個受試者完成了8週的治療期,其接受試驗藥物的所有給藥(PP群體)。於試驗期間透過評定所納入無症狀HIV-1感染受試者的個別和平均最大病毒量下降,以評估UB-421多次投予的療效,且將第1和2劑量組之ITT和PP群體的結果概述於表7。
發現平均最大病毒量下降在ITT或PP群體的兩個劑量水平之間並無顯著差異。具體來說,在第1劑量組於ITT群體之病毒量減少了2.27±0.60 log10 copies/mL,而在第2劑量組於ITT群體之病毒量減少了2.45±0.46 log10 copies/mL。於PP群體,在第1劑量組病毒量減少了2.73±0.34 log10 copies/mL,而在第2劑量組病毒量減少了2.47±0.45 log10 copies/mL。
在治療期期間,於所有(n=29,100.00%)試驗受試者觀察到0.5 log10 copies/mL的病毒量下降;且於所有(n=29,100.00%)試驗受試者觀察到1 log10 copies/mL的病毒量下降。
於以下內容揭露在治療期期間所獲得之數據的進一步評估:在第1劑量組,於ITT之8/14(57.14%)的受試者和於PP之5/7(71.43%)的受試者具有200copies/mL的病毒量;此外,於ITT之3/14(21.43%)的受試者和於PP之3/7(42.86%)的受試者具有<50copies/mL的病毒量。
在第2劑量組,於ITT之10/15(66.67%)的受試者和於PP之7/11(63.64%)的受試者具有200copies/mL的病毒量;且於ITT之3/15(20.00%)的受試者和於PP之2/11(18.18%)的受試者具有<50copies/mL的病毒量。
來自第1和2劑量組受試者之代表的病毒量下降數據如表7及第10A圖所示。在每一劑量組之內、每一劑量組之間,或在每一劑量組內的次群體之間,於具有病 毒量下降之受試者的比例並無統計上顯著的差異。此外,在8週治療期期間,在第1和2劑量組分別有42.9%和18.2%受試者的病毒量減少至低於目前實驗檢測極限(20copies/mL)的水平。在所有受試者中,當以UB-421完全覆蓋CD4+ T細胞時可使病毒量下降持續。在隨訪期結束時,於兩個劑量組的病毒量回復至基線水平。此外,在治療期期間於任何的試驗受試者中未觀察到病毒反彈。來自兩個劑量組之患者於整個治療期中未偵測到可計量的抗-UB421抗體。
8.6. UB-421和TMB-355的比較
針對由他人(Jacobson,J.L.,et al.,2009;Toma,J.,et al.,2011;and Pace,C.S.,et al.,2013)所執行TMB-355(ibalizumab,先前稱為TNX-355)的相似試驗所提供的結果,以評估UB-421於此試驗所提供之結果。第10A圖顯示在具有CD4+細胞完全覆蓋的UB-421存在下,有高達>3 Log10之優異的病毒量下降而無病毒量反彈。相反地,甚至在CD4+細胞完全覆蓋存在下,從治療起只有一週之後,接受TMB-355治療的患者便遭遇到病毒反彈,此為抗藥性病毒突變種發展的象徵(第10B圖)。
這兩種治療方案的比較,如圖所示,證明了利用UB-421治療HIV感染的受試者具有較TMB-355治療明顯的優勢。具體來說,UB-421在整個治療期中提供了於HIV病毒量的持續性下降,且甚至在進入到隨訪期的一或兩週仍具有>3 log10的最大病毒量下降。相反地,TMB-355 藉由第一次投予只提供了暫時性的病毒量下降,以及接近1 log10之最大病毒量下降。
此外,使用TMB-355之先前試驗發現,儘管呈現血清TMB-355和CD4陽性T細胞之完全覆蓋,HIV病毒反彈仍在進入治療的一週後發生(Jacobson,J.L.,et al.,2009)。這結果與於上述實施例4之先前預測一致,非競爭型進入抑制機制,如TMB-355(ibalizumab)所調停者,在抗體治療期期間可提供抗藥性HIV突變種發展的高度可能性。實際上,發現來自接受TMB-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種於gp120的V5區域上辨別出突變(Toma,J.,et al.,2011;Pace,C.S.,et al.,2013)。
當這些細胞被各種抗原,包括超抗原SEB、CMV胜肽pp65,或具有一致性B序列的HIV gag胜肽(HIV Gag基序胜肽)刺激時,對CD3+、CD3+/CD4+相對CD3+/CD8+細胞群體的增殖反應有一些非常有趣的觀察。
如第9B圖所示,關於在治療期之前(W1)、在結束時(W8)或兩個月後(W16)的二群體以超抗原SEB(左圖)或CMV pp65胜肽(右圖)刺激的反應,在CD3或CD3/CD4+細胞都未見差異。
當以HIV Gag基序胜肽刺激來自接受UB-421的患者(在治療期之前(W1)、在結束時(W8)或治療期後兩個月(W16))的PBMC產生非常有趣的觀察(第11圖)。發現顯著增生的CD3+增生反應,進一步分析是因為界於W1和W8的CD3/CD8+群體(P<0.01)。在接受UB-421後,當以 HIV Gag基序胜肽刺激後,於HIV患者的CD3/CD8+群體顯著增加,可提供在這些患者中經改進的HIV特異性CTL反應之重要具臨床意義的指標,其可允許對這些患者中HIV感染T細胞較佳的監控,因此與那些無進展者的患者類似。
9. 結論
發現於無症狀HIV-1感染的受試者以UB-421進行8週治療具有良好的耐受性。此外,分別來自第1(第9A圖左圖)和2(第9A圖右圖)劑量組的平均CD4 T細胞數量在整個為期兩個月的監測中保持穩定。
更重要的是,以UB-421治療導致在所有受試者中顯著的病毒量下降(100%接受治療的受試者以1 log10 copies/mL之最大下降作出反應)。兩種治療方案,每週10mg/kg(第1劑量組)和每兩週25mg/kg(第2劑量組)輸注,顯示於病毒量下降之類似療效。在第1劑量組於ITT群體之平均最大病毒量下降達到2.27±0.60 log10 copies/mL,而在第2劑量組於ITT群體之平均最大病毒量下降達到2.45±0.46 log10 copies/mL。利用UB-421所觀察到的病毒減少療效比迄今所測試的任何其他的小分子抗HIV藥物優越。
從此周密進行之UB-421的多劑量第IIa期試驗所得到的臨床試驗結果證明在治療期期間不具有病毒反彈之作為單一藥物治療的高耐受性、安全性,和於病毒量下降之空前的療效。在這試驗中所獲得的結果是意想不到 的,且與此領域中長期抱持之懷疑(結合CD4功能區塊1的抗-CD4單株抗體是免疫抑制的,因為其對於第二型主要組織相容性複合體所調停之免疫功能的干擾,且此種療法對於HIV疾病之治療並不合適(Jacobson,J.L.,et al.,2009))相矛盾。此結果進一步指出利用UB-421合併使用正交的(orthogonal)HAART及/或其他HIV病毒庫激活劑(例如HDACi)之HIV療法的額外形式可達到HIV感染的功能性治癒。
實施例9. 利用UB-421單一藥物治療的治療形式作為於HIV-1感染成年人之抗反轉錄病毒療法的替代藥物
第12A至12B圖說明利用UB-421單一藥物治療對穩定接受HAART治療的患者的治療形式,以作為抗反轉錄病毒療法的替代藥物。詳細的目的和計畫書於以下內容敘述。
1. 適用的患者群體
藉由穩定的高效抗反轉錄病毒療法(HAART)而具有病毒抑制之對HIV-1為血清反應陽性的受試者有資格進行此種治療。
符合資格的患者在4個月的初期透過IV、IM或SC途徑接受UB-421投予,之後是HAART治療的另一個循環。“HAART-UB-421”交替治療循環可重複多次,直到停用UB-421和HAART治療時不再觀察到病毒反彈為止,從而達成對HIV感染的功能性治癒。
更具體地,如第12A至12B圖所示,這些受試者分別地於為期8週和16週的治療期,以兩個劑量水平(每週10mg/kg或每兩週25mg/kg)之一,接受試驗藥物(UB-421)的多次靜脈輸注。在第一次UB-421輸注的前一天停用HAART治療方案。在UB-421投予之前,依照試驗總主持人所判斷,給予受試者預防用藥(治療前給藥),包含類固醇和抗組織胺藥物,以預防輸注反應。在完成最後一次排程的UB-421給藥後,所有受試者在同一天重啟其原先或其他適當之病毒敏感的抗反轉錄病毒療法。HAART治療方案之使用是由試驗總主持人所判斷。在治療期期間和在治療期結束後的2個月監測來自所有患者的病毒量以及CD4和CD8細胞數量。
2. 納入標準
若受試者滿足以下所有標準則可納入此治療形式:
(1)HIV-1血清反應陽性;
(2)年齡20歲(含)以上;
(3)已接受HAART治療,定義為至少2個核苷類/核苷酸類反轉錄酶抑制劑(NRTIs)加上1個非核苷類反轉錄酶抑制劑(NNRTI)、整合酶抑制劑,或蛋白酶抑制劑,達至少2年;此治療在進入本試驗之前一年內是不間斷的且無藥物更換。
(4)在篩選訪視前1年內具有CD4+ T細胞數量≧500cells/mm3或CD4百分比≧28%的兩個測量值;
(5)在篩選訪視前4週內或於篩選訪視時所提供具有CD4+ T細胞數量≧500cells/mm3
(6)篩選訪視前至少1年之HIV-1血漿RNA保持在低於檢測極限,每年具有至少2個病毒量測定。病毒量在篩選訪視前4週內或於篩選訪視時也是低於檢測極限;在篩選訪視前4週以前的可檢測HIV血漿RNA的單次事件將不排除參與。
3. 排除標準
為了以下任何的理由可將受試者排除在此治療形式之外:(1)需要立即治療的任何感染症(HIV除外);(2)根據美國疾病控制與預防中心(CDC)對HIV感染分類系統按照第B類和第C類條件之任何先前確診或現行的AIDS-界定疾病;(3)體重>80kg;(4)在篩選前12週內任何紀錄的CD4+ T細胞數量<250cells/mm3或CD4+ T細胞百分比≦14%;(5)先前納入於UB-421的第I期或第IIa期試驗,或呈現抗-UB-421抗體的任何病史;(6)在試驗藥物UB-421第一次給藥前12週內對單株抗體的任何先前暴露;(7)任何顯著疾病(除了HIV-1感染)或臨床上顯著的發現,包括精神和行為問題,根據篩選、病史及/或生理學檢查決定,由試驗主持人判定,將受試者排除參加此項試驗; (8)在試驗藥物第一次給藥前8週內的任何疫苗接種;(9)在試驗藥物第一次給藥前12週內的任何免疫調節治療(包含干擾素)、全身化療;(10)少於12個月的預期餘命;(11)在試驗藥物第一次給藥前12週內的任何非法靜脈注射藥物;(12)由於病毒學失敗和先前的非何杰金氏淋巴瘤或卡波西氏肉瘤之不只一次的HAART治療方案改變;(13)任何當前之酒精或非法毒品的使用,由試驗主持人判定,會妨礙受試者去遵從投藥和訪視時程表以及計畫書評估的能力。
4. 藥品成品
以濃度為10mg/mL(100mg於10mL藥瓶)提供藥品成品UB-421(dB4C7 mAb)。受試者利用靜脈輸注接受8次每週劑量為10mg/kg的UB-421,或8次每兩週劑量為25mg/kg的UB-421。
UB-421的適當體積是基於特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調整每個個別劑量的體積,藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100mL,而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200mL。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。
5. 結果
5.1 試驗群體
在台灣的兩個試驗地點篩選總共29個穩定接受HAART治療的HIV患者。其中29個受試者通過了篩選標準並被選擇進行試驗。所有符合資格的29個受試者均為男性。
5.2 安全性和耐受性結果
所有29名受試者在試驗期間經歷至少1件不良事件。所有治療前不良事件均與UB-421無關,且這些事件中無事件被視為SAEs。報導TEAEs中的大多數為輕度。最常見的TEAE是皮疹和蕁麻疹。生理學檢查結果和生命徵象在試驗期期間大多為正常或無臨床意義。
如臨床試驗計劃書所說明,UB-421在8週或16週的整體治療耐受性治療期間具良好耐受性。
5.3 藥效學
5.3.1 CD4 + T和CD8 + T細胞數量
在8週(第1劑量組)和16週(第2劑量組)治療期和8週隨訪期(V12)之後,平均CD4+ T細胞數量從基線(V1)在治療和觀察期後(V12)保持約略相同,沒有顯著差異(第1劑量組P=0.331,而第2劑量組P=0.905)(如第13圖所示);而對第1劑量組(P<0.001)與第2劑量組(P=0.004)而言,平均CD8+ T細胞數量從基線(V1)在治療和觀察期後(V12)顯著地增加(如第14圖所示)。於穩定接受HAART治療的患者在UB-421治療後觀察到CD8+細胞的顯著增加,此現象如實施例7所示在接受UB-421之未接受治療的患者中也可觀察得到,此為接受UB-421治療患者的重要特徵。
5.3.2 以UB-421覆蓋CD4受體
利用螢光結合的UB-421透過流式細胞儀偵測CD4受體覆蓋的程度。從來自第1劑量組和第2劑量組患者所提供之結果,分別如第15A和15B圖所示。對第1劑量組和第2劑量組而言發現,CD4受體的完全覆蓋分別至第63天和112天。以每週10mg/kg或每兩週25mg/kg重複給藥後,UB-421的臨床療效顯示,在整個治療和完全CD4受體覆蓋期間,以及在所有患者(100%)中當患者回復至其原先HAART治療計畫書在治療後期間內(第1劑量組從第63至第112天,而第2劑量組從第112至168天),可使病毒量完全抑制至低於檢測極限。只要在治療期期間PBMC CD4+細胞被完全覆蓋(即dB4C7-Alexa結合百分比接近0)就沒有病毒反彈。
在兩個劑量水平中只要投予UB-421一次後可達成以UB-421完全覆蓋位於PBMC上之CD4受體。此外,於整個治療期期間可保持以UB-421完全覆蓋CD4+ T細胞(第15圖)。在大多數受試者中,如同利用螢光dB4C7 mAb(dB4C7-Alexa)之結合所測定,在最終UB-421輸注的三週內,結合至CD4受體的UB-421減少並回復至基線數值。
評估試驗期間於受試者血清中所呈現之UB-421的濃度,以決定足以達成完全CD4覆蓋和HIV-1病毒抑制之UB-421的血清濃度。基於所獲得的數據,只要UB-421血清濃度維持在高於10μg/mL,則可利用UB-421達成持續的CD4+ T細胞的完全覆蓋和HIV-1病毒抑制。
5.3.3. 調節性T細胞的定量
調節性T細胞(Tregs),以前稱為抑制性T細胞,是調節免疫系統之T細胞的亞族群,可維持對自體抗原的耐受性,並避免自體免疫疾病。Tregs具有免疫抑制性,且通常可抑製或向下調節效應T細胞的誘導與增生。Tregs表現生物標誌CD4、FOXP3和CD25,且被視為衍生自與幼稚CD4細胞(naïve CD4 cells)相同的系譜(en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell)。因此,我們將%Tregs(出於CD3/CD4陽性細胞)納入作為生物標誌以評估UB421的免疫調節能力。下文描述了調節性T細胞的定量的方法。
將收集在EDTA真空採血管的血液於室溫下以裂解緩衝液溶血10分鐘,然後以染色緩衝液洗滌一次。在冰上利用用於表面標誌染色的各種抗體(包括抗-CD4(D2)-FITC、抗-CD25-APC和抗-CD45-PerCP)進行細胞染色30分鐘。然後將細胞洗滌兩次並根據廠商說明書以抗-FoxP3-PE(BD Biosciences)進行細胞染色。然後將細胞洗滌兩次並以固定緩衝液進行固定。於FACSVerse流式細胞儀上獲得樣品。利用FlowJo軟體V10.0.8.(6)進行數據分析。
如第17圖所示,在V1之後於治療期期間(V2至V8)之Treg細胞減少水平(%)平均約為V1的一半(於第1劑量組和第2劑量組分別為44.4-59.6%和52.4-65.3%)。在治療期之後,於V11之Treg細胞%的水平反彈超過基線(於 第1劑量組為120.5%,而第2劑量組為120.1%),且平均於V12回復至基線(於第1劑量組為110.5%,而第2劑量組為110.2%)。
5.3.4 HIV-1原病毒DNA的定量
HIV-1原病毒DNA可能可以提供於接受治療之患者中用以監控HIV感染病毒庫含量的另一生物標誌。因此,如下所述,我們建立用以定量HIV-1原病毒DNA的試驗,對已經在HAART治療後達到穩定化狀態之接受UB-421的患者進行監控。
5.3.5 細胞分離和DNA萃取
將患者血液樣品利用標準Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離出周邊血液單核球細胞(PBMCs)。利用ZR-Duet DNA/RNA Miniprep Plus Kit(Zymo Research)由純化PBMCs萃取細胞DNA,並將其儲存於-80℃直到使用時。在DNA萃取前計算每個樣品的PBMCs數量。
5.3.6 HIV-1原病毒DNA的定量
經修飾的半巢式即時定量聚合酶連鎖反應(semi-nested Real Time PCR)的引子和探針序列以及PCR程序如下所示。簡言之,將純化的DNA和標準品質體直接進行兩輪PCR,其擴增具有HIV-1 gag基序的保留區域。首先在SimpliAmp Thermal Cycler(Applied Biosystems)上進行10個循環反應,於25μl反應體積中,利用AmpliTaq Gold(Applied BioSystem),以0.2μM的每一種引子、GAG1和SK431擴增萃取的DNA。隨後利用第一次PCR產物作 為第二次定量PCR擴增的模板,第二次定量PCR擴增是利用TaqMan偵測化學在即時定量聚合酶連鎖反應機器上進行。在20μl反應體積中利用TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied BioSystem),以0.2μM的每一種引子、GAG1和GAG2對用於第二次PCR之2μl第一次PCR產物進行擴增,並在QuantStudio 5 RealTime PCR System(Applied BioSystem)上利用0.2μM的雙重標記的螢光探針GAG3偵測第二次PCR之產物。利用含有HIV-1 gag衣殼區域的質體產生由5 x 106至4 x 101copies的標準曲線。
利用白蛋白基因的定量PCR測定細胞數量。於20μl反應體積中,利用TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied BioSystem),以0.2μM每一種引子、Alb-F和Alb-R擴增萃取的DNA,並在QuantStudio 5RealTime PCR System(Applied BioSystem)上利用0.2μM雙重標記的螢光探針Alb-P偵測第二次PCR之產物。利用含有白蛋白的質體產生由2.5 x 106至4 x 103copies的標準曲線。
所有樣品進行二重複試驗。結果以每百萬PBMCs的HIV原病毒DNA拷貝數加以表示,其利用由qPCR定量的細胞數進行標準化。引子和探針的序列如下所示:SK431 5’-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT-3’(SEQ ID NO:15),GAG1 5’-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT-3’(SEQ ID NO:16),GAG2 5’-CACTGTGTTTAGCATGGTGTTT-3’(SEQ ID NO:17), GAG3 5’-FAM-ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGA-IBHQ-3’(SEQ ID NO:18),Alb-F 5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3’(SEQ ID NO:19),Alb-R 5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’(SEQ ID NO:20),Alb-P 5’-FAM-GGAGAGATTTGTGTGGGCATGACAGG-IBHQ-3’(SEQ ID NO:21)
5.3.7 利用UB-421消除細胞HIV DNA
在UB-421 HAART取代治療試驗,收集PBMCs供DNA萃取和HIV原病毒DNA定量。在V1(UB-421治療之前)、V8(UB-421治療結束時)和V12(隨訪結束時)測定細胞HIV原病毒DNA含量。分析七個受試者發現,HIV原病毒DNA含量在UB-421治療後顯著地下降,且在患者回復至其原先HAART治療後維持相似程度,直到最後UB-421投予後9週(V12)。此結果指出,UB-421治療可於穩定接受HAART治療的患者中進一步減少整合和未整合的細胞HIV原病毒DNA,此指明由於UB-421治療而導致HIV病毒庫細胞減少的潛力。這代表了與UB-421相關的另一項重要特徵,超出其作為有效的HIV進入抑製劑的重要作用。
5.4 療效結果
將病毒反彈定義為病毒量於超過兩次連續檢測在每毫升血清或血漿中高於400 HIV-1 RNA copies。如第16圖所示,對個別患者而言,除了在HAART治療期間對穩定接受HAART治療的患者以約略相同的頻率偶而偵 測到之少數忽上忽下的走勢之外,在整個治療期或是超出治療期外可維持完全病毒抑制至低於400RNA copies/mL(虛線)。UB-421治療作為HAART的替代藥物達成100%療效。
相較於NIH所實施相似的HAART替代試驗(使用廣泛中和抗-gp120單株抗體VRC01(NIH疫苗研究中心VRC01),當所有患者(9名之中的9名)於第11至86天治療期間無法維持此種抑制(第19-1至19-5圖),利用UB-421治療直到第16週維持100%病毒抑制(第2劑量組)的能力是空前的。當以病毒抑制百分比作為終點參數與迄今所測定的所有單一藥物治療(如在第20圖所示HIV-1藥物)相比較時,這是更令人印象深刻的。
如第20圖所示,市場上HIV藥物的歷史性數據指出只有50%患者可維持病毒抑制狀態直到第4週。VRC01類似抗gp120廣泛中和抗體顯示對HIV-1藥物的顯著改進,其中70%接受此種單一藥物治療的患者可維持病毒抑制直到進入治療的第4週,在此當治療達第8週時約10%患者可維持病毒抑制。作為CCR5進入抑制劑的Pro140可提供超越上述二者的進一步改進,儘管不方便排除約30%進入試驗的患者(因為患者的HIV-1並非使用CCR5作為進入受體),患者於第4週保持98%的病毒抑制,於第8週保持82%的抑制,並於第12週保持75%的抑制。最令人印象深刻的是,UB421作為單一藥物治療已經在此替代試驗中證明,根據測試的臨床試驗計劃書其可維持100%抑制直到 治療的第16週。此空前的臨床試驗結果指出只要CD4細胞被完全覆蓋之病毒進入抑制(100%)的最先進療效;如以在治療期間之%Treg細胞減少,以及在治療期間CD4和CD8細胞(例如於對HIV gag反應的CD8 T細胞增生的增加)於患者中的恢復為例的令人印象深刻的免疫調節效果;以及UB-421治療後HIV DNA含量的減少,表明病毒庫細胞減少。
第21圖總結接受UB-421類似抗-CD4抗體治療後會積極影響HIV-1患者的因素。例如,第21圖顯示利用UB-421類似抗體治療:(1)恢復HIV-抗原特異性T細胞活性,如於實施例8和9所證實,藉由在治療後和治療期間Treg細胞百分比減少、在治療後增加CD8+細胞數量,以及在治療後增加對HIV gag基序胜肽刺激反應的CD8+增生細胞,所有這些都指明於那些HIV感染CD4細胞中調停靶向CTL之功能性HIV特異性T細胞的增強;(2)增強T細胞活化,如增加的TNF-α生成所示,特別是在組織濾泡CD4細胞,在此富含HIV病毒庫T細胞,且此種細胞被緊包成團;(3)藉由提供有效的進入抑制阻斷細胞間和無細胞感染,因此避免CD4陽性細胞新的感染。藉由這三個機制的支持,利用UB-421類似抗體治療導致:(4)於HIVT細胞病毒庫的減少,此可透過測定血液細胞中HIV DNA含量的減少加以證實。如第21圖所說明,這四個機制可導致最終HIV-1感染之持續性病毒緩解,或功能性治癒。
實施例10. 利用UB-421直接活化CD4+細胞(利用TCR訊息激酶LCK的磷酸化和活化加以測定)
調查經由Lck激酶磷酸化(其為TCR近端訊息分子,且已知可直接結合至CD4細胞內功能區塊)之UB-421對CD4+ T細胞活化的影響。在利用UB-421和其他已知T細胞刺激劑(作為陽性控制組(例如OKT3,抗-CD3))刺激後利用西方墨點法和流式細胞儀分析評估Lck磷酸化的程度。
T細胞的訊息傳遞被嚴格調控以確保適當的T細胞活化和抑制。在抗原辨識後,蛋白質磷酸化是用以傳遞和增強T細胞受體訊息(TCR訊息)的主要途徑。一種特異性地表現於T細胞中的激酶,淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck),在早期TCR訊息傳遞和調節中具有重要性。Lck透過與協同受體CD4或CD8結合,而被吸引至TCR訊息複合體,且其磷酸化CD3-zeta(ζ)鏈和zeta鏈相關蛋白激酶70(zeta-chain-associated protein kinase 70,Zap70)的免疫受體酪胺酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAMs),其依次磷酸化位於導致T細胞活化之TCR信號級聯中的其他蛋白質。
Lck屬於Src酪胺酸激酶家族,且僅在淋巴細胞中表現,主要是在NK和T細胞中。已知Src激酶家族的活性是由兩個酪胺酸磷酸化位點控制,一個是增強(Lck的Y394),一個是抑制(Lck的Y505)其激酶活性。Lck的催 化活性是由控制Y505和Y394磷酸化狀態的激酶和磷酸酶所調控。於CD4+ T細胞,Lck以四種不同活性狀態存在:(1)未磷酸化,(2)Y394磷酸化,(3)Y505磷酸化,以及(4)無刺激的雙重磷酸化狀態。Y394是自磷酸化位點,且與蛋白質活化相關。Y505,其位置接近羧基端,可被Csk磷酸化,並可被CD45去磷酸化。在Y505磷酸化期間,Lck的三級結構被折疊,其阻斷位點Y394的磷酸化。當CD45去磷酸化Y505時,位在Lck上的酪胺酸Y394被自磷酸化,以提供激酶活性。
在T細胞活化後,活化的Lck立刻被吸引至免疫突觸並磷酸化下游分子。在TCR結合至抗原之後被活化,並磷酸化下游分子(包括CD3 ζ鏈和ZAP-70),藉由(a)透過磷酸酶PTPN22之Y394的去磷酸化,以及(b)透過激酶Csk之Y505的再磷酸化,Lck被快速地去活化。在刺激後於不同時間點之Y394的去磷酸化指明透過TCR訊息級聯的T細胞活化。
UB-421結合至位於CD4功能區塊1上之CDR2區域附近的構型抗原表位,以阻斷HIV-1結合和進入細胞。透過利用西方墨點法和流式細胞儀分析定量Lck之Y394和Y505的磷酸化,已經研究了在結合至CD4之後UB-421對TCR訊息傳遞級聯和免疫調控的影響。
1 材料與方法
1.1 原代CD4 + T細胞製備
首先利用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)密度 梯度離心分離出來自正常健康捐贈者的周邊血液單核球細胞(PBMCs)。然後從純化的PBMCs中利用CD4 T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)陰性選擇CD4+ T細胞。
1.2 Phospho-Lck的免疫墨點分析
利用RPMI洗滌兩百萬(2 x 106)個Jurkat T細胞或原代人類T細胞兩次。將所有細胞置於1ml預熱的RPMI中以濃度為5μg/ml的單株抗體UB-421或抗-CD3(OKT-3,BioLegend)刺激,然後對“交聯”樣品利用10μg/ml streptavidin(Jackson ImmunoResearch)進行交聯,且在指定的時間間隔於37℃進行培養。藉由加入1ml冷的PBS以停止刺激,並離心以移除上清液。立刻將細胞沉澱物冷凍並儲存於-80℃直到細胞裂解。
將冷凍的細胞沉澱物置於40μL的Triton-X100裂解緩衝液(1%(v/v))(溶於20mM Tris-HCl(pH 7.4)和150mM NaCl,內含10μg/ml抑肽酶(aprotinin)、10μg/ml亮肽素(leupeptin)、1mM PMSF、1mM[正]釩酸鈉、1mM焦磷酸鈉,以及10mM氟化鈉)中進行裂解。將溶胞產物於4℃以14,000rpm離心7分鐘以移除細胞碎片。於SDS-PAGE上將細胞萃取物分成多個部份並轉漬至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。利用抗-phosph-Lck(Y394)(R&D Systems)、抗-phosph-Lck(Y505)(R&D Systems)或抗-Lck(Abcam),之後透過添加適當辣根過氧化物酶結合的二級抗體(Jackson ImmunoResearch),探測轉漬膜。利用ClarityTM化學發光試劑(Bio-Rad)和BioSpectrum 500成像系統(UVP)偵測信號。用於免疫墨點的所有一級抗體是以1:1,000至1:5,000稀釋而加以使用。Lck Y394和Y505的磷酸化程度(條帶的密度)是利用VisionWorkLS 8.2成像系統軟體測定,並以於每個時間點之總Lck的密度加以標準化。
1.3 Phospho-Lck的流式細胞儀分析
在刺激前將分離的CD4+ T細胞置於無血清的AIM-5培養液中隔夜培養。將CD4+ T細胞置於冰上,並且在於冰上培養額外10分鐘之前將5μg/mL生物素化抗-CD3抗體(OKT-3,BioLegend)或UB-421加入細胞中。然後細胞在37℃下於有或無交聯狀況下刺激指定的時間。藉由在37℃下刺激指定的時間前將純化的streptavidin加入生物素化的抗體以達成交聯。然後利用Phosflow固定緩衝液(BD Biosciences)於37℃下作用10分鐘立即地固定細胞,之後再以Phosflow Perm/Wash緩衝液(BD Biosciences)對細胞進行通透化。在冰上利用PE-抗-Src(pY418)和Alexa Fluor 647-抗-Lck(pY505)(BD Biosciences)對細胞進行染色。在BD FACSVerse流式細胞儀(BD Biosciences)上收集所有樣品。在FlowJo軟體V10.0.8(Tree Star Inc.,Ashland,OR)上進行數據分析。
2. 結果
從約80mL正常健康捐贈者的血液獲得CD4+ T細胞。血液樣品有限且各捐贈者的CD4+ T細胞數量不盡相同。因此,並非所有測試條件都可以用相同捐贈者的 CD4+ T細胞進行。在幾個例子中,只在無交聯狀況下評估UB-421對Lck磷酸化的影響。在交聯狀況下測試的陽性控制組是抗-CD3(OKT3),而陰性控制組是未處理(只有培養基)的樣品。
2.1 由UB-421結合於Jurkat T細胞上所引起之Lck的酪胺酸磷酸化
利用UB-421刺激Jurkat T細胞,以評估其誘導Lck磷酸化和下游TCR訊息傳遞事件的能力。使用抗-CD3抗體(已知的T細胞刺激劑)刺激作為陽性控制組。先前的實驗利用流式細胞儀證明100%的Jurkat T細胞在細胞表面表現CD4受體。
如預期的,在交聯狀況下,於抗-CD3-刺激的Jurkat T細胞之phospho-Y394 Lck水平增加且於第一個時間點(5分鐘)達到峰值(第22A圖和第22B圖)。
在利用UB-421刺激的細胞中,於Jurkat細胞中在交聯或無交聯的兩種狀況下Lck都會被磷酸化,且Lck酪胺酸Y394之磷酸化水平增加並於15分鐘後達到峰值(第22C圖和第22D圖)。
2.2 由UB-421結合於原代CD4+ T細胞上所引起之Lck的酪胺酸磷酸化
在原代CD4+ T細胞中研究UB-421結合對CD4和TCR訊息的影響。
利用陰性篩選分離CD4+ T細胞並純化至約90-95%的純度。作為陽性控制組,利用抗-CD3抗體刺激細 胞,且Lck Y394磷酸化水平如預期持續(第23A圖和第23B圖)。
出人意料地,在交聯和無交聯的兩種狀況下於利用UB-421刺激的細胞中,Lck Y394和Y505二者的酪胺酸磷酸化都被增強(第24A-1至24A-2圖和第24B-1至24B-2圖)。相較於來自相同捐贈者(捐贈者1和捐贈者2)在交聯狀況下以UB-421刺激的細胞中Lck Y394磷酸化程度,Lck Y394磷酸化程度在無交聯狀況下以UB-421刺激的細胞中略低(第24A-1至24A-2圖)。在有或無UB-421交聯的狀況下,捐贈者1之磷酸化的Y394-Lck於5分鐘達到峰值,而捐贈者2之磷酸化的Y394-Lck於30分鐘達到峰值(第24A-1至24A-2圖)。
為了進一步評估於無交聯狀況下UB-421的刺激能力,利用西方墨點分析測試來自額外捐贈者(捐贈者4至7)的原代CD4+ T細胞。在測試的大多數捐贈者中觀察到活化(Y394的磷酸化)和抑制(Y505的磷酸化)(第24A-1至24B-2圖和第24C-1至24D-3圖)。磷酸化的程度、達到峰值和持續的時間似乎在個別捐贈者間存在顯著差異(第24C-1至24C-3圖和第24D-1至24D-3圖)。對於無交聯狀況下利用UB-421處理的CD4+ T細胞而言,在捐贈者之間Y394的峰值磷酸化水平範圍介於1至4倍,在刺激後達到峰值的時間範圍介於5至30分鐘(第24C-1至24C-3圖和第24D-1至24D-3圖)。
透過流式細胞儀利用細胞內染色進一步評估UB-421所引起的Lck磷酸化,以在單個細胞基礎上測量Lck Y394和Y505磷酸化。作為陽性控制組,於交聯狀況下利用抗-CD3抗體刺激細胞。在陽性控制組樣品中,Lck磷酸化和去磷酸化迅速發生以控制TCR信號的強度(第25A圖,虛線)。在陰性控制組樣品中(無任何處理),Y394和Y505磷酸化水平隨時間保持不變(第25A圖,實線)。
利用UB-421處理來自兩個不同捐贈者(捐贈者8和9)的原代CD4+ T細胞。在交聯狀況下,發現UB-421可引起Y394和Y505磷酸化,其與利用抗-CD3刺激之陽性控制組細胞類似(第25B-1至25B-2圖,虛線)。在無交聯狀況下,UB-421引起較低的Lck磷酸化(第25B-1至25B-2圖,實線)。在某些例子中,只有觀察到下降的趨勢,原因在於活化發生得太快。此結果證明Y394的峰值磷酸化水平發生得比Y505早。第25B-1至25B-2圖顯示,相較於Y505的峰值磷酸化水平發生在第10分鐘,Y394的峰值磷酸化水平發生在約第3分鐘。結果也顯示,由UB-421交聯所引起的Lck磷酸化達到高原的時間較抗-CD3刺激晚,但相較於抗-CD3具有相似的磷酸化水平。
3. 討論
CD4+ T細胞的TCR信號被嚴格調控以避免不必要和不受控制的免疫反應。作為TCR信號的關鍵激酶,Lck的活性在時間和空間上均受到調控。在此試驗中,證明UB-421(UB-421為抗-CD4抗體)能夠活化CD4+ T細胞 並引發位於Y394(活化形式)和Y505(抑制形式)的Lck磷酸化。透過分析Lck的Y394磷酸化,在UB-421無交聯狀況下在大多數捐贈者的CD4+ T細胞中的Lck被活化;然而,相較於交聯狀況下利用UB-421處理,其磷酸化程度較低。透過流式細胞儀分析發現,在交聯UB-421狀況下,活化性酪胺酸首先被磷酸化,並在第3分鐘達到高原,之後是抑制性酪胺酸Y505磷酸化,其於約第10分鐘達到高原。此表明Lck活性首先被Y394的磷酸化所增強,然後很快地被Y505的抑制性磷酸化所控制。
已經在用以治療慢性HIV感染的幾項臨床試驗中對UB-421進行評估,且顯示UB-421作為單一療法在HIV病毒抑制上具有很大的療效。藉由結合至CD4,UB-421也可以在交聯或無交聯狀況下引發TCR信號級聯激酶Lck的活化。UB-421治療對Lck Y394和Y505磷酸化水平、達到峰值和持續的時間的影響因受試者不同而異。目前的研究結果表明,UB-421可能具有調控免疫反應的潛力。除了透過HIV進入的競爭型抑制之外,透過增強CD4+ T細胞反應,UB-421還可以透過內在的免疫反應控制HIV感染。此對於UB-421所引發之CD4+ T細胞TCR信號和免疫反應的調查與進一步研究可以更好地了解UB-421在控制HIV感染的額外機制。
4. 結論
●目前研究的結果證明,UB-421與CD4的結合於來自 正常健康捐贈者之原代CD4+ T細胞中透過活化性酪胺酸Y394和抑制性酪胺酸Y505而引發或增強Lck的磷酸化。
●在交聯或無交聯狀況下可利用UB-421活化Lck的磷酸化。
●利用UB-421治療後,Lck磷酸化的程度、達到峰值和持續的時間因個別捐贈者不同而異。
●UB-421除了作為有效的HIV進入抑制劑以外還可以作為免疫調節劑。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此,除非另有特別說明,文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知,熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵,在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。
<110> 美國聯合生物醫學公司 王長怡
<120> 以CD4抗體於穩定接受HAART治療的患者進行HIV感染的治療和持續性的病毒緩解
<130> 1004263.216WO(2035-WO)
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<150> US 62/374,752
<151> 2016-08-13
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(5)
<223> 鼠源抗體B4之重鏈的CDR1
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(17)
<223> 鼠源抗體B4之重鏈的CDR2
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(9)
<223> 鼠源抗體B4之重鏈的CDR3
<400> 3
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(15)
<223> 鼠源抗體B4之輕鏈的CDR1
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(7)
<223> 鼠源抗體B4之輕鏈的CDR2
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(9)
<223> 鼠源抗體B4之輕鏈的CDR3
<400> 6
<210> 7
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(448)
<223> 具有與衍生自來自親本鼠源B4抗體重鏈序列之相對應CDRs 1、2和3相同之CDRs 1、2和3的去免疫化人類抗體B4[UB421]的重鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(218)
<223> 具有與衍生自來自親本鼠源B4抗體輕鏈序列之相對應CDRs 1、2和3相同之CDRs 1、2和3的去免疫化人類抗體B4[UB421]的輕鏈
<400> 8
<210> 9
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<220>
<221> 區域
<222> (1)..(448)
<223> 具有M253Y/S255T/T257E取代之去免疫化人類抗體B4[UB421]的重鏈
<400> 9
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<220>
<221> 位點
<222> (253)..(253)
<223> M或Y
<220>
<221> 位點
<222> (255)..(255)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (257)..(257)
<223> T或E
<220>
<221> 位點
<222> (298)..(298)
<223> N或H
<400> 10
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<400> 11
<210> 12
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<220>
<221> 位點
<222> (135)..(135)
<223> M或Y
<220>
<221> 位點
<222> (137)..(137)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (139)..(139)
<223> T或E
<220>
<221> 位點
<222> (180)..(180)
<223> N或H
<400> 12
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<400> 13
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 擬人化抗體
<400> 14
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SK431引子序列
<400> 15
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAG1引子序列
<400> 16
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAG2引子序列
<400> 17
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAG3引子序列
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1)
<223> Fluorescein Amidite(FAM)
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (27)..(27)
<223> Iowa Black Hole Quencher(IBHQ)
<400> 18
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Alb-F引子序列
<400> 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Alb-R引子序列
<400> 20
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Alb-P引子序列
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(1)
<223> Fluorescein Amidite(FAM)
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (26)..(26)
<223> Iowa Black Hole Quencher(IBHQ)
<400> 21
<210> 22
<211> 458
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 位置
<222> (1)..(25)
<223> 訊息胜肽
<220>
<221> 位置
<222> (1)..(396)
<223> 細胞外
<220>
<221> 位置
<222> (1)..(92)
<223> gp120結合區域
<220>
<221> 位置
<222> (1)..(458)
<223> UniProtKB/Swiss-Prot:P01730.1
<220>
<221> 位置
<222> (26)..(125)
<223> 功能區塊1(D1)
<220>
<221> 位置
<222> (126)..(203)
<223> 功能區塊2(D2)
<220>
<221> 位置
<222> (204)..(317)
<223> 功能區塊3(D3)
<220>
<221> 位置
<222> (318)..(374)
<223> 功能區塊4(D4)
<220>
<221> 位置
<222> (397)..(418)
<223> 跨膜區域
<220>
<221> 位置
<222> (419)..(458)
<223> 細胞質區域
<400> 22

Claims (65)

  1. 一種針對CD4分子的抗體,其中該抗體特異性地結合該CD4分子的一細胞外區域,且其中當該抗體結合位於一CD4+細胞之一表面上的該CD4分子時,該抗體:a)競爭型抑制HIV進入該CD4+細胞;b)活化位於HIV感染之一靜默CD4+細胞的潛伏HIV病毒庫;c)減少細胞HIV DNA的量;以及d)提供HIV感染之持續性的病毒緩解且無病毒量反彈。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體競爭型抑制HIV的無細胞和細胞間傳播(transmission)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體在投予一受試者時可減少調節性T細胞的百分比。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體在投予一受試者時可增加CD8+細胞的數量。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體在投予一受試者時可增加對HIV gag基序胜肽刺激反應的CD8+增生細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體在投予一受試者時可增強靶向一HIV感染CD4+細胞的功能性HIV特異性CD8+ CTL細胞。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體可增強CD4+細胞之TNF-alpha的生成。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體以有或無交聯的方式活化一靜默CD4+細胞。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體於一HIV陽性患者中可減少HIV病毒量至每毫升血液低於50copies且無病毒量反彈。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體結合至位於該CD4分子之功能區塊1附近的一區域。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體結合至位於CD4之功能區塊1的CDR2區域附近的一區域。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體包含:一重鏈可變區胺基酸序列包含:SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2,以及SEQ ID NO:3的CDR3;以及一輕鏈可變區胺基酸序列包含:SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2,以及SEQ ID NO:6的CDR3。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體為一單株抗體。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體為一擬人化單株抗體。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體為一擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:11之一胺基酸序列的一重鏈可變區;以及包含SEQ ID NO:13之一胺基酸序列的一輕鏈可變區。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體為一擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:10之一胺基酸序列的一重鏈;以及包含SEQ ID NO:8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體為一擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:9之一胺基酸序列的一重鏈;以及包含SEQ ID NO:8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其中該抗體為一擬人化單株抗體包含:包含SEQ ID NO:7之一胺基酸序列的一重鏈;以及包含SEQ ID NO:8之一胺基酸序列的一輕鏈。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其對位於HPB-ALL細胞上與膜結合的CD4具有介於約3.1 x 10-11M至約8.1 x 10-11M之絕對結合親和力(Kd)。
  20. 如申請專利範圍第1項所述之抗體,其結合至一CD4分子。
  21. 一種包含如申請專利範圍第1項所述之抗體的組成物。
  22. 一種醫藥組成物,包含如申請專利範圍第1項所述之抗體以及一藥學上可接受的載體。
  23. 一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中之如申請專利範圍第1項所述的抗體。
  24. 一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM組胺酸中之如申請專利範圍第1項所述的抗體。
  25. 一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中約1.0mg/mL至約200.0mg/mL之如申請專利範圍第1項所述的抗體。
  26. 一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM組胺酸中約1.0mg/mL至約200.0mg/mL之如申請專利範圍第1項所述的抗體。
  27. 一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸以及0.05%(v/v)聚山梨酯20中約10.0mg/mL之如申請專利範圍第1項所述的抗體。
  28. 一種醫藥組成物,包含溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)、20mM甘胺酸、0.05%(v/v)聚山梨酯20以及10mM組胺酸中約10.0mg/mL之如申請專利範圍第1項所述的抗體。
  29. 一種醫藥組成物,包含如申請專利範圍第12項所述之抗體以及一藥學上可接受的載體。
  30. 一種醫藥組成物,包含如申請專利範圍第16項所述之抗體以及一藥學上可接受的載體。
  31. 一種用以治療暴露於HIV之受試者的方法,包含:投予該受試者如申請專利範圍第1項所述之抗體的一藥理學上有效劑量。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之方法,其中該抗體在暴露於HIV前投予該受試者。
  33. 如申請專利範圍第31項所述之方法,其中該抗體在暴露於HIV後投予該受試者。
  34. 如申請專利範圍第31項所述之方法,其中該抗體在暴露於HIV後48小時內投予。
  35. 如申請專利範圍第31項所述之方法,其中該抗體是以至少約5mg/kg體重之一劑量投予該受試者。
  36. 如申請專利範圍第35項所述之方法,其中該抗體多次投予該受試者。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之方法,其中該抗體是以每週、每兩週或每月之間隔投予該受試者。
  38. 如申請專利範圍第36項所述之方法,更包含投予該受試者一抗病毒藥物之步驟。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之方法,其中該抗病毒藥物為一高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
  40. 如申請專利範圍第39項所述之方法,其中該HAART包含一核苷類似物反轉錄酶抑制劑合併使用一蛋白酶抑制劑或一非核苷類反轉錄酶抑制劑。
  41. 如申請專利範圍第39項所述之方法,其中該抗體與HAART同時投予。
  42. 如申請專利範圍第39項所述之方法,其中在一循環之期間內投予該受試者該抗體和HAART,其中該循環包含:i)在一第一段期間對該受試者投予該抗體,之後為一第二段期間之治療假日;以及ii)持續地於(i)內之該第一段期間和該第二段期間對該受試者投予HAART。
  43. 如申請專利範圍第39項所述之方法,其中在一循環之期間內投予該受試者該抗體和HAART,其中該循環包含:i)以每週、每兩週或每月之一間隔於4個月之一期間對該受試者投予該抗體,之後為兩個月之一治療假日;以及ii)於(i)內之該六個月期間持續地對該受試者投予HAART。
  44. 如申請專利範圍第42項所述之方法,其中該受試者是於二循環之期間治療。
  45. 如申請專利範圍第43項所述之方法,其中該受試者是於二循環之期間治療。
  46. 如申請專利範圍第39項所述之方法,其中該抗體是不同於HAART之一時間投予。
  47. 如申請專利範圍第39項所述之方法,其中在一循環之期間內投予該受試者該抗體和HAART,其中該循環包含: i)在一第一段期間對該受試者投予該抗體,之後為一第二段期間之一治療假日;以及ii)在該第二段期間而非該第一段期間對該受試者投予HAART。
  48. 如申請專利範圍第47項所述之方法,其中該抗體於該第一段期間是以定期間隔投予。
  49. 如申請專利範圍第47項所述之方法,其中該抗體於該第一段期間是以一每週、每兩週或每月之間隔投予。
  50. 一種用以治療HIV感染之一受試者的方法,包含給予該受試者一治療方案,包含:a)如申請專利範圍第1項所述之抗體的一藥理學上有效劑量;以及b)一高效抗反轉錄病毒療法(HAART)。
  51. 如申請專利範圍第50項所述之方法,其中該抗體是以至少約5mg/kg體重之一劑量投予該受試者。
  52. 如申請專利範圍第50項所述之方法,其中在一循環之期間內投予該受試者該抗體和HAART,其中該循環包含:i)在一第一段期間對該受試者投予該抗體,之後為一第二段期間之一治療假日;以及ii)持續地於(i)內之該第一段期間和該第二段期間對該受試者投予HAART。
  53. 如申請專利範圍第50項所述之方法,其中在一循環之期間內投予該受試者該抗體和HAART,其中該循環包含: i)以每週、每兩週或每月之一間隔於4個月之一期間對該受試者投予該抗體,之後為兩個月之一治療假日;以及ii)於(i)內之該六個月期間持續地對該受試者投予HAART。
  54. 如申請專利範圍第52項所述之方法,其中該受試者是在二循環或多個循環之期間治療。
  55. 如申請專利範圍第53項所述之方法,其中該受試者是在二循環或多個循環之期間治療。
  56. 如申請專利範圍第53項所述之方法,其中在一循環之期間內投予該受試者該抗體和HAART,其中該循環包含:i)以每週、每兩週或每月之一間隔於4個月之一期間對該受試者投予該抗體,之後為兩個月之一治療假日;以及ii)於(i)內之該六個月期間持續地對該受試者投予HAART。
  57. 如申請專利範圍第50項所述之方法,其中(a)內之該抗體是於一不同於(b)內之HAART之時間投予。
  58. 如申請專利範圍第50項所述之方法,其中在一循環之期間內投予該受試者(a)內之該抗體和(b)內之HAART,其中該循環包含:i)在一第一段期間對該受試者投予該抗體,之後為一第二段期間之一治療假日;以及 ii)在該第二段期間而非該第一段期間對該受試者投予HAART。
  59. 如申請專利範圍第58項所述之方法,其中該抗體於該第一段期間是以定期間隔投予。
  60. 如申請專利範圍第58項所述之方法,其中該抗體於該第一段期間是以一每週、每兩週或每月之間隔投予。
  61. 一種抑制HIV進入CD4+細胞的方法,包含:將如申請專利範圍第1項所述之抗體暴露於該細胞。
  62. 一種抑制gp120結合CD4+細胞的方法,包含:將如申請專利範圍第1項所述之抗體暴露於該細胞。
  63. 一種活化一靜默CD4+ T細胞的方法,包含:將如申請專利範圍第1項所述之抗體暴露於該細胞。
  64. 一種活化位於靜默T細胞之HIV的潛伏病毒庫的方法,包含:將如申請專利範圍第1項所述之抗體暴露於該細胞。
  65. 一種減少位於HIV感染之細胞樣品的潛伏HIV病毒庫的方法,包含:a)將如申請專利範圍第1項所述之抗體暴露於該細胞樣品;以及b)將HAART暴露於該細胞樣品。
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