JPH06125783A - 組換え抗ｈｉｖ抗体およびその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する中
和活性を有する抗体の可変領域をコードする遺伝子断
片、この遺伝子を用いて発現された組換え抗ＨＩＶ抗体
およびその調製法を提供する。 【構成】 ＨＩＶに対する中和活性を有する抗体のＨ鎖
及びＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子断片の特異的核
酸配列を得、この塩基配列をもとに合成したＤＮＡとヒ
ト免疫グロブリンをコードする遺伝子とを人為的に融合
させることによりＨＩＶに対する中和活性を有するマウ
ス・ヒトキメラ抗体並びにマウス・ヒト改変抗体を得
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）に起因するエイズ（ＡＩＤＳ）の治療および
予防に期待できる新規な組換え抗ＨＩＶ抗体に関する。
さらに詳細には、マウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免
疫グロブリン遺伝子から遺伝子組換え技術を用いて発現
された、ＨＩＶに対して中和活性を有する組換え抗ＨＩ
Ｖ抗体（改変抗体およびキメラ抗体）ならびにその新規
調製方法に関する。さらには、このような有用な組換え
抗体の発現に有効なＨ鎖及びＬ鎖の可変領域をコードす
るＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【発明の背景】後天性免疫不全症候群(acquired immune
deficiency syndrome：AIDS) は、レトロウイルスに属
するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に起因するウイル
ス性疾患である。この疾患は1981年にアメリカで発見さ
れて以来急速に世界中に広がりをみせているが、有効な
ワクチンや治療法はまだ提供されていない。

【０００３】このような状況の中で、輸血によってＨＩ
Ｖ陽性となったサラセミアの患者グループと小児のＡＩ
ＤＳ及びＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）のグループにお
いて、その臨床と中和抗体の関連についての報告がある
［R.Guroffら, J.Immunol.,138, p3731,(1987) ；R. Gu
roff ら, Pediatric Research, inpress］。いずれの
場合でも中和抗体の検出できる症例においては臨床症状
も軽く良好であるが、中和抗体が検出できない症例にお
いては臨床症状が悪化していることが報告されており、
in vivo おける中和抗体の有効性を示唆している。この
ように抗ＨＩＶ中和抗体はin vivo における感染の拡大
防止や感染細胞の排除に役立つ可能性があり、現在臨床
で用いられている抗ウイルス剤等との併用により更に高
い効果が期待される。

【０００４】

【従来技術】上記のような抗ＨＩＶ中和抗体をＡＩＤＳ
の患者から直接採取・調製するやり方もあるが、この方
法は、倫理的な問題や原材料入手、バイオハザードの問
題など数多い困難が予想される。そこで、このような高
力価血清の代替品としてＨＩＶウイルス中和活性を有す
るモノクローナル抗体の使用が考えられる。モノクロー
ナル抗体作製に関する基本的な技術はすでにマウス型モ
ノクローナル抗体において確立されているが、マウス抗
体は副作用（マウスモノクローナル抗体をヒトに使用し
た場合、異種タンパクとしてアナフィラキシーショック
や血清病などの副作用を起こすことが考えられる）等の
点からその臨床応用が難しく、最終的にはヒトモノクロ
ーナル抗体の使用が望ましい。

【０００５】しかしながら、ヒトモノクローナル抗体の
調製においては、目的の特異性を有する抗体を調製する
点において克服する問題が多く、マウス型モノクローナ
ル抗体の調製と比べて現実的には非常に困難を伴う。こ
のような問題を克服すべく、抗体の特異性を特徴づける
可変領域はマウス抗体由来のアミノ酸配列を有し、定常
領域のアミノ酸配列をヒト抗体由来のものにした、遺伝
子組換え技術を応用したキメラモノクローナル抗体の調
製手法が最近報告されている。

【０００６】このキメラモノクローナル抗体は、可変
（Ｖ）領域の原料となるマウスモノクローナル抗体を産
生するマウスハイブリドーマからクローニングしたＶ遺
伝子と、定常（Ｃ）領域の原料となるヒト抗体産生細胞
等のヒト細胞からクローニングしたＣ遺伝子とを結合さ
せたマウス（Ｖ）−ヒト（Ｃ）キメラ抗体遺伝子を動物
細胞あるいは微生物細胞等で発現させ、その培養上清中
に得られるものである。キメラ抗体に関するいくつかの
報告がすでに見受けられ［特開昭60-155132、特開昭61-
47500］、本発明者らも既にキメラ抗体の作製に成功し
ている［特開平2-2352］。さらに、このキメラ抗体の考
え方を一層進めた改変抗体の作製も報告［特開昭62-296
890］されている。

【０００７】免疫グロブリン遺伝子についての解析は、
最近の遺伝子操作技術の急速な発展に伴って急速に進み
つつある。免疫グロブリン遺伝子は抗原との結合部位で
ある可変領域（Ｖ領域）遺伝子と補体や特定の細胞と相
互作用等に関与した生理活性を持つ定常領域（Ｃ領域）
遺伝子により形成されていることがよく知られている。
さらに、Ｖ領域遺伝子は、数あるＶ遺伝子断片群、Ｄ遺
伝子断片群（Ｌ鎖ではまだ見つかっていない）及びＪ遺
伝子断片群の中からそれぞれ１個が選ばれこの順序で並
んで結合することによって形成される。さらに、結合し
た 遺伝子断片（Ｖ領域遺伝子）は体細胞突然変異によ
って細かな修飾を受け変化する。即ち、抗体の特異性は
Ｈ鎖とＬ鎖のＶ領域遺伝子の中の各遺伝子断片の組合せ
と体細胞突然変異によって決定される［利根川進, Natu
re, 307, p575 (1983); 本庶佑,Annual Rev. Immunol.
1, p499 (1983) 参照］。従って、ある特定の抗原に対
しては、特定のＨ鎖ＶＤＪ遺伝子断片と特定のＬ鎖のＶ
Ｊ遺伝子断片の組合せさらには特定の体細胞突然変異が
あると考えられる。しかも、これらの遺伝子断片の組合
せやその核酸塩基あるいはアミノ酸配列を抗原側の構
造、核酸塩基あるいはアミノ酸配列等から類推すること
は非常に困難であり、実際に抗体を産生している細胞か
ら抗体遺伝子あるいは抗体蛋白質を単離しなくては決定
できない。このように、抗体分子の可変領域のアミノ酸
配列は抗原決定基毎に異なり、可変領域そのものは抗原
ごとに全く異なるアミノ酸配列を有する。

【０００８】本発明の対象となる組換え抗ＨＩＶ抗体に
ついては、既に本発明者等が抗ＨＩＶ中和組換え抗体と
して0.5β組換え抗体を発表している［特開平2-2352］
が、該組換え抗体はHTLV-IIIBを特異的に中和すること
はできるが、疫学上多いとされるHTLV-IIIMNを中和する
ことはできなかった。前述のように、組換え抗体の作製
には、目的の抗原と結合能を持つ抗体分子の可変領域の
アミノ酸配列をコードする遺伝子を見いだすことが非常
に重要な要素となっており、本発明の対象となるＨＩ
Ｖ、特にHTLV-IIIMNに対して中和活性を持つ抗体の可変
領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を見いだすこと
が困難であったために、これまでこのHTLV-IIIMNに結合
しこれを実質的に中和する組換え抗体が得られたという
報告はない。

【０００９】

【発明の目的】このような状況において、本発明者らは
ＨＩＶ（HTLV-IIIMN）に対して中和活性を有するモノク
ローナル抗体を産生する細胞（ハイブリドーマ）から、
該抗体の可変領域をコードする遺伝子を分離することに
成功し、さらにこれを用いてマウス−ヒト組換え抗体の
発現を試みた結果、ＨＩＶ（HTLV-IIIMN）に対して中和
活性を有する組換え抗ＨＩＶ抗体の作製に成功し、本発
明を完成するに至った。すなわち本発明は、これまでに
一切報告されていない抗ＨＩＶ中和抗体の可変領域をコ
ードする遺伝子を提供し、これを用いて形質転換細胞内
で発現される組換え抗ＨＩＶ抗体を提供するものであ
り、この新規抗ＨＩＶ組換え抗体からなる副作用の少な
いＡＩＤＳ診断薬・治療薬・予防薬の開発を可能にする
ことを目的とするものである。

【００１０】

【発明の構成および効果】本発明に用いる抗ＨＩＶ（HT
LV-IIIMN）マウスモノクローナル抗体産生細胞は、これ
までに確立されているマウスモノクローナル抗体の作製
技術を用いて作製される。例えば、マウスを種々の適当
な免疫原、例えばＨＩＶ（HTLV-IIIMN）産生細胞から得
られるウイルス粒子、もしくは精製外皮膜糖蛋白質gp12
0、もしくは遺伝子組換え技術を用いて調製される組換
えペプチド、好ましくはgp120のアミノ酸配列第247-370
に対応する組換えペプチド、もしくは該ウイルス蛋白の
アミノ酸配列に基づいて調製される好適な合成ペプチ
ド、好ましくはgp120のアミノ酸配列第303-325に対応す
る合成ペプチド等で免疫し、得られた脾臓細胞をマウス
のミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ
から、精製外皮膜糖蛋白質gp120、もしくは前記組換え
ペプチド、もしくは前記合成ペプチドに反応する細胞を
選択し、該細胞を培養することによって調製することが
できる。更に、このようにして得られた抗ＨＩＶマウス
モノクローナル抗体産生細胞の中からＨＩＶに対して中
和活性を有するモノクローナル抗体を産生している細胞
を選択する。ＨＩＶの場合その特有の性質からこのよう
な中和活性を有するモノクローナル抗体を得ることは容
易なことではないが、そのような細胞株として本発明者
等はＨＩＶ（HTLV-IIIMN）に対して中和活性を有する抗
体を産生するハイブリドーマμ39.1あるいはμ5.5細胞
の確立に成功しており［特願平2-188300］、これらが本
発明に用いる最も好ましい細胞株としてあげられる。

【００１１】本発明の可変領域をコードする遺伝子断片
は、このような抗ＨＩＶ中和モノクローナル抗体産生細
胞より分離され、解析された遺伝子配列である。しかし
ながら前にも述べたように、このような細胞は目的の抗
ＨＩＶ抗体に特異的なＶ領域をコードする遺伝子の他
に、数多いＶ領域構成遺伝子群を有している（例えば、
マウス抗体の特異性を決定するＶＨ鎖のＶ遺伝子群だけ
でも少なくとも100種以上異なる遺伝子を持ち、Ｄ遺伝
子群として１１種以上、Ｊ遺伝子群として４種の遺伝子
を持っている。同様にＶκ鎖のＶ遺伝子群としては約30
0種以上の遺伝子、Ｊ遺伝子群としては４種の遺伝子を
保有している) ため、細胞の持つ染色体遺伝子の中か
ら、目的の抗ＨＩＶ抗体に特異的なＶ領域をコードして
いる遺伝子を分離することが必要である。Ｖ領域遺伝子
は通常の遺伝子操作技術により単離することができる。
例えば、その細胞の染色体ＤＮＡから常法［例えば、T.
Maniatis "Molecular Cloning" Cold Spring Harbor L
ab.(1982)参照]に従ってＶ領域遺伝子をクローニングす
る方法、あるいは、その細胞のmRNAを材料として常法
［例えば、D.M.Glover編集 " DNA cloning Vol.I" IRL
press (1985)］によりｃＤＮＡを合成しＶ領域遺伝子を
クローニングする方法である。いずれの方法も、Ｖ領域
遺伝子クローニングの為のプローブとして、すでに報告
されているマウス免疫グロブリン遺伝子の核酸塩基配列
［例えば、 坂野ら、Nature, 286,p676,(1980); E.E.Max
ら、J. Biol. Chem., 256,p5116,(1981)］を参照して合
成したＤＮＡプローブ等を利用することが出来る。ま
た、ＰＣＲ（ポリメレース連鎖反応）を利用したクロー
ニングも可能である［R. Orlandi, et al., Proc. Nat
l. Acad.Sci. USA, 86, 3833 (1989); W. D. Huse, et
al., Science, 246, 1275 (1989)］。

【００１２】このようにしてクローニングされたＶ領域
遺伝子をキメラ抗体作製法［特開平2-2352］や改変抗体
作製法［特開昭62-296890］のような種々方法により遺
伝子解析を行なった。その結果、抗ＨＩＶ抗体Ｖ領域を
コードする本発明の遺伝子断片は、その特異的な遺伝子
配列として、Ｈ鎖をコードする遺伝子に、 （Ｈ−ａ） (a) Lys-Tyr-Gly-Met-Asn (b) Typ-Lys-Asn-Thr-Asn-Thr-Gly-Glu-Ser-Thr-His-Va
l-Glu-Glu-Phe-Lys-Gly (c) Glu-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Gly-Phe-Ser-Tyr または、 （Ｈ−ｂ） (a) Glu-Tyr-Thr-Met-His (b) Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Th
r-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly (c) Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser のアミノ酸配列をコードする遺伝子をその一部に含み、
またＬ鎖をコードする遺伝子に、 （Ｌ−ａ） (a) Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Gly-Ala-Asp-Val-Ala (b) Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-His-Thr (c) Gln-Gln-Tyr-Ser-Ser-Phe-Pro-Leu-Thr または、 （Ｌ−ｂ） (a) Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Se
r-Tyr-Met-Asn (b) Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser (c) Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列をその一部に有
することを特徴とすることが見い出された。このような
上記のＨ鎖、Ｌ鎖に含まれるそれぞれ３種のアミノ酸配
列は、抗体分子の結合能を決定する重要なアミノ酸配列
と考えられ、このようなアミノ酸配列が、ＨＩＶに対す
る中和活性を有する抗体分子の機能と密接に関連してい
るものと考えられた。すなわち、Kabatらにより報告さ
れている抗体遺伝子の一般的解析［Sequences of Prote
ins of Immunological Interest, 4th. ed. U.S. Depar
tment of Health and Human Services (1987)］の結果
を参照することにより、上記のアミノ酸配列は、本発明
の抗ＨＩＶ抗体の抗体活性を決定する可変領域の相補性
決定領域（CDR1〜CDR3）の配列であることが見いだされ
た。このような抗ＨＩＶ中和活性を有する抗体分子の可
変領域をコードする遺伝子として、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれ
図１、または図３、図２または図４のアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子断片がその好ましい一例として挙げられ
る。また、そのような遺伝子の具体的核酸塩基配列の一
例としては、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれ図１または図３、図２
または図４に示された核酸塩基配列が挙げられる。

【００１３】このように本発明により提供される上記の
核酸配列をもとに、ＨＩＶに対して中和活性を有する組
換え抗体を調製することが可能となる。すなわち、この
ような組換え抗体の可変領域をコードする遺伝子とし
て、その相補性決定領域をコードするＤＮＡ断片とし
て、上記に示したアミノ酸配列をコードするよう合成Ｄ
ＮＡ等をそれぞれ調製し、これをヒト免疫グロブリンを
コードする遺伝子と融合させることにより、目的の組換
え抗ＨＩＶ抗体、すなわち、抗ＨＩＶキメラ抗体または
抗ＨＩＶ改変抗体を調製することが可能となる。このよ
うにして調製される本発明の組換え抗ＨＩＶ抗体は、そ
のＨ鎖可変領域の相補性決定領域として下記の配列（CD
R1〜CDR3）を有することを特徴とする。

【００１４】（Ｈ−Ａ） CDR1：Lys-Tyr-Gly-Met-Asn CDR2：Typ-Lys-Asn-Thr-Asn-Thr-Gly-Glu-Ser-Thr-His-
Val-Glu-Glu-Phe-Lys-Gly CDR3：Glu-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Gly-Phe-Ser-Tyr または （Ｈ−Ｂ） CDR1：Glu-Tyr-Thr-Met-His CDR2：Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-
Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly CDR3：Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser

【００１５】また、Ｌ鎖鎖可変領域の相補性決定領域と
して下記の配列（CDR1〜CDR3）を有することを特徴とす
る。 （Ｌ−Ａ） CDR1：Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Gly-Ala-Asp-Val-Ala CDR2：Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-His-Thr CDR3：Gln-Gln-Tyr-Ser-Ser-Phe-Pro-Leu-Thr または、 （Ｌ−Ｂ） CDR1：Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-
Ser-Tyr-Met-Asn CDR2：Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser CDR3：Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr

【００１６】さらに、本発明者らは、改変抗体を調製す
る際には、これまで報告されているように、上記の相補
性決定領域のみマウス由来のアミノ酸配列に組換えるよ
りも、さらに相補性決定領域に隣接するフレーム（Ｆ
Ｒ）領域の一部についてもマウス由来の配列に組換える
ことで、より本来の抗体活性を維持した組換え抗体が得
られることを見いだした。

【００１７】すなわち、Ｈ鎖可変領域遺伝子として上記
（Ｈ−Ａ）の相補性決定領域配列を利用する際には、可
変領域の相補性決定領域CDR1に隣接するFR1のＣ末側１
個のアミノ酸がスレオニン（Thr）であり、CDR2に隣接
するFR2のＣ末側４個のアミノ酸配列が Lys-Trp-Met-Gl
yであり、CDR2に隣接するFR3のＮ末側５個のアミノ酸配
列が Arg-Val-Thr-Met-Serであり、さらにCDR3に隣接す
るFR3のＣ末側１個のアミノ酸がアルギニン（Arg）であ
るＨ鎖可変領域遺伝子を調製することにより優れた効果
を有する抗ＨＩＶ改変抗体を調製することができる。同
様に、Ｈ鎖可変領域遺伝子として上記（Ｈ−Ｂ）の相補
性決定領域配列を利用する際には、可変領域の相補性決
定領域CDR1に隣接するFR1のＣ末側１個のアミノ酸がス
レオニン（Thr）であり、CDR2に隣接するFR2のＣ末側２
個のアミノ酸配列が Ile-Glyであり、CDR2に隣接するFR
3のＮ末側６個のアミノ酸配列が Lys-Ala-Thr-Met-Thr-
Valであり、さらにCDR3に隣接するFR3のＣ末側１個のア
ミノ酸がスレオニン（Thr）であるであるＨ鎖可変領域
遺伝子を調製することにより優れた効果を有する抗ＨＩ
Ｖ改変抗体を調製することができる。また、Ｌ鎖可変領
域遺伝子として上記（Ｌ−Ａ）の相補性決定領域配列を
利用する際には、可変領域の相補性決定領域CDR2に隣接
するFR2のＣ末側１個のアミノ酸がセリン（Ser）である
Ｌ鎖可変領域遺伝子を調製することが好ましい。

【００１８】このようにして調製される、本発明の抗Ｈ
ＩＶ改変抗体のＨ鎖可変領域をコードする遺伝子の核酸
配列およびアミノ酸配列の好ましい例としては、図９ま
たは図１１に示された配列を挙げることが出来る（図
中、マウス由来のアミノ酸配列の領域を下線にて示
す）。また、一方、本発明の抗ＨＩＶ改変抗体のＬ鎖可
変領域をコードする遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配
列の好ましい例としては、図１０または図１２に示され
た配列を挙げることが出来る（図中、マウス由来のアミ
ノ酸配列の領域を下線にて示す）。

【００１９】一方、本発明に従い、抗ＨＩＶキメラ抗体
を調製する際には、Ｈ鎖可変領域をコードする遺伝子の
核酸配列およびアミノ酸配列として、図１または図３に
示された配列がその好ましい一例として挙げられる。ま
た、Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子の核酸配列および
アミノ酸配列としては、図２または図４に示された配列
がその好ましい一例として挙げられる。

【００２０】一方、抗ＨＩＶ組換え抗体作製に用いられ
るヒト免疫グロブリンＨ鎖遺伝子並びにＬ鎖遺伝子の定
常領域（Ｃ）遺伝子は、例えば ヒト抗体産生細胞から
同様の方法により単離することが出来る。また、Ｃ領域
遺伝子はその遺伝子内で再配列を行わないので特にヒト
Ｃ領域遺伝子を単離するためにヒト抗体産生細胞を使う
必要はない。単離する方法としては、前述のマウスＶ領
域遺伝子の単離の場合と同様にして行なうことができ
る。また、Ｃ領域遺伝子の種類としては、特にγ1 鎖、
κ鎖に限ったものではなく、μ鎖、α鎖、γ2鎖、γ3
鎖、γ4鎖、ε鎖、λ鎖の各鎖の遺伝子でも可能であ
る。しかし、補体活性化能、抗体依存性細胞傷害活性を
期待するならば、γ1鎖が望ましい。

【００２１】抗ＨＩＶ組換え抗体遺伝子は、Ｈ鎖遺伝子
もＬ鎖遺伝子も、基本的に上記２種の遺伝子断片（Ｖ領
域遺伝子とＣ領域遺伝子）を結合させることにより構築
される。例えば、渡辺らによって既に示された方法［渡
辺ら、Cancer Research, 47,p999-1005, (1987) ］やM.
Bruggemann[Waldmann H (ed) Monoclonal AntibodyTher
apy. Prog Allergy. Basel, Karger, 1988, vol 45, pp
91 ]やS. L. Morrison[Advances in Immunology, 44, 6
5, (1989) ] 等の総説に紹介されている方法に準じて行
うことが出来る。また、発現させる宿主によって動物細
胞発現系、大腸菌発現系、酵母細胞発現系などベクター
系が異なるが、いずれの場合でも発現可能である。更
に、ＤＨＦＲ等の遺伝子増幅系を使うことも可能であ
る。

【００２２】このようにして得られる本発明の組換え抗
体は、ＨＩＶに対して中和活性を有していることが確認
され、本発明によりこれまでになかった抗ＨＩＶ組換え
抗体を調製することが可能となった。このような抗ＨＩ
Ｖ組換え抗体は、ＡＩＤＳの臨床において、これまでに
なっかた実質的に有効なＡＩＤＳ治療剤となりうるもの
である。さらに、 本発明により提供される抗ＨＩＶ抗体
可変領域をコードする遺伝子断片は、ＨＩＶに対して中
和活性を有する抗体分子の可変領域の特異的アミノ酸配
列もしくは核酸塩基配列を開示するものであり、今後、
さらに進んだ遺伝子組換え技術を応用して目的の抗体分
子を修飾、または一部置換等することにより、より優れ
た抗ＨＩＶ組換え抗体分子の開発を可能にするものであ
る。

【００２３】次に、実施例に従い、本発明をさらに詳細
に説明するが、これにより本発明が限定されるものでは
ない。

【００２４】

【実施例】(1) 抗ＨＩＶマウスモノクローナル抗体産生細胞の作製 抗ＨＩＶマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマの作製方法は以下に示す通りである。免疫抗原と
して、HTLV-IIIMN株外皮膜糖蛋白質gp120のアミノ酸配
列第303〜325番目に対応する合成ペプチド（SP-1:YNKRK
RIHIGPGRAFYTTKNIIG）及び合成ペプチドをＫＬＨ（キー
ホールリンペットヘモシアニン）と結合させたペプチド
-ＫＬＨコンジュゲート、あるいはHTLV-IIIMN産生細胞
（H9/HTLV-IIIMN）培養上清よりショ糖密度勾配遠心に
より得たウイルス粒子、あるいはH9/HTLV-IIIMN培養液
より得た細胞を１％トリトンX-100にて溶解後ConA-セフ
ァロース4BカラムとＨＩＶ抗体(IgG)-セファロース４Ｂ
カラムにてアフィニティー精製して得たgp120、さらにH
9/HTLV-IIIMN細胞の高分子量ＤＮＡ（genomic ＤＮＡ）
よりHTLV-IIIMN gp120 Ｖ３ドメイン（アミノ酸 247-37
0）をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ法で増幅単離［G.
I.LaRosaら、Science Vol.249 p932 (1990)］し、pUEX2
（アマシャム製）発現ベクター用いて大腸菌で発現させ
たHTLV-IIIMNgp120 Ｖ３ドメイン(アミノ酸247-370)β-
ガラクトシダーゼ融合蛋白、等を組み合わせて使用し
た。これらの免疫原でBALB/cマウスを４回免疫後、脾細
胞を採取し、P3X63Ag8-U1X63マウスミエローマ細胞［AT
CC CRL 1597］とポリエチレングリコール（シグマ社）
を用いて細胞融合を行いクローニングした。得られたク
ローンの培養上清中の抗体の前述の免疫原への結合活性
を酵素抗体法にて測定し、反応が陽性と思われるクロー
ンについて、さらに、ウエスタンブロット法及び間接蛍
光法を用いて確認し、抗ＨＩＶモノクローナル抗体、μ
39.1あるいはμ5.5を産生するハイブリドーマを確立し
た［特願平2-188300、寄託番号；μ39.1（微工研菌寄第
11472号）、μ5.5（微工研条寄第3402号）］。これらの
抗体はSP-1ペプチドに結合し、ＨＩＶ感染細胞と非感染
CD4 陽性細胞間の合胞体形成（syncytium formation）
を抑制する。さらに、これらの抗体とＨＩＶウイルスを
混和し細胞（H9）へ感染させるウイルス中和試験におい
ても中和活性を確認している。以下に述べる本発明の抗
ＨＩＶ組換え抗体のＶ領域遺伝子の調製には、該中和活
性を有するこれらの抗ＨＩＶマウスモノクローナル抗体
を産生する細胞（μ39.1、μ5.5細胞）を使用した。

【００２５】(2) 抗ＨＩＶ抗体マウスＶ領域遺伝子の単
離 マウス免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子の単離につ
いては以下のように行った。μ39.1、μ5.5細胞から常
法［D.M.Glover編集 " DNA cloning Vol.I" IRLpress
(1985)］に従って全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成シス
テム・プラス（アマシャム）を用いて1本鎖cDNAを合成
した。この１本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、Kabatら[Sequence
s of Proteins of Immunological Interest 4th ed., P
ublic Health Service, NIH, Washington DC, 1987]の
分類したＶ領域とＪ領域の核酸塩基配列をもとにして合
成したＤＮＡプライマーを用いてポリメレース連鎖反応
（ＰＣＲ）を行なった。Ｖ領域プライマーとＪ領域プラ
イマーにはそれぞれHindIIIとBamHIサイトが付加されて
いる。ＰＣＲはシータス社のプロトコールに従って行な
った。すなわち 、これらのプライマーはともに100 pmo
l 使い、ＰＣＲの試薬はCETUS 社のキットを使用した。
ＰＣＲの条件は、94℃１分、55℃１分、72℃１分で25サ
イクル行なった。ＰＣＲ後、得られたDNA断片をpUC18
(宝酒造製； 以下本実施例で使用した試薬は特に断りの
ない限り宝酒造製あるいは東洋紡製を使用した)のHincI
Iサイトへサブクローニングした。

【００２６】(3) 抗ＨＩＶ抗体マウスＶ領域遺伝子の核
酸塩基配列 東洋紡社のシークナーゼVer.2キットを用いて、pUC18に
組み込まれたＶ領域遺伝子をシークエンスした。その結
果得られたμ39.1、μ5.5の核酸塩基配列を図１から図
４に示す。また、その核酸塩基配列から得られるアミノ
酸配列についても同様に図１から図４に示す。μ39.1、
μ5.5い ずれの核酸塩基配列もＶ領域遺伝子特有の再配
列を起こしており、しかも発現可能なオー プンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）をとっていた。

【００２７】(4) 抗ＨＩＶキメラ抗体の作製 (2)で単離されたμ39.1、μ5.5 Ｖ領域遺伝子が本当に
抗ＨＩＶ活性を担うＶ領域をコードする遺伝子であるか
どうかを確認するために、マウス−ヒトキメラ抗体が作
製された。キメラ抗体の発現のためにヒトサイトメガロ
ウイルス（HCMV）のエンハンサー、プロモーター［ N.
Whittle, et al., Protein Engineering, 1, 499 (198
7)］を持った発現ベクター HCMV-κ,HCMV-γ1 がそれぞ
れ使われた。 HCMV-κ, はヒトκ鎖定常領域遺伝子を持
ち HCMV-γ1 はヒトγ１鎖定常領域遺伝子を持つ。前述
の(2)で調製されたμ39.1Ｖ領域をHindIIIとBamHI制限
酵素で消化し、ＶＨ、ＶＬ断片をそれぞれ HCMV-γ１、
HCMV-κのHindIII-BamHIサイトに組み込んだ。μ39.1キ
メラ抗体遺伝子発現ベクター（それぞれCHμ39.1、CLμ
39.1）の構造を図５、図６に示す。また、μ5.5 ＶＨ、
ＶＬ領域遺伝子も、μ39.1の場合と同様にして、 HCMV-
γ１、HCMV-κにそれぞれ組み込んだ(それぞれCHμ5.
5、CLμ5.5；図５、図６参照)。

【００２８】(5) 抗ＨＩＶキメラ抗体の発現 上記のように構築したμ39.1あるいはμ5.5キメラ抗体
遺伝子の持つ抗体活性をCOS7細胞[ATCC CRL 1651]を用
いた一時的発現系で検討した。CHμ39.1及びCLμ39.1プ
ラスミドDNAの混合物、あるいはCHμ5.5及びCLμ5.5プ
ラスミドＤＮＡの混合物をBio-Rad社製のElectroporati
on 装置を用いて、Boi-Rad社のプロトコールにしたがっ
てCOS7細胞に導入し、１０％牛胎児血清を含むDMEM培地
（GIBCO社）で培養した。３日後その培養上清を回収
し、抗ヒトIgG あるいはSP-1抗原ペプチドを用いたELIS
A 法によりその培養上清に存在する抗体の活性を測定し
た。その結果図７に示すように、CHμ39.1及びCLμ39.1
プラスミドDNAの混合物、あるいはCHμ5.5及びCLμ5.5
プラスミドDNAの混合物のいずれの発現産物もSP-1ペプ
チドに結合した。従って(2)で単離したμ39.1、μ5.5
Ｖ領域遺伝子は間違いなく抗ＨＩＶ活性を持った抗体の
Ｖ領域をコードしている遺伝子であることが確認され
た。

【００２９】(6) 抗ＨＩＶ改変抗体の作製 クローニングしたμ39.1、μ5.5のＶＨ、ＶＬ領域の中
で、どの領域が抗原結合に関して重要であるかどうかを
調べるために、μ39.1及びμ5.5のCDR（相補性決定）領
域をそれぞれヒトＶ領域へ移植した。方法は、改変抗体
作製方法［特開昭62-296890］にしたがった。μ39.1及
びμ5.5のＶＨ領域のＣＤＲ領域はヒトサブグループＩ
のＦＲ（フレームワーク）領域を持ったＶＨ領域［SG
I：英国MRC Collabrative Center のDr. Bendigより分
与されたもの]へ移植し（図８、図１０）、μ39.1及び
μ5.5のＶＬ領域のＣＤＲ領域はヒトκ鎖のＦＲ領域を
持ったＶＬ領域［ REI： W. Palm and N. Hilscmann Z.
Physiol. Chem., 356, 167 (1975)］に移植した（図
９、図１１）。具体的には、改変抗体はアマシャムのキ
ット(Oligonucleotide-directed in vitoro mutagenesi
s system version 2 code RPN.1523) とPCR[Saiki, R.
G. et al., Science, 239, 487 (1988)]を組み合わせた
アマシャム-ＰＣＲ法により行なった。μ39.1あるいは
μ5.5のＶＨ、ＶＬ領域の移植部位をコードする長鎖ヌ
クレオチドを、ＳＧＩあるいはＲＥＩのＶ領域遺伝子を
組み込んだM13DNAにアニーリングさせた後にdCTPαS を
含む溶液中でＤＮＡの伸長・結合を行い、NciIで鋳型M1
3DNAを切断、Exonuclease IIIによる鋳型ＤＮＡの消化
を行なって突然変異したM13DNAのみのストランドを得た
（ここまではアマシャムのキットのプロトコールにした
がって行なった）。さらに、Exonuclease III消化産物
を鋳型にユニバーサルプライマー（UP:M13mp18 の5'側
に相補的な配列を持つ）とリバースプライマー（RSP:M1
3mp18の3'側と同じ配列を持つ）を用いてＰＣＲを行な
った。これらのプライマーはともに20 pmol 使い、ＰＣ
Ｒの試薬はCETUS 社のものを使用した。ＰＣＲの条件
は、94℃１分、55℃１分、72℃１分で25サイクル行なっ
た。ＰＣＲ終了後、産物をBamHI/HindIII で消化しpUC1
8 の BamHI-HindIIIサイトに組み込み、DH5 α(BRL社)
に形質転換し、１次スクリーニングとして、突然変異に
使用したＣＤＲプライマーを用いてアマシャムキットの
プロトコールにしたがってコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行ない、ＣＤＲの突然変異に成功しているクロー
ンを選んだ。さらに、２次スクリーニングとして、１次
スクリーニングで得られたクローンよりプラスミドを調
製しシークナーゼキット（東洋紡）を用いてシークエン
スを行ない、正確にＣＤＲ移植が出来ていることを確認
した。このようにして改変されたμ39.1、μ5.5のＶ領
域（それぞれRHμ39.1 、RLμ39.1、RHμ5.5、RLμ5.
5：図８〜図１１参照）を得た。これらの改変Ｖ領域断
片 を(4)のキメラ抗体の作製と同様にしてHindIIIとBam
HI制限酵素で消化し、ＶＨ、ＶＬ断片をそれぞれ HCMV-
γ１、HCMV-κのHindIII-BamHI サイトに組み込んだ。
このようにしてμ39.1改変抗体遺伝子発現ベクター(そ
れぞれRHμ39.1 、RLμ39.1)、及びμ5.5改変抗体遺伝
子発現ベクター(それぞれRHμ5.5、RLμ5.5)が調製され
た。

【００３０】(7) 抗ＨＩＶ改変抗体の発現 この改変μ39.1、μ5.5抗体遺伝子によって得られる抗
体活性を前述のCOS7細胞における一時的発現系で検討し
た。(5)の場合と同様にして遺伝子導入細胞の培養上清
を回収、抗ヒトIgG あるいはSP-1ペプチドを用いたELIS
A 法によりその培養上清に存在する抗体の活性を測定し
た。その結果図７に示すように、RHμ39.1及びRLμ39.1
プラスミドDNAの混合物、あるいはRHμ5.5及びRLμ5.5
プラスミドDNAの混合物の発現産物のいずれもがSP-1 ペ
プチドに結合した。従って図９〜図１２で示されたμ3
9.1、μ5.5のアミノ酸配列の中で移植ＣＤＲ領域は抗Ｈ
ＩＶ活性を担う重要な領域であることが確認された。こ
の結果から、これらの領域をコードする遺伝子は組換え
抗ＨＩＶ抗体を作製するにあたり、極めて有用な遺伝子
であることが確認された。

【００３１】配列番号：１ 配列の長さ：３５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：マウス 配列 CAG ATC CAG ATG GTG CAG TCT GGA CCT GAG TTG AAG AAG CCT GGA GAG 48 Gln Ile Gln Met Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA AAA TAT 96 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTG AAA CAG ACT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG 144 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 GGC TGG AAA AAC ACC AAT ACT GGA GAG TCA ACA CAT GTT GAA GAG TTC 192 Gly Trp Lys Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Thr His Val Glu Glu Phe 50 55 60 AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGT ACT GCC TAT 240 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 TTG CAG ATC AAC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT 288 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 GCA AGA GAA TAT GAT TAC GAC GGG GGC TTT TCT TAC TGG GGC CAA GGG 336 Ala Arg Glu Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115

【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：３２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：マウス 配列 GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG GCC AGT CAG GAT GTG GGT GCT GAT 96 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Asp 20 25 30 GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA CAA TCT CCT AAA CAA CTG ATT 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Gln Leu Ile 35 40 45 TCC TGG GCA TCC ACC CGG CAC ACT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC 192 Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATT ACC AAT GTG CAG TCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 GAA GAC TTG GCA GAT TAT TTC TGT CAG CAA TAT AGC AGC TTT CCT CTC 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu 85 90 95 ACG TTC GGT ACT GGG ACC AAG TTG GAG CTG AGA 321 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105

【００３３】配列番号：３ 配列の長さ：３５４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：マウス 配列 GAG GTC CAG CTG CAA CAG TCT GGG CCT GAC CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG ACT TCT GGA TAC ACA TTC ACT GAA TAC 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 ACC ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AGG AGC CTT GAG TGG ATT 144 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 GGA GGT ATT AAT CCT AAC AAT GGT GAT ACT AGC TAC ACC CAG AAG TTC 192 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60 AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTA GAC AAG TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAG GAT TCT GCA GTC TAT TAC TGT 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCA ACA CCC TAC TAT GCC TAT GCT ATT GAC TCC TGG GGT CAA GGA ACC 336 Ala Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr Ala Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 TCA GTC ACC GTC TCC TCA 354 Ser Val Thr Val Ser Ser 115

【００３４】配列番号：４ 配列の長さ：３３３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：マウス 配列 GAC ATT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT GGG ATC CCA GCC 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 CCT GTG GAG GAG GAG GAT GGT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT 288 Pro Val Glu Glu Glu Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 GAG GAT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA 333 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

【００３５】配列番号：５ 配列の長さ：３５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（合成核酸） 配列の特徴 起源 生物名：マウスおよびヒト 配列 CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC GAA GTG AAG AAA CCC GGT GCT 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 TCC GTG AAG GTG AGC TGT AAA GCT AGC GGT TAT ACC TTC ACA AAA TAT 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30 GGA ATG AAC TGG GTT AGA CAG GCC CCA GGC CAA GGG CTC AAG TGG ATG 144 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 GGC TGG AAA AAC ACC AAT ACT GGA GAG TCA ACA CAT GTT GAG GAG TTT 192 Gly Trp Lys Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Thr His Val Glu Glu Phe 50 55 60 AAG GGC AGG GTT ACC ATG TCC TTG GAC ACC TCT ACA AAC ACC GCC TAC 240 Lys Gly Arg Val Thr Met Ser Leu Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG GAC ACT GCA GTT TAC TAC TGC 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCC AGA GAA TAT GAT TAC GAC GGG GGC TTC TCC TAT TGG GGA CAG GGT 336 Ala Arg Glu Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 ACC CTT GTC ACC GTC AGT TCA 357 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

【００３６】配列番号：６ 配列の長さ：３２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（合成核酸） 配列の特徴 起源 生物名：マウスおよびヒト 配列 GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAA GCC AGC CAG GAT GTG GGT GCT GAT 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Asp 20 25 30 GTA GCT TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC 144 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 TCC TGG GCA TCC ACC CGG CAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT 192 Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 GAG GAC ATC GCC ACA TAC TAC TGC CAA CAA TAT AGC AGC TTT CCA CTC 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu 85 90 95 ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

【００３７】配列番号：７ 配列の長さ：３５４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（合成核酸） 配列の特徴 起源 生物名：マウスおよびヒト 配列 CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC GAA GTG AAG AAA CCC GGT GCT 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 TCC GTG AAG GTG AGC TGT AAA GCT AGC GGT TAT ACC TTC ACT GAA TAC 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 ACC ATG CAT TGG GTT AGA CAG GCC CCA GGC CAA GGG CTC GAG TGG ATT 144 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 GGC GGT ATT AAC CCT AAC AAT GGC GAT ACA AGC TAT ACC CAG AAG TTT 192 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe 50 55 60 AAG GGC AAG GCT ACC ATG ACC GTA GAC ACC TCT ACA AAC ACC GCC TAC 240 Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG GAC ACT GCA GTT TAC TAC TGC 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCC ACA CCC TAC TAC GCC TAC GCT ATT GAC TCC TGG GGA CAG GGT ACC 336 Ala Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr Ala Ile Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 CTT GTC ACC GTC AGT TCA 354 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

【００３８】配列番号：８ 配列の長さ：３３３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸（合成核酸） 配列の特徴 起源 生物名：マウスおよびヒト 配列 GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA 144 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 AAG CTG CTG ATC TAC GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT GGT GTG CCA AGC 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 65 70 75 80 AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAA AGT AAT 288 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 GAG GAC CCA TGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 333 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例(3)で示した抗ＨＩＶ中和抗体μ39.1
のＨ鎖可変領域をコードする本発明のＤＮＡ断片の核酸
配列およびアミノ酸配列を示す。

【図２】 実施例(3)で示した抗ＨＩＶ中和抗体μ39.1
のＬ鎖可変領域をコードする本発明のＤＮＡ断片の核酸
配列およびアミノ酸配列を示す。

【図３】 実施例(3)で示した抗ＨＩＶ中和抗体μ5.5の
Ｈ鎖可変領域をコードする本発明のＤＮＡ断片の核酸配
列およびアミノ酸配列を示す。

【図４】 実施例(3)で示した抗ＨＩＶ中和抗体μ5.5の
Ｌ鎖可変領域をコードする本発明のＤＮＡ断片の核酸配
列およびアミノ酸配列を示す。

【図５】 実施例(4)で構築した抗ＨＩＶキメラ抗体Ｈ
鎖発現プラスミドＣＨμ39.1およびＣＨμ5.5の構造を
示す。

【図６】 実施例(4)で構築した抗ＨＩＶキメラ抗体Ｌ
鎖発現プラスミドＣＬμ39.1およびＣＬμ5.5の構造を
示す。

【図７】 実施例(5)で測定した抗ＨＩＶキメラ抗体μ3
9.1および実施例(7)で測定した抗ＨＩＶ改変抗体μ39.1
の抗ＨＩＶ活性を示す。

【図８】 実施例(5)で測定した抗ＨＩＶキメラ抗体μ
5.5および実施例(7)で測定した抗ＨＩＶ改変抗体μ5.5
の抗ＨＩＶ活性を示す。

【図９】 実施例(6)で調製した抗ＨＩＶ改変抗体μ39.
1Ｈ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片の核酸配列お
よびアミノ酸配列を示す（下線部分の配列がマウス抗体
由来のアミノ酸配列を示す）。

【図１０】 実施例(6)で調製した抗ＨＩＶ改変抗体μ3
9.1Ｌ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片の核酸配列
およびアミノ酸配列を示す（下線部分の配列がマウス抗
体由来のアミノ酸配列を示す）。

【図１１】 実施例(6)で調製した抗ＨＩＶ改変抗体μ
5.5Ｈ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片の核酸配列
およびアミノ酸配列を示す（下線部分の配列がマウス抗
体由来のアミノ酸配列を示す）。

【図１２】 実施例(6)で調製した抗ＨＩＶ改変抗体μ
5.5Ｌ鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片の核酸配列
およびアミノ酸配列を示す（下線部分の配列がマウス抗
体由来のアミノ酸配列を示す）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 長富 潔 熊本県熊本市竜田町上立田1687−５パナハ イツ102号 (72)発明者 時吉 幸男 熊本県熊本市若葉３丁目14−19

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マウス抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗
   体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体Ｈ鎖で
   あって、可変領域の相補性決定領域（CDR1〜CDR3）のア
   ミノ酸配列が下記の配列であることを特徴とし、ヒト免
   疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する中和活性を有する組
   換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖。 CDR1：Lys-Tyr-Gly-Met-Asn CDR2：Typ-Lys-Asn-Thr-Asn-Thr-Gly-Glu-Ser-Thr-His-
   Val-Glu-Glu-Phe-Lys-Gly CDR3：Glu-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Gly-Phe-Ser-Tyr
2. 【請求項２】 可変領域の相補性決定領域CDR1に隣接す
   るFR1のＣ末側１個のアミノ酸がスレオニン（Thr）であ
   り、CDR2に隣接するFR2のＣ末側４個のアミノ酸配列が
   Lys-Trp-Met-Glyであり、CDR2に隣接するFR3のＮ末側５
   個のアミノ酸配列が Arg-Val-Thr-Met-Serであり、さら
   にCDR3に隣接するFR3のＣ末側１個のアミノ酸がアルギ
   ニン（Arg）である請求項１の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ
   鎖。
3. 【請求項３】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖が改変抗体で
   あって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：配列番
   号５に記載のアミノ酸順位１から１１９のアミノ酸配列
   である請求項１の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖。
4. 【請求項４】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖がキメラ抗体
   であって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：」配
   列番号１に記載のアミノ酸順位１から１１９のアミノ酸
   配列である請求項１の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖。
5. 【請求項５】 マウス抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗
   体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体Ｌ鎖で
   あって、可変領域の相補性決定領域（CDR1〜CDR3）のア
   ミノ酸配列が下記の配列であることを特徴とし、ヒト免
   疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する中和活性を有する組
   換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖。 CDR1：Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Gly-Ala-Asp-Val-Ala CDR2：Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-His-Thr CDR3：Gln-Gln-Tyr-Ser-Ser-Phe-Pro-Leu-Thr
6. 【請求項６】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖が改変抗体で
   あって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：配列番
   号６に記載のアミノ酸順位１から１０７のアミノ酸配列
   である請求項５の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖。
7. 【請求項７】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖がキメラ抗体
   であって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：配列
   番号２に記載のアミノ酸順位１から１０７のアミノ酸配
   列である請求項５の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖。
8. 【請求項８】 前記請求項１の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖
   と前記請求項５の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖とからなる組
   換え抗ＨＩＶ抗体。
9. 【請求項９】 マウス抗体由来のアミノ酸配列とヒト抗
   体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体Ｈ鎖で
   あって、可変領域の相補性決定領域（CDR1〜CDR3）のア
   ミノ酸配列が下記の配列であることを特徴とし、ヒト免
   疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する中和活性を有する組
   換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖。 CDR1：Glu-Tyr-Thr-Met-His CDR2：Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-
   Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly CDR3：Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser
10. 【請求項１０】 可変領域の相補性決定領域CDR1に隣接
    するFR1のＣ末側１個のアミノ酸がスレオニン（Thr）で
    あり、CDR2に隣接するFR2のＣ末側２個のアミノ酸配列
    が Ile-Glyであり、CDR2に隣接するFR3のＮ末側６個の
    アミノ酸配列が Lys-Ala-Thr-Met-Thr-Valであり、さら
    にCDR3に隣接するFR3のＣ末側１個のアミノ酸がスレオ
    ニン（Thr）である請求項９の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ
    鎖。
11. 【請求項１１】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖が改変抗体
    であって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：配列
    番号７に記載のアミノ酸順位１から１１８のアミノ酸配
    列である請求項９の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖。
12. 【請求項１２】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖がキメラ抗
    体であって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：配
    列番号３に記載のアミノ酸順位１から１１８のアミノ酸
    配列である請求項９の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ鎖。
13. 【請求項１３】 マウス抗体由来のアミノ酸配列とヒト
    抗体由来のアミノ酸配列からなる遺伝子組換え抗体Ｌ鎖
    であって、可変領域の相補性決定領域（CDR1〜CDR3）の
    アミノ酸配列が下記の配列であることを特徴とし、ヒト
    免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する中和活性を有する
    組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖。 CDR1：Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-
    Ser-Tyr-Met-Asn CDR2：Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser CDR3：Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr
14. 【請求項１４】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖が改変抗体
    であって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：配列
    番号８に記載のアミノ酸順位１から１１１のアミノ酸配
    列である請求項１３の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖。
15. 【請求項１５】 該組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖がキメラ抗
    体であって、可変領域の全アミノ酸配列が、配列表：配
    列番号４に記載のアミノ酸順位１から１１１のアミノ酸
    配列である請求項１３の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖。
16. 【請求項１６】 前記請求項９の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｈ
    鎖と前記請求項１３の組換え抗ＨＩＶ抗体Ｌ鎖とからな
    る組換え抗ＨＩＶ抗体。
17. 【請求項１７】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対
    する中和活性を有する抗体のＨ鎖可変領域もしくはその
    一部をコードするＤＮＡ断片であって、その核酸配列
    が、配列表：配列番号１に記載の核酸順位１から３５７
    の核酸配列またはその一部の核酸配列であるＤＮＡ断
    片。
18. 【請求項１８】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対
    する中和活性を有する抗体のＬ鎖可変領域もしくはその
    一部をコードするＤＮＡ断片であって、その核酸配列
    が、配列表：配列番号２に記載の核酸順位１から３２１
    の核酸配列またはその一部の核酸配列であるＤＮＡ断
    片。
19. 【請求項１９】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対
    する中和活性を有する抗体のＨ鎖可変領域もしくはその
    一部をコードするＤＮＡ断片であって、その核酸配列
    が、配列表：配列番号３に記載の核酸順位１から３５４
    の核酸配列またはその一部の核酸配列であるＤＮＡ断
    片。
20. 【請求項２０】 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対
    する中和活性を有する抗体のＬ鎖可変領域もしくはその
    一部をコードするＤＮＡ断片であって、その核酸配列
    が、配列表：配列番号４に記載の核酸順位１から３３３
    の核酸配列またはその一部の核酸配列であるＤＮＡ断
    片。
21. 【請求項２１】 請求項１７のＤＮＡ断片と請求項１８
    のＤＮＡ断片を用い、さらにヒト免疫グロブリンをコー
    ドするＤＮＡ断片を用いて、少なくとも相補性決定領域
    がマウス抗体由来のアミノ酸配列である組換え抗体を発
    現可能な発現ベクターを構築し、これを動物細胞内で発
    現させ、該抗体を回収することを特徴とする組換え抗Ｈ
    ＩＶ抗体の調製方法。
22. 【請求項２２】 請求項１９のＤＮＡ断片と請求項２０
    のＤＮＡ断片を用い、さらにヒト免疫グロブリンをコー
    ドするＤＮＡ断片を用いて、少なくとも相補性決定領域
    がマウス抗体由来のアミノ酸配列である組換え抗体を発
    現可能な発現ベクターを構築し、これを動物細胞内で発
    現させ、該抗体を回収することを特徴とする組換え抗Ｈ
    ＩＶ抗体の調製方法。