KR100304333B1 - 재조합의사람화된항-사람면역결핍바이러스항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HIV gp120과 특이적으로 반응하며 역전사 효소, p24 및 합포체 형성 검정에 의해 밝혀지는 바와 같이 배양물중 생 HIV 균주 MN, 및 H9 세포의 감염을 증화시키는 능력을 지닌, 쥐의 mAb NM-01(PCT/US92/07111)로 부터 기원한 사람 모노클로날 항체를 제공한다. 이들 항체는 상술한 범주에 의해 모 쥐의 항체와 같이 또는 이보다 더욱 효과적임이 밝혀졌다.
Description
[발명의 명칭]
재조합의 사람화된 항-사람 면역결핍 바이러스 항체
[발명의 영역]
본 발명은 일반적으로 분자생물학 분야 및 특히 사람화된 항체 분야에 관한 것이다.
[발명의 배경]
본 출원은 사람 면역 결핍 바이러스(HIV-1) 감염의 예방 및 치료시 유용한 물질 및 방법 및 특히 HIV-1에 감염되기 쉬운 동물 또는 이에 감염된 동물, 특히 사람의 수동 면역화에 유용한 모노클로날 항체를 기술하고 있는 1992 년 8 월 24일 에 출원된 국제 특허원 제PCT/US92/07111호에 관한 것이다. 상기 국제 출원은 HIV-1 감염 및 수동 면역화에 의한 이의 예방학적 또는 치료학적 방법에 대한 배경을 제공하며, 이의 주요 요지는 본원에서 인용될 것이다.
생체내에서 HIV-1의 감염 방법은 문헌[참조: McCune Cell, 64 pp. 351-363(1991)]에 보고되어 있다. HIV-1은 CD4 수용체를 발현하는 세포 계통을 감염시킨다. 이들 세포의 대부분은 휴지기 상태이며 특이한 시그날에 반응할때만 분열하므로, HIV-1 감염은 바이러스 입자가 생성되어 감염이 확산될 때 CD4+세포의 복제를 유발시킬 수 있다. HIV-1에 감염된 동물의 면역 반응을 자극하는 것은 적절하지 못하므로, HIV-1의 감염을 예방 또는 치료하는 최선의 방법은 수동 면역화에 의한 방법이다. 이것은 환자에게 항 HIV-1 항체를 투여하는 것을 포함하며, 아마도 이 항체 제제는 비면역원성인 것이 바람직할 것이다. 이러한 치료는 이미 수행되어 왔다. 진행된 후천성 면역결핍증(AIDS), HIV-1 감염과 관련된 진행성 면역계 손상의 증상으로 고통받고 있는 사람 환자에게는 HIV-1에 대한 항체를 함유하는 혈장이 제공되며, 다양한 질병 파라메터의 일시적인 감소를 나타낸다[참조: Jackson et al., Lancet, 2. pp. 647-652, 1988]. 또한, HIV-1에 노출되기 전에 침팬치에 대해 HIV-1 특이적인 항체를 투여하면 동물은 바이러스 감염의 징후를 나타내지 않는다[참조: Emini et al., Nature. 355, pp, 728-730, 1992].
HIV-1의 주요 외부 외피 당단백질인, gp120은 세포성 CD4 수용체에 결합하여 바이러스의 내재화를 촉진시킨다. gp120의 몇몇 에피토프는 선행 출원[PCT/US82/07111]에서 언급한 바와 같이 gp120의 “V3 루프”에 국재화되는 소위 “기본적인 중화 결정인자”를 지닌 중화 항체의 개발과 연관되어 있다. V3 루프는 도메인을 플랭킹(flanking)하는 시스테인 잔기사이에 디설파이드 결합에 의해 형성된 초가변성 도메인으로 이루어져 있다.
PCT 공개 특허원 제 PCT/US92/07111호는 비록 어느것도 생 HIV-1의 다수 균주를 중화시킴이 입증되어 있지 않지만 분리되거나 타입 특이적인 V3 루프와 반응성인 항체 및 광범위한 중화 항체로서의 후보물질의 예를 예시하고 있다. 이들 항체가 나타내는 반응성의 방식은 V3 루프의 일차 서열의 배열 및 구조와 관련되어 있는 것 같다. 상술한 출원은 또한 이와 같은 항체의 잠재적인 부적합성을 강조하고 있다: 즉, CD4 는 바이러스 감염성에 관여하는 유일한 세포 수용체가 아닐 수 있으며[참조 : Cheng-Mayer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 3526-3530, 1987]. 항체/HIV-1 복합체는 예를 들면, 수용체-매개된 엔도사이토시스(endocytosis)에 의한 단핵구의 감염을 촉진시킴으로써, 바이러스 복제를 증진시킬 수 있다[참조: Takeda et al., Science, 242, pp. 580-583, 1988].
선행의 연구에서는 특정의 동물 바이러스가 항체-비의존적 메카니즘을 통해 보체, 특히 Clq에 의해 불활성화됨을 밝혔다[참조: Weiss, in Molecular Biology of Tumour Viruses, RNA Tumour Viruses, Weiss et al., Eds., Cold Spring harbor Laboratory, New York, pp. 1219-1220, 1982].
반면, 다른 문헌[참조: Banapour et al., Virology, 252 pp. 268-271(1986)]에서는 비가열된 혈청 제제가 HIV-1의 밀도 또는 말초 혈액 단핵 세포를 감염시키는 자체의 능력에 효과가 없는 것으로 기술하고 있으며, 또 다른 문헌[참조: Spear et al., J. Virol., 64, pp. 5869-5873(1990)]에서는 보체 및 HIV-1 혈청-양성 환자로부터의 혼주된 혈청의 배합물로 처리된 HIV-1이 감소된 감염성을 나타낸다고 보고하고 있다.
즉, 상술한 발명[PCT/US92/07111]의 배경은 HIV-1 균주와 특이적으로 면역반응하며, 바람직하게는 다수의 HIV-균주를 중화시키는 신규한 모노클로날 항체 물질에 대한 필요성을 밝혀내는 것이다. 감염된 및 비-감염된 환자의 수동 면역화에 사용하기 위한 후보물질로서, 이들 제제는 HIV-1 입자의 보체-의존적 바이러스분해 및 HIV-1 감염된 세포의 항체-의존적 세소분해를 이상적으로 중재할 수 있다.
상술한 발명[PCT/US92/07111]은 생 HIV-1 균주 MN 및 IIIB에 의해 배양중 H9 세포의 감염을 중화시키며 HIV-1 입자의 보체-의존적 바이러스분해를 중재하고/하거나 HIV-1 감염된 세포의 항체-의존적인 세포의 세포독성을 중재하는 능력으로 특징화되는, 아미노산 서열 GPGR을 포함하는, HIV-1 gp120의 일부분, 즉 gp160의 전구체와 반응성인 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 모노클로날 항체는 HIV-1에 감염되었거나 감염되기 쉬운 동물, 특히 사람에 있어서 항-HIV-1 치료에 사용하기에 적합한 것으로 제안된다. 상기 발명의 항체의 유도체로서 제조될 수 있는, 키메릭 항체, 사람화된 항체, 항체 단편 또는 이중특이적 항체의 유사한 용도 및 다른 면역제 및/또는 치료제와 배합된 상기 발명의 생성물의 용도가 상기 발명내에 포함된다.
본 발명은 적합한 숙주를 생 HIV-1으로 면역화시킴으로써, gp120이 자체의 천연 구조를 나타내는 모노클로날 항체의 생성을 기술하고 있다. 본원에는 하이브리도마 세포주 HB 10726에 의해 생성된 쥐의 모노클로날 항체 NM-01이 예시되어 있다. 시험관내 검정에서 NM-01의 효능, gp120 V3 루프의 GPGR 서열에 대한 NM-01의 에피토프에 대한 맵핑 및 NM-01 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열의 결정이 기술되어 있다.
사람 항체는 사람의 HIV-1 감염의 예방 및 치료시 이종 항체보다 더욱 적합한 것으로 기대된다. 이것은 사람 항체가 예를 들면, 쥐의 대응물보다 덜 면역원성이기 때문이며[참조: Bruggermann et al., J Exp Med, 170, pp. 2153-2157, 1989], 관련된 아이소타입에 따라서, HIV-1 감염된 세포의 보체-의존적 바이러스분해 및 항체-의존적 세포의 세포독성의 유발에 더욱 효과적일 수 있다[참조: Winter and Milstein Nature, 349, 293-299, 1991].
사람 항체의 장점을 보장하면서, 상이한 종에서 발생된 항체의 항원-결합 특성을 사용하기 위해서, 연구자들은 사람 주형에 항원-결합 루프를 전이시키는 사람화 기술을 사용하였다[참조: Riechmann et al., Nature, 332, pp. 323-327, 1988; Tempest et al., Bio/Technology, 9, pp. 266-271, 1991]. 상보성 결정 영역(CDR)으로 공지된 이들 루프들은 함께 각각의 항체쇄의 N-말단 끝에 위치하는 소위 가변성 도메인을 구성하는 스캐폴드(scaffold)-프레임워크 영역-상에 배치된다. 비록 프레임워크 잔기가 CDR 구조의 변경에 간접적으로 또는 직접적으로 항원과 상호반응할 수 있다해도, 각각의 결합 부위는 대부분 이들 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDRs로부터 형성된다. 이들 제조합 항체를 암호화하는 유전자는 예를 들면, 포유동물 세포에서 발현되며, 이의 불변 영역 성분은 본 출원에 적합하도록 조절될 수 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 HIV gp120과 특이적으로 반응하며 역전사 효소, p24 및 합포체 형성 검정에 의 나타나는 바와 같이 배양물에서 생 HIV-1 균주 및 MN 및 IIIB에 의한 H9 세포의 감염을 중화시키는 능력을 지닌, 쥐의 mAb NM-01[PCT/US92/07111]로부터 기원하는 사람 모노클로날 항체를 제공한다. 이들 항체는 상술한 기준에 의해 모 쥐의 항체보다 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 모노클로날 항체는 특히 사람의 항-HIV-1 치료시 사용하기에 적합한데, 이는 이들이 이종 항체보다 덜 면역원성이며 HIV-1 입자의 보체-의존적 바이러스 분해 및/또는 HIV-1 감염된 세포의 항체-의존적 세포의 세포독성에 있어서 더욱 효과적이기 때문인 것으로 여겨진다.
하기 상세한 설명에 기술된 바와 같이, 본 발명의 모노클로날 항체는 쥐의 mAb NM-01의 사람화에 의해 사람 IgG1/K 항체로서 제조된다. 본 발명의 양태 및 장점은 후속되는 발명의 상세한 설명에서 예시적 실시예 및 본 발명의 실시의 기재 및 하기 설명되는 도면을 참조하여 고려할 때 더욱 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1(a)도, 제1(b)도 및 제1(c)도는 쥐의 NM-01 중쇄 가변 영역(VH) cDNA(서열확인번호 8) 및 해독 산물(서열확인번호 9)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
제2(a)도, 제2(b)도 및 제2(c)도는 쥐의 kappa쇄 가변 영역(VK cDNA)의 뉴클레오타이드 (서열확인번호 10) 및 아미노산 서열(서열확인번호 11)을 나타낸다.
제3도는 ELISA에 의해 판단되는 바와 같이 재조합 gp120에 결합하는 다양한 재조합 NM-01 항체의 능력을 나타내는 그래프.
제4(a)도 및 제4(b)도는 아미노산 서열의 2가지 비교를 나타낸다. 제4(a)도에서, 쥐의 NM-01 VH(MuVH)는 이의 사람화된 대응물(HuVH, 서열확인번호 13)과 함께 정열된다. 나타낸 프레임워크 잔기는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 사람화된 쇄내에 도입된 쥐의 잔기이다. 제4(b)도에서, 쥐의 NM-01 VK는 사람화된 NM-01 VK(HuVK, 서열확인번호 14)와 비교된다. HuVKF 쇄내에 포함된 MuVK 의 F71이 나타나 있다.
제5(a)도는 MN 바이러스의 분해물에 대한 NM-01 항체의 결합을 측정한 ELISA 결과를 나타낸다.
제5(b)도는 MN 바이러스 분해물에 대한 항체의 결합을 측정한 ELISA 결과를 나타낸다.
제6도는 ELISA의 결과를 나타내는 그래프이며, 여기에서 수록된 항체 HIV-1MNgp120의 잔기 312-326을 나타내는 루프 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 시험되었다.
제7도는 재조합 gp120에 대한 표지된 쥐의 NM-01 항체의 결합을 차단하는 다양한 MN-01 항체의 능력을 나타내는 도이다.
제8도 및 제9도는 역전사 효소 검정에 의해 측정된 것으로서 HIV-1의 MN 및 IIIB균주에 대한 항체 NM-01 및 HuVH/HuVKF 의 중화 활성을 도식적으로 설명한다.
제10도 및 제11도는 p24 검정에 의해 측정된 것으로서의 HIV-1의 MN 및 IIIB균주에 대한 항체 NM-01 및 HuVH/HuVKF 의 중화 활성을 도식적으로 설명한다.
제12도는 HIV-1의 MN 균주의 합포체 형성을 억제하는 수록된 항체의 능력을 나타내는 도이다.
[실시예]
하기 실시예는 HIV-1 gp120과 반응성인 사람화된 모노클로날 항체의 생성에 대한 본 발명의 실시 양태를 나타낸다. 이 실시예들은 청구된 발명을 예시하기 위한 목적으로 제공된 것이며, 청구된 발명을 제한하는 것으로서 고려되어서는 안된다.
더욱 특히, 실시예 1에서는 모 NM-01 쥐의 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 결정을 기술한다. 실시예 2 및 3에서는 키메릭 및 사람화된 NM-01 항체의 생성에 관한 것이며, 실시예 4 는 사람화된 항체중 하나의 에피토프에 대한 특성에 관한 것이고, 실시예 5는 상기 사람화된 항체의 생물학적 활성의 평가를 기술하고 있다.
[실시예 1]
[쥐의 NM-01 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열의 분리]
가변 영역 서열은 특허원 제PCT/US92/07111호에 기술되어 있으며, 본원에서 기술한 바와 같이 독립적인 분리에 의해 확인되었다. 이 서열은 특히 Tempest 등(상기 참조)에 의해 기술된 바와 같이 세포질성 RNA로부터 합성된 중쇄 및 경쇄 cDNA로부터 결정되었다.
1. RNA 분리
대략 200㎍의 세포질성 RNA를 107개의 NM-01-생성 하이브리도마 세포로부터 Favalora 등의 방법[참조: Meth Enzymol, 65, pp. 718-749(1980)]에 의해 분리하였다. 이들 세포의 배양물로부터 수득된 상등액을 Inno-Lia 마우스 모노클로날 항체 아이소타입 키트(Innogenetics, Antwerp, Belgium)을 사용하여 고체-상 ELISA에 의해 항체의 존재에 대해 검정하였다. 이 항체는 상기 방법에 의해 IgG2b/K로 확인되었다.
2. cDNA 합성
NM-01 RAN의 역전사는 쥐의 IgG2a/IgG2b(CG2FOR, 서열확인번호 1) 또는 쥐의 kappa(CK2FOR, 서열확인번호 2) 불편 영역 유전자의 5' 말단 상에 기준한 프라이머로부터 개시된다. 이 반응물은 총 50㎍ 용량중 5㎍의 RNA, 5㎍의 CG2FOR 또는 CK2FOR, 250μM이 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 10mM DTT, 3mM MgCl2, 30단위의 RNase 억제제(Pharmacia Milton Keynes, United Kingdom)를 함유한다. 샘플을 70 ℃에서 가열한 후 30분에 걸쳐 37℃로 냉각시킨다. 100 단위의 M-MLV 역전사효소(Life Technologies, Paisley, United Kingdom)를 가하고, 반응을 37℃에서 1시간 동안 진행시킨다.
3. VH 및 VK cDNA의 증폭
쥐의 가변 영역 cDNA를 Orlandi 등이 기술한 것[참조: Proc. Natl. Acad Sci USA, 86, pp. 3833-3837 (1989)]을 포함하는 가변 영역 프라이머, 및 Jones 및 Bendig이 기술한 것[참조: Bio/Technology, 9, 88-89(1991)]으로부터 유래된 시그날 서열 플이머, 및 제1쇄 cDNA 합성에 관련된 불변 영역 프라이머를 사용하여 PCR[참조: Saiki et al. Science, 239, 498-491, 1988]에 의해 증폭시킨다. 몇몇 프라이머는 성공적으로 증폭된다. 이들 추가의 프라이머는 쥐의 VH(VH1BACK, 서열확인번호 3) 또는 쥐의 VK(VK1BACK, 서열확인번호 4) 유전자의 5′말단 또는 쥐의 VH 유전자(VH1FOR, 서열확인 번호 5)의 3′ 말단에서의 보존된 영역을 기본으로 한다. 다른 프라이머는 쥐의 중쇄(SH3BACK, 서열확인번호 6) 또는 Kappa 쇄(SK5BACK, 서열확인번호 7)의 시그날 서열 유전자로부터 설계된다.
VH의 PCR 증폭에 있어서, 반응물은 5㎍의 RNA/cDNA 하이브리드, 0.5 μM CG2FOR 및 0.5μm VH1BACK 또는 SH3BACK를 함유한다. VK의 경우, 5μg의 RNA/cDNA 하이브리드를 0.5μM의 각각의 CK2FOR 및 VK1BACK 또는 SK5BACK를 사용하여 증폭시킨다. 또한, 각각의 반응물은 250μM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 10mM 트리스-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01 %(v/v) 트윈 20, 0.01%(v/v) NP-40 및 3단위의 AmpliTaq(Perkin Elmer Cetus, Beaconsfield, UK)를 함유한다. 증폭은 94 ℃에서 30초; 50 또는 55 ℃에서 30초; 72 ℃에서 45초 및 72 ℃에서 5분간의 25주기에 거쳐 수행하여 종결한다. 특이성을 증대시키기 위해서, CG2FOR 및 SH3BACK와 VH 반응의 산물은 추가로 VH1FOR 및 SH3BACK를 사용하여 증폭시킨다. VH 산물의 크기는 아가로즈 겔 전기영동에 의해 가시화되는 바와 같이 대략 400bp(CG2FOR, VH1BACK) 및 440bp(VH1FOR, SH3BACK)이다. VK 산물은 약 37bp(CK2ROR, VK1BACK) 및 440bp(CK2FOR, SK5BACK)이다. 이 DNA를 저융점 아가로즈상에서의 전기영동 및 Elutip-d 칼럼 크로마토그래피(Schleider 및 Schuell, Dassel, Germany)에 의해 정제한다.
4. VH cDNA의 클로닝 및 서열분석
일반적인 클로닝 방법은 문헌[참조: Maniatis et al. Molecular cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982)]에 기술되어 있다. 효소는 라이프 테크놀로지(Life Technologies, Paisley, United Kingdom)로부터 입수한다.
CG2FOR, VH1BACK 산물을 PCR 프라이머내로 도입된 HindIII 및 PstI 제한 부위를 사용하여 M13mp18 및 M13mp19(Pharmacia, Milton Keynes, United Kindom)내로 클로닝시킨다. 클론은 T7 DNA 폴리머라제(Pharmacia, Milton Keynes, United Kingdom)를 사용하여 디데옥시 방법[참조: Sanger et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 74 pp. 5463-5467, 1977]에 의해 서열분석한다.
이들중 7개의 클론이 전체 삽입물에 대한 것으로 서열분석된 대부분의 클론은 공지된 서열과 비교하여 동일한 완전한 VH 유전자를 포함하며 모두 단편 배향을 나타낸다. 하나의 클론은 PCR-유도된 전이 돌연변이를 포함한다. 수득된 유일한 다른 서열은 확인되지 않았으나, VH-형은 아니다.
VH의 N-말단에서 서열이 VH1BACK 프라이머에 의해 지시되기 때문에, VH1FOR 및 SH3BACK 반응 산물은 본래의 잔기를 동정하도록 클로닝되었다. 이 산물은 SH3BACK의 SalI 제한 부위 및 VH 단편에 내재하는 BamHI 부위를 사용하여 클로닝시킨다. 5 ′VH 서열은 2개의 클론으로 부터 수득된다. 완전한 VH 뉴클레오타이드 서열 및 해독에 의해 유도된 아미노산 서열은 제1도(서열확인번호 8 및 9)에 나타낸다. 지시된 CDRs 범위는 카벳(Kabat) 등이 정의한 바와 같이 측정한다[참조: Sequences of proteins of Immunological Interest(5th edition), U.S. Department of Health and Human Services (1991)]. 이것은 특허원 PCT/US92/0711에 나타낸 것과는 상이하다.
5. VK cDNA의 클로닝 및 서열분석
VK cDNA의 증폭시 사용된 프라이머는 또한 제한 부위를 포함하여, CK2FOR, VH1BACK 산물은 HindIII-PvuII 단편으로 및 CK2FOR, SK5BACK 산물은 HindIII-salI 단편으로 M13mp18 및 M13mp19내로 클로닝된다.
서열분석된 클론의 대부분(26/31)은 동일한 VK 삽입물을 포함하며, 공지된 VK 서열과의 상동성에 의해 동정되었다. 이것은 양쪽 배향 모두에서 PCR 산물 모두로부터 수득된다. 21개 클론의 서열은 200개 이상의 뉴클레오타이드에 대해 판독되었으며, 14개 클론의 경우, 전체 VK 가 판독되었다. 여기에는 4개의 PCR-유도된 점 돌연변이가 존재한다. 수득된 다른 클론중의 대부분에는 동정되지 않은 삽입물이 존재하지만, 하나는 카뱃 위치 23에서 보존된 시스테인 잔기의 결실 및 CDR3를 암호화하는 DNA내에서의 프레임쉬프트(frameshift)에 기인하여 비-생산성일 수 있는 VK-유사 서열을 포함한다. 이 서열은 다른 하이브리도마 세포의 RNA로부터 수득되며, 융합 파트너로부터 기원하는 것으로 여겨진다(공개되지 않은 데이터).
CK2FOR, SK5BACK 산물로부터 수득된 바와 같이 본래의 5′잔기를 포함하는 NM-01 VK 뉴클레오타이드 서열은 이의 아미노산 해독 산물(서열확인 번호 10 및 11)과 함께 제2도에 나타낸다. 카뱃 등의 정의(상기 참조)에 따르면 CDRs는 또한 국제 특허원 PCT/US92/07111에 나타낸 것들과 상이하다.
[실시예 2]
[키메릭 NM-01 항체의 제조]
쥐의 가변 영역과 사람의 불변 영역으로 이루어진 키메릭 항체의 제조는 사람화 공정에는 필요하지 않지만, 상기 항체가 항원에 결합하는 능력은 정확한 VH 및 VK 가 하이브리도마의 cDNA로부터 클로닝되었다는 것을 제시해 주기 때문에 유용할 수 있으며, 상기 항체는 사람화된 항체의 효능을 평가하는 검정에서 대조군으로서 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 VH1FOR 및 VH1BACK 또는 VK1FOR[참조: Orlandi et al., 상기 참조; 서열확인번호 12] 및 VK1BACK를 사용하여 M13 클론으로부터 VH 및 VK 삽입물을 증폭시킴으로써, 이들의 키메릭 발현 벡터로의 전이를 혼입된 제한 부위에 의해 촉진시킬 수 있다. 반응 혼합물은 전체 50㎕의 용적중에 M13 ssDNA 약 100ng, 각 프라이머 0.5μM, 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 250 μM, 트리스 HCl 20mM(pH 8.8), KCl 10mM, (NH4)2SO410mM, MgSO42mM, 0.1%(v/v) 트리톤 X-100 및 벤트 DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA, USA) 1 유니트를 함유한다. 상기 샘플을 대상으로 94℃ 에서 30초간; 50℃에서 30초간, 75℃에서 1분간, 및 이어서 75℃에서 5분간 10회 주기로 수행한다. VH 생성물은 PstI 및 BstEII로 분해시키고, M13VHPCR1[Orlandi et al., 상기 참조]로 클로닝시킨다. VK 생성물을M13VKPCR1[Orland et al., 상기 참조]의 PvuII 및 BcII 부위내로 PvuII-Bg1I 단편으로서 클로닝 시킨다. 이들 조작은 프로모터 배후의 가변영역과 시그날 펩타이드 유전자 서열을 발현을 위한 정확한 전후 관계가 되도록 위치시키는 작용을 하지만, 또한 이들의 말단 잔기를 약간 변화시킨다;
VH I2에서 V; K5 에서 Q; S108에서 T
VK V3에서 Q; L106에서 l.
이들 발현 카셋트를 완전히 서열분석하여 가성(spurious) 돌연변이의 부재 여부를 확인한 다음, M13 RF DNA로부터 HindIII-BamHI 단편으로 절단한다. 부분적인 BamHI 분해를 이용하여, BamHI 부위 내부에서 VH 및 VK 로 절단되지 않은 완전한 길이의 단편을 수득할 수 있다. 이 VH 단편을 사람 IgGl 불변 영역 유전자[참조: Takahashi et al., Cell 29, pp. 671-679, 1982]를 포함하는 pSVgpt의 유도체[Orlandi et al., 상기 참조]내로 클로닝시킨다. VK 단편은 이미 사람 kappa 불변 영역 유전자[참조: Hieter et al., Cell, 22, pp. 197-207, 1980]를 포함하는 pSVhyg[Orland et al., 상기 참조]내로 클로닝시킨다.
앞서 기술한 바와 같이[Tempest et al., 상기 참조] 벡터를 랫트 골수종 YB2/0[참조: Kilmartin et al., J. Cell Biol., 93, pp. 576-582, 1982(69); 기탁번호 CRL-1662하에 American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA로부터 입수 용이함]로 공형질감염시킨다. 미코페놀산내성 클론을 대상으로 사람 IgG/K 항체의 분비 여부를 알아보기 위해 ELISA로 스크리닝한다. ELISA 양성 클론을 증식시키고, 단백질 A 친화 크로마토그래피하여 배양 배지로부터 항체를 정제한다.
형질감염시킨 세포로부터 정제시킨 키메릭 항체를 대상으로 재조합 gp120(American BioTechnologies Inc., Cambridge, MA, USA)에 대한 결합을 알아보기 위해 ELISA로 시험한다. gp120(웰당 2ng/100μl 15mN Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6)을 Immulon 2 플레이트(Dynateh)내에서 4℃에서 밤새 항온처리한다. 이 플레이트를 인산염 완충 염수(PBS)-0.05% 트윈 20으로 세척하고, 5% 정상 염소 혈청(Life Technologies Paisley, United Kingdom)으로 37℃에서 1시간 동안 차단시킨 다음 다시 세척한다. 항체를 PBS-0.05% 트윈 20에 여러가지 농도를 가하고, 37℃에서 1 시간 동안 항온처리한다. 세척후, HRPO-접합된 염소 항-사람 Kappa 쇄 항체(Sera-Lab Limited, Crawley Down, Sussex, England; 40ng/100μl PBS-0.05% 트윈 20/웰)를 가한다. 1시간 후, 웰을 세척하고, 색이 나타날 때까지(5 내지 10분) o-페닐디아민의 존재하에 항온처리한다. 흡광도는 492nm에서 판독되었다.
- 결과(제3도)는 키메릭 항체(MuBH/MuVK로 칭함)가 재조합 gp120에 반응성인 것으로 나타났다.
[실시예 3]
[사람화된 NM-01 항체의 생성]
모 항체의 항원-결합 루프를 사람 가변 영역 프레임워크내로 전이시킴으로써 사람화된 가변 도메인을 생성시킨다. NM-01의 경우에 사용된 프레임워크는 NEWH VH의 프레임워크[참조: Saul et al., J. Biol Chem. 253, pp. 585-597, 1978] 및 REI VK의 프레임워크[참조: Epp et al., Eur, J. Biochem. 45, pp. 513-524, 1974]이다.
사람화된 중쇄(HuVH, 서열확인번호 13)의 경우, 이는 카뱃 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같은 CDRs 및 상기 프레임워크로부터의 추가의 5개 잔기(제4(a)도)의 전이와 관련되어 있다. CDR1 앞의 4개의 잔기는 초가변성이 아니기 때문에 카뱃 등에 의해 CDR의 일부로서 정의되지 않았지만, 이들은 도메인의 β-시트 프레임워크로부터 연장되어 루프 형태에 영향을 미치는 루프 구조의 일부이다[참조: Chothia and Lesk, J Mol. Biol., 196, pp. 901-917, 1987). 잔기71(카뱃에 의한 넘버링)은 CDRs1의 루프와 CDRs2의 루프 사이에 존재하여 CDR2의 구조를 결정짓는데 중요하다[참조: Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215, pp. 175-182, 1990].
기본적인 사람화된 VK[HuVK, 서열확인번호 14]는 쥐의 항체 CDR 서열만을 함유하지만, 제 2 버전(HuVKF)은 카뱃 위치 71에서 쥐의 잔기 F를 추가로 포함한다(제4(b)도). 이 위치에서의 아미노산의 측쇄는 CDR1의 구조에 영향을 미치고[Chothia and Lesk, 상기 참조], 쥐의 잔기로의 역전은 다른 사람화된 항체의 결합능에 유리하게 영향을 미친다[참조: Foote and Winter, J. Mol. Biol, 224, pp. 487-499, 1992].
NM-01 CDRs와 전술한 프레임워크 잔기를 암호화하는 DNA를, M3VHPCRI 및 M13VKPCR1의 유도체내에 함유된 바와 같이(실시예 2), 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 적당한 사람 가변 영역 유전자내로 도입시킨다.
M13 파아지를 이. 콜라이 RZ1032(dut-ung-)에서 성장시켜, 티민 대신 우라실을 포함하는 일본쇄 주형 DNA를 수득한다. DNA 0.5㎍을 각각의 1pmol 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드 및 삽입체 DNA의 하부에 있는 M13 주형과 어닐링하는 올리고뉴클레오타이드와 혼합한다. 상기 올리고뉴클레오타이드를, 80℃로 5분간 가열한 다음 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 25mM MgCl2, 63mM NaCl 20㎖중 주형과 어닐링시킨다.
dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 동일한 완충액 중에서 0.5 단위 T7 DNA 폴리머라제(United States Biochemical Cleveland, OH, USA) 및 0.5 단위 T4 DAN 리가제(Life Technologies. Paisley, UK)와 함께 250μM 최종 농도, 즉 DTT 7mM, ATP 1mM에 가한다. 반응물 30㎕를 실온에서 1시간 동안 항온처리한 다음 DNA 에탄올을 침전시킨다. 모 쇄에 닉(nick)을 내기 위해서, DNA를 1단위 우라실 DNA 글리코실라제(Boehringer Mannheim, Lewis, Sussex, UK)를 함유하는 5㎕의 60mM 트리스 HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mg/ml BSA에 용해시키고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 다음 NaOH를 0.2M로 가하고; 실온에서 5분 동안 계속 항온처리한다. DNA를 에탄올 침전시키고, 20㎕의 TE에 용해시킨 다음 삽입체 단편을 PCR로 증폭시킨다. 반응 혼합물은 50μl 중에 변이체 DNA 2㎕, 각각의 M13 정방향 및 역방향 프라이머 0.5μM, 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 250μM, 10mM 트리스 HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01% 트윈-20, 0.01% 젤라틴, 0.01% NP40 및 2단위의 더말제(Thermalse; IBI, Cambridge, UK)를 함유한다. 증폭은 94℃에서 30초간; 50℃에서 30초간, 72℃에서 1분간, 마지막으로 72℃에서 5분간의 15주기로 수행하여 종결한다. 생성물 DNA를 HindIII-BamHI 단편으로서 M13mp19내로 클로닝시킨다. 대표적인 클론을 서열화한다. HindIII-BamHI 단편을 정확하게 돌연변이시킨 클론의 RF DNA로부터 절단한 다음 실시예 2에 기술된 pSVgpt 및 pSVhyg 발현 벡터에 옮긴다.
YB2/O의 형질감염 및 이들의 선별 및 발현은 실시예 2에서와 같이 수행한다. HuVHS/HuVKF G4, HuVH/HuVKF C4, HuVHM/HuVK G7, HuVHM/HuVKF G8, HuVHS/HuVK F6, 및 HuVH/HuVK F6(실시예 6 참조)은 NM01 HuVH/HuVK 항체를 생산하는 항체(HuVH/HuVK 및 HuVH/HuVKF)를 제공하기 위한 형질감염 뿐만 아니라, 키메릭 및 사람화된 항체 쇄 발현 벡터를 공-형질감염시켜, 사람화된 쇄의 효능이 개별적으로 검사될 수 있는 혼합 항체를 수득한다.
항체를 단백질 A 아가로즈 친화성 크로마토그래피로 정제시킨 다음, 실시예 2에 기재된 바와 같이 재조합 gp120과의 결합에 대해 시험한다(제3도). 결과는 2 내지 4배의 장점을 제공해주는 HuVKF 쇄와 함께 HuVK 및 MuVK 쇄에서와 같이, HuVH와 MuVH 쇄가 등가물이라는 것을 지시해준다. 이는 NM-01 사람화 항체(HuVH/HuVK 및 HuVH/HuVKF)가 재조합 gp120과 잘 결합한다는 것을 제시해준다. MN 바이러스 및 돌연변이체 MN 바이러스의 트리톤 X-100 분해물에 결합하는 능력에 대해 상기 항체를 유사하게 시험한다(제5(a)도 및 제5(b)도). 쥐의 항체 및 재조합 항체에 대한 시그날 수준은 상이한 리포터 항체가 사용되기 때문에 비교할 수 없지만, HuVH/MuVK, HuVH/HuVK 및 HuVH/HuVKF 항체 모두가 MN 바이러스에는 결합하지만, NM-01 쥐의 mAb가 결합되지 않는 돌연변이체 바이러스에는 결합하지 않는 것으로 보인다.
[실시예 4]
NM-01 HuVH/HuVKF 에피토프의 측정
사람화된 항체 NM-01 HuVH/HuVKF의 에피토프를 펩타이드 결합 및 경쟁 ELISA에 의해 조사한다.
1. HIV-1 펩타이드에 대한 ELISA
쥐의 NM-01은, GPGR 모티프를 포함한 HIV-1MNgp120의 312 내지 326 잔기를 나타내는 루프 펩타이드에 결합한다.
V3 루프의 상이한 부분을 나타내는, 펩타이드(Multiple Peptide Systems, San Diego, CA, USA 제조) 및 음성 대조군 펩타이드(둘 모두 웰당 250ng/100㎕ 0.1M 붕산나트륨 pH 8.0)를 Immulon 2 플레이트(Dynatech)에서 밤새 4℃에서 항온처리한다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 20으로 세척하고 PBS-0.1% 트윈 20-0.1% BSA로 실온에서 1시간 동안 차단한다. 차단 용액을 제거하고, NM-01 항체의 희석물을 차단 용액에 부가한 후 37℃에서 1시간 동안 항온처리를 지속한다. 플레이트를 세척하고, HRPO-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체(Zymed, San Francisco, CA, USA: 60ng/웰) 또는 HRPO-접합된 염소 항-사람 IgG 항체(Sera-Lab Limited, Crawley Down, Sussex, UK; 40ng/웰)을 가한다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후 플레이트를 세척하고, 색상이 나타날 때까지 o-페닐디아민의 존재하에 항온처리한다(약 5분). 492nm에서 흡광도를 판독한다. HIV-1MNgp120 잔기 312-326 펩타이드에 대한 NM-01 항체의 결합이 제6도에 나타나 있는데, 음성 대조군 펩타이드가 사용되는 경우 결합은 관측되지 않는다. NM-01 HuVH/HuVKF 항체는 키메릭(MuVH/MuVK) 항체에 비하여 높은 효율성으로 펩타이드에 결합하는 것으로 나타났다. 쥐의 NM-01 항체에 대한 직접적인 비교는 상이한 접합 항체가 사용되었으므로 수행될 수 없다.
2. 재조합 gp120에 대한 완전 ELISA
플레이트를 재조합 gp120(5ng/웰)으로 피복하고, 실시예 2에서와 같이 차단시킨다. NM-01 항체 또는 대조군 사람화된 항체의 희석물을 100㎕/웰로 가하고, 플레이트를 37℃에서 30분간 항온처리한다. 바이오티닐화된 쥐의 NM-01 항체(500mg/50㎕ PBS, 웰 당)를 가하고 1시간 동안 계속 항온처리한다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 20으로 세척하고, HRPO-스트렙타비딘(Sera-Lab Limited, Crawley Down, Sussex, UK, 40ng/100㎕ PBS, 웰 당)을 가한 후 30분간 계속 항온처리한다. 플레이트를 세척하고, 색이 나타날 때까지 5분간 o-페닐디아민의 존재하에 항온처리한다. 492nm에서 흡광도를 판독한다.
제7도에 결과가 나타나 있는데, 이로써 쥐의 항체와 재조합 NM-01 항체의 직접적인 비교가 가능해진다. HuVH/HuVK는 표지된 쥐의 NM-01 항체의 결합을 차단하는데 있어서 쥐의 NM-01만큼 효과적이다. HuVH/HuVKF는 쥐의 항체보다 약 4배 더 활성적인 반면, 키메릭 항체(MuVH/MuVK)는 쥐의 항체보다 약간 덜 활성적이다. 이는 아마도 키메릭 항체의 생성중에 가변 영역 말단에서의 변형에 기인하는 것 같다(실시예 2). 대조군 사람화된 항체는 차단 활성을 나타내지 않는다.
이들 두 실험은, 사람화된 NM-01 항체, HuVH/HuVKF에 의해 인지되는 에피토프가, 완전히는 아닐지라도, 거의 쥐의 NM-01 항체의 에피토프와 동일함을 나타낸다.
[실시예 5]
NM-01 HuVH/HuVKF의 생물학적 활성
사람화된 NM-01 항체인 HuVH/HuVKF를 생 HIV-1 균주 MN 및 IIIB에 의한 H9 세포의 감염을 중화하는 능력에 대해 역전사효소 및 p24 검정으로 측정함으로써 쥐의 NM-01과 비교한다. 항체는 또한 생 MN 바이러스를 이용한 합포체 형성 검정으로 비교한다.
1. 역전사효소 및 p24 검정
항체의 희석액을 100 TCID50의 MN 또는 IIIB생 바이러스와 4℃에서 2시간 동안 96-웰 플레이트에서 항온처리한다. H9 세포(2.5 x 105)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. H9 세포 현탁액을 2ml RPMI 1640/15% FBS로 희석하고, 37℃에서 24웰 플레이트에서 항온처리한다. 바이러스 증식을 문헌[참조: Poiesz et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 77, pp. 7415-7419 (1980)]에 기술된 바와 같이 7일째 되는 날에 수행되는 역전사효소 검정으로 측정한다. 조직 배양 상등액 중에 p24 항원의 존재를 재조업체(Du Pont-New England Nuclear)에 의해 기술된 방법을 이용하여 HIV-1 p24 코어 프로파일 ELISA에 의해 6 내지 8일 후에 정량한다. 결과는 제8도 내지 제12도에 나타낸다. MN 균주의 경우, RT 활성의 50% 중화는 1.2μg/ml 의 쥐의 NM-01 또는 0.8μg/ml 의 NM-01 HuVH/HuVKF에 의해 성취된다(제8도). 균주 IIIB의 경우, ID50은 쥐의 NM-01에 대해서는 0.2㎎/ml이고 NM-01 HuVH/HuVKF에 대해서는 0.08㎎/ml이다(제9도). p24 검정에 의한 MN 바이러스의 50% 중화는 쥐의 NM-01 1.5μg/ml 또는 NM-01 HuVH/HuVKF 0.3 μg/ml를 요구하며(제10도), IIIB바이러스의 50% 중화는 쥐의 NM-01 0.15μm/ml 또는 NM-01 HuVH/HuVKF 0.08㎎/ml을 요구한다(제11도). 이들 결과는 NM-01 HuVH/HuVKF가 HIV-1의 NM 및 IIIB균주를 중화하는데 있어서 모 쥐의 NM-01보다 더욱 효과적이라는 것을 입증한다. 제11도는 또한 다른 재조합 NM-01 항체 및 음성 대조군으로서 작용하는 무관한 사람화된 항체(2990.7 HuVH/HuVK)의 중화 활성을 보여준다. 이 결과는 키메릭 항체(MuVH/MuVK)가 쥐의 NM-01에 대해 비교적 결함이 있음을 제시하는 경쟁 ELISA의 결과를 뒷받침해준다. HuVH/HuVK 항체는 다시 HuVH/HuVKF보다 덜 효과적인 것으로 보여진다. 혼합된 항체 MuVH/HuVKF를 사용한 결과는 중쇄보다 사람화된 kappa 쇄가 쥐의 항체와 비교하여 HuVH/HuVKF의 우수한 활성에 관여한다는 것을 나타낸다.
2. 합포체 형성 검정
결합 억제 검정은 이전에 기술된 검정[참조: Johnson and Walker. Eds., Techniques in HIV-1 Research, stockton Press, New York, NY, pp. 92-97 (1990)]의 변형이다. 간략하게 만성적으로 MN 바이러스로 가염된 H9 세포를 37℃에서 1시간 동안 항체 희석물과 함께 항온 처리한다. 지시 세포주 C8166으로부터의 세포를 첨가(3 x 104세포/웰)하고, 플레이트를 37℃에서 2 내지 12시간 동안 항온처리한다. 3개의 임파구 세포 직경보다 큰 합포체의 수를 카운팅하고, 항체의 부재하에 처리된 감염된 대조군 H9 세포에 대해 수득된 것과 비교한다.
상기 결과를 제12도에 나타내며, 이는 쥐의 NM-01과 비교하여 NM-01 HuVH/HuVKF 항체에 의해 억제 수준이 증가되었음을 입증한다. 음성 대조군 사람화된 항체(2990.7)는 검출가능한 어떠한 효과도 없다.
[실시예 6]
[제형]
본 발명의 사람화된 면역글로불린 및 이의 약제학적 조성물은 특히 비경구적 투여(예: 피하내, 근육내, 정맥내)에 유용하다. 비경구 투여를 위한 조성물은 통상적으로 생리학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수용성 담체에 용해된 사람화된 면역글리불린의 용액을 포함한다. 다양한 수용성 담체(예: 물, 완충수, 생리식염수, 0.3% 글리신 등)가 사용될 수 이다. 비 경구 투여를 위한 액제는 바람직하게는 살균되며 일반적으로 미립자 물질이 없다. 비경구 투여를 위한 조성물은 간편한 저장을 위해 동결건조하고, 이용전에 재수화한다. 비경구 투여를 위한 조성물은 통상적인 멸균 기술로 멸균할 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 독성조절제 등(예: 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등)과 같이 대략적인 생리 조건에 요구되는 약제학적 허용되는 보조 물질을 포함할 수 있다. 이들 제형중에 사람화된 면역글로불린의 농도는 광범위하게 다양할 수 있고(예: 약 0.5% 미만, 일반적으로 약 1% 내지 15중량% 또는 20중량%), 선택된 특정 투여방식에 따라 주로 유체용적, 점도 등을 기준으로 하여 선택할 수 있다.
[생물학적 기탁]
본원의 출원전에 본 출원인은 ECACC에 하기에 기술되는 바와 같은 항체를 생산하는 세포주를 기탁하였다:
HuVHS/HuVKF G4(수탁번호 # 93082018),
HuVH/HuVKF C4(수탁번호 # 93082019),
HuVHM/HuVK G7(수탁번호 # 93082020),
HuVHM/HuVKF G8(수탁번호 # 93082021),
HuVHS/HuVK F6(수탁번호 # 93082023), 및
HuVH/HuVK F6(수탁번호 # 93082022).
기탁된 균주의 이용은 특허법에 따라 모든 정부 당국하에 승인된 권리를 침해한 경우에는 본 발며의 실시권으로서 해석되지 않는다.
[참고사항]
상기 명세서에서 언급된 모든 공고 및 특허는 본원에 참고로 도입된다. 이전에 기술된 명세서는 본 분야에 통상의 기술을 가진자가 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 여겨진다. 더우기, 분자생물학 분야 또는 관련된 분야에서의 숙련가들에게 명백한 본 발며을 실시하기 위한 상기 기술된 방식의 여러 가지 변형은 하기 청구항의 범위안에 포함되는 것으로 여겨진다.
[서열 목록]
서열확인번호 1: 일본쇄 DNA: CG2FOR
5′ GGAAGCTTAGACCGATGGGGCTGTTGTTTG 3′
서열확인번호 2: 일본쇄 DNA: CK2FOR
5′ GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3′
서열확인번호 3: 일본쇄 DNA: VH1BACK
3′ AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG 3′
서열확인번호 4: 일본쇄 DNA: VK1BACK
5′ GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA 3′
서열확인번호 5: 일본쇄 DNA: VH1FOR
5′ TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3′
서열확인번호 6: 일본쇄 DNA: SH3BACK
5′ TTGTCGACATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG 3′
서열확인번호 7: 일본쇄 DNA: SK5BACK
5′ AAGTCGACATGRRTWTASTCACWCACCTSCTRKSGKT 3′
서열확인번호 8: 이본쇄 DNA: 쥐의 NM-01 VH cDNA
제1도 참조
서열확인번호 9: 단백질: 쥐의 NM-01 VH
제1도 참조
서열확인번호 10: 이본쇄 DNA: 쥐의 NM-01 VK cDNA
제2도 참조
서열확인번호 11: 단백질: 쥐의 NM-01 VK
제2도 참조
서열확인번호 12: 일본쇄 DNA: VK1FOR
5′ GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC 3′
서열확인번호 31: 단백질; 사람화된 NM-01 VH
제4(a)도 참조
서열확인번호 14: 단백질; 사람화된 NM-01 VK
제4(b)도 참조
Claims (7)
- HuVH에 대해 서열확인 번호 13 및 HuVK에 대해 서열확인번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 지닌 가변 영역을 포함하는 사람화된 항체.
- 제1항에 있어서, 카뱃(Kabat) 위치 71에서 페닐알라닌(F) 잔기가 치환됨으로써 변형된 정쇄 프레임 워크 영역을 지니는, 사람화된 항체.
- ECACC 수탁 번호 제93082019호로 기탁된 세포주 HuVH/HuVKF C4.
- (a) 제1도 및 제2도에 나타낸 서열로부터 CDR을 취하는 단계; (b) 단계(a)의 CDR을 사람 프레임워크 영역에 결합시키는 단계; 및 (c) 사람 프레임워크 영역을 추가로 변형시킴으로써 쥐의 항체 NM-01과 비교하여, 역전사 효소, p24 및 합포체 형성 검정하는 경우, H9 세포내에서 생 HIV-1 균주 MN 및 IIIB에 의한 감염을 중화시키는 개선된 능력을 포함하는 개선된 특성을 지닌 항체를 수득하는 단계를 포함하는, HIV-1 과 특이적으로 반응하는 사람화된 항체를 생산하는 방법.
- 제4항에 있어서, 변형단계가 항체의 경쇄 프레임워크 카벳 위치 71에서 페닐알라닌(F) 잔기를 취환시켜 수행되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 따른 항체를 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된 형태로 함유하는, HIV-1 감염의 치료 또는 예방을 위한 치료학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료 방법에 사용하기 위한 항체.
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