DE60221705T2

DE60221705T2 - Glykosylierungsresistente cyanovirine und damit verbundene konjugate, zusammensetzungen, nukleinsäuren, vektoren, wirtszellen, herstellungsverfahren sowie verfahren zur verwendung nichtglykosylierter cyanovirine

Info

Publication number: DE60221705T2
Application number: DE60221705T
Authority: DE
Inventors: Michael R. Mobile BOYD; Barry R. Frederick O'KEEFE; Toshiyuki Germantown MORI; Angela M. Bethesda GRONENBORN
Original assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Current assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2022-03-23
Also published as: EP1456382A2; JP4307841B2; EP1456382A4; CA2441287C; EP1456382B1; JP2004535784A; AU2002254382B2; US7339037B2; CA2441287A1; DE60221705D1; ATE369427T1; US20040220107A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Cyanovirinen zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer Influenza viralen Infektion, sowie glykosylierungsbeständige Cyanovirine und verwandte Konjugate, Zusammensetzungen, Nukleinsäuren, Vektoren, Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Gebiet viraler Therapeutika hat sich als Reaktion auf den Bedarf an wirksamen Mitteln gegen Retroviren, besonders HIV, entwickelt. Es gibt viele Weisen, auf die ein Mittel eine anti-retrovirale Aktivität aufweisen kann (siehe z. B. DeClercq, Adv. Virus Res. 42, 1–55, 1993; DeClercq, J. Acquir. Immun. Def. Synd. 4, 207–218, 1991, und Mitsuya et al., Science 249, 1533–1544, 1990). Nucleosidderivate, wie zum Beispiel AZT, welche die virale reverse Transkriptase inhibieren, waren unter den ersten klinisch aktiven Mitteln, die kommerziell für eine anti-HIV-Therapie zur Verfügung standen. Obwohl es bei manchen Patienten sehr nützlich ist, wird die Nützlichkeit von AZT und verwandten Verbindungen durch Toxizität und unzureichende therapeutische Indizes für eine vollständig adäquate Therapie beschränkt. Auch ist es in Anbetracht der anschließenden Aufdeckungen über die wahre Dynamik einer HIV-Infektion (Coffin, Science 267, 483–489, 1995, und Cohen, Science 267, 179, 1995) zunehmend offensichtlich geworden, dass Mittel, die so früh wie möglich im viralen replikativen Zyklus wirken, benötigt werden, um die Infektion von neu hergestellten, nicht infizierten Immunzellen zu inhibieren, die im Körper als Reaktion auf das vireninduzierte Töten infizierter Zellen erzeugt werden. Auch ist es unentbehrlich, neue infektiöse Viren, die durch infizierte Zellen produziert werden, zu neutralisieren oder zu inhibieren.
Eine Infektion von Menschen durch Influenzaviren ist auch eine Hauptursache für pandemische Krankheit, Morbidität und Mortalität weltweit. Die nachteiligen ökonomischen Konsequenzen sowie das menschliche Leiden sind enorm. Zur Verfügung stehende Behandlungen für eine etablierte Infektion durch dieses Virus sind entweder minimal wirksam oder unwirksam; diese Behandlungen setzen Amantadin, Rimantadin und Neuraminidase-Inhibitoren ein. Von diesen Arzneistoffen sind nur die Neuraminidase-Inhibitoren wesentlich aktiv gegen mehrere Stämme des Influenzavirus, die gewöhnlich Menschen infizieren, diese Arzneistoffe haben jedoch noch eine beschränkte Nützlichkeit oder Wirksamkeit gegen eine pandemische Erkrankung.
Derzeit ist die einzige wirksame, vorbeugende Behandlung gegen eine Influenza virale Infektion eine Impfung. Dies ist jedoch, wie die Arzneistoffbehandlungen, durch die Neigung von Influenzaviren, rasch durch genetischen Austausch zu mutieren, schwerwiegend beschränkt, was zum Auftauchen hoch resistenter viraler Stämme führt, die rasch infizieren und sich in empfänglichen Populationen überall ausbreiten. In der Tat ist eine Impfstrategie nur von Jahr zu Jahr wirksam, falls die möglichen pandemischen Stämme identifiziert oder vorhergesagt und entsprechende Impfstoffe früh genug hergestellt und verabreicht werden können, damit die mögliche Pandemie des Jahres abgebrochen oder abgeschwächt werden kann. Somit werden neue vorbeugende und therapeutische Interventionen und Mittel dringend benötigt, um Influenzaviren zu bekämpfen.
Neue Mittel mit einer breiten anti-Influenzavirus-Aktivität gegen vielfältige Stämme, klinische Isolate und Subtypen des Influenzavirus wären höchst nützlich, da derartige Mittel höchstwahrscheinlich gegen das mutierende Virus aktiv bleiben würden. Die beiden Haupttypen des Influenzavirus, die Menschen infizieren, sind Influenza A und B, die beide eine schwere akute Krankheit verursachen, die sowohl ein Leiden des Atmungssystems als auch ein Magen-Darm-Leiden einschließen können, sowie andere ernste pathologische Folgeerscheinungen. Ein Mittel, das eine anti-Influenzavirus-Aktivität gegen vielfältige Stämme und Isolate von sowohl Influenza A als auch B, einschließlich kürzlicher klinischer Isolate davon, aufweist, wäre besonders vorteilhaft zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung von Wirten, die für Influenzavirus-Infektionen empfänglich sind.
Die überwiegende Übertragungsweise einer Influenza viralen Infektion ist respiratorisch, d. h. eine Übertragung mittels Inhalation virenbeladener aerosolisierter Partikel, die durch Husten, Niesen, Atmen usw. eines mit Influenza infizierten Individuums erzeugt werden. Eine Übertragung infektiöser Influenza-Viruspartikel kann auch durch Kontakt (d. h. durch versehentlichen Hand-zu-Mund-Kontakt, Küssen, Berühren usw.) mit Speichel oder anderen Körpersekreten eines infizierten Individuums vorkommen. Somit sind die primären, ersten Kontaktpunkte infektiöser Influenza-Viruspartikel in einem empfänglichen Individuum die Schleimhautoberflächen in der oropharyngealen Schleimhaut und die Schleimhautoberflächen in den oberen und unteren Atemwegen. Diese Stellen umfassen nicht nur erste Punkte des Virenkontakts zur anfänglichen Infektion eines Individuums, sondern sie sind auch die primären Stellen zur Produktion und zum Austritt (z. B. durch Husten, Niesen, Übertragung von Speichel usw.) von Körperflüssigkeiten, die infektiöse Influenza-Viruspartikel enthalten. Deshalb wäre die Verfügbarkeit eines hochpotenten anti-Influenzavirus-Mittels mit einer Breitspektrum-Aktivität gegen vielfältige Stämme und Isolate der Influenzaviren A und B, das topisch an den zuvor erwähnten Schleimhautstellen, an denen Kontakt und Infektion und Übertragung infektiöser Influenzaviren stattfindet, angewendet oder abgegeben werden könnte, höchst vorteilhaft für eine therapeutische und vorbeugende Inhibierung einer Influenza viralen Infektion, entweder in empfänglichen nicht infizierten oder in infizierten Wirten.
In dieser Hinsicht werden neue Klassen antiviraler Mittel, die allein oder in Kombination mit existierenden antiviralen Mitteln verwendet werden sollen, für eine wirksame antivirale Therapie benötigt. Neue Mittel sind auch zur prophylaktischen Inhibierung einer viralen Infektion wichtig. In beiden Bedarfsbereichen würde(n) das (die) ideale(n) neue(n) Mittel so früh wie möglich im viralen Lebenszyklus wirken; wäre(n) so virenspezifisch wie möglich (d. h. würde(n) ein für das Virus spezifisches molekulares Ziel angreifen, aber nicht den Wirt); würde(n) das intakte Virus nicht infektiös machen; würde(n) den Tod oder die Dysfunktion vireninfizierter Zellen verhinden; würde(n) eine weitere Produktion von Viren aus infizierten Zellen verhindern; würde(n) die Ausbreitung der Virusinfektion auf nicht infizierte Zellen verhindern; wäre(n) hochpotent und aktiv gegen den weitestmöglichen Bereich von Stämmen und Isolaten eines bestimmten Virus; wäre(n) resistent gegen Abbau unter physiologischen Bedingungen und drastischen Umweltbedingungen und wäre(n) schnell und preiswert hergestellt.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion, genauer gesagt einer Influenza viralen Infektion, eines Wirtes bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, glykosylierungsbeständige Cyanovirine und verwandte Konjugate, Nukleinsäuren, Vektoren, Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung bereitzustellen. Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung, sowie zusätzliche erfinderische Merkmale, werden aus der hierin bereitgestellten Beschreibung ersichtlich werden.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül bereit, das für ein Protein oder Peptid kodiert, umfassend mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2, wobei die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren die Aminosäuren 30–32 der SEQ ID NR: 2 umfassen, die glykosylierungsbeständig gemacht worden sind, und wobei die mindes tens neun zusammenhängenden Aminosäuren antivirale Aktivität aufweisen. Ferner wird ein Vektor, der ein derartiges isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül umfasst, und eine Wirtszelle oder ein Organismus, die/der den Vektor umfasst, bereitgestellt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines antiviralen Proteins oder antiviralen Peptids bereit, wobei das Verfahren die Expression des Vektors in einer Wirtszelle oder einem Organismus umfasst. Somit wird auch ein antivirales Protein oder antivirales Peptid, umfassend mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2, wobei die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren die Aminosäuren 30–32 der SEQ ID NR: 2 umfassen, die glykosylierungsbeständig gemacht worden sind, und wobei die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren antivirale Aktivität aufweisen, bereitgestellt, wie auch ein Konjugat, umfassend das antivirale Protein oder antivirale Peptid und mindestens eine Wirkkomponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Albumin, Dextran, einem Toxin und einem immunologischen Reagenz. Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge des antiviralen Proteins, antiviralen Peptids, antiviralen Proteinkonjugats oder antiviralen Peptidkonjugats umfassen, werden auch bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion, genauer gesagt einer Influenza viralen Infektion, eines Wirtes bereit. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge eines antiviralen Proteins, antiviralen Peptids, antiviralen Proteinkonjugats oder antiviralen Peptidkonjugats, umfassend mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2, an den Wirt, wobei die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren nicht glykosyliert sind und antivirale Aktivität aufweisen, worauf die virale Infektion inhibiert wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bei 1A handelt es sich um ein Diagramm von OD (206 nm) gegen Zeit (min), das ein HPLC-Chromatogramm von nicht reduziertem Cyanovirin darstellt.
Bei 1B handelt es sich um ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegen die HPLC-Fraktion, das für die nicht reduzierten HPLC-Fraktionen von Cyanovirin die maximale Verdünnung jeder HPLC-Fraktion veranschaulicht, die einen 50%igen Schutz vor den cytopathischen Wirkungen einer HIV-Infektion bereitstellte.
Bei 1C handelt es sich um ein Diagramm von OD (206 nm) gegen Zeit (min), das ein HPLC-Chromatogramm von reduziertem Cyanovirin darstellt.
Bei 1D handelt es sich um ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegen die HPLC-Verdünnung, das für die reduzierten HPLC-Fraktionen von Cyanovirin die maximale Verdünnung jeder Fraktion veranschaulicht, die einen 50%igen Schutz vor den cytopathischen Wirkungen einer HIV-Infektion bereitstellte.
2 zeigt ein Beispiel einer DNA-Sequenz, die für ein synthetisches Cyanovirin-Gen kodiert (SEQ ID NR: 1–4).
3 veranschaulicht ein ortsspezifisches Mutagenesemanöver, das verwendet wurde, um die Codons für ein FLAG-Octapeptid und eine Hind III Restriktionsstelle aus der Sequenz von 2 zu entfernen.
4 zeigt ein typisches HPLC-Chromatogramm während der Reinigung eines rekombinanten nativen Cyanovirins.
Bei 5A handelt es sich um ein Diagramm von % der Kontrolle gegen Konzentration (nM), das die antivirale Aktivität von nativem Cyanovirin aus Nostoc ellipsosporum veranschaulicht.
Bei 5B handelt es sich um ein Diagramm von % der Kontrolle gegen Konzentration (nM), das die antivirale Aktivität von rekombinantem Cyanovirin veranschaulicht.
Bei 5C handelt es sich um ein Diagramm von % der Kontrolle gegen Konzentration (nM), das die antivirale Aktivität von rekombinantem FLAG-Fusions-Cyanovirin veranschaulicht.
Bei 6A handelt es sich um ein Diagramm von % der Kontrolle gegen Konzentration (nM), das die relative Anzahl lebensfähiger, mit HIV-1 infizierter CEM-SS Zellen in einem BCECF-Assay abbildet.
Bei 6B handelt es sich um ein Diagramm von % der Kontrolle gegen Konzentration (nM), das den relativen DNA-Gehalt von mit HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellkulturen abbildet.
Bei 6C handelt es sich um ein Diagramm von % der Kontrolle gegen Konzentration (nM), das die relative Anzahl lebensfähiger, mit HIV-1 infizierter CEM-SS Zellen in einem XTT-Assay abbildet.
Bei 6D handelt es sich um ein Diagramm von % der Kontrolle gegen Konzentration (nM), das die Wirkung eines Bereichs von Cyanovirinkonzentrationen auf Indizes von infektiösen Viren oder auf die virale Replikation abbildet.
Bei 7 handelt es sich um ein Diagramm von % nicht infizierter Kontrolle gegen Zeit der Zugabe (h), das Ergebnisse von Untersuchungen zur Zugabezeit eines Cyanovirins zeigt, das eine anti-HIV-Aktivität in mit HIV-1_RF infizierten CEM-SS Zellen zeigt.
Bei 8 handelt es sich um ein Diagramm von OD (450 nm) gegen Cyanovirinkonzentration (μg/ml), das Cyanovirin/gp120-Wechselwirkungen veranschaulicht, die gp120 als ein molekulares Hauptziel von Cyanovirin definieren.
9 veranschaulicht schematisch eine kodierende DNA-Sequenz, die eine für FLAG-Cyanovirin-N kodierende Sequenz, gekoppelt an eine für Pseudomonas-Exotoxin kodierende Sequenz, umfasst.
Bei 10 handelt es sich um ein Diagramm von OD (450 nM) gegen PPE-Konzentration (nM), welches das selektive Töten von (H9/IIIB)-Zellen, die virales gp120 exprimieren, durch ein FLAG-Cyanovirin-N/Pseudomonas-Exotoxin Proteinkonjugat (PPE) veranschaulicht.
Bei 11 handelt es sich um ein Ablaufschema der Synthese eines Cyanovirin-Gens.
Bei 12 handelt es sich um ein Ablaufschema der Expression von synthetischem Cyanovirin.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Das Hauptgesamtziel der vorliegenden Erfindung ist, antivirale Proteine, Peptide und Derivate davon und breite medizinische Verwendungen davon, einschließlich prophylaktischer und/oder therapeutischer Anwendungen gegen Viren, bereitzustellen. Eine anfängliche Beobachtung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, war eine antivirale Aktivität in bestimmten Extrakten aus gezüchteten Cyanobakterien (Blaualgen), die bei einem anti-HIV-Screening getestet wurden. Bei dem Screening handelt es sich um eines, das 1986 konzipiert wurde (von M. R. Boyd von den National Institutes of Health) und seit 1988 am U.S. National Cancer Institute (NCI) entwickelt und durchgeführt worden ist (siehe Boyd, in AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, DeVita et al., Hrsg., Philadelphia: Lippincott, 1988, S. 305–317).
Cyanobakterien (Blaualgen) wurden für ein anti-HIV-Screening spezifisch ausgewählt, weil bekannt war, dass sie eine große Vielfalt strukturell einzigartiger und biologisch aktiver, nicht stickstoffhaltiger und von Aminosäuren abgeleiteter natürlicher Produkte produzieren (Faulkner, Nat. Prod. Rep. 11, 355-394, 1994, und Glombitza et al., in Algal and Cyanobacterial Biotechnology, Cresswell, R. C., et al., Hrsg., 1989, S. 211–218). Diese photosynthetischen prokaryotischen Organismen sind signifikante Produzenten zyklischer und linearer Peptide (Molekulargewicht im Allgemeinen < 3 kDa), die oft hepatotoxische oder antimikrobielle Eigenschaften aufweisen (Okino et al., Tetrahedron Lett. 34, 501–504, 1993; Krishnamurthy et al., PNAS USA 86, 770–774, 1989; Sivonen et al., Chem. Res. Toxicol. 5, 464–469, 1992; Carter et al., J. Org. Chem. 49, 236–241, 1984, und Frankmolle et al., J. Antibiot. 45, 1451–1457, 1992). Sequenzieruntersuchungen von Peptiden und Proteinen mit höherem Molekulargewicht aus Cyanobakterien haben sich im Allgemeinen auf diejenigen konzentriert, die mit primären metabolischen Vorgängen zusammenhängen, oder solche, die als phylogenetische Marker dienen können (Suter et al., FEBS Lett. 217, 279–282, 1987; Rumbeli et al., FEBS Lett. 221, 1–2, 1987; Swanson et al., J. Biol. Chem. 267, 16146–16154, 1992; Michalowski et al., Nucleic Acids Res. 18, 2186, 1990; Sherman et al., in The Cyanobacteria, Fay et al., Hrsg., Elsevier: N.Y., 1987, S. 1–33, und Rogers, in The Cyanobacteria, Fay et al., Hrsg., Elsevier: N.Y., 1987, S. 35–67). Im Allgemeinen waren Proteine mit antiviralen Eigenschaften nicht mit Cyanobakterien als Quelle in Zusammenhang gebracht worden.
Der Extrakt aus Cyanobakterien, der zu der vorliegenden Erfindung führte, war einer unter vielen Tausenden von unterschiedlichen Extrakten, die anfänglich zufällig ausgewählt und in dem vorstehend beschriebenen anti-HIV-Screening blind getestet wurden. Für etliche dieser Extrakte war vorläufig bestimmt worden, dass sie eine anti-HIV-Aktivität in dem NCI-Screening zeigten (Patterson et al., J. Phycol. 29, 125–130, 1993). Von dieser Gruppe wurde ein wässriger Extrakt aus Nostoc ellipsosporum, der wie beschrieben hergestellt worden war (Patterson, 1993, vorstehend) und der eine ungewöhnlich hohe anti-HIV-Stärke und einen ungewöhnlich hohen "therapeutischen Index" in vitro in dem primären NCI-Screening zeigte, zur ausführlichen Untersuchung ausgewählt. Eine spezifische, durch einen Bioassay geleitete Strategie wurde verwendet, um ein gegen HIV hochaktives, homogenes Protein zu isolieren und zu reinigen.
In der durch einen Bioassay geleiteten Strategie wird die ursprüngliche Auswahl des Extrakts zur Fraktionierung sowie die Entscheidungen, welche das anzuwendende gesamte chemische Isolierungsverfahren betreffen, und die Art der einzelnen Schritte darin durch die Interpretation biologischer Testdaten bestimmt. Der anti-HIV-Screeningassay (siehe z. B. Boyd, 1988, vorstehend; Weislow et al., J. Natl. Cancer Inst. 81, 577–586, 1989), der verwendet wird, um das Isolierungs- und Reinigungsverfahren zu leiten, misst den Grad des Schutzes menschlicher lymphoblastoider T-Zellen vor den cytopathischen Wirkungen von HIV. Fraktionen des Extrakts von Interesse werden unter Verwendung einer Vielfalt chemischer Mittel hergestellt und werden in dem primären Screening blind getestet. Aktive Fraktionen werden weiter aufgetrennt und die so erhaltenen Subfraktionen werden im Screening auf ähnliche Weise blind getestet. Dieses Verfahren wird so viele Male wiederholt, wie nötig ist, um die aktive(n) Verbindung(en), d. h. die antivi rale(n) Fraktion(en), die (eine) reine Verbindung(en) darstellt (darstellen), zu erhalten, die dann einer ausführlichen chemischen Analyse und Strukturaufklärung unterworfen werden kann (können).
Unter Verwendung dieser Strategie wurde gezeigt, dass wässrige Extrakte von Nostoc ellipsosporum ein antivirales Protein enthalten. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes antivirales Protein, das Cyanovirin-N benannt wird, aus Nostoc ellipsosporum und funktionelle Homologe davon, die "Cyanovirine" genannt werden, bereit. Der Begriff "Cyanovirin" wird hierin allgemein verwendet, um ein natives Cyanovirin oder jedes verwandte, funktionell äquivalente (d. h. antivirale) Protein, Peptid oder Derivat davon zu bezeichnen. Per Definition enthält ein verwandtes, funktionell äquivalentes Protein, Peptid oder Derivat davon in diesem Zusammenhang a) eine Sequenz von mindestens neun Aminosäuren, die direkt zu einer Subsequenz von neun zusammenhängenden Aminosäuren, die in einem nativen Cyanovirin enthalten ist, homolog ist und ist b) fähig, spezifisch an ein Virus, insbesondere ein Influenzavirus oder ein Retrovirus, genauer gesagt ein Primaten-Immundefizienzvirus, genauer gesagt, HIV-1, HIV-2 oder SIV, oder an eine infizierte Wirtszelle, die ein oder mehr virale Antigene exprimiert, genauer gesagt ein Hüllglykoprotein, wie zum Beispiel gp120, des jeweiligen Virus zu binden. Hierin bezeichnet der Begriff "Protein" eine Sequenz, die 100 oder mehr Aminosäuren umfasst, während "Peptid" eine Sequenz bezeichnet, die weniger als 100 Aminosäuren umfasst. Zusätzlich kann ein derartiges funktionell äquivalentes Protein oder Derivat davon die Aminosäuresequenz eines nativen Cyanovirins, besonders Cyanovirin-N (siehe SEQ ID NR: 2) umfassen, bei der 1–20, vorzugsweise 1–10, stärker bevorzugt 1, 2, 3, 4 oder 5 und am meisten bevorzugt 1 oder 2 Aminosäuren von einem oder beiden Enden entfernt worden sind, vorzugsweise von nur einem Ende und am meisten bevorzugt vom aminoterminalen Ende des nativen Cyanovirins. Alternativ dazu kann ein funktionell äquivalentes Protein oder Derivat davon die Aminosäuresequenz eines nativen Cyanovirins, besonders Cyanovirin-N (siehe SEQ ID NR: 2) umfassen, bei der 1–20, vorzugsweise 1–10, stärker bevorzugt 1, 2, 3, 4 oder 5 und am meisten bevorzugt 1 oder 2 Aminosäuren einem oder beiden Enden hinzugefügt worden sind, vorzugsweise von nur einem Ende und am meisten bevorzugt vom aminoterminalen Ende des nativen Cyanovirin.
Vorzugsweise umfasst das Protein, Peptid oder Derivat davon eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen zu der eines antiviralen Proteins von Nostoc ellipsosporum homolog ist. Mit "im Wesentlichen homolog" ist eine ausreichende Homologie gemeint, um das Protein, Peptid oder Derivat davon antiviral zu machen, mit einer antiviralen Aktivität, die für ein antivirales Protein, das aus Nostoc ellipsosporum isoliert wurde, kennzeichnend ist. Mindestens etwa 50% Homologie, vorzugsweise mindestens etwa 75% Homologie, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% Homologie sollte existieren. Ein Cyanovirinkonjugat umfasst ein Cyanovirin, das an ein ausgewähltes Wirkmolekül oder mehrere ausgewählte Wirkmoleküle, wie zum Beispiel ein Toxin oder ein immunologisches Reagenz, gekoppelt ist. "Immunologisches Reagenz" wird verwendet, um einen Antikörper, ein Immunglobulin und ein immunologisches Erkennungselement zu bezeichnen. Bei einem immunologischen Erkennungselement handelt es sich um ein Element, wie zum Beispiel ein Peptid, z. B. die FLAG-Sequenz des rekombinanten Cyanovirin-FLAG Fusionsproteins, das durch immunologische Erkennung die Isolierung und/oder Reinigung und/oder Analyse des Proteins oder Peptids, an dem es befestigt ist, erleichtert. Ein Cyanovirin-Fusionsprotein ist eine Art Cyanovirinkonjugat, wobei ein Cyanovirin an ein anderes Protein oder mehrere andere Proteine gekoppelt ist, das bzw. die gewünschte Eigenschaften oder Wirkfunktionen, wie zum Beispiel cytotoxische oder immunologische Eigenschaften oder andere gewünschte Eigenschaften, wie zum Beispiel die Isolierung, Reinigung oder Analyse des Fusionsproteins zu erleichtern, aufweist bzw. aufweisen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Protein bereit, das durch ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz der SEQ ID NR: 1, ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz der SEQ ID NR: 3, ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 kodiert, oder ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 4 kodiert, kodiert wird. Vorzugsweise kodieren die zuvor erwähnten Nukleinsäuremoleküle für mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2, die wünschenswerterweise antivirale Aktivität aufweisen. Falls die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 die Aminosäuren 30–32 umfassen, sind die Aminosäuren 30–32 wünschenswerterweise glykosylierungsbeständig gemacht worden, erhalten aber antivirale Aktivität aufrecht. Vorzugweise sind die Aminosäuren 30–32 der SEQ ID NR: 2 durch Deletion oder Substitution der Aminosäure 30 glykosylierungsbeständig gemacht worden. Vorzugsweise ist die Aminosäure 30 durch eine Aminosäure substituiert worden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Glutamin und Valin. Gegebenenfalls kann die Aminosäure 51 deletiert oder zum Beispiel durch Glycin substituiert werden. Es wird erwartet, dass eine Substitution oder Deletion des Prolins an Position 51 die Dimerisierungsbeständigkeit verstärkt; es ist bekannt, dass die Dimerisierung eines Cyanovirins unter bestimmten Bedingungen vorkommt (Yang et al., J. Molec. Biol., 288, 403–412, 1999; Bewley et al., JACS, 122, 6009–6016 (2000)), und die Faltungsstabilität und Beständigkeit gegen physiochemi schen Abbau sind wünschenswerte zusätzliche Attribute der Cyanovirine. Derartige Eigenschaften sind für eine Isolierung und Reinigung und Massenproduktion von Cyanovirinen in prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen/Organismen in großem Maßstab wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Erhalten eines Cyanovirins aus Nostoc ellipsosporum bereit. Ein derartiges Verfahren umfasst (a) einen Extrakt von Nostoc ellipsosporum zu identifizieren, der antivirale Aktivität enthält, (b) gegebenenfalls Biopolymere mit hohem Molekulargewicht aus dem Extrakt zu entfernen, (c) den Extrakt, geleitet von einem antiviralen Bioassay, zu fraktionieren, um einen Rohextrakt von Cyanovirin zu erhalten, und (d) den Rohextrakt durch Reverse-Phase-HPLC zu reinigen, um Cyanovirin zu erhalten (siehe auch Beispiel 1). Genauer gesagt bezieht das Verfahren die Verwendung von Ethanol, um Biopolymere mit hohem Molekulargewicht aus dem Extrakt zu entfernen, und die Verwendung eines anti-HIV-Bioassays, um die Fraktionierung des Extrakts zu leiten, ein.
Cyanovirin-N (ein Protein mit genau der SEQ ID NR: 2), das unter Verwendung des zuvor erwähnten Verfahrens isoliert und gereinigt wurde, wurde herkömmlichen Verfahren unterworfen, die normalerweise verwendet werden, um die Aminosäuresequenz eines bestimmten reinen Proteins zu bestimmen. Somit wurde das Cyanovirin anfänglich durch N-terminalen Edman-Abbau des intakten Proteins und zahlreicher überlappender Peptidfragmente, die durch Endoproteinase-Verdau erzeugt wurden, sequenziert. Die Aminosäureanalyse stimmte mit der abgeleiteten Sequenz überein. Eine ESI-Massenspektrometrie von reduziertem, HPLC-gereinigtem Cyanovirin-N zeigte ein mit dem berechneten Wert überereinstimmendes molekulares Ion. Diese Untersuchungen zeigten an, dass Cyanovirin-N aus Nostoc ellipsosporum aus einer einzigen Sequenz von 101 Aminosäuren bestand, die wenig oder keine signifikante Homologie zu früher beschriebenen Proteinen oder Transkriptionsprodukten bekannter Nukleotidsequenzen aufwies. Nicht mehr als acht zusammenhängende Aminosäuren von Cyanovirin wurden in irgendwelchen Aminosäuresequenzen von bekannten Proteinen gefunden, noch gab es irgendwelche bekannten Proteine aus irgendeiner Quelle, die mehr als 13% Sequenzhomologie mit Cyanovirin-N enthielten. In Anbetracht der chemisch abgeleiteten Aminosäuresequenz von Cyanovirin-N wurde ein entsprechendes rekombinantes Cyanovirin-N (r-Cyanovirin-N) erzeugt und verwendet, um definitiv zu etablieren, dass die abgeleitete Aminosäuresequenz tatsächlich gegen Viren, wie zum Beispiel HIV, aktiv war (Boyd et al., 1995, vorstehend; siehe auch Beispiele 2–5).
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung isolierte und gereinigte Nukleinsäuremoleküle und synthetische Nukleinsäuremoleküle bereit, die eine kodierende Sequenz für ein Cyanovirin umfassen, wie zum Beispiel ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz der SEQ ID NR: 1, ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz der SEQ ID NR: 3, ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, kodierend für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2, ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, kodierend für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 4, und ein Nukleinsäuremolekül, das im Wesentlichen homolog zu einem oder mehreren der zuvor erwähnten Nukleinsäuremoleküle ist. Mit "im Wesentlichen homolog" ist eine ausreichende Homologie gemeint, um das Protein, Peptid oder Derivat davon antiviral zu machen, mit einer antiviralen Aktivität, die für ein antivirales Protein, das aus Nostoc ellipsosporum isoliert wurde, kennzeichnend ist. Mindestens etwa 50% Homologie, vorzugsweise mindestens etwa 75% Homologie, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% Homologie sollte existieren.
Das vorliegende erfinderische Nukleinsäuremolekül umfasst vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die für mindestens neun (vorzugsweise mindestens zwanzig, stärker bevorzugt mindestens dreißig und am meisten bevorzugt mindestens fünfzig) zusammenhängende Aminosäuren der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 kodiert. Das vorliegende erfinderische Nukleinsäuremolekül umfasst auch eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz eines nativen Cyanovirins, besonders Cyanovirin-N umfasst, bei dem 1–20, vorzugsweise 1–10, stärker bevorzugt 1, 2, 3, 4, oder 5, und am meisten bevorzugt 1 oder 2 Aminosäuren von einem oder beiden Enden entfernt worden sind, vorzugsweise von nur einem Ende und am meisten bevorzugt vom aminoterminalen Ende des nativen Cyanovirins. Alternativ dazu kann das Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz eines nativen Cyanovirins, besonders Cyanovirin-N (siehe SEQ ID NR: 2) umfasst, bei der 1–20, vorzugsweise 1–10, stärker bevorzugt 1, 2, 3, 4 oder 5 und am meisten bevorzugt 1 oder 2 Aminosäuren einem oder beiden Enden hinzugefügt worden sind, vorzugsweise von nur einem Ende und am meisten bevorzugt vom aminoterminalen Ende des nativen Cyanovirins. Vorzugsweise kodiert das isolierte und gereinigte Nukleinsäuremolekül für ein Protein oder Peptid, das mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst, die wünschenswerterweise antivirale Aktivität aufweisen. Falls die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 die Aminosäuren 30–32 umfassen, sind die Aminosäuren 30–32 wünschenswerterweise glykosylierungsbeständig gemacht worden, erhalten aber antivirale Aktivität aufrecht. Vorzugweise sind die Aminosäuren 30–32 der SEQ ID NR: 2 durch Deletion oder Substitution der Aminosäure 30 glykosylierungsbeständig gemacht worden. Vorzugsweise ist die Aminosäure 30 durch eine Aminosäure substituiert worden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Glutamin und Valin. Gegebenenfalls kann die Aminosäure 51 deletiert oder zum Beispiel durch Glycin substituiert werden. Derartige Deletionen und Substitutionen gehören zum Fachwissen, wie nachstehend angezeigt wird.
In Anbetracht der vorliegenden Offenbarung wird es dem Fachmann ersichtlich sein, dass eine teilweise Gensequenz von Cyanovirin-N wahrscheinlich ausreichen wird, um für ein vollständig funktionelles, d. h. antivirales, wie zum Beispiel anti-Influenza- oder anti-HIV-Cyanovirin zu kodieren. Eine minimale unentbehrliche kodierende DNA-Sequenz bzw. DNA-Sequenzen, die für ein funktionelles Cyanovirin kodiert bzw. kodieren, kann bzw. können durch einen Fachmann leicht bestimmt werden, zum Beispiel durch Synthese und Auswertung von Subsequenzen, die das native Cyanovirin umfassen, und durch ortsspezifische Mutageneseuntersuchungen der für Cyanovirin-N kodierenden DNA-Sequenz.
Unter Verwendung einer geeigneten kodierenden DNA-Sequenz kann ein rekombinantes Cyanovirin durch gentechnische Verfahren hergestellt werden (für einen allgemeinen Hintergrund siehe z. B. Nicholl, in An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge University Press: Cambridge, 1994, S. 1–5 & 127–130; Steinberg et al., in Recombinant DNA Technology Concepts and Biomedical Applications, Prentice Hall: Englewood Cliffs, N.J., 1993, S. 81–124 & 150–162; Sofer, in Introduction to Genetic Engineering, Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, 1991, S. 1–21 & 103–126; Old et al., in Principles of Gene Manipulation, Blackwell Scientific Publishers: London, 1992, S. 1–13 & 108–221, und Emtage, in Delivery Systems for Peptide Drugs, Davis et al., Hrsg., Plenum Press: New York, 1986, S. 23–33). Zum Beispiel kann ein Gen von Nostoc ellipsosporum oder eine cDNA, das bzw. die für ein Cyanovirin kodiert, identifiziert und subkloniert werden. Das Gen oder die cDNA kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden und in einen geeigneten Protein-synthetisierenden Organismus (z. B. E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris oder andere Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierzellen) abgegeben werden, wo das Gen, unter der Kontrolle eines endogenen oder exogenen Promoters, richtig transkribiert und translatiert werden kann. Alternativ dazu kann der Expressionsvektor zur Herstellung in großem Maßstab zum Beispiel einer Pflanze oder einem Tier verabreicht werden (siehe z. B. Fischer et al., Transgenic Res., 9 (4–5), 279–299, 2000; Fischer et al., J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 14, 83–92, 2000; deWilde et al., Plant Molec. Biol., 43, 347–359, 2000; Houdebine, Transgenic Research, 9, 305–320, 2000; Brink et al., Theriogenology, 53, 139–148, 2000; Pollock et al., J. Immunol. Methods, 231, 147–157, 1999; Conrad et al., Plant Molec. Biol., 38, 101–109, 1998; Staub et al., Nature Biotech., 18, 333– 338, 2000; McCormick et al., PNAS USA, 96, 703-708, 1999; Zeitlin et al., Nature Biotech., 16, 1361–1364 (1998); Tacker et al., Microbes and Infection, 1, 777–783, 1999, und Tacket et al., Nature Med., 4 (5), 607–609, 1998). Derartige Expressionsvektoren (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phagen-, Cosmid-, virale und Plasmid-Vektoren) sind Fachleuten bekannt, genau wie Reagenzien und Techniken, die zum Gentransfer geeignet sind (z. B. Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Mikroinjektion, Transformation usw.). Anschließend kann das rekombinant hergestellte Protein unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardtechniken (z. B. Chromatographie, Zentrifugation, differentielle Löslichkeit, isoelektrisches Fokussieren usw.) isoliert und gereinigt und auf antivirale Aktivität hin analysiert werden. Falls ein Cyanovirin in isolierten eukaryotischen Zellen oder in einem eukaryotischen Organismus, wie zum Beispiel einer Pflanze (siehe die vorstehenden Referenzen und auch Methods in Biotechnology, Recombinant Proteins from Plants. Production and Isolation of Clinically Useful Compounds, Cunningham und Porter, Herausgeber, Humana Press: Totowa, N. J., 1998), rekombinant hergestellt werden soll, wird die N-gebundene Glykosylierungsstelle an Position 30 (Asn30–Thr31–Ser32) wünschenswerterweise glykosylierungsbeständig gemacht, wie zum Beispiel in Übereinstimmung mit den hierin beschriebenen Verfahren. Gegebenenfalls wird die Aminosäure 51 deletiert oder zum Beispiel durch Glycin substituiert.
Alternativ dazu kann ein natives Cyanovirin von Nostoc ellipsosporum durch nicht rekombinante Verfahren (siehe z. B. Beispiel 1 und vorstehend) erhalten und durch herkömmliche Techniken sequenziert werden. Die Sequenz kann dann verwendet werden, um die entsprechende DNA zu synthetisieren, die in einen geeigneten Expressionsvektor subkloniert und zur rekombinanten Massenproduktion des gewünschten Proteins in eine Protein-produzierende Zelle abgegeben werden kann.
In dieser Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung auch einen Vektor bereit, der eine DNA-Sequenz umfasst, z. B. eine Gensequenz von Nostoc ellipsosporum für Cyanovirin, eine für ein Cyanovirin kodierende cDNA oder eine synthetische, für ein Cyanovirin kodierende DNA-Sequenz, eine den Vektor umfassende Wirtszelle und ein Verfahren zur Verwendung einer derartigen Wirtszelle, um ein Cyanovirin herzustellen.
Die DNA, ob isoliert und gereinigt oder synthetisch, oder cDNA, die für ein Cyanovirin kodiert, kann für das ganze Cyanovirin oder ein Teilstück davon kodieren. Wo die DNA oder cDNA nicht die gesamte kodierende Sequenz des nativen Cyanovirins umfasst, kann die DNA oder cDNA als Teil einer Genfusion subkloniert werden. Bei einer transkriptionellen Genfusion enthält die DNA oder cDNA ihre eigene Kontrollsequenz, die eine richtige Produktion von Protein steuert (z. B. Ribosomenbindungsstelle, Transla tions-Initiationscodon usw.) und die transkriptionellen Kontrollsequenzen (z. B. Promotorelemente und/oder Enhancer) werden durch den Vektor bereitgestellt. Bei einer translationalen Genfusion werden transkriptionelle Kontrollsequenzen sowie mindestens einige der translationalen Kontrollsequenzen (d. h. das translationale Initiationscodon) durch den Vektor bereitgestellt. Im Falle einer translationalen Genfusion wird ein chimäres Protein hergestellt.
Gene können auch für spezifische Fusionsproteine konstruiert werden, die eine funktionelle Cyanovirin-Komponente plus eine Fusionskomponente enthalten, die dem zusammengesetzten Protein ein zusätzliches gewünschtes Attribut bzw. zusätzliche gewünschte Attribute verleihen. Zum Beispiel kann eine Fusionssequenz für ein Toxin oder immunologisches Reagenz, wie vorstehend definiert, hinzugefügt werden, um die Reinigung und Analyse des funktionellen Proteins zu erleichtern (wie z. B. das in den Beispielen 2–5 ausführlich beschriebene FLAG-Cyanovirin-N Fusionsprotein).
Gene können spezifisch konstruiert werden, um für Fusionsproteine zu kodieren, die ein Cyanovirin enthalten, das zum spezifischen Abzielen auf Viren oder vireninfizierte Zellen, z. B. HIV und/oder HIV-infizierte Zellen oder Influenza und/oder Influenza-infizierte Zellen, an ein Wirkprotein, wie zum Beispiel ein Toxin oder immunologisches Reagenz, gekoppelt ist. In diesen Fällen dient die Cyanovirin-Einheit nicht nur als neutralisierendes Mittel sondern auch als Zielmittel, um die Wirkaktivitäten dieser Moleküle selektiv gegen ein bestimmtes Virus, wie zum Beispiel HIV oder Influenza, zu richten. Somit kann zum Beispiel ein therapeutisches Mittel durch Kombinieren der auf HIV zielenden Funktion oder auf Influenza zielenden Funktion eines funktionellen Cyanovirins mit einem auf Neutralisieren von infektiösen Viren und/oder Zerstören von Zellen, die infektöse Viren, wie zum Beispiel HIV oder Influenza, produzieren, gezieltes Toxin erhalten werden. Auf ähnliche Weise kann ein therapeutisches Mittel erhalten werden, das die auf Viren zielende Funktion eines Cyanovirins mit der Multivalenz und den Wirkfunktionen verschiedener Immunglobulin-Subklassen kombiniert. Beispiel 6 veranschaulicht die auf Viren zielenden, spezifisch auf gp120 zielenden Eigenschaften eines Cyanovirins weiter.
Ähnliche Grundprinzipien liegen ausgedehnten therapeutischen Entwicklungsanstrengungen zu Grunde, welche die auf gp120 von HIV zielenden Eigenschaften von sCD4 ausnutzen. Zum Beispiel sind sCD4-Toxin-Konjugate hergestellt worden, bei denen sCD4 an eine Pseudomonas Exotoxin-Komponente (Chaudhary et al., in The Human Retrovirus, Gallo et et, Hrsg., Academic Press: San Diego, 1991, S. 379–387, und Chaudhary et al., Nature 335, 369–372, 1988) oder an eine Diphtherietoxin-Komponente (Aullo et al., EMBO J. 11, 575–583, 1992) oder an eine Ricin A-Ketten-Komponente (Till et al., Science 242, 1166–1167, 1988) gekoppelt ist. Auf ähnliche Weise sind sCD4-Immunglobulin-Konjugate bei Bemühungen hergestellt worden, die Geschwindigkeit der in-vivo-Beseitigung von funktioneller sCD4-Aktivität zu senken, den Plazenta-Transfer zu verstärken und ein gezieltes Rekrutieren immunologischer Mechanismen der Pathogeneliminierung, wie zum Beispiel phagozytisches Verschlingen und Töten durch antikörperabhängige, zellvermittelte Cytotoxizität, zu bewirken, HIV-infizierte Zellen und Viren zu töten und/oder zu entfernen (Capon et al., Nature 337, 525–531, 1989; Traunecker et al., Nature 339, 68–70, 1989, und Langner et al., 1993, vorstehend). Während derartige CD4-Immunglobulin-Konjugate (manchmal "Immunadhäsine" genannt) tatsächlich vorteilhafte pharmakokinetische und Verteilungs-Attribute in vivo und anti-HIV-Wirkungen in vitro gezeigt haben, sind die klinischen Ergebnisse entmutigend gewesen (Schooley et al., 1990, vorstehend; Husson et al., 1992, vorstehend, und Langner et al., 1993, vorstehend). Dies ist nicht überraschend, da klinische Isolate von HIV im Gegensatz zu Laborstämmen gegen Binden und Neutralisieren durch sCD4 hoch beständig sind (Orloff et al., 1995, vorstehend, und Moore et al., 1992, vorstehend). Deshalb können die außerordentlich breiten Zieleigenschaften eines funktionellen Cyanovirins auf Viren, z. B. Primaten-Retroviren im Allgemeinen und insbesondere klinische und Laborstämme (Boyd et al., 1995, vorstehend, und Gustafson et al., 1995, vorstehend), besonders vorteilhaft zum Kombinieren mit Toxinen, Immunglobulinen und anderen ausgewählten Wirkproteinen sein.
Auf Viren gezielte Konjugate können entweder durch gentechnische Verfahren (siehe zum Beispiel Chaudhary et al., 1988, vorstehend) oder durch chemisches Koppeln der zielenden Komponente mit einer Wirkkomponente hergestellt werden. Die praktikabelste oder geeignetste Technik, die verwendet werden soll, um ein gegebenes Cyanovirinkonjugat oder Fusionsprotein zu konstruieren, wird beruhend auf einer Erwägung der Kennzeichen des jeweiligen Wirkmoleküls ausgewählt, das zum Koppeln an ein Cyanovirin ausgewählt ist. Zum Beispiel kann bei einem nicht proteinösen ausgewählten Wirkmolekül chemisches Koppeln anstelle von gentechnischen Verfahren die einzig praktikable Option zum Erzeugen des gewünschten Cyanovirinkonjugats sein.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch Nukleinsäuremoleküle bereit, die für Cyanovirin Fusionsproteine kodieren. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereit, das SEQ ID NR: 3 und im Wesentlichen homologe Sequenzen davon umfasst. Auch wird ein Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Cyanovirin Fusionsprotein kodiert, und ein Verfahren zum Erhalten eines Cyanovirin Fusionsproteins durch Expression des für ein Cyanovirin Fusionsprotein kodierenden Vektors in einem Protein-synthetisierenden Organismus, wie vorstehend beschrieben, bereitgestellt. Dementsprechend werden Cyanovirin Fusionsproteine auch bereitgestellt.
Angesichts des Vorstehenden stellt die vorliegende Erfindung ferner ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül bereit, das eine für ein Cyanovirin kodierende Sequenz umfasst, wie zum Beispiel eine der zuvor erwähnten Nukleinsäuren, nämlich ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 kodiert, ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 4 kodiert, ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz der SEQ ID NR: 1 umfasst, oder ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz der SEQ ID NR: 3 umfasst, gekoppelt an eine zweite Nukleinsäure, die für ein Wirkprotein kodiert. Die erste Nukleinsäure umfasst vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die für mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 kodiert, die für ein funktionelles Cyanovirin kodiert, und die zweite Nukleinsäure kodiert vorzugsweise für ein Wirkprotein, wie zum Beispiel ein Toxin oder immunologisches Reagenz, wie vorstehend beschrieben.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch ferner ein isoliertes und gereinigtes Fusionsprotein bereit, das durch ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz der SEQ ID NR: 1 umfasst, ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz der SEQ ID NR: 3 umfasst, ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 kodiert, oder ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 4 kodiert, kodiert wird, von denen irgendeines an eine zweite Nukleinsäure, die für ein Wirkprotein kodiert, gekoppelt ist. Vorzugsweise kodieren die zuvor erwähnten Nukleinsäuremoleküle für mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2, die wünschenswerterweise antivirale Aktivität aufweisen, gekoppelt an ein Wirkmolekül, wie zum Beispiel ein Toxin oder immunologisches Reagenz, wie vorstehend beschrieben. Vorzugsweise zielt das Wirkmolekül auf ein Virus, stärker bevorzugt HIV oder Influenza und am meisten bevorzugt das Glykoprotein gp120 von HIV. Falls die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 die Aminosäuren 30–32 umfassen, sind die Aminosäuren 30–32 wünschenswerterweise glykosylierungsbeständig gemacht worden, erhalten aber eine antivirale Aktivität aufrecht. Vorzugsweise sind die Aminosäuren 30–32 der SEQ ID NR: 2 durch Deletion oder Substitution der Aminosäure 30 glykosylierungsbeständig gemacht worden. Vorzugsweise ist die Aminosäure 30 durch eine Aminosäure substituiert worden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Glutamin und Valin. Gegebenenfalls kann die Aminosäure 51 deletiert oder zum Beispiel durch Glycin substituiert weder.
Das Koppeln kann auf DNA-Ebene oder durch chemisches Koppeln wie vorstehend beschrieben bewirkt werden. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Cyanovirin-Wirkprotein-Konjugat durch (a) Auswählen eines gewünschten Wirkproteins oder -peptids; (b) Synthetisieren einer zusammengesetzten kodierenden DNA-Sequenz, umfassend eine erste kodierende DNA-Sequenz, die eine der zuvor erwähnten Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für ein funktionelles Cyanovirin kodiert, gekoppelt an eine zweite kodierende DNA-Sequenz für ein Wirkprotein oder -peptid, z. B. ein Toxin oder immunologisches Reagenz; (c) Exprimieren der zusammengesetzten kodierenden DNA-Sequenz in einem geeigneten Protein-synthetisierenden Organismus und (d) Reinigen des gewünschten Fusionsproteins oder -peptids zu im Wesentlichen reiner Form erhalten werden. Alternativ dazu kann ein erfindungsgemäßes Cyanovirin-Wirkmolekül-Konjugat durch (a) Auswählen eines gewünschten Wirkmoleküls und eines Cyanovirins oder Cyanovirin-Fusionsproteins; (b) chemisches Koppeln des Cyanovirin oder Cyanovirin-Fusionsproteins an das Wirkmolekül und (c) Reinigen des gewünschten Cyanovirin-Wirkmolekül-Konjugats zu im Wesentlichen reiner Form erhalten werden.
Konjugate, die ein funktionelles Cyanovirin umfassen (z. B. ein antivirales Protein oder antivirales Peptid, das mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst, wie zum Beispiel SEQ ID NR: 2, wobei die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren an Viren binden, insbesondere infektiöse Viren, wie zum Beispiel Influenzavirus oder HIV, in welchem Fall das Cyanovirin an gp120 bindet), gekoppelt an einen anti-Cyanovirin-Antikörper oder mindestens eine Wirkkomponente, die gleich oder unterschiedlich sein kann, wie zum Beispiel ein Toxin, ein immunologisches Reagenz oder anderes funktionelles Reagenz, können sogar noch spezifischer entworfen werden, um das einzigartige virale Zielen von Cyanovirinen, z. B. auf gp120 zielende Eigenschaften, auszunutzen.
Andere funktionelle Reagenzien, die in den vorliegenden erfinderischen Konjugaten als Wirkkomponenten verwendet werden können, können zum Beispiel Polyethylenglycol, Dextran, Albumin und dergleichen einschließen, deren beabsichtigte Wirkfunktionen eine oder mehrere der Folgenden einschließen können: die Stabilität des Konjugats zu verbessern; die Halbwertszeit des Konjugats zu erhöhen; die Beständigkeit des Konjugats gegen Proteolyse zu erhöhen; die Immunogenität des Konjugats zu verringern; ein Mittel bereitzustellen, ein funktionelles Cyanovirin auf einer festen Unterlagenmatrix zu befestigen oder zu immobilisieren (siehe z. B. Harris, in Poly(Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, Harris, Hrsg., Plenum Press: New York (1992), S. 1–14). Konjugate können darüberhinaus ein funktionelles Cyanovirin umfassen, das an mehr als ein Wirkmolekül gekoppelt ist, von denen jedes gegebenenfalls unterschiedliche Wirkfunktionen haben kann (wie zum Beispiel ein Toxinmolekül (oder ein immunologisches Reagenz) und ein Polyethylenglycol-(oder Dextran- oder Albumin-)molekül). Vielfältige Anwendungen und Verwendungen funktioneller Proteine und Peptide, wie zum Beispiel im vorliegenden Fall ein funktionelles Cyanovirin, befestigt oder immobilisiert auf einer festen Unterlagenmatrix, werden genauer für Poly(ethylenglycol)-konjugierte Proteine oder Peptide in einem Übersichtsartikel von Holmberg et al. (In Poly(Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, Harris, Hrsg., Plenum Press: New York, 1992, S. 303–324) beispielhaft angeführt. Bevorzugte Beispiele für feste Unterlagenmatrizes schließen Magnetkugeln, eine Durchflussmatrix und eine Matrix, die ein Verhütungsmittel umfasst, wie zum Beispiel ein Kondom, ein Diaphragma, eine Portiokappe, einen Vaginalring oder einen Schwamm, ein.
Beispiel 6 deckt neue, auf gp120 gerichtete Wirkungen von Cyanovirinen auf. Zusätzliche Erkenntnisse sind von Esser et al. (J. Virol., 73, 4360–4371, 1999) berichtet worden. Sie beschrieben eine Reihe von Untersuchungen, die weiter bestätigten, dass Cyanovirin das gp120-vermittelte Binden und die Fusion intakter HIV-1-Viruspartikel an Wirtszellen blockieren. Sie stellten auch eine zusätzliche Bestätigung bereit, dass Cyanovirine die durch Hüllglykoprotein vermittelte Infektivität anderer Viren einschließlich des Katzen-Immundefizienzvirus (FIV) inhibieren.
Der Bereich antiviraler Aktivität (Boyd et al., 1995, vorstehend) von Cyanovirin gegen vielfältige CD4⁺-trope immundefiziente Virenstämme in verschiedenen Zielzellen ist bemerkenswert; alle getesteten Stämme von HIV-1, HIV-2 und SIV waren ähnlich empfindlich gegen Cyanovirin; klinische Isolate und Laborstämme zeigten eine im Wesentlichen äquivalente Empfindlichkeit. Die Kokultivierung chronisch infizierter und nicht infizierter CEM-SS Zellen mit Cyanovirin inhibierte die virale Replikation nicht, verursachte aber eine konzentrationsabhängige Inhibierung von Zell-Zell-Fusion und Virenübertragung; ähnliche Ergebnisse von Bindungs- und Fusionsinhibierungsassays, die HeLa-CD4-LTR-β-Galaktosidase-Zellen einsetzten, stimmten mit einer Cyanovirin-Inhibierung von Virus-Zell- und/oder Zell-Zell-Bindung überein.
Die antivirale, z. B. anti-HIV-, Aktivität der erfindungsgemäßen Cyanovirine und Konjugate davon kann ferner in einer Reihe miteinander verwandter antiviraler in-vitro-Assays demonstriert werden (Gulakowski et al., J. Virol. Methods 33, 87–100, 1991), die antivirale Aktivität bei Menschen exakt vorhersagen. Diese Assays messen die Fähigkeit von Verbindungen, die Replikation von HIV und/oder die cytopathischen Wirkungen von HIV auf menschliche Zielzellen zu verhindern. Diese Messungen korrelieren direkt mit der Pathogenese HIV-induzierter Erkrankungen in vitro. Man glaubt, dass die Ergebnisse der Analyse der antiviralen Aktivität von Cyanovirinen oder Konjugaten, wie in den Bei spielen 5 und 13 dargelegt und wie in den 8, 9 und 10 veranschaulicht wird, exakt die antivirale Aktivität dieser Produkte in vivo bei Menschen vorhersagen und deshalb die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung etablieren. Darüberhinaus ist die Nützlichkeit von Cyanovirinen und Konjugaten, da die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Verwendung von Cyanovirinen und Konjugaten ex vivo bereitstellt (siehe zum Beispiel die in den Beispielen 5 und 13 und in den 6 und 7 dargelegten Ergebnisse), noch sicherer.
Es kann gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Cyanovirine und Konjugate davon ein Virus hinhibieren, besonders ein Retrovirus, genauer gesagt ein Immundefizienzvirus, wie zum Beispiel das menschliche Immundefizienzvirus, d. h. HIV-1 oder HIV-2. Die erfindungsgemäßen Cyanovirine und Konjugate können verwendet werden, um andere Retroviren sowie andere Viren zu inhibieren (siehe z. B. Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, Flint et al., Hrsg., ASM Press: Washington, D.C., 2000, besonders Kapitel 19). Beispiele für Viren, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen Retroviren des Typs C und Typs D, HTLV-1, HTLV-2, HIV, FIV, FLV, SIV, MLV, BLV, BIV, equines infektiöses Virus, Anämievirus, Vogelsarkom-Viren, wie zum Beispiel Rous-Sarkom-Virus (RSV), Hepatitisviren des Typs A, B, non-A und non-B, Arboviren, Varicellaviren, menschliches Herpesvirus (z. B. HHV-6), Masern-, Mumps- und Rötelnviren ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Cyanovirine und Konjugate davon können auch verwendet werden, um eine Influenza virale Infektion prophylaktisch und therapeutisch in Übereinstimmung mit den hierin dargelegten Verfahren zu inhibieren (siehe z. B. Fields Virology, 3. Auflage, Fields et al., Hrsg., Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia, PA, 1996, besonders Kapitel 45).
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur prophylak tischen und therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion, insbesondere einer Influenza viralen Infektion, eines Wirtes bereit. Das Verfahren umfasst, dem Wirt eine wirksame Menge eines antiviralen Proteins, antiviralen Peptids, antiviralen Proteinkonjugats oder antiviralen Peptidkonjugats zu verabreichen, umfassend mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2, wobei die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren nicht glykosyliert sind und antivirale Aktivität aufweisen, worauf die virale Infektion inhibiert wird. Das antivirale Protein oder Peptid kann von einem aus Nostoc ellipsosporum erhaltenen oder in Übereinstimmung mit den vorstehend beschriebenen Verfahren rekombinant produzierten Cyanovirin abgeleitet werden. Nicht glykosylierte antivirale Proteine und Peptide können in prokaryotischen Zellen/Organismen hergestellt werden. In derartigen nicht glykosylierten antiviralen Proteinen und antiviralen Peptiden kann die Aminosäure 51 deletiert oder zum Beispiel durch Glycin substituiert werden. Nicht glykosylierte antivirale Proteine oder Peptide können auch in eukaryotischen Zellen/Organismen produziert werden, indem ein Teil eines Cyanovirins, wie zum Beispiel das der SEQ ID NR: 2, das keine Glykosylierungstelle enthält, oder das ganze Cyanovirin, wie zum Beispiel das der SEQ ID NR: 2, oder ein Teil davon, das eine Glykosylierungsstelle enthält, die wie hierin beschrieben und beispielhaft aufgeführt glykosylierungsbeständig gemacht worden ist, exprimiert wird. Falls die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 die Aminosäuren 30–32 umfassen, ist die Aminosäure 30 wünschenswerterweise deletiert oder substituiert worden. Falls die Aminosäure 30 substituiert ist, ist die Aminosäure vorzugsweise durch eine Aminosäure substituiert, die aus der Gruppe, bestehend aus Alanin, Glutamin und Valin, ausgewählt ist, und, falls die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 ferner die Aminosäure 51 umfassen, ist die Aminosäure 51 gegebenenfalls deletiert oder zum Beispiel durch Glycin substituiert. Wenn es sich bei der viralen Infektion um eine Influenza virale Infektion handelt, wird das antivirale Protein, antivirale Peptid, antivirale Proteinkonjugat oder antivirale Peptidkonjugat dem Wirt topisch verabreicht, vorzugsweise im Atmungssystem der Wirtes, vorzugsweise als ein Aerosol oder Mikropartikel-Pulver.
Cyanovirine und Konjugate davon umfassen gemeinsam Proteine und Peptide und sind als solche besonders empfänglich für eine Hydrolyse von Amidbindungen (die z. B. durch Peptidase katalysiert wird) und eine Zerstörung unentbehrlicher Disulfidbindungen oder eine Bildung inaktivierender oder unerwünschter Disulfidbindungen (Carone et al., J. Lab. Clin. Med. 100, 1–14, 1982). Es gibt verschiedene Wege, die Molekülstruktur zu ändern, falls nötig, um dem Cyanovirin oder Konjugat davon eine erhöhte Stabilität zu verleihen (Wunsch, Biopolymers 22, 493–505, 1983, und Samanen, in Polymeric Materials in Medication, Gebelein et al., Hrsg., Plenum Press: New York, 1985, S. 227–242), die zur Herstellung und Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Cyanovirine oder Konjugate davon enthalten, für therapeutische oder prophylaktische Anwendungen gegen Viren, z. B. HIV, unentbehrlich sein kann. Mögliche Optionen für nützliche chemische Modifikationen eines Cyanovirins oder Konjugats schließen die Folgenden ein (angepasst nach Samanen, J. M., 1985, vorstehend), sind aber nicht darauf beschränkt: (a) Olefinsubstitution, (b) Carbonylreduktion, (c) D-Aminosäuresubstitution, (d) N-Methylsubstitution, (e) C-Methylsubstitution, (f) C-C'-Methyleninsertion, (g) Dehydroaminosäureninsertion, (h) Retro-Inverso-Modifikation, (i) N-terminal-C-terminal-Zyklisierung und (j) Thiomethylenmodifikation. Cyanovirine und Konjugate davon können auch durch kovalente Befestigung von Kohlenhydrat- und Polyoxyethylen derivaten modifiziert werden, von denen erwartet wird, dass sie die Stabilität und Beständigkeit gegen Proteolyse erhöhen (Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs, Holcenberg et al., Hrsg., John Wiley: New York, 1981, S. 367–378).
Andere wichtige allgemeine Betrachtungen für das Entwerfen von Abgabestrategiesystemen und Zusammensetzungen und für Verabreichungswege, für Protein- und Peptidarzneistoffe, wie zum Beispiel Cyanovirine und Konjugate davon (Eppstein, CRC Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 5, 99–139, 1988; Siddiqui et al., CRC Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 3, 195–208, 1987; Banga et al., Int. J. Pharmaceutics 48, 15–50, 1988; Sanders, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 15, 95–102, 1990, und Verhoef, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 15, 83–93, 1990) finden auch Anwendung. Das geeignete Abgabesystem für ein bestimmtes Cyanovirin oder Konjugat davon hängt von dessen jeweiliger Art, der jeweiligen klinischen Anwendung und der Stelle der Arzneistoffwirkung ab. Wie bei jedem Protein- oder Peptidarzneistoff wird die orale Abgabe eines Cyanovirins oder Konjugats davon wahrscheinlich spezielle Probleme präsentieren, in erster Linie auf Grund von Instabilität im Magen-Darm-Trakt und geringer Absorption und Bioverfügbarkeit von intaktem, bioaktivem Arzneistoff davon. Deshalb wird es, besonders im Falle von oraler Abgabe, aber möglicherweise auch in Zusammenhang mit anderen Abgabewegen, nötig sein, in Kombination mit einem gegebenen Cyanovirin oder Konjugat davon ein die Absorption verstärkendes Mittel zu verwenden. Eine große Vielfalt absorptionsverstärkender Mittel sind in Kombination mit Protein- und Peptidarzneistoffen zur oralen Abgabe und zur Abgabe auf anderen Wegen untersucht und/oder angewendet worden (Verhoef, 1990, vorstehend; van Hoogdalem, Pharmac. Ther. 44, 407–443, 1989; Davis, J. Pharm. Pharmacol. 44 (Ergänzg. 1), 186–190, 1992). Am häufigsten fallen typische Verstärker in die allgemeinen Kategorien von (a) Chelatbildnern, wie zum Beispiel EDTA, Salicylaten und N-Acyl-Derivaten von Collagen, (b) oberflächenaktiven Mitteln, wie zum Beispiel Laurylsulfat und Polyoxyethylen-9-laurylether, (c) Gallensalzen, wie zum Beispiel Glycholat und Taurocholat und Derivaten, wie zum Beispiel Taurodihydrofusidat, (d) Fettsäuren, wie zum Beispiel Ölsäure und Kaprinsäure und deren Derivaten, wie zum Beispiel Acylcarnitinen, Monoglyceriden und Diglyceriden, (e) nicht oberflächenaktiven Mitteln, wie zum Beispiel ungesättigten zyklischen Harnstoffen, (f) Saponinen, (g) Cyclodextrinen und (h) Phospholipiden.
Andere Ansätze zum Verstärken der oralen Abgabe von Protein- und Peptidarzneistoffen, wie zum Beispiel der Cyanovirine und Konjugate davon, können zuvor erwähnte Modifikationen einschließen, um die Stabilität gegen Magen-Darm-Enzyme und/oder erhöhte Lipophilität zu verstärken. Alternativ dazu oder zusätzlich kann der Protein- oder Peptidarzneistoff in Kombination mit anderen Arzneistoffen oder Substan zen verabreicht werden, die Proteasen und/oder andere mögliche Quellen des enzymatischen Abbaus von Proteinen und Peptiden direkt inhibieren. Noch ein anderer alternativer Ansatz, um die Magen-Darm-Absorption von Protein- oder Peptid-Arzneistoffen, wie zum Beispiel Cyanovirinen oder Konjugaten, zu verhindern oder zu verzögern, ist, sie in ein Abgabesystem einzufügen, das dazu gedacht ist, das Protein oder Peptid vor Kontakt mit den proteolytischen Enzymen im Darmlumen zu schützen und das intakte Protein oder Peptid erst nach Erreichen eines Gebiets freizusetzen, das für dessen Absorption günstig ist. Ein spezifischeres Beispiel für diese Strategie ist die Verwendung bioabbaubarer Mikrokapseln oder Mikrokugeln, sowohl um ungeschützte Arzneistoffe vor Abbau zu schützen als auch um eine verlängerte Freisetzung aktiven Arzneistoffs zu bewirken (Deasy, in Microencapsulation and Related Processes, Swarbrick, Hrsg., Marcell Dekker, Inc.: New York, 1984, S. 1–60, 88–89, 208–211). Mikrokapseln können auch einen nützlichen Weg bereitstellen, um eine verlängerte Abgabe eines Protein- und Peptidarzneistoffes, wie zum Beispiel eines Cyanovirins oder Konjugats davon, nach einer Injektion zu bewirken (Maulding, J. Controlled Release 6, 167–176, 1987).
In Anbetracht der zuvor erwähnten möglichen Komplexitäten einer erfolgreichen oralen Abgabe eines Protein- oder Peptidarzneistoffes ist es günstig, dass es zahlreiche andere mögliche Abgabewege für einen Protein- oder Peptidarzneistoff, wie zum Beispiel ein Cyanovirin oder Konjugat davon, gibt. Diese Wege schließen intravenös, intraarteriell, intrathekal, intracisternal, buccal, rektal, nasal, pulmonal, transdermal, vaginal, Okular und dergleichen ein (Eppstein, 1988, vorstehend; Siddiqui et al., 1987, vorstehend; Banga et al., 1988, vorstehend; Sanders, 1990, vorstehend; Verhoef, 1990, vorstehend; Barry, in Delivery Systems for Peptide Drugs, Davis et al., Hrsg., Plenum Press: New York, 1986, S. 265–275, und Patton et al., Adv. Drug Delivery Rev. 8, 179–196, 1992). Auf jedem dieser Wege oder tatsächlich auf jedem anderen Verabreichungs- oder Anwendungsweg kann ein Protein- oder Peptidarzneistoff, wie zum Beispiel ein Cyanovirin oder Konjugat davon, eine immunogene Reaktion auslösen. In derartigen Situationen kann es nötig sein, das Molekül zu modifizieren, um immunogene Gruppen zu maskieren. Es kann auch möglich sein, gegen unerwünschte Immunreaktionen durch eine umsichtige Wahl des Formulierungs- und/oder Verabreichungsverfahrens zu schützen. Zum Beispiel kann eine ortsspezifische Abgabe eingesetzt werden, sowie das Maskieren von Erkennungsstellen vor dem Immunsystem durch Verwendung oder Anheftung eines sogenannten Tolerogens, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Dextran, Albumin und dergleichen (Abuchowski et al., 1981, vorstehend; Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3578–3581, 1977; Lisi et al., J. Appl. Biochem. 4, 19–33, 1982, und Wileman et al., J. Pharm. Pharmacol. 38, 264–271, 1986). Derartige Modifikationen können auch vorteilhafte Wirkungen auf Stabilität und Halbwertszeit sowohl in vivo als auch ex vivo haben.
Verfahren zur kovalenten Befestigung von Molekülen, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Dextran, Albumin und dergleichen an Proteinen, wie zum Beispiel Cyanovirinen und Konjugaten davon, sind Fachleuten wohlbekannt und sind ausführlich in der Literatur dokumentiert (siehe z. B. Davis et al., In Peptide and Protein Drug Delivery, Lee, Hrsg., Marcel Dekker: New York, 1991, S. 831–864).
Andere Strategien, um nachteilige Immunreaktionen zu vermeiden, können auch die Induktion von Toleranz durch Verabreichung von anfangs nur geringen Dosen einschließen. in jedem Fall wird es dem Fachmann aus der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sein, dass der Fachmann für jede besondere gewünschte medizinische Anwendung oder Verwendung eines Cyanovirins oder Konjugats davon, aus einer großen Vielfalt möglicher Zusammensetzungen, Verabreichungswege oder Anwendungsorte auswählen kann, was vorteilhaft ist.
Dementsprechend können die erfindungsgemäßen antiviralen Cyanovirine und Konjugate davon in verschiedenen Zusammensetzungen, zum Beispiel zur Verwendung entweder in therapeutischen Behandlungsverfahren für infizierte Individuen oder in prophylaktischen Verfahren gegen virale, z. B. HIV- und Influenzavirus-, Infektion nicht infizierter Individuen, formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung, wie zum Beispiel eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein isoliertes und gereinigtes Cyanovirin, ein Cyanovirinkonjugat, ein in einer Matrix verankertes Cyanovirin oder ein in einer Matrix verankertes Cyanovirinkonjugat, wie zum Beispiel eine antiviral wirksame Menge davon, umfasst. Die Zusammensetzung kann ferner einen Träger umfassen, wie zum Beispiel einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Zusammensetzung kann ferner mindestens eine zusätzliche antivirale Verbindung umfassen, die eine andere als ein Cyanovirin oder Konjugat davon ist, wie zum Beispiel in einer antiviral wirksamen Menge. Geeignete antivirale Verbindungen schließen AZT, ddI, ddC, Ganciclovir, fluorierte Didesoxynucleoside, Nevirapin, R82913, Ro 31-8959, BI-RJ-70, Aciclovir, α-Interferon, rekombinantes sCD4, Michellamine, Calanolide, Nonoxynol-9, Gossypol und Derivate davon und Gramicidin ein. Falls die Zusammensetzung verwendet werden soll, um eine Immunreaktion zu induzieren, umfasst sie eine Immunreaktions-auslösende Menge eines Cyanovirins oder Konjugats davon und kann ferner ein Immunadjuvans umfassen, wie zum Beispiel Polyphosphazen-Polyelektrolyt. Das in der Zusammensetzung, z. B. einer pharmazeutischen Zusammensetzung, verwendete Cyanovirin, kann aus der Natur isoliert und gereinigt oder gentechnisch hergestellt werden. Auf ähnliche Weise kann das Cyanovirinkonjugat gentechnisch hergestellt oder chemisch gekoppelt werden.
Die vorliegenden erfinderischen Zusammensetzungen können einem Wirt, wie zum Beispiel einem Menschen, verabreicht werden, um so eine virale Infektion in einem prophylaktischen oder therapeutischen Verfahren zu inhibieren. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind besonders nützlich beim Inhibieren des Wachstums oder der Replikation eines Virus, wie zum Beispiel eines Influenzavirus oder eines Retrovirus, insbesondere eines Immundefizienzvirus, wie zum Beispiel HIV, speziell HIV-1 und HIV-2. Die Zusammensetzungen sind bei der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung von Tieren, wie zum Beispiel Menschen, die mit einem Virus infiziert sind beziehungsweise bei denen das Risiko einer viralen Infektion besteht, nützlich. Die Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um Gegenstände oder Materialien, wie zum Beispiel medizinische Ausrüstung, Vorräte oder Flüssigkeiten, einschließlich biologischer Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut, Blutprodukte und Impfstoffformulierungen, Zellen, Gewebe und Organe zu behandeln, um Viren in dem Bemühen, eine virale Infektion eines Tieres, wie zum Beispiel eines Menschen, zu verhindern oder zu behandeln, zu entfernen oder zu inaktivieren. Derartige Zusammensetzungen sind auch nützlich, um die sexuelle Übertragung viraler Infektionen, z. B. HIV, zu verhindern, was der primäre Weg ist, auf dem man sich die AIDS-Fälle auf der Welt zuzieht (Merson, 1993, vorstehend).
Mögliche virenabtötende Mittel, die zur Verwendung gegen die sexuelle Übertragung von HIV verwendet oder in Betracht gezogen werden, sind sehr beschränkt; vorliegende Mittel in dieser Kategorie schließen zum Beispiel Nonoxynol-9 (Bird, AIDS 5, 791–796, 1991), Gossypol und Derivate (Polsky et al., Contraception 39, 579–587, 1989; Lin, Antimicrob. Agents Chemother. 33, 2149–2151, 1989, und Royer, Pharmacol. Res. 24, 407–412, 1991) und Gramicidin (Bourinbair, Life Sci./Pharmacol. Lett. 54, PL5–9, 1994, und Bourinbair et al., Contraception 49, 131–137, 1994) ein. Das Verfahren der Vehinderung der sexuellen Übertragung einer viralen Infektion, z. B. HIV-Infektion, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfasst eine vaginale, rektale, orale, penile oder andere topische Behandlung mit einer antiviral wirksamen Menge eines Cyanovirins und/oder Cyanovirinkonjugats, allein oder in Kombination mit einer anderen antiviralen Verbindung, wie vorstehend beschrieben.
In einem neuen Ansatz zur anti-HIV-Prophylaxe, der unter der Schirmherrschaft des U.S. National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) (z. B. wie von Painter, USA Today, 13. Feb. 1996, mitgeteilt wurde) betrieben wurde, wurde eine vaginale Zäpfcheninstillation lebender Kulturen von Lactobacillen in einer Studie mit 900 Frauen ausgewertet. Die Studie beruhte speziell auf Beobachtungen von anti-HIV-Wirkungen bestimmter H₂O₂-produzierender Lactobacillen in vitro (siehe z. B. den veröffentlichten Abstract von Hilier von der durch das NIAID veranstalteten Konferenz über "Advances in AIDS Vaccine Development", Bethesda, MD, 11.–15. Feb. 1996). Lactobacillen besiedeln die Vagina rasch und sind bei den meisten gesunden Frauen tatsächlich eine vorherrschende bakterielle Population (Redondo-Lopez et al., Rev. Infect. Dis. 12, 856–872, 1990; Reid et al., Clin. Microbiol. Rev. 3, 335–344, 1990; Bruce und Reid, Can. J. Microbiol. 34, 339–343, 1988; reu et al., J. Infect. Dis. 171, 1237–1243, 1995; Hilier et al., Clin. Infect. Dis. 16 (Ergänzg. 4), S273–S281; Agnew et al., Sex. Transm. Dis. 22, 269–273, 1995). Lactobacillen sind auch bedeutende, nicht pathogene Bewohner anderer Körperhöhlen, wie zum Beispiel dem Mund, dem Nasopharynx, dem oberen und unteren Magen-Darm-Trakt und dem Rektum.
Es ist gut etabliert, dass Lactobacillen unter Verwendung zur Verfügung stehender gentechnischer Verfahren leicht transformiert werden können, um eine gewünschte fremde kodierende DNA-Sequenz einzufügen, und dass derartige Lactobacillen dazu gebracht werden können, ein entsprechendes gewünschtes, fremdes Protein zu exprimieren (siehe z. B. Hols et al., Appl. and Environ. Microbiol. 60, 1401–1413, 1994). Deshalb wird es dem Fachmann im Zusammenhang der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sein, dass lebensfähige Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten und ein erfindungsgemäßes Protein exprimieren, direkt als Abgabevehikel für ein Cyanovirin oder Konjugat davon an der (den) gewünschte(n) Stelle(n) in vivo verwendet werden kann. Bevorzugte Wirtszellen für eine derartige Abgabe von Cyanovirinen oder Konjugaten davon direkt an der (den) gewünschte(n) Stelle(n), wie zum Beispiel einer ausgewählten Körperhöhle, können Bakterien umfassen. Genauer gesagt können derartige Wirtszellen einen geeignet hergestellten Stamm bzw. geeignet hergestellte Stämme von Lactobacillen, Enterokokken oder anderen gewöhnlichen Bakterien, wie zum Beispiel E. coli umfassen, von deren normalen Stämmen bekannt ist, dass sie Körperhöhlungen gewöhnlich besiedeln. Noch genauer gesagt können derartige Wirtszellen ein oder mehrere ausgewählte nicht pathogene Lactobacillenstämme umfassen, wie zum Beispiel diejenigen, die von Andreu et al. (1995, vorstehend) beschrieben wurden, besonders diejenigen mit hohen Adhärenzeigenschaften an Epithelzellen, wie zum Beispiel Adhärenz an vaginale Epithelzellen, und unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen geeignet transformiert sind.
Wie von McGroarty (FEMS Immunol. Med. Microbiol. 6, 251–264, 1993) besprochen, ist die "probiotische" oder direkte therapeutische Anwendung lebender Bakterien, besonders von Bakterien, die normalerweise in der Natur vorkommen, ganz besonders Lactobacillen, zur Behandlung oder Vorbeugung gegen pathogene Bakterien- oder Hefeinfektionen des Urogenitaltraktes, insbesondere des weiblichen Urogenitaltraktes, ein gut etabliertes Konzept. Kürzlich ist die Verwendung einer herkömmlichen probiotischen Strategie, insbesondere die Verwendung von lebenden Lactobacillen, zur Inhibierung der sexuellen Übertragung von HIV vorgeschlagen worden, speziell beruhend auf der normalen, endogenen Produktion von virenabtötenden Spiegeln von H₂O₂ und/oder Milchsäure und/oder anderen möglicherweise virenabtötenden Stoffen durch bestimmte normale Lactobacillenstämme (z. B. Hilier, 1996, vorstehend). Die vorliegende erfinderische Verwendung von Zellen, bei denen es sich nicht um Säugetierzellen handelt, besonders Bakterien, ganz besonders Lactobacillen, speziell mit einem fremden Gen erzeugt, genauer gesagt mit einem Cyanoviringen, um einen antiviralen Stoff, genauer gesagt ein Protein, und noch genauer gesagt ein Cyanovirin, zu exprimieren, ist bisher als Verfahren zur Behandlung eines Tieres, speziell eines Menschen, um die Infektion durch ein Virus, speziell ein Retrovirus, genauer gesagt HIV-1 oder HIV-2, zu verhindern, noch nie dagewesen.
Elmer et al. (JAMA 275, 870–876, 1996) haben kürzlich spekuliert, dass eine "gentechnische Herstellung die Möglichkeit bietet, Mikroben zum Abgeben spezifischer Wirkungen oder Produkte an das Colon oder andere Schleimhautoberflächen zu verwenden ... andere fruchtbare Gebiete zur zukünftigen Untersuchung schließen das Definieren des Wirkungsmechanismus verschiedener biotherapeutischer Mittel mit der Möglichkeit ein, eine gentechnische Herstellung zum Verstärken von Aktivitäten anzuwenden." Elmer et al. (1996, vorstehend) weisen ferner daraufhin, dass die Begriffe "probiotisch" und "biotherapeutisches Mittel" in der Literatur verwendet worden sind, um Mikroorganismen zu beschreiben, die eine antagonistische Aktivität gegen Pathogene in vivo aufweisen; diese Autoren bevorzugen genauer gesagt den Begriff "biotherapeutisches Mittel" um "Mikroorganismen mit spezifischen therapeutischen Eigenschaften" zu bezeichnen.
Angesichts der vorliegenden Offenbarung wird es einem Fachmann ersichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung eine völlig neue Art von "probiotischer" oder "biotherapeutischer" Behandlung unter Verwendung spezifisch hergestellter, hierin bereitgestellter Stämme von Mikroorganismen lehrt, die in der Natur nicht vorkommen. Nichtsdestoweniger können zur Verfügung stehende Lehren, welche die Auswahl von optimalen Mikrobenstämmen, insbesondere von Bakterienstämmen, für herkömmliche probiotische oder biotherapeutische Anwendungen betreffen, im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zum Beispiel können die Auswahl optimaler Lactobacillus-Stämme zur gentechnischen Herstellung, Transformation, direkten Expression von Cyanovirinen oder Konjugaten davon und direkte probiotische oder biotherapeutische Anwendungen zum Behandeln oder Vorbeugen einer HIV-Infektion auf den gleichen oder ähnlichen Kriterien beruhen, wie zum Beispiel denjenigen, die von Elmer et al. (1996, vorstehend) beschrieben wurden, die typischerweise verwendet werden, um normale, endogene oder "nicht gentechnisch hergestellte" Bakterienstämme für eine herkömmliche probiotische oder biotherapeutische Therapie auszuwählen. Darüberhinaus sind die von McGroarty gelehrten Empfehlungen und Kennzeichen, besonders zur Auswahl optimaler Lactobacillus-Stämme für eine herkömmliche, probiotische Verwendung gegen weibliche Urogenitalinfektionen für die vorliegende Erfindung relevant: " ... zur Einfügung in probiotische Herstellungen gewählte Lactobacillen sollten leicht und, falls möglich, preiswert zu züchten sein ... Stämme sollten stabil sein, die Lebensfähigkeit nach Gefriertrocknung beibehalten und natürlich für den Wirt nicht pathogen sein ... es ist unentbehrlich, dass Lactobacillen, die zur Verwendung in probiotischen Herstellungen gewählt werden, gut an das Vaginalepithel anhaften sollten ... idealerweise sollten künstlich implantierte Lactobacillen an das Vaginalepithel anhaften, mit den natürlich vorkommenden Mikroorganismen integrieren und proliferieren" (McGroarty, 1993 vorstehend). Während die Lehren von McGroarty spezifisch die Auswahl "normaler" Lactobacillus-Stämme für probiotische Verwendungen gegen pathogene Bakterien- oder Hefeinfektionen des weiblichen Urogenitaltrakts ansprechen, werden ähnliche Betrachtungen auf die Auswahl optimaler Bakterienstämme für gentechnische Herstellung und "probiotische" oder "biotherapeutische" Anwendung gegen virale Infektionen zutreffen, wie sie besonders durch die vorliegende Erfindung umfasst werden.
Dementsprechend umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Vorbeugung einer sexuellen Übertragung einer viralen Infektion, z. B. einer HIV-Infektion, eine vaginale, rektale, orale, penile oder andere topische, einführende oder instillierende Behandlung mit einer antiviral wirksamen Menge eines Cyanovirins, eines Cyanovirinkonkugats, eines auf einer Matrix verankerten Cyanovirins oder Konjugats davon, und/oder lebende Wirtszellen, die so transformiert sind, dass sie ein Cyanovirin oder Konjugat davon exprimieren, allein oder in Kombination mit einer oder mehreren anderen antiviralen Verbindungen (z. B. wie vorstehend beschrieben wurde).
Zusammensetzungen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen prophylaktischen oder therapeutischen Behandlungsverfahren umfassen ein oder mehrere Cyanovirin(e) oder Konjugat(e) davon, von denen jedes auf einer Matrix verankert sein kann, und wünschenswerterweise einen Träger dafür, wie zum Beispiel einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind Fachleuten wohlbekannt, wie auch geeignete Verabreichungsverfahren. Die Wahl des Trägers wird teilweise durch das jeweilige Cyanovirin oder Konjugat davon bestimmt, sowie durch das jeweilige Verfahren, das verwendet wird, um die Zusammensetzung zu verabreichen.
Einem Fachmann wird ersichtlich sein, dass verschiedene Wege zur Verabreichung eines Arzneistoffes zur Verfügung stehen, und obwohl mehr als ein Weg verwendet werden kann, um einen bestimmten Arzneistoff zu verabreichen, kann ein bestimmter Weg eine sofortigere und wirksamere Reaktion als ein anderer Weg bereitstellen. Darüberhinaus wird einem Fachmann ersichtlich sein, dass der jeweilige eingesetzte pharmazeutische Träger teilweise von dem jeweiligen eingesetzten Cyanovirin oder Konjugat davon und dem gewählten Verabreichungsweg abhängt. Dementsprechend gibt es eine große Vielfalt geeigneter Formulierungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können aus flüssigen Lösungen, wie zum Beispiel einer wirksamen Menge der Verbindung, gelöst in Verdünnungsmitteln, wie zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung oder Fruchtsaft; Kapseln, Portionspackungen oder Tabletten bestehen, die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffs enthalten, als Feststoff, Granulatkörner oder gefriergetrocknete Zellen; Lösungen oder Suspensionen in einer wässrigen Flüssigkeit und Öl-in-Wasser-Emulsionen oder Wasser-in-Öl-Emulsionen. Tablettenformen können eine oder mehrere von Lactose, Mannitol, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Cellulose, Gummi arabicum, Gelatine, kolloidales Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talcum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Exzipierten, Farbstoffe, Verdünnungsmittel, Puffermittel, Befeuchtungsmittel, Konservierungsmittel, Aromamittel und pharmakologisch verträgliche Träger einschließen. Geeignete Formulierungen zur oralen Abgabe können auch in synthetische und natürliche polymere Mikrokugeln oder andere Mittel, um die erfindungsgemäßen Mittel vor Abbau im Magen-Darm-Trakt zu schützen, eingefügt werden (siehe z. B. Wallace et al., Science 260, 912–915, 1993).
Die Cyanovirine oder Konjugate davon können, allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Verbindungen, zu Aerosolformulierungen oder Formulierungen aus Mikropartikel-Pulver hergestellt werden, die mittels Inhalation verabreicht werden sollen. Diese Aerosol-Formulierungen können in unter Druck stehende verträgliche Treibmittel, wie zum Beispiel Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen gegeben werden.
Die Cyanovirine oder Konjugate davon können, allein oder in Kombinationen mit anderen antiviralen Verbindungen oder Absorptionsmodulatoren, zu geeigneten Formulierungen zur transdermalen Anwendung und Absorption hergestellt werden (Wallace et al., 1993, vorstehend). Eine transdermale Elektroporation oder Iontophorese kann auch verwendet werden, um die systemische Abgabe der erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder Zusammensetzungen durch die Haut zu fördern und/oder zu kontrollieren (siehe z. B. Theiss et al., Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 13, 353-359, 1991).
Für eine topische Verabreichung geeignete Formulierungen schließen Lutschtabletten ein, die den Wirkstoff in einem Aromastoff, normalerweise Saccharose und Gummi arabicum oder Tragacanth umfassen; Pastillen, die den Wirkstoff in einem inerten Grundstoff, wie zum Beispiel Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi arabicum, umfassen, und Mundspülungen, die den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen; sowie Cremes, Emulsionen, Gele und dergleichen, die, zusätzlich zu dem Wirkstoff zum Beispiel gefriergetrocknete Lactobacillen oder lebende Lactobacillus-Kulturen, die genetisch verändert werden, um ein erfindungsgemäßes Cyanovirin oder Konjugat davon direkt zu produzieren, derartige Träger, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, enthalten. Eine topische Verabreichung wird für die prophylaktische und therapeutische Behandlung einer Influenza viralen Infektion, wie zum Beispiel durch die Verwendung eines Inhalators, bevorzugt.
Formulierungen zur rektalen Verabreichung können als Zäpfchen mit einem geeigneten Grundstoff, der zum Beispiel Kakaobutter oder ein Salicylat umfasst, vorgelegt werden. Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprühformulierungen vorgelegt werden, die zusätzlich zum Wirkstoff zum Beispiel gefriergetrocknete Lactobacillen oder lebende Lactobacillus-Kulturen, die genetisch verändert werden, um ein erfindungsgemäßes Cyanovirin oder Konjugat davon direkt zu produzieren, derartige Träger, wie sie auf dem Fachgebiet als geeignet bekannt sind, enthalten. Auf ähnliche Weise kann der Wirkstoff als Beschichtung auf einem Kondom mit einem Gleitmittel kombiniert werden. Tatsächlich wird der Wirkstoff vorzugsweise auf einem Verhütungsmittel angewendet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Kondom, ein Diaphragma, eine Portiokappe, einen Vaginalring und einen Schwamm.
Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wässrige und nicht wässrige, isotone sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten, welche die Formlierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isoton machen, und wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel, Solubilisierer, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in versiegelten Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern vorgelegt werden, wie zum Beispiel Ampullen und Fläschchen, und können in gefriergetrocknetem (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, was nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, zum Beispiel Was ser, unmittelbar vor der Verwendung, für Injektionen erfordert. Unvorbereitete Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulat und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Formulierungen, die ein Cyanovirin oder Cyanovirinkonjugat umfassen, das zur Viren (z. B. HIV) abtötenden Sterilisation von unbelebten Gegenständen, wie zum Beispiel medizinischem Verbrauchsmaterial oder Ausrüstung, Laborausrüstung und Vorräten, Instrumenten, Geräten und dergleichen, geeignet ist, können zum Beispiel soweit erforderlich aus jeder der zuvor erwähnten Zusammensetzungen oder Formulierungen durch einen Fachmann ausgewählt oder angepasst werden. Vorzugsweise wird das Cyanovirin durch rekombinante DNA-Technik hergestellt. Das Cyanovirinkonjugat kann durch rekombinante DNA-Technik oder durch chemisches Koppeln eines Cyanovirins mit einem Wirkmolekül wie vorstehend beschrieben hergestellt werden. Auf ähnliche Weise können Formulierungen zur ex vivo Sterilisation oder Entfernung von Viren, wie zum Beispiel infektiösen Viren, aus einer Probe, wie zum Beispiel Blut, Blutprodukten, Sperma oder anderen Körperprodukten, wie zum Beispiel einer Flüssigkeit, Zellen, einem Gewebe oder einem Organ oder jeder anderen Lösung, Suspension, Emulsion, Impfstoffformulierung (wie zum Beispiel bei der Entfernung von infektiösen Viren) oder jedem anderen Material, das einem Patienten bei einem medizinischen Verfahren verabreicht werden kann, soweit erforderlich von einem Fachmann aus jeder der zuvor erwähnten Zusammensetzungen oder Formulierungen ausgewählt oder angepasst werden. Geeignete Formulierungen zur ex-vivo-Sterilisation oder Entfernung von Viren aus einer Probe oder auf einem unbelebten Gegenstand sind auf keinen Fall auf eine der zuvor erwähnten Formulierungen oder Zusammensetzungen beschränkt. Zum Beispiel können derartige Formulierungen oder Zusammensetzungen ein funktionelles Cyanovirin umfassen, wie zum Beispiel das, welches durch die SEQ ID NR: 2 kodiert wird, oder ein antivirales Fragment davon, wie zum Beispiel ein Fragment, das mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst, wobei die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren an ein Virus binden, oder ein Konjugat von einem der vorhergehenden, befestigt an einer festen Trägermatrix, um das In-Kontakt-Bringen oder Binden von infektiösen Viren in einer Probe zu erleichtern oder infektiöse Viren aus einer wie vorstehend beschriebenen Probe, z. B. einem Körperprodukt, wie zum Beispiel einer Flüssigkeit, Zellen, einem Gewebe oder einem Organ von einem Organismus, insbesondere einem Säugetier, wie zum Beispiel einem Menschen, einschließlich zum Beispiel Blut, einer Blutkomponente oder Sperma, zu entfernen. Vorzugsweise umfasst das antivirale Protein die SEQ ID NR: 2. Auch binden die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren vorzugsweise gp120 von HIV, insbesondere von infektiösem HIV. Als spezifischeres Beispiel kann eine derartige Formulierung oder Zusammensetzung ein funktionelles Cyanovirin oder Konjugat davon umfassen, befestigt an (z. B. daran gekoppelt oder darauf immobilisiert) einer festen Trägermatrix, umfassend Magnetkugeln, um das In-Kontakt-Bringen, Binden und Entfernen von infektiösen Viren zu erleichtern, und um eine magnetunterstützte Entfernung der Viren aus einer wie vorstehend beschriebenen Probe, z. B. einem Körperprodukt, wie zum Beispiel einer Flüssigkeit, Zellen, einem Gewebe oder einem Organ, z. B. Blut, einer Blutkomponente oder Sperma, zu ernöglichen. Alternativ dazu und auch vorzugsweise umfasst die feste Trägermatrix ein Verhütungsmittel, wie zum Beispiel ein Kondom, ein Diaphragma, eine Portiokappe, einen Vaginalring oder einen Schwamm.
Als eine noch spezifischere Veranschaulichung kann eine derartige Zusammen setzung (z. B. für ex vivo) ein funktionelles (z. B. gp120-bindendes, HIV-inaktivierendes) Cyanovirin oder Konjugat davon umfassen, das mittels eines anti-Cyanovirin-Antikörpers oder mindestens einer Wirkkomponente, welche die gleiche oder eine andere sein kann, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Albumin oder Dextran, an einer festen Trägermatrix, wie zum Beispiel Magnetkugeln oder einer Durchflussmatrix, befestigt wird. Das Konjugat kann ferner mindestens eine Wirkkomponente umfassen, welche die gleiche oder eine andere sein kann, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem immunologischen Reagenz und einem Toxin. Eine Durchflussmatrix würde zum Beispiel eine einer Affinitätssäule ähnliche Konfiguration umfassen. Das Cyanovirin kann mittels eines nachstehend beschriebenen anti-Cyanovirin-Antikörpers kovalent an eine feste Trägermatrix gekoppelt werden. Verfahren zum Befestigen eines Antikörpers an einer festen Trägermatrix sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (siehe zum Beispiel Harlow und Lane. Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Alternativ dazu kann die feste Trägermatrix, wie zum Beispiel Magnetkugeln, mit Streptavidin beschichtet werden, in welchem Falle das Cyanovirin oder Fragment davon (das mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst) oder ein Konjugat von einem der beiden biotinyliert ist. Die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 weisen wünschenswerterweise antivirale Aktivität auf und binden vorzugsweise gp120 von HIV, das vorzugsweise infektiös ist. Vorzugsweise umfasst das antivirale Protein die SEQ ID NR: 2. Eine derartige Zusammensetzung kann zum Beispiel durch Biotinylieren des Cyanovirins oder Konjugats davon und dann In-Kontakt-Bringen des biotinylierten Proteins oder Peptids mit einer (im Handel zur Verfügung stehenden) mit Streptavidin beschichteten festen Trägermatrix, wie zum Beispiel Magnetkugeln, hergestellt werden. Die Verwen dung von Biotinylierung als Mittel, ein gewünschtes biologisch aktives Protein oder Peptid an eine Streptavidin-beschichtete Trägermatrix, wie zum Beispiel Magnetkugeln, zu binden, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Beispiel 7 beschreibt speziell ein Verfahren, das auf die Biotinylierung von Cyanovirin-N und Befestigung des biotinylierten Proteins an Streptavidin-beschichteten Magnetkugeln anwendbar ist. Beispiel 7 veranschaulicht auch ein anderes wichtiges Prinzip, das für die vorliegende Erfindung entscheidend ist: für jede bestimmte Formulierung oder Zusammensetzung, die ein funktionelles Cyanovirin oder Konjugat davon umfasst, das auf einer festen Trägermatrix befestigt oder immobilisiert ist, ist es unentbehrlich, dass die Formulierung oder Zusammensetzung die gewünschten (d. h. in diesem Falle die virenbindenden (z. B. gp120-bindenden) und Virus (z. B. HIV) inaktivierenden) Eigenschaften des funktionellen Cyanovirins oder Konjugats davon selbst beibehält.
Einem Fachmann wird ersichtlich sein, dass eine geeignete oder angemessene Formulierung beruhend auf der jeweiligen vorliegenden Anwendung ausgewählt, angepasst oder entwickelt werden kann.
Für ex-vivo-Verwendungen, wie zum Beispiel virenabtötende Behandlungen von unbelebten Gegenständen oder Materialien, Blut oder Blutprodukten oder Geweben, sollte die Menge an Cyanovirin oder Konjugat oder Zusammensetzung davon ausreichen, damit alle vorliegenden Viren oder virenproduzierenden Zellen nicht infektiös gemacht werden oder zerstört werden. Zum Beispiel würde dies für HIV erfordern, dass der Virus und/oder die virenproduzierenden Zellen Konzentrationen von Cyanovirin-N im Bereich von 0,1–1000 nM ausgesetzt würden. Ähnliche Betrachtungen treffen auf in-vivo-Anwendungen zu. Deshalb wird die Bezeichnung "antiviral wirksame Menge" im Allgemeinen verwendet, um die Menge eines bestimmten Cyanovirins, Konjugats oder einer bestimmten Zusammensetzung davon zu beschreiben, die für eine antivirale Wirksamkeit bei einer bestimmten Anwendung erforderlich ist.
Angesichts des Vorstehenden stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion eines Wirtes bereit, bei welchem dem Wirt eine antiviral wirksame Menge eines vorstehend beschriebenen Konjugats verabreicht wird. Nach Verabreichung der antiviral wirksamen Menge des Konjugats wird die virale Infektion inhibiert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht zusätzlich ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion eines Wirtes, bei welchem dem Wirt eine antiviral wirksame Menge einer Zusammensetzung verabreicht wird, die ein isoliertes und gereinigtes antivirales Protein, antivirales Peptid, antivirales Proteinkonjugat oder antivirales Peptidkonjugat, umfassend mindestens neun zusammenhän gende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2, das antivirale Aktivität aufweist und an einer festen Trägermatrix befestigt ist, umfasst. Nach Verabreichung der antiviral wirksamen Menge der Zusammensetzung wird die virale Infektion inhibiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der festen Trägermatrix um ein Verhütungsmittel, wie zum Beispiel ein Kondom, ein Diaphragma, eine Portiokappe, einen Vaginalring oder Schwamm. In einer alternativen Ausführungsform kann eine feste Trägermatrix operativ implantiert und später entfernt werden.
Für in-vivo-Verwendungen sollte die Dosis eines Cyanovirins oder Konjugats oder einer Zusammensetzung davon, die an ein Tier, besonders einen Menschen, verabreicht wird, ausreichen, um eine prophylaktische oder therapeutische Reaktion in dem Individuum über einen vernünftigen Zeitrahmen hinweg zu bewirken. Die Dosis, die verwendet wird, um eine gewünschte antivirale Konzentration in vivo zu erreichen (z. B. 0,1–1000 nM) wird durch die Stärke des jeweiligen Cyanovirins oder Konjugats, das eingesetzt wird, den Schweregrad des Erkrankungszustandes von infizierten Individuen sowie, im Falle von systemischer Verabreichung, dem Körpergewicht und Alter des infizierten Individuums bestimmt werden. Die Größe der Dosis wird auch durch das Vorhandensein von nachteiligen Nebenwirkungen bestimmt, die das jeweilige Cyanovirin oder Konjugat oder die Zusammensetzung davon, das bzw. die eingesetzt wird, begleiten können. Es ist immer wünschenswert, wann immer möglich, nachteilige Nebenwirkungen auf ein Minimum zu beschränken.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Entfernen von Viren, wie zum Beispiel infektiösen Viren, aus einer Probe bereit. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Zusammensetzung, die ein isoliertes und gereinigtes antivirales Protein, antivirales Peptid, antivirales Proteinkonjugat, oder antivirales Peptidkonjugat umfasst, umfassend mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2. Die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren weisen wünschenswerterweise antivirale Aktivität auf und binden an das Virus, und das antivirale Protein oder antivirale Peptid (oder Konjugat von einem der vorangehenden) ist an einer festen Trägermatrix, wie zum Beispiel einer Magnetkugel, befestigt. "Befestigt" wird hierin verwendet, um die Befestigung an (oder Kopplung an) und Immobilisierung in oder auf einer festen Trägermatrix zu bezeichnen. Während jede Befestigungsweise verwendet werden kann, wird eine Befestigung vorzugsweise durch kovalente Bindungen stattfinden. Das Verfahren umfasst ferner das Trennen der Probe und der Zusammensetzung durch alle geeigneten Mittel, worauf die Viren, wie zum Beispiel die infektiösen Viren, von der Probe entfernt werden. Vorzugsweise umfasst das antivirale Protein die SEQ ID NR: 2. In einer Ausführungsform ist das antivirale Protein oder antivirale Peptid mit einem anti-Cyanovirin-Antikörper oder mindestens einer Wirkkomponente konjugiert, welche die gleiche oder eine andere sein kann, ausgewählt aus Polyethylenglycol, Dextran und Albumin, in welchem Fall das antivirale Protein oder antivirale Peptid wünschenswerterweise durch mindestens eine Wirkkomponente an der festen Trägermatrix befestigt ist. Das antivirale Protein oder antivirale Peptid kann ferner mit mindestens einer Wirkkomponente konjugiert sein, welche die gleiche oder eine andere sein kann, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem immunologischen Reagenz und einem Toxin. In einer anderen Ausführungsform ist die feste Trägermatrix mit Streptavidin beschichtet und das antivirale Protein oder antivirale Peptid ist biotinyliert. Durch Biotin wird das biotinylierte antivirale Protein/Peptid an der Streptavidin-beschichteten festen Trägermatrix befestigt. Andere Arten von Mitteln, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können verwendet werden, um ein funktionelles Cyanovirin (d. h. ein antivirales Protein oder Peptid oder Konjugat von einem der vorangehenden, wie vorstehend beschrieben) an einer festen Trägermatrix, wie zum Beispiel einer Magnetkugel, zu befestigen, in welchem Fall der Kontakt mit einem Magneten verwendet wird, um die Probe und die Zusammensetzung zu trennen. Auf ähnliche Weise können andere Arten fester Trägermatrizes verwendet werden, wie zum Beispiel eine Matrix, umfassend eine poröse Oberfläche oder Membran, über oder durch die man eine Probe fließen oder durchsickern lässt, wobei man dadurch selektiv infektiöse Viren aus der Probe einfängt oder entfernt. Die Wahl der festen Trägermatrix, Mittel zur Befestigung des funktionellen Cyanovirins an der festen Trägermatrix und Mittel zur Trennung der Probe und des auf der Matrix verankerten Cyanovirins hängen teilweise von der Probe (z. B. Flüssigkeit gegenüber Gewebe) und dem Virus, das entfernt werden soll, ab. Es wird erwartet, dass die Verwendung eines ausgewählten Kopplungsmoleküls einer Matrix bestimmte gewünschte Eigenschaften verleihen kann, umfassend ein funktionelles Cyanovirin, das damit gekoppelt ist, das in einer bestimmten Situation besonders vorteilhafte Eigenschaften aufweisen kann. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Blut, eine Blutkomponente, Sperma, Zellen, Gewebe oder ein Organ. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe auch um eine Impfstoffformulierung, in welchem Fall das Virus, das entfernt wird, infektiös ist, wie zum Beispiel HIV, obwohl HIV, insbesondere infektiöses HIV, aus anderen Proben in Übereinstimmung mit diesem Verfahren entfernt werden kann. Derartige Verfahren sind auch bei der ex vivo Echtzeit-Entfernung von Viren oder vireninfizierten Zellen aus einer Körperflüssigkeit, wie zum Beispiel Blut, z. B. bei der Behandlung einer viralen Infektion, oder bei der Entfernung von Viren aus Blut oder einer Blutkomponente, z. B. für eine Transfusion, bei der Inhibierung oder Vorbeugung einer viralen Infektion von Nutzen. Derartige Verfahren sind auch bei der Dialyse, wie zum Beispiel Nierendia lyse, und beim Entfernen von Viren aus Sperma, das von einem Spender zur in-vitro- und in-vivo-Befruchtung erhalten wird, von Nutzen. Die Verfahren finden auch Anwendung im Zusammenhang von Gewebe- und Organtransplantationen.
Zum Beispiel könnte der Fachmann ein Poly(ethylenglycol)-Molekül zur Befestigung eines funktionellen Cyanovirins an einer festen Trägermatrix auswählen, um dadurch ein auf einer Matrix verankertes Cyanovirin bereitzustellen, wobei das Cyanovirin durch eine längere "Leine" an der Matrix befestigt ist, als es mit anderen Befestigungsverfahren machbar oder möglich Ware, wie zum Beispiel Biotinylierung/Streptavidin-Kopplung. Ein durch eine Poly(ethylenglycol)-"Leine" an eine feste Trägermatrix (wie zum Beispiel Magnetkugeln, eine poröse Oberfläche oder Membran und dergleichen) gekoppeltes Cyanovirin kann ein optimales Exponieren einer Bindungsoberfläche, eines Epitops, hydrophoben oder hydrophoben Focus und/oder dergleichen, auf einem funktionellen Cyanovirin auf eine Weise gestatten, die, in einer bestimmten Situation und/oder für ein bestimmtes Virus das Binden und/oder die Inaktivierung des Virus erleichtert. Eine bevorzugte feste Trägermatrix ist eine Magnetkugel, so dass eine Trennung der Probe und der Zusammensetzung durch einen Magneten bewirkt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens binden die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren gp120 von HIV und HIV wird aus der Probe entfernt.
Zusammenfassend kann ein Cyanovirin, das an einer festen Trägermatrix, wie zum Beispiel einer Magnetkugel, befestigt ist, verwendet werden, um Viren, insbesondere infektiöse Viren, einschließlich Immundefizienzviren, wie zum Beispiel HIV, z. B. HIV-1 oder HIV-2, aus einer Probe, wie zum Beispiel einer Probe, die sowohl infektiöse als auch nicht infektiöse Viren enthält, entfernt werden. Im Gegensatz zu früher offenbarten Verfahren zum Inaktivieren oder Zerstören von Viren in einer Probe benutzt das vorliegende erfinderische Verfahren Cyanovirine, die irreversibel an Viren, wie zum Beispiel infektiöse Viren, insbesondere infektiöse Immundefizienzviren, z. B. HIV, speziell HIV-1 oder HIV-2, binden. Das infektiöse Viruspartikel wird permanent an das antivirale Mittel fixiert und ist unfähig, Wirtszellen zu infizieren. Das vorliegende erfinderische Verfahren ermöglicht eine Trennung infektiöser von nicht infektiösen Viren und ist deshalb vorteilhafter als andere derzeit auf dem Fachgebiet zur Verfügung stehende Verfahren. In dieser Hinsicht ist unerwarteterweise beobachtet worden, dass ein Cyanovirin eine Konformation oder ein Teilstück von gp120 erkennt, die bzw. das für infektiöses HIV kennzeichnend ist. Deshalb werden durch das Cyanovirin nur infektiöse Viren gebunden, während nicht infektiöse Viren in der Probe verbleiben. Einem Fachmann werden die Vorteile der Verwendung der vorliegenden erfinderischen, auf einer Matrix verankerten Cyanovirine ersichtlich sein, um Pools von nicht infektiösen Viren herzustellen. Das vorliegende erfinderische Verfahren kann auch verwendet werden, um gp120-präsentierende Zellen, z. B. infizierte Zellen, die gp120 auf ihrer Oberfläche haben, aus einer Probe zu entfernen.
Die vorliegende Erfindung stellt deshalb ferner eine Zusammensetzung bereit, umfassend natürlich vorkommende, nicht infektiöse Viren, wie zum Beispiel eine wie vorstehend beschrieben hergestellte Zusammensetzung. Die Zusammensetzung kann ferner einen Träger, wie zum Beispiel einen biologisch oder pharmazeutisch verträglichen Träger und ein Immunadjuvans umfassen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem nicht infektiösen Virus um ein Immundefizienzvirus, wie zum Beispiel HIV, z. B. HIV-1 oder HIV-2. Alternativ dazu und auch vorzugsweise handelt es sich bei dem nicht infektiösen Virus um FIV. Eine Zusammensetzung, die nur natürlich vorkommende, nicht infektiöse Viren umfasst, findet viele Anwendungen in der Forschung und der prophylaktischen Behandlung einer viralen Infektion. Was eine prophylaktische Behandlung einer viralen Infektion betrifft, wird dem Fachmann der Bedarf, alle infektiösen Viren vollständig aus der Zusammensetzung zu entfernen, ersichtlich sein. Auf Wunsch wird eine weitere Behandlung der Zusammensetzung, die nicht infektiöse Partikel umfasst, mit vireninaktivierenden Chemikalien, wie zum Beispiel Iminen oder Psoralenen und/oder Druck- oder Hitzeinaktivierung, die nicht infektiöse Art der Zusammensetzung unterstützen. Zum Beispiel kann eine Menge der vorliegenden erfinderischen Zusammensetzung, die eine Immunreaktion induziert, einem Tier verabreicht werden, bei dem das Risiko einer viralen Infektion besteht, um eine Immunreaktion zu induzieren. Dem Fachmann wird ersichtlich sein, dass eine derartige Zusammensetzung eine signifikante Verbesserung gegenüber früher offenbarten Zusammensetzungen bedeutet, insofern als das Virus nicht infektiös und natürlich vorkommend ist. Somit besteht kein Risiko einer versehentlichen Infektion, höhere Dosen können im Vergleich zu Zusammensetzungen, die infektiöse virale Partikel umfassen, verabreicht werden, und die anschließende Immunreaktion wird mit Sicherheit gegen Antigene gerichtet sein, die auf natürlich vorkommenden Viren vorliegen. Die Zusammensetzung, die natürlich vorkommende, nicht infektiöse Viren umfasst, kann auf jede Weise verabreicht werden, die geeignet ist, um eine Immunreaktion zu induzieren. Vorzugsweise werden die Viren zum Beispiel intramuskulär, mucosal, intravenös, subkutan oder topisch verabreicht. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung natürlich vorkommende, nicht infektiöse menschliche Immundefizienzviren, die gp120 umfassen.
Die Zusammensetzung, die natürlich vorkommende, nicht infektiöse Viren umfasst, kann auf Wunsch mit verschiedenen Trägern, Adjuvanzien, Verdünnungsmitteln oder anderen antiviralen Therapeutika kombiniert werden. Geeignete Träger schließen zum Beispiel Ovalbumin, Albumin, Globuline, Hämocyanine und dergleichen ein. Adjuvanzien oder Immunadjuvanzien werden in den meisten Fällen eingefügt, um das Immunsystem weiter zu stimulieren. Jedes physiologisch geeignete Adjuvans kann verwendet werden. Geeignete Adjuvanzien zum Einschluss in die vorliegende erfinderische Zusammensetzung schließen zum Beispiel Aluminiumhydroxid, Berylliumsulfat, Siliciumdioxid, Kaolin, Kohlenstoff, bakterielles Endotoxin, Saponin und dergleichen ein.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Induzieren einer Immunreaktion gegen ein Virus in einem Tier bereit. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer eine Immunreaktion auslösenden Menge einer Zusammensetzung, die natürlich vorkommende, nicht infektiöse Viren, wie vorstehend beschrieben, umfasst, an das Tier.
Die geeignete Dosis einer Zusammensetzung, die natürlich vorkommende, nicht infektiöse Viren umfasst, die erforderlich ist, um eine Immunreaktion gegen das Virus in einem Tier zu induzieren, hängt von zahlreichen Faktoren, wie der Größe des Tieres und der Immunkompetenz ab. Die verabreichte Menge der Zusammensetzung sollte ausreichen, um eine humorale und/oder zelluläre Immunreaktion zu induzieren. Die Menge an nicht infektiösen Viren in einer bestimmten Zusammensetzung kann unter Verwendung von Routineverfahren auf dem Fachgebiet bestimmt werden, wie zum Beispiel dem Coulter HIV p24 Antigen-Assay (Coulter Corp., Hialeah, FL). Jede geeignete Dosis einer Zusammensetzung, die nicht infektiöse Viren umfasst, ist geeignet, so lange eine Immunreaktion induziert wird, wünschenswerterweise ohne das Auftreten von für den Wirt schädlichen Nebenwirkungen. In dieser Hinsicht sind Zusammensetzungen, die von etwa 10¹ bis etwa 10⁵ Partikel, vorzugsweise von etwa 10² bis etwa 10⁴ Partikel, am meisten bevorzugt etwa 10³ Partikel, umfassen zum Induzieren einer Immunreaktion geeignet.
Ein Fachmann kann die Wirksamkeit der Zusammensetzung, eine Immunreaktion zu induzieren, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Routineverfahren bestimmen. Die Zell-vermittelte Reaktion kann zum Beispiel durch Einsetzen eines Proliferations-Assays mit Virus-Antigen-stimulierten T-Zellen bestimmt werden. Die Anwesenheit einer humoralen Immunreaktion kann zum Beispiel mit dem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt werden. Dem Fachmann wird ersichtlich sein, dass es zahlreiche andere geeignete Assays zum Evaluieren der Induktion einer Immunreaktion gibt. Soweit wie eine Dosis inadäquat ist, um eine geeignete Immunreaktion zu induzieren, können "Auffrischungs"-Verabreichungen anschließend verabreicht werden, um eine wirksamere Immunreaktion zu veranlassen.
Was die Verabreichung der vorliegenden erfinderischen antiviralen Mittel oder Konjugate davon betrifft, kann die Dosierung in Einheitsdosierungsform, wie zum Beispiel einer Tablette oder Kapsel, vorliegen. Der Begriff "Einheitsdosierungsform", wie hierin verwendet, bezeichnet physikalisch getrennte Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für menschliche und tierische Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge eines Cyanovirins oder Konjugats davon enthält, allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln, die in einer ausreichenden Menge berechnet werden, um die gewünschte Wirkung in Zusammenhang mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger, oder Vehikel zu produzieren.
Die Spezifizierungen für die erfindungsgemäßen Einheitsdosierungsformen hängen von dem jeweiligen Cyanovirin, oder dem jeweiligen Konjugat oder der jeweiligen Zusammensetzung davon, das/die eingesetzt wird, und der zu erreichenden Wirkung, sowie von der mit jedem Cyanovirin, jedem Konjugat oder jeder Zusammensetzung davon im Wirt zusammenhängenden Pharmakodynamik ab. Die verabreichte Dosis sollte eine "antiviral wirksame Menge" oder eine Menge sein, die nötig ist, um einen "wirksamen Spiegel" in dem einzelnen Patienten zu erreichen.
Da der "wirksame Spiegel" als bevorzugter Endpunkt für die Dosierung verwendet wird, können die tatsächliche Dosis und der Plan, abhängig von interindividuellen Unterschieden in Pharmakokinetik, Arzneistoffverteilung und Stoffwechsel, variieren. Der "wirksame Spiegel" kann zum Beispiel als der im Patienten gewünschte Blut- oder Gewebespiegel (z. B. 0,1–1000 nM) definiert werden, der einer Konzentration von einem oder mehreren Cyanovirinen oder Konjugaten davon entspricht, die einen Virus, wie zum Beispiel HIV, in einem Assay inhibiert, von dem bekannt ist, dass er eine klinische antivirale Aktivität chemischer Verbindungen und biologischer Mittel vorhersagt. Der "wirksame Spiegel" für erfindungsgemäße Mittel kann auch variieren, wenn das Cyanovirin, oder das Konjugat oder die Zusammensetzung davon, in Kombination mit AZT oder anderen bekannten antiviralen Verbindungen oder Kombinationen davon verwendet wird.
Ein Fachmann kann leicht die geeignete Dosis, den Plan und das Verabreichungsverfahren für die genaue Formulierung der verwendeten Zusammensetzung bestimmen, um die gewünschte "wirksame Konzentration" im einzelnen Patienten zu erreichen. Ein Fachmann kann auch leicht einen geeigneten Indikator der "wirksamen Konzentration" der erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine direkte (z. B. analytisch-chemische Analyse) oder indirekte (z. B. mit Ersatzindikatoren, wie zum Beispiel p24 oder RT) Analyse geeigneter Patientenproben (z. B. Blut und/oder Gewebe) bestimmen und verwenden.
Bei der Behandlung mancher viral infizierter Individuen kann es wünschenswert sein, ein "Mega-Dosierungs"-Regime zu benutzen, wobei eine große Dosis des Cyanovirins oder Konjugats davon verabreicht wird, eine Zeit lang abgewartet wird, damit der Arzneistoff wirken kann, und dem Individuum dann ein geeignetes Reagenz verabreicht wird, um den Arzneistoff zu inaktivieren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann andere Pharmazeutika in Verbin dung mit dem Cyanovirin oder Konjugat davon enthalten, wenn sie verwendet wird, um eine virale Infektion therapeutisch zu behandeln, wie zum Beispiel diejenige, die zu AIDS führt. Repräsentative Beispiele für diese zusätzlichen Pharmazeutika schließen antivirale Verbindungen, virenabtötende Mittel, Immunmodulatoren, Immunstimulantien, Antibiotika und Absorptionsverstärker ein. Beispielhafte antivirale Verbindungen schließen AZT, ddI, ddC, Ganciclovir, fluorierte Didesoxynucleoside, Verbindungen, bei denen es sich nicht um Nucleosidanaloga handelt, wie zum Beispiel Nevirapin (Shih et al., PNAS 88, 9878-9882, 1991), TIBO-Derivate, wie zum Beispiel R82913 (White et al., Antiviral Res. 16, 257–266, 1991), BI-RJ-70 (Merigan, Am. J. Med. 90 (Ergänzg. 4A), 8S-17S, 1991), Michellamine (Boyd et al., J. Med. Chem. 37, 1740–1745, 1994) und Calanolide (Kashman et al., J. Med. Chem. 35, 2735–2743, 1992), Nonoxynol-9, Gossypol und Derivate und Gramicidin (Bourinbair et al., 1994, vorstehend) ein. Beispielhafte Immunmodulatoren und Immunstimulantien schließen verschiedene Interleukine, sCD4, Cytokine, Antikörperherstellungen, Bluttransfusionen und Zelltransfusionen ein. Beispielhafte Antibiotika schließen Antipilzmittel, antibakterielle Mittel und anti-Pneumocystitis carnii-Mittel ein. Beispielhafte Absorptionsverstärker schließen Gallensalze und andere oberflächenaktive Substanzen, Saponine, Cyclodextrine und Phospholipide ein (Davis, 1992, vorstehend).
Es wird erwartet, dass die Verabreichung eines Cyanovirins oder Konjugats davon mit anderen anti-retroviralen Mitteln und besonders mit bekannten RT-Inhibitoren, wie zum Beispiel ddC, AZT, ddI, ddA oder anderen Inhibitoren, die gegen andere HIV-Proteine wirken, wie zum Beispiel anti-TAT-Mitteln, die meisten oder alle replikativen Stadien des viralen Lebenszyklus inhibiert. Die Dosierungen von ddC und AZT, die bei AIDS- oder ARC- Patienten verwendet werden, sind veröffentlicht worden. Ein virustatischer Bereich von ddC liegt im Allgemeinen zwischen 0,05 μM bis 1,0 μM. Ein Bereich von etwa 0,005–0,25 mg/kg Körpergewicht ist bei den meisten Patienten virustatisch. Die vorläufigen Dosisbereiche für eine orale Verabreichung sind etwas breiter, zum Beispiel 0,001 bis 0,25 mg/kg, gegeben in einer oder mehreren Dosen in Abständen von 2, 4, 6, 8, 12 usw. Stunden. Derzeit wird 0,01 mg/kg Körpergewicht ddC, gegeben alle 8 Std., bevorzugt. Wenn sie in kombinierter Therapie gegeben wird, kann die andere antivirale Verbindung zum Beispiel zur gleichen Zeit wie das Cyanovirin oder Konjugat davon gegeben werden oder das Dosieren kann wie gewünscht versetzt werden. Die beiden Arzneistoffe können auch in einer Zusammensetzung kombiniert werden. Dosen von jedem können geringer sein, wenn sie in Kombination verwendet werden, als wenn jedes alleine verwendet wird.
Es wird einem Fachmann auch ersichtlich sein, dass die DNA-Sequenz eines erfindungsgemäßen Cyanovirins oder Konjugats davon ex vivo in Säugetierzellen eingefügt werden kann, die von einem bestimmten tierischen, insbesondere einem menschlichen, Wirt entnommen wurden. Derartige Zellen können eingesetzt werden, um das entsprechende Cyanovirin oder Konjugat nach der Rückführung in den Wirt in vivo zu exprimieren. Die Machbarkeit einer derartigen therapeutischen Strategie, um eine therapeutische Menge eines Mittels in unmittelbarer Nachbarschaft zu den gewünschten Zielzellen und Pathogenen, d. h. Viren, ganz besonders Retroviren, speziell HIV und dessen Hüllglykoprotein gp120, abzugeben, ist in Untersuchungen mit Zellen demonstriert worden, die ex vivo hergestellt wurden, um sCD4 zu exprimieren (Morgan et al., 1994, vorstehend). Es ist auch möglich, dass derartige Sequenzen, als Alternative zur ex vivo Insertion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, direkt in vivo in Zellen eingefügt werden können, wie zum Beispiel durch Verwendung eines geeigneten viralen Vektors. Es wird erwartet, dass derartige in vivo transfizierte Zellen antivirale Mengen von Cyanovirin oder einem Konjugat davon direkt in vivo produzieren.
In Anbetracht der vorliegenden Offenbarung wird zusätzlich ersichtlich sein, dass eine DNA-Sequenz, die einem Cyanovirin oder Konjugat davon entspricht, in geeignete Wirtszellen, bei denen es sich nicht um Säugetierzellen handelt, eingefügt werden kann, und dass derartige Wirtszellen therapeutische oder prophylaktische Mengen eines Cyanovirins oder Konjugats davon direkt in vivo in einem gewünschten Körperkompartiment eines Tieres, insbesondere eines Menschen, exprimieren. Beispiel 3 veranschaulicht die Transformation und Expression wirksamer virenabtötender Mengen eines Cyanovirins in einer Zelle, bei der es sich nicht um eine Säugetierzelle handelt, genauer gesagt einer bakteriellen Zelle. Beispiel 10 veranschaulicht die Transformation und Expression eines Cyanovirins in einer Zelle, bei der es sich nicht um eine Säugetierzelle handelt, speziell einer Hefezelle. Falls eine Hefezelle transformiert werden soll, ist das Cyanovirin wünschenswerterweise nicht glycosyliert oder wie vorstehend beschrieben glykosylierungsbeständig gemacht worden.
Auch offenbart wird eine durch Frauen kontrollierbare Prophylaxe gegen eine HIV-Infektion, welche die intravaginale Verabreichung und/oder Etablierung einer persistenten intravaginalen Population von Lactobacillen, die mit einer erfindungsge mäßen kodierenden Sequenz transformiert worden sind, um über eine verlängerte Zeit hinweg wirksame virenabtötende Spiegel eines Cyanovirins oder Konjugats davon zu produzieren, direkt auf oder innerhalb der vaginalen und/oder Cervix- und/oder Uterus-Schleimhaut, in einem weiblichen Menschen umfasst. Es ist bemerkenswert, dass sowohl die World Health Organization (WHO), sowie das U.S. National Institute of Allergy and Infectious Diseases auf den Bedarf für die Entwicklung von durch Frauen kontrollierten topischen Mikrobiziden, die dazu geeignet sind, die Übertragung von HIV zu blockieren, mit dringendem globalen Vorrang hingewiesen haben (Lange et al., Lancet 341, 1356, 1993; Fauci, NIAID News, Apr. 27, 1995). Eine Zusammensetzung, die ein vorliegendes erfinderisches antivirales Mittel und eine feste Trägermatrix umfasst, ist in dieser Hinsicht besonders nützlich, besonders wenn es sich bei der festen Trägermatrix um ein Verhütungsmittel, wie zum Beispiel ein Kondom, ein Diaphragma, eine Portiokappe, einen Vaginalring oder einen Schwamm, handelt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper bereit, die gegen die Proteine der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen ein bestimmtes Protein ist hoch vorteilhaft, da es die Grundlage für eine große Vielfalt qualitativer und quantitativer analytischer Verfahren, Trennungs- und Reinigungsverfahren und anderer nützlicher Anwendungen, die gegen die Test-Proteine gerichtet sind, bereitstellt. Dementsprechend wird es in Anbetracht der vorliegenden Offenbarung und der erfindungsgemäßen Proteine einem Fachmann leicht ersichtlich sein, dass Antikörper, insbesondere Antikörper, die spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein binden, unter Verwendung von gut etablierten Methodiken (wie z. B. den ausführlich von Harlow und Lane, in Antibodies. A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, 1988, S. 1–725, beschriebenen Methodiken) hergestellt werden können. Derartige Antikörper können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper umfassen. Darüberhinaus können derartige Antikörper entweder in einer Lösungsphase oder gekoppelt an eine gewünschte Festphasenmatrix, wie zum Beispiel Magnetkugeln oder eine Durchflussmatrix, erhalten und eingesetzt werden. Wenn er derartige Antikörper, wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, zur Hand hat, wird dem Fachmann ferner ersichtlich sein, dass derartige Antikörper, in Verbindung mit gut etablierten Verfahren (wie z. B. den von Harlow und Lane (1988, vorstehend) beschriebenen) nützliche Verfahren zum Nachweis, zur Quantifizierung oder Reinigung eines Cyanovirins, Konjugats davon oder einer Wirtszelle umfassen, die transformiert ist, um ein Cyanovirin oder Konjugat davon zu produzieren. Beispiel 12 veranschaulicht ferner einen Antikörper, der spezifisch an ein Cyanovirin bindet.
Auf einer Matrix verankerte anti-Cyanovirin-Antikörper können auch in einem Verfahren zum Entfernen von Viren in einer Probe verwendet werden. Vorzugsweise bindet der Antikörper an ein Epitop eines antiviralen Proteins oder eines antivirales Peptids, das mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst. Vorzugsweise handelt es sich bei der Matrix um eine feste Trägermatrix, wie zum Beispiel eine Magnetkugel oder eine Durchflussmatrix. Falls die feste Trägermatrix, an welcher der anti-Cyanovirin-Antikörper befestigt ist, Magnetkugeln umfasst, kann die Entfernung des Antikörper-Cyanovirin-Virus-Komplexes leicht unter Verwendung eines Magneten erreicht werden.
Angesichts des Vorstehenden stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Entfernen von Viren aus einer Probe bereit. Das Verfahren umfasst (a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Zusammensetzung, die ein isoliertes und gereinigtes antivirales Protein, antivirales Peptid, antivirales Proteinkonjugat oder antivirales Peptidkonjugat umfasst, wobei (i) das antivirale Protein oder das antivirale Peptid mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst und (ii) die mindestens neun zusammenhängenden Aminosäuren an das Virus binden, und (b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem anti-Cyanovirin-Antikörper, der an einer festen Trägermatrix befestigt ist, worauf der anti-Cyanovirin-Antikörper an das antivirale Peptid, antivirale Protein, antivirale Peptidkonjugat oder antivirale Proteinkonjugat bindet, an welches das Virus gebunden ist, und (c) Trennen der festen Trägermatrix von der Probe, worauf die Viren aus der Probe entfernt werden. Vorzugsweise umfasst das antivirale Protein die SEQ ID NR: 2. Wünschenswerterweise ist das Virus, das entfernt wird, infektiös, wie zum Beispiel HIV. Bei der Probe kann es sich um Blut, eine Blutkomponente, Sperma, Zellen, Gewebe oder ein Organ handeln.
Der Antikörper zur Verwendung im zuvor erwähnten Verfahren ist ein Antikörper, der an ein Protein oder Peptid bindet, das mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2 umfasst, und wobei das Protein oder Peptid an ein Virus binden und es inaktivieren kann. Der Antikörper kann unter Verwendung ähnlicher Verfahren und mit ähnlichen Betrachtungen, wie vorstehend für das Befestigen eines Cyanovirins an einer festen Trägermatrix beschrieben wurde, gekoppelt werden. Zum Beispiel können Kopplungsverfahren und eingesetzte Moleküle zum Befestigen eines anti-Cyanovirin-Antikörpers an einer festen Trägermatrix, wie zum Beispiel Magnetkugeln oder einer Durchflussmatrix, eine Biotin/Streptavidin-Kopplung oder ein Koppeln durch Moleküle, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Albumin oder Dextran, einsetzen. Zum Beispiel kann im Wesentlichen das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 7 für das Befestigen eines Cyanovirins an einer festen Trägermatrix, umfassend Magnetkugeln, beschrieben wird, verwendet werden, um einen anti-Cyanovirin-Antikörper an Magnetkugeln zu befestigen. Ebenfalls in Analogie kann gezeigt werden, dass nach einer derartigen Kopplung der auf einer Matrix verankerte anti-Cyanovirin-Antikörper seine Fähigkeit beibehält, an ein Protein oder ein Peptid, umfassend mindestens neun zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NR: 2, zu binden, wobei das Protein oder Peptid an ein Virus binden und es inaktivieren kann.
Die vorliegenden erfinderischen Cyanovirine, Konjugate, Wirtszellen, Antikörper, Zusammensetzungen und Verfahren werden im Zusammenhang der folgenden Beispiele weiter beschrieben. Diese Beispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt Einzelheiten der durch einen anti-HIV-Bioassay geleiteten Isolierung und Aufklärung von reinem Cyanovirin aus wässrigen Extrakten des gezüchteten Cyanobakteriums Nostoc ellipsosporum.
Das in Weislow et al. (1989, vorstehend) beschriebene Verfahren wurde verwendet, um das Isolierungs- und Reinigungsverfahren zu überwachen und zu steuern. Die Zuchtbedingungen, Medien und Klassifizierung der Cyanobakterien waren wie zuvor beschrieben (Patterson, J. Phycol. 27, 530–536, 1991). Kurz gesagt, die Zellmasse eines einalgigen Stammes von Nostoc ellipsosporum (Kultur Q68D170) wurde durch Filtration geerntet, gefriergetrocknet und mit MeOH-CH₂Cl₂ (1:1) extrahiert, gefolgt von H₂O. Der Bioassay zeigte an, dass nur der H₂O-Extrakt eine HIV-inhibitorische Aktivität enthielt. Eine Lösung des wässrigen Extrakts (30 mg/ml) wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens Ethanol (EtOH) behandelt. Die so erhaltene 1:1 H₂O–EtOH-Lösung wurde 15 h lang bei –20°C aufbewahrt. Dann wurde die Lösung zentrifugiert, um präzipitierte Materialien (vermutlich Biopolymere mit hohem Molekulargewicht) zu entfernen. Der erhaltene HIV-inhibitorische Überstand wurde eingedampft, dann durch Reverse-Phase-Vakuum-Flüssigchromatographie (Coll et al., J. Nat. Prod. 49, 934–936, 1986, und Pelletier et al., J. Nat. Prod. 49, 892–900, 1986) auf weitporiger C₄-Packung (300, BakerBond WP-C₄) fraktioniert und mit steigenden Konzentrationen von Methanol (MeOH) in H₂O eluiert. Die anti-HIV-Aktivität war in dem mit MeOH-H₂O (2:1) eluierten Material konzentriert. Eine SDS-PAGE-Analyse dieser Fraktion zeigte eine Hauptproteinbande mit einer relativen Molekülmasse (Mr) von ungefähr 10 kDa. Die Endreinigung wurde durch wiederholte Reverse-Phase-HPLC auf 1,9 × 15 cm μBondapak C₁₈(Waters Associates) Säulen durchgeführt, die mit einem Gradienten von steigender Konzentration an Acetonitril in H₂O eluiert wurden. Die mobile Phase enthielt 0,05% (Vol./Vol.) TFA, pH = 2. Eluierte Proteine und Peptide wurden durch UV-Absorption bei 206, 280 und 294 nm mit einem schnellen Spektraldetektor (Pharmacia LKB Modell 2140) nachgewiesen. Einzelne Fraktionen wurden gesammelt, beruhend auf dem UV-Chromatogramm vereinigt, und lyophilisiert. Die vereinigten HPLC-Fraktionen wurden einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (Laemmli, Nature 227, 680–685, 1970), einer herkömmlichen Aminosäureanalyse und dem Testen auf anti-HIV-Aktivität unterworfen.
Bei 1A handelt es sich um ein Diagramm von OD 206 nm gegen Zeit (min), welches das μBondapak C18 HPLC-Chromatogramm von nicht reduziertem Cyanovirin darstellt, das mit einem linearen CH₃CN/H₂O-Gradienten (gepuffert mit 0,05% TFA) von 28–38% CH₃CN eluiert wurde. Bei Abbildung 1C handelt es sich um ein Diagramm von OD 206 nm gegen Zeit (min), welches das Chromatogramm von Cyanovirin zeigt, das zunächst mit β-Mercaptoethanol reduziert und dann unter identischen HPLC-Bedingungen aufgetrennt wurde. HPLC-Fraktionen von den beiden Läufen wurden wie angezeigt gesammelt. Teilmengen von 10% jeder Fraktion wurden lyophilisiert, in 3:1 H₂O/DMSO auf 100 μl aufbereitet und in dem XTT-Assay auf anti-HIV-Aktivität abgeschätzt. Bei 1B handelt es sich um ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegen die HPLC-Fraktion, das die maximale Verdünnung jeder Fraktion veranschaulicht, die einen 50%igen Schutz vor den cytopathischen Wirkungen einer HIV-Infektion für die nicht reduzierten HPLC-Fraktionen von Cyanovirin anzeigt. Entsprechende anti-HIV-Ergebnisse für die HPLC-Fraktionen von reduziertem Cyanovirin werden in 1D gezeigt, bei der es sich um ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegen die HPLC-Fraktion handelt. 20%-Teilmengen ausgewählter HPLC-Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert. Bei der anfänglichen HPLC-Trennung unter Verwendung eines linearen Gradienten von 30–50% CH₃CN eluierte die anti-HIV-Aktivität zusammen mit dem Haupt-UV-absorbierenden Peak bei ungefähr 33% CH₃CN. Fraktionen, die dem aktiven Peak entsprachen, wurden vereinigt und in zwei Teilmengen aufgespalten.
Eine erneute Injektion der ersten Teilmenge unter ähnlichen HPLC-Bedingungen, aber mit einem linearen Gradienten von 28–38% CH₃CN, löste das aktive Material in zwei nah beieinander eluierende Peaks bei 33,4 und 34,0% CH₃CN auf. Das anti-HIV- Aktivitätsprofil der während dieses HPLC-Laufs gesammelten Fraktionen (wie in 1B gezeigt wird) entsprach den beiden UV-Peaks (wie in 1A gezeigt wird). Eine SDS-PAGE der Fraktionen, die unter den einzelnen Peaks gesammelt wurden, zeigte nur eine einzige Proteinbande.
Die zweite Teilmenge der ursprünglichen HPLC-Trennung wurde vor der erneuten Injektion auf die HPLC mit β-Mercaptoethanol reduziert. Unter Verwendung eines identischen Gradienten von 28–38% ergab das reduzierte Material einen Hauptpeak (wie in 1C gezeigt wird), der später im Lauf mit 36,8% CH₃CN eluierte. Nur eine Spur von anti-HIV-Aktivität wurde in den HPLC-Fraktionen aus dem reduzierten Material nachgewiesen (wie in 1D gezeigt wird).
Die beiden nah beieinander eluierenden HPLC-Peaks des nicht reduzierten Materials (1A) ergaben nur eine identische Bande auf (unter reduzierenden Bedingungen laufender) SDS-PAGE, und eine Reduktion mit β-Mercaptoethanol führte zu einem HPLC-Peak mit einer längeren Rückhaltezeit als jeder der nicht reduzierten Peaks. Dies zeigte an, dass in dem nativen Protein Disulfide vorlagen. Eine Aminosäureanalyse der beiden aktiven Peaks zeigte, dass sie praktisch identische Zusammensetzungen hatten. Es ist möglich, dass sich die beiden HPLC-Peaks aus einer cis/trans-Isomerie um einen Prolinrest oder aus der Mikroheterogenität in der Proteinprobe ergaben, die weder bei der Aminosäureanalyse noch während des Sequenzierens nachgewiesen wurde. Das Material, das als die beiden HIV-inhibitorischen Peaks gesammelt wurde, wurde zur weiteren Analyse kombiniert und ihm wurde der Name Cyanovirin-N gegeben.
Beispiel 2
Diese Beispiel veranschaulicht die Synthese von Cyanovirin-Genen.
Die chemisch abgeleitete Aminosäuresequenz von Cyanovirin-N wurde rücktranslatiert, um eine kodierende DNA-Sequenz zu erhalten. Um die anfängliche Herstellung und Reinigung von rekombinantem Cyanovirin-N zu erleichtern, wurde ein kommerzieller Expressionsvektor (pFLAG-1, von International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), für den Reagenzien zur Affinitätsreinigung und zum Nachweis zur Verfügung standen, ausgewählt. Geeignete Restriktionsstellen zur Ligation an pFLAG-1 und ein Stoppcodon waren in der DNA-Sequenz enthalten. Bei 2 handelt es sich um ein Beispiel für eine DNA-Sequenz, die für ein synthetisches Cyanovirin-Gen kodiert. Dieser DNA-Sequenz-Entwurf koppelt die kodierende Region von Cyanovirin-N an Codons für ein "FLAG"-Octapeptid am N-terminalen Ende von Cyanovirin, was für die Herstellung eines FLAG-Cyanovirin Fusionsproteins sorgt.
Ein Ablaufschema für die Synthese dieser DNA-Sequenz wird in 11 gezeigt. Die DNA-Sequenz wurde als 13 überlappende, komplementäre Oligonucleotide synthetisiert und zusammengesetzt, um die doppelsträngige kodierende Sequenz zu bilden. Oligonucleotidelemente der synthetischen kodierenden DNA-Sequenz wurden auf einem Nukleinsäure-Synthesizer mit zwei Säulen (Modell 392, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) synthetisiert. Fertige Oligonucleotide wurden von den Säulen abgespalten und durch Inkubation über Nacht bei 56°C in konzentriertem Ammoniumhydroxid entschützt. Vor der Behandlung mit T4 Polynucleotidkinase wurden 33–66mere einer Tropfendialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen. Die 13 Oligonucleotidpräparate wurden einzeln durch HPLC gereinigt und 10 nmol-Mengen von jedem wurden mit T4 DNA-Ligase zu einer 327 bp langen, doppelsträngigen DNA-Sequenz ligiert. Die DNA wurde aus dem Reaktionspuffer durch Extraktion mit Phenol: Chloroform, Ethanol-Präzipitation und weiteres Waschen mit Ethanol gewonnen und gereinigt. Einzelne Nucleotidherstellungen wurden vereinigt und 10 min lang gekocht, um eine Denaturierung sicherzustellen. Die Temperatur des Gemisches wurde dann zum Aneinanderlagern der komplementären Stränge auf 70°C reduziert. Nach 20 min wurde das Röhrchen auf Eis gekühlt und 2.000 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zusammen mit zusätzlichem Ligase-Puffer zugegeben. Die Ligation wurde über Nacht bei 16° durchgeführt. Die DNA wurde aus dem Ligations-Reaktionsgemisch durch Extraktion mit Phenol : Chloroform und Ethanol-Präzipitation und Waschen gewonnen und gereinigt.
Die gereinigte, doppelsträngige synthetische DNA wurde dann als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. Als Matrize wurde ein μl der DNA-Lösung, die nach der Reinigung des Ligations-Reaktionsgemisches erhalten wurde, verwendet. Thermisches Zyklisieren wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Gerätes durchgeführt. Thermostabile "Vent"-DNA-Polymerase, Restriktionsenzyme, T4 DNA-Ligase und Polynucleotidkinase wurden von New England Biolabs, Beverly, MA erhalten. Eine Vent-Polymerase wurde wegen ihrer behaupteten Überlegenheit bei der Zuverlässigkeit, verglichen mit dem normal Taq-Enzym, für diese Anwendung ausgewählt. Das PCR-Reaktionsprodukt wurde auf einem 2%igen Agarosegel in TBE-Puffer laufen gelassen. Das 327 bp lange Konstrukt wurde dann aus dem Gel ausgeschnitten und durch Elektroelution gereinigt. Weil festgestellt wurde, dass es relativ beständig gegen einen Verdau mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xho I war, wurde es anfänglich unter Verwendung des pCR-Script-Systems (Stratagene) kloniert. Der Verdau einer Plasmidherstel lung aus einem dieser Klone ergab die kodierende Sequenz, die dann in die Multiklonierungsstelle des Vektors pFLAG-1 ligiert wurde.
E. coli-Zellen wurden mit dem pFLAG-Konstrukt transformiert und rekombinante Klone wurden durch die Analyse von Restriktionsverdaus von Plasmid-DNA identifiziert. Die Sequenzanalyse von einem dieser ausgewählten Klone zeigte an, dass vier Basen von der beabsichtigten kodierenden Sequenz abwichen. Dies schloss die Deletion von drei Basen ein, die für einen von vier Cysteinresten kodieren, die im Protein enthalten sind, und eine Veränderung der dritten Base in dem vorhergehenden Codon (durch die Rahmen in 2 angezeigt). Um diese "Mutationen" zu korrigieren, die vermutlich während der PCR-Amplifikation der synthetischen Matrize auftraten, wurde ein doppelsträngiger "Flicken" synthetisiert, der in Restriktionsstellen ligiert werden konnte, welche die Mutationen flankieren (diese Bst XI und Esp1 Stellen sind in 2 auch angezeigt). Der Flicken wurde angewendet und die Reparatur wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
Zur Herstellung einer für natives Cyanovirin kodierenden DNA-Sequenz wurde das zuvor erwähnte FLAG-Cyanovirin-Konstrukt einer ortsspezifischen Mutagenese unterworfen, um die Codons für das FLAG-Octapeptid zu eliminieren und um gleichzeitig eine nur einmal auftretende Hind III Restriktionsstelle zu eliminieren. Dieses Verfahren wird in 3 veranschaulicht, die ein ortsspezifisches Mutagenesemanöver veranschaulicht, das verwendet wurde, um Codons für ein FLAG-Octapeptid und eine Hind III Restriktionsstelle aus der Sequenz von 2 zu eliminieren. Ein mutagener Oligonucleotidprimer wurde synthetisiert, der Teilstücke der Codons für das sekretorische Omp-Peptid und Cyanovirin einschloss, dem aber die Codons für das FLAG-Peptid fehlten. Das Anlagern dieses mutagenen Primers mit der Erzeugung eines DNA-Hairpins im Matrizenstrang und die Verlängerung durch DNA-Polymerase führte zur Erzeugung einer neuen Plasmid-DNA, der sowohl die FLAG-Codonsequenz als auch die Hind III-Stelle fehlte (siehe 2 für Einzelheiten). Ein Verdau von Plasmid-DNA mit Hind III führte zur Linearisierung von "Wildtyp-"Strängen aber nicht von "mutanten" Strängen. Da eine Transformation von E. coli mit zirkulärer DNA effizienter stattfindet, konnten Klone leicht ausgewählt werden, welche die revidierte kodierende Sequenz hatten, die eine Produktion von nativem Cyanovirin-N direkt hinter dem sekretorischen Omp-Peptid spezifizierte. Eine DNA-Sequenzierung verifizierte die Anwesenheit der beabsichtigten Sequenz. Ortsspezifische Mutagenesereaktionen wurden unter Verwendung von Materialien (Polymerase, Puffer usw.) durchgeführt, die von Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, erhalten wurden.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Expression synthetischer Cyanovirin-Gene.
E. coli-Zellen (Stamm DH5α) wurden (durch Elektroporation) mit dem Vektor pFLAG-1 transformiert, der die kodierende Sequenz für das FLAG-Cyanovirin-N Fusionsprotein enthielt (siehe 2 für Einzelheiten der DNA-Sequenz). Ausgewählte Klone wurde in Schüttelkolben von kleinem Maßstab beimpft, die (LB) Wachstumsmedium mit 100 μg/ml Ampicillin enthielten und durch Inkubation bei 37°C ausgeweitet. Erlenmeyer-Kolben von größerem Maßstab (0,5–3,0 Liter) wurden dann beimpft und man ließ sie auf eine Dichte von 0,5–0,7 OD₆₀₀-Einheiten wachsen. Die Expression des FLAG-Cyanovirin-N Fusionsproteins wurde dann durch Zugeben von IPTG auf eine Endkonzentration von 1,7 mM und 3–6 h langes Fortsetzen der Inkubation bei 30°C induziert. Zum Ernten periplasmatischer Proteine wurden die Bakterien pelletiert, gewaschen und dann durch Behandlung mit Saccharose osmotisch geschockt, gefolgt von Resuspension in destilliertem Wasser. Periplasmatische Proteine wurden durch Sedimentieren der Bakterien und dann Filtrieren des wässrigen Überstands durch Whatman-Papier erhalten. Rohe periplasmatische Extrakte zeigten sowohl anti-HIV-Aktivität als auch die Anwesenheit eines FLAG-Cyanovirin-N Fusionsproteins durch Western- oder Spot-Blot-Analyse.
Das in Beispiel 2 beschriebene Konstrukt für natives Cyanovirin-N wurde verwendet, um Bakterien auf die gleiche Weise, wie vorstehend für das FLAG-Cyanovirin-N Fusionsprotein beschrieben, zu transformieren. Klonieren, Ausweiten, Induktion mit IPTG und Ernten wurde auf ähnliche Weise durchgeführt. Periplasmatische Rohextrakte zeigten eine starke anti-HIV-Aktivität im Bioassay. Ein Ablaufschema der Expression synthetischer Cyanovirin-Gene wird in 12 gezeigt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Reinigung von rekombinanten Cyanovirin-Proteinen.
Unter Verwendung einer Affinitätssäule, die auf einem monoklonalen anti-FLAG-Antikörper (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) beruhte, konnte das FLAG-Cyanovirin-N Fusionsprotein folgendermaßen gereinigt werden.
Der jeweilige periplasmatische Extrakt, der wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde, wurde auf Schwerkraftsäulen von 2–20 ml geladen, die eine Affinitätsmatrix enthielten, und ausgiebig mit Ca⁺⁺ enthaltendem PBS gewaschen, um kontaminierende Proteine zu entfernen. Da das Binden des FLAG-Peptids an den Antikörper Ca⁺ abhängig ist, konnte das Fusionsprotein durch Leiten von EDTA durch die Säule eluiert werden. Säulenfraktionen und Waschvolumen wurden durch Spot-Blot-Analyse unter Verwendung des gleichen anti-FLAG-Antikörpers überwacht. Fraktionen, die das Fusionsprotein enthielten, wurden dann vereinigt, ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Zur Reinigung von rekombinantem nativem Cyanovirin-N wurde der entsprechende periplasmatische Extrakt aus Beispiel 3 einer Stufengradienten-C₄-Reverse-Phase-Vakuum-Flüssigchromatographie unterworfen, um drei Fraktionen zu ergeben: (1) mit 100% H₂O eluiert, (2) mit MeOH-H₂O (2:1) eluiert und (3) mit 100% MeOH eluiert. Die anti-HIV-Aktivität war in Fraktion (2) konzentriert. Eine Reinigung des rekombinanten Cyanovirin-N wurde durch HPLC auf einer 1,9 × 15 cm μBondapak (Waters Associates) C₁₈-Säule durchgeführt, die mit einem Gradienten ansteigender Konzentration von CH₃CN in H₂O (0,05% TFA, Vol./Vol. in der mobilen Phase) eluiert wurde. Ein Chromatogramm der HPLC-Endreinigung auf einer 1 × 10 cm (Cohensive Technologies, Inc.) C₄-Säule, die bei 280 nm überwacht wurde, wird in 4 gezeigt, bei der es sich um ein typisches HPLC-Chromatogramm während der Reinigung eines rekombinanten, nativen Cyanovirins handelt. Die Gradientenelution, 5 ml/min, von 100% H₂O bis H₂O-CH₃CN (7:3) wurde über 23 min hinweg mit 0,05% TFA (Vol./Vol.) in der mobilen Phase ausgeführt.
Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt anti-HIV-Aktivitäten von nativem und rekombinantem Cyanovirin-N und FLAG-Cyanovirin-N.
Reine Proteine wurden anfänglich unter Verwendung eines zuvor beschriebenen XTT-Tetrazolium-anti-HIV-Assays (Boyd, in AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 1988, vorstehend; Gustafson et al., J. Med. Chem. 35, 1978–1986, 1992; Weislow, 1989, vorstehend, und Gulakowski, 1991, vorstehend) auf antivirale Aktivität hin ausgewertet. Die in allen Assays verwendete menschliche Lymphozyten-Zielzelllinie CEM-SS wurde in RPMI 1650-Medium (Gibco, Grand Island, NY) ohne Phenolrot erhalten und wurde mit 5% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamicin ergänzt (vollständiges Medium).
Exponentiell wachsende Zellen wurden pelletiert und bei einer Konzentration von 2,0 × 10⁵ Zellen/ml in vollständigem Medium resuspendiert. Die Haitianische Variante von HIV, HTLV-III_RF (3,54 × 10⁶ SFU/ml), wurde durchgehend verwendet. Gefrorene
Virenstammlösungen wurden unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut und in vollstän digem Medium resuspendiert, um 1,2 × 12⁵ SFU/ml zu ergeben. Die geeigneten Mengen der reinen Proteine für anti-HIV-Auswertungen wurden in H₂O–DMSO (3:1) aufgelöst, dann in vollständigem Medium auf die gewünschte Anfangskonzentration verdünnt. Alle Arzneistoff-Reihenverdünnungen, Reagenzzugaben und Platte-zu-Platte-Übertragungen wurden mit einer automatisierten Biomek 1000 Workstation (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) ausgeführt.
Bei den 5A–5C handelt es sich um Diagramme von % der Kontrolle gegen Konzentration (nm), die antivirale Aktivitäten von nativem Cyanovirin aus Nostoc ellipsosporum (A), rekombinantem nativem (B) und rekombinantem FLAG-Fusions-(C) Cyanovirin veranschaulichen. Die Diagramme zeigen die Wirkungen eines Konzentrationsbereiches der jeweiligen Cyanovirine auf mit HIV-1 infizierten CEM-SS Zellen (•), wie sie nach 6 Tagen in Kultur bestimmt wurden. Die Datenpunkte stellen den Prozentsatz der jeweiligen nicht infizierten, nicht mit Arzneistoff behandelten Kontrollwerte dar. Alle drei Cyanovirine zeigten eine starke anti-HIV-Aktivität, mit einem EC₅₀ im niedrigen nanomolaren Bereich, und keinen signifikanten Beweis einer direkten Cytotoxizität auf die Wirtszellen bei den höchsten getesteten Konzentrationen (bis zu 1,2 μM).
Als Beispiel für eine weitere Demonstration der anti-HIV-Aktivität von reinem Cyanovirin-N wurde eine Reihe von miteinander verwandten HIV-Assays unter Verwen dung von im Einzelnen anderswo beschriebenen Verfahren (Gulakowski, 1991, vorstehend) in einzelnen Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Kurz gesagt war das Verfahren folgendermaßen. Cyanovirin-Lösungen wurden in vollständigem Medium seriell verdünnt und zu Testplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Nicht infizierte CEM-SS Zellen wurden bei einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen in 50 μl vollständigem Medium ausplattiert. Verdünntes HIV-1 wurde dann zu entsprechenden Vertiefungen in einem Volumen von 50 μl gegeben, um eine Infektionsmultiplizität von 0,6 zu ergeben. Geeignete Zell-, Viren- und Arzneistoffkontrollen wurden in jedes Experiment eingefügt. Das Endvolumen in jeder Mikrotitervertiefung betrug 200 μl. Für vireninfizierte Zellen wurden Vertiefungen in vierfacher Ausfertigung verwendet. Die Platten wurden bei 37°C in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre 4, 5 oder 6 Tage lang inkubiert.
Anschließend wurden Teilmengen des zellfreien Überstands von jeder Vertiefung unter Verwendung des Biomek entnommen und auf Reverse-Transkriptase-Aktivität, p24-Antigenproduktion und Synthese infektiöser Viruspartikel wie beschrieben analysiert (Gulakowski, 1991, vorstehend). Zellwachstum oder Lebensfähigkeit wurde dann an dem verbleibenden Inhalt jeder Vertiefung unter Verwendung des XTT-(Weislow et al., 1989, vorstehend), BCECF-(Rink et al., J. Cell Biol. 95, 189–196, 1982) und DAPI-(McCaffrey et al., In vitro Cell Develop. Biol. 24, 247–252, 1988) Assays wie beschrieben (Gulakowski et al., 1991, vorstehend) abgeschätzt. Um die graphischen Darstellungen und Vergleiche der Daten zu erleichtern, wurde der Durchschnitt der einzelnen experimentellen Assayergebnisse (von mindestens vierfachen Bestimmungen von jedem) gebildet und die mittleren Werte wurden verwendet, um Prozentsätze in Bezug auf die geeigneten Kontrollen zu berechnen. Standardfehler der Mittelwerte, die bei diesen Berechnungen verwendet wurden, betrugen im Durchschnitt typischerweise weniger als 10% der jeweiligen Mittelwerte.
Bei den 6A–6D handelt es sich um Diagramme von % der Kontrolle gegen Konzentration (nm), welche die anti-HIV-Aktivität eines Cyanovirins in einem Multiparameter-Assayformat veranschaulichen. Die Diagramme 6A, 6B und 6C zeigen die Wirkungen eines Konzentrationsbereiches von Cyanovirin auf nicht infizierte CEM-SS Zellen (o) und auf mit HIV-1 infizierte CEM-SS Zellen (•), wie nach 6 Tagen in Kultur bestimmt wurde. Das Diagramm 6A bildet die relative Anzahl lebensfähiger CEM-SS Zellen ab, wie durch den BCECF-Assay abgeschätzt wurde. Das Diagramm 68 bildet den relativen DNA-Gehalt der jeweiligen Kulturen ab. Das Diagramm 6C bildet die relative Anzahl lebensfähiger CEM-SS Zellen ab, wie durch den XTT-Assay abgeschätzt wurde. Das Diagramm 6D zeigt die Wirkungen eines Konzentrationsbereichs von Cyanovirin auf Indizes von infektiösen Viren oder Virusreplikation, wie nach 4 Tagen in Kultur bestimmt wurde. Diese Indizes schließen die virale reverse Transkriptase (
), das virale Kernprotein p24 (♦) und Syncytium-bildende Einheiten (
) ein. In den Diagrammen 6A, 6B und 6C werden die Daten als Prozent der nicht infizierten, nicht mit Arzneistoff behandelten Kontrollwerte dargestellt. Im Diagramm 6D werden die Ergebnisse als Prozentsatz der infizierten, nicht mit Arzneistoff behandelten Kontrollwerte dargestellt.
Wie in 6 veranschaulicht wird, war Cyanovirin-N zur vollständigen Inhibierung der cytopathischen Wirkungen von HIV-1 auf menschliche lymphoblastoide CEM-SS Zielzellen in vitro fähig; eine direkte Cytotoxizität des Proteins auf die Zielzellen wurde bei den höchsten getesteten Konzentrationen nicht beobachtet. Cyanovirin-N inhibierte auffallenderweise auch die Produktion von RT, p24 und SFU in HIV-1-infizierten CEM-SS Zellen innerhalb dieser gleichen inhibitorisch wirksamen Konzentrationen, was anzeigt, dass das Protein die virale Replikation anhielt.
Die anti-HIV-Aktivität der Cyanovirine ist extrem belastbar gegen raue Umweltherausforderungen. Zum Beispiel widerstanden ungepufferte Cyanovirin-N-Lösungen wiederholten Zyklen von Einfrieren und Auftauen oder einer Auflösung in organischen Lösungsmitteln (bis zu 100% DMSO, MeOH oder CH₃CN) ohne Aktivitätsverlust. Cyano virin-N tolerierte eine Behandlung mit Detergenz (0,1% SDS), hohem Salz (6M Guanidin-HCl) und Hitze (10 min langes Kochen in H₂O) ohne signifikanten Verlust der HIV-inhibitorischen Aktivität. Eine Reduktion der Disulfide mit β-Mercaptoethanol, unmittelbar gefolgt von einer Reinigung durch C₁₈-HPLC reduzierte die zellschützende Aktivität von Cyanovirin-N drastisch. Lösungen von reduziertem Cyanovirin-N gewannen die anti-HIV-inhibitorische Aktivität während einer verlängerten Lagerung jedoch zurück. Wenn Cyanovirin-N reduziert wurde (β-Mercaptoethanol, 6M Guanidin-HCl, pH-Wert 8,0), aber nicht durch eine C₁₈-HPLC geschickt wurde und stattdessen einfach entsalzt, rekonstituiert und getestet wurde, behielt es eine praktisch vollständige Aktivität bei.
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass die virale Hülle von HIV, gp120, ein molekulares Hauptziel von Cyanovirin-N ist.
Anfängliche Experimente die den XTT-Tetrazolium-Assay (Weislow et al., 1989, vorstehend) einsetzten, deckten auf, dass Wirtszellen, die mit Cyanovirin (10 nM, 1 h) vorinkubiert und dann von Cyanovirin-N frei zentrifugiert wurden, eine normale Empfänglichkeit für eine HIV-Infektion beibehielten; im Gegensatz dazu wurde die Infektivität von konzentrierten Viren, die auf ähnliche Weise vorbehandelt und dann verdünnt wurden, um nicht inhibitorische Konzentrationen von Cyanovirin-N zu ergeben, im Wesentlichen aufgehoben. Dies zeigte an, dass Cyanovirin-N direkt auf das Virus selbst wirkte, d. h. als direktes "virenabtötendes" Mittel, um eine virale Infektivität zu verhindern, bevor es in die Wirtszellen eindringen konnte. Dies wurde weiter in Experimenten zur Zugabezeit bestätigt, die auf ähnliche Weisen den XTT-Tetrazolium-Assay (Weislow, 1989, vorstehend) einsetzten, die zeigten, dass Cyanovirin-N, um eine maximale antivirale Aktivität zu gewähren, vor oder so bald wie möglich nach Zugabe von Viren zu Zellen gegeben werden musste, wie in 7 gezeigt wird, bei der es sich um ein Diagramm von % der nicht infizierten Kontrolle gegen die Zugabezeit (h) handelt, das die Ergebnisse von Untersuchungen zur Zugabezeit eines Cyanovirins zeigt, die eine anti-HIV-Aktivität bei mit HIV-1_RF infizierten CEM-SS Zellen zeigen. Das Einführen von Cyanovirin (•) oder ddC (
)(Konzentrationen von 10 nM beziehungsweise 5 μM) wurde um verschiedene Zeiten nach der anfänglichen Inkubation verzögert, gefolgt von einer 6 Tage langen Inkubation, dann einem Assay auf zelluläre Lebensfähigkeit (Liniendiagramme) und RT (offene Balken, Einfügung). Punkte stellen Durchschnittswerte (± S.D.) von mindestens dreifachen Bestimmungen dar. In deutlichem Gegensatz zu dem Reverse-Transkriptase-Inhibitor ddC führte das Verzögern der Zugabe von Cyanovirin-N um nur 3 h zu wenig oder keiner antiviralen Aktivität (7). Die zuvor erwähnten Ergebnisse legten nahe, dass Cyanovirin-N die HIV-Infektivität durch Unterbrechen der anfänglichen Wechselwirkung des Virus mit der Zelle inhibiert; dies würde deshalb wahrscheinlich eine direkte Wechselwirkung von Cyanovirin-N mit dem viralen gp120 einbeziehen. Dies wurde durch Ultrafiltrationsexperimente und Dot-Blot-Assays bestätigt.
Ultrafiltrationsexperimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob lösliches gp120 und Cyanovirin-N direkt binden konnten, wie durch Inhibierung des Durchtritts von Cyanovirin-N durch einen Ultrafilter mit einem Ausschluss von 50 kDA abgeschätzt wurde. Lösungen von Cyanovirin (30 μg) in PBS wurden 1 h lang bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von gp120 behandelt, dann durch einen Zentrifugal-Ultrafilter mit einem Ausschluss von 50 kDA (Amicon) filtriert. Nach 3-maligem Waschen mit PBS wurden die Filtrate mit 3 kDa Ultrafiltern entsalzt; die Retentate wurden lyophilisiert, in 100 μl H₂O rekonstituiert und auf anti-HIV-Aktivität hin analysiert.
Bei 8 handelt es sich um ein Diagramm von OD (450 nm) gegen Cyanovirinkonzentration (μg/ml), das Cyanovirin/gp120-Wechselwirkungen veranschaulicht, die gp120 als ein molekulares Hauptziel von Cyanovirin definieren. Freies Cyanovirin-N wurde leicht eluiert, wie durch vollständige Rückgewinnung der Cyanovirin-N-Bioaktivität im Filtrat bewiesen wurde. Im Gegensatz dazu deckten Filtrate von Cyanovirin-N-Lösungen, die mit gp120 behandelt worden waren, einen konzentrationsabhängigen Verlust der Bioaktivität des Filtrats auf; darüberhinause waren die Retentate des 50 kDa-Filters alle inaktiv, was anzeigt, dass Cyanovirin-N und lösliches gp120 direkt in Wechselwirkung traten, um einen Komplex zu bilden, der unfähig war, gp120 von intakten Viren zu binden.
Es gab weitere Beweise für eine direkte Wechselwirkung von Cyanovirin-N und gp120 in einem Dot-Blot-Assay mit einer PVDF-Membran. Auf eine PVDF-Membran wurden 5 μg CD4 (CD), 10 μg Aprotinin (AP), 10 μg Rinderglobulin (BG) und abnehmende Mengen Cyanovirin getropft; 6 μg [1], 3 μg [2], 1,5 μg [3], 0,75 μg [4], 0,38 μg [5], 0,19 μg [6], 0,09 μg [7] und 0,05 μg [8], dann wurde sie mit PEST gewaschen und nach den Empfehlungen des Herstellers sichtbar gemacht. Ein Dot-Blot der Bindung von Cyanovirin und einem gp120-HRP-Konjugat (Invitrogen) zeigte, dass Cyanovirin-N ein Meerrettichperoxidase-Konjugat von gp120 (gp120-HRP) auf konzentrationsabhängige Weise band.
Beispiel 7
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung und biologische Aktivität einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die ein funktionelles Cyanovirin umfasst, das an eine feste Trägermatrix gekoppelt ist.
In E. coli hergestelltes rekombinantes CV-N (rCV-N) wurde mit biotinyliertem CV-N (bCV-N) bei 0,05 μg oder 0,5 μg in Bezug auf die in-vitro-Inaktivierung von 100 TCID₅₀ eines primären Isolats (HIV-1 UG/021/92) verglichen, das zu fötalem Rinderserum zugesetzt wurde. Teilmengen von 10⁴ Streptavidin-beschichteten magnetischen Glaskugeln wurden bei Raumtemperatur mit 0,5 μg bCV-N 60 Minuten lang umgesetzt und gewaschen, um freies bCV-N zu entfernen. Das Binden von bCV-N an die Kugeln wurde mit polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen CV-N unter Verwendung von FITC-markiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG in einer Durchflusszytometrie-Analyse der Kugeln nachgewiesen. Das kugelgebundene festsitzende CV-N (sCV-N) und ungebundene Kontrollkugeln wurden gegen 100 TCID₅₀ von HIV auf antivirale Aktivität getestet. Nach einer 90 Minuten langen Inkubation bei 37°C wurden die viralen Überstände 7 Tage lang in PHA-stimulierten menschlichen PMBC gezüchtet und die Synthese von p24-Antigen wurde abgeschätzt.
Bei 0,5 μg waren sowohl rCV-N als auch bCV-N gleich wirksam bei der Inaktivierung von 100 TCID₅₀ von HIV; bei 0,05 μg waren sie jedoch nur 40% wirksam bei der Inaktivierung von 100 TCID₅₀. Das kugelgebundene sCV-N inaktivierte 100 TCID₅₀ von HIV vollständig, obwohl ein Bruchteil nicht infektiöser HIV anscheinend an sCV-N anhaften blieb, wie durch RT-PCR abgeschätzt wurde. Somit stellt ein auf einer Matrix verankertes Cyanovirin ein praktisches und wirksames Mittel bereit, um infektiöse Viren von nicht infektiösen Viren in einer Probe zu entfernen.
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht den außerordentlich breiten Bereich antiretroviraler Aktivität gegen vielfältige laborangepasste und klinische Stämme menschlicher und nicht menschlicher Primaten-lmmundefizienz-Retroviren. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die Vergleichsbereiche von anti-Immundefizienzvirus-Aktivitäten von Cyanovirin-N und sCD4, die gegen einen breiten Bereich von Virusstämmen in vielfältigen Wirtszellen getestet wurden. Besonders bemerkenswert ist die ähnliche Stärke von Cyanovirin-N gegen laborangepasste Stämme sowie klinische Isolate von HIV. Dies stand in scharfem Kontrast zum Mangel der Aktivität von sCD4 gegen die klinischen Isolate.

Die EC₅₀-Werte (Tabelle 1) wurden aus Konzentrations-Wirkungs-Kurven von acht Verdünnungen der Testmittel bestimmt (Durchschnittswerte aus dreifachen Vertiefungen pro Konzentration); G910-6 ist ein AZT-resistenter Stamm; A17 ist ein Pyridinonresistenter Stamm; HIV-1 Ba-L wurde in Kulturen menschlicher peripherer Blutmakrophagen (PBM) durch Reverse-Transkriptase-Aktivität im Überstand getestet; alle anderen Assays setzten XTT-Tetrazolium ein (Gulakowski et al., 1991, vorstehend). Weitere Details der Virusstämme, Zelllinien, klinischen Isolate und Assayverfahren sind veröffentlicht (Buckheit et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10, 1497–1506, 1994; Buckheit et al., Antiviral Res. 25, 43–56, 1994 und darin enthaltene Referenzen). In Tabelle 1, N. D. = nicht bestimmt. TABELLE 1. Vergleichsbereiche der antiviralen Aktivität von CV-N und sCD4

		EC₅₀(nM)^a
Virus HIV-1 Laborstämme	Zielzellen	Cyanovirin-N s	CD4
RF	CEM-SS	0,5	0,8
RF	U937	0,5	0,1
IIIB	CEM-SS	0,4	1,6
IIIB	MT-2	0,4	13
MN	MT-2	2,3	N.D.
G910-6	MT-2	5,8	N.D.
A17	MT-2	0,8	13
Promonocytrope HIV-1-Isolate
214	CEM-SS	0,4	N.D.
SKI	CEM-SS	4,8	N.D.
Lymphotrope HIV-1-Isolate
205	CEM-SS	0,8	N.D.
G1	CEM-SS	0,9	N.D.
Klinische HIV-1-Isolate
WEJO	PBL	6,7	> 100
VIHU	PBL	5,5	> 100
BAKI	PBL	1,5	> 100

WOME	PBL	4,3	> 100
HIV-2
ROD	CEM-SS	7,6	> 200
MS	CEM-SS	2,3	N.D.
SIV
Delta_B670	174xCEM	11	3,0

Beispiel 9
Dieses Beispiel veranschaulicht ferner die Konstruktion einer Konjugat-kodieren den DNA-Sequenz und deren Expression, um ein Cyanovirin-Toxin-Proteinkonjugat bereitzustellen, dass selektiv auf HIV-infizierte Zellen zielt und diese tötet. Genauer gesagt veranschaulicht dieses Beispiel die Konstruktion und Expression einer Konjugatkodierenden DNA-Sequenz für ein Cyanovirin/Pseudomonas-Exotoxin, dass selektiv Wirtszellen tötet, die virales gp120 exprimieren.
Eine DNA-Sequenz (SEQ ID NR: 3), die für ein FLAG-Cyanovirin-N kodiert, und eine DNA-Sequenz die für das PE38-Fragment des Pseudomonas Exotoxins (Kreitman et al., Blood 83, 426–434, 1994) kodiert, wurden in dem Expressionsvektor pFLAG-1 kombiniert. Die für PE38 kodierende Sequenz wurde unter Verwendung von Standardverfahren für rekombinante DNA aus einem Plasmid ausgeschnitten, angepasst und an die C-terminale Position der für FLAG-Cyanovirin-N kodierenden Sequenz ligiert. Dieses Konstrukt wird in 9 schematisch veranschaulicht. Die Transformation von E. coli mit diesem Konstrukt, Auswahl von Klonen und Induktion der Genexpression mit IPTG führte zur Herstellung eines Proteinkonjugats mit dem erwarteten Molekulargewicht und der erwarteten Immunreaktivität bei einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines anti-FLAG-Antikörpers. Das chimäre Molekül wurde durch FLAG-Affinitätschromatographie gereinigt (z. B. wie in Beispiel 4) und auf Toxizität auf menschliche lymphoblastoide Zellen, die mit HIV infiziert waren (H9/TBB Zellen), sowie ihre nicht infizierten Gegenstücke (H9 und CEM-SS Zellen) hin ausgewertet. Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und verschiedenen Konzentrationen des (PPE benannten) Proteinkonjugats ausgesetzt. Nach drei Tagen wurde die Lebensfähigkeit unter Verwendung des XTT-Assays (Gulakowski et al., 1991, vorstehend) abgeschätzt.
10 veranschaulicht die Ergebnisse dieses Testens. Wie erwartet waren die infizierten H9/IIIB Zellen, die das Zelloberflächen-gp120 exprimierten, dramatisch empfindlicher gegenüber den toxischen Wirkungen von PPE als es die nicht infizierten H9 oder CEM-SS Zellen waren. Die IC₅₀-Werte, die aus den Konzentrations-Wirkungs-Kurven bestimmt wurden, betrugen 0,014 nM für H9/IIIB im Vergleich zu 0,48 und 0,42 nM für H9 beziehungsweise CEM-SS.
Beispiel 10
Dieses Beispiel veranschaulicht die Transformation einer Säugetierzelle, um ein Cyanovirin darin zu exprimieren.
Ein zur Demonstration der Expression eines Cyanovirins in Säugetierzellen geeignetes genetisches Konstrukt wurde durch Ligieren einer für FLAG-Cyanovirin-N kodierenden DNA-Sequenz in den Expressionsvektor pFLAG CMV-1 (IBI-Kodak, Rochester, NY) hergestellt. Die für FLAG-Cyanovirin-N kodierende Sequenz (SEQ ID NR: 3) wurde aus einem zuvor konstruierten Plasmid ausgeschnitten und unter Verwendung von Standardverfahren für rekombinante DNA an den Vektor pFLAG CMV-1 ligiert. Zellen der Grünen Meerkatze (COS-7 Zellen, erhalten von der American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden transformiert, indem sie dem Konstrukt in DEAE-Dextranlösung ausgesetzt wurden. Um die Expression von FLAG-Cyanovirin-N abzuschätzen, wurden Zellen nach 72 Stunden lysiert und einer PAGE- und Western-Blot-Analyse unterworfen. In transformierten COS-7 Zellen wurde anti-FLAG immunreaktives Material leicht nachgewiesen, jedoch bei einem scheinbaren Molekulargewicht, das wesentlich höher war als das von nativem rekombinantem FLAG-Cyanovirin-N, das in E. coli produziert wurde. Diagnostische Analysen von Verdaus, die auf die gleiche Weise wie im nachfolgenden Beispiel 11 durchgeführt wurden, zeigten an, dass dieses erhöhte Molekulargewicht auf eine posttranslationale Modifikation (N-gebundene Oligosaccharide) des FLAG-Cyanovirin-N zurückzuführen war.
Beispiel 11
Dieses Beispiel veranschaulicht die Transformation und Expression eines Cyanovirins in einer Zelle, bei der es sich nicht um eine Säugetierzelle handelt, genauer gesagt eine Hefezelle.
Ein zur Demonstration der Expression eines Cyanovirins in Pichia pastoris geeignetes Konstrukt wurde durch Ligieren einer für Cyanovirin-N kodierenden DNA-Sequenz in den Expressionsvektor pPIC9 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) hergestellt. Die für Cyanovirin-N kodierende Sequenz (SEQ ID NR: 1) wurde aus einem zuvor konstru ierten Plasmid ausgeschnitten und unter Verwendung rekombinanter DNA-Standardverfahren an den Vektor ligiert. Hefezellen wurden durch Elektroporation transformiert und Klone wurden zur Charakterisierung ausgewählt. Es wurde festgestellt, dass einige Klone Material exprimierten und in das Kulturmedium sezernierten, das mit polyklonalen anti-Cyanovirin-N-Antikörpern reagierte (siehe z. B. Beispiel 12).
Ähnlich wie bei Beobachtungen mit den in Beispiel 10 beschriebenen Säugetierformen legte das erhöhte scheinbare Molekulargewicht des von Hefe abgeleiteten Produkts auf PAGE und Western-Blot-Analyse nahe, dass eine posttranslationale Modifikation des Cyanovirin-N in diesem Expressionssystem stattfand.
Um diese Modifikation weiter zu definieren, wurden die sezernierten Produkte von zwei Klonen mit Peptid-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)-asparaginamidase verdaut. Dieses Enzym, das von New England Biolabs (Beverly, MA) erhalten wurde, spaltet spezifisch Oligosaccharid-Einheiten, die an Asparaginresten befestigt sind. Diese Behandlung reduzierte das anscheinende Molekulargewicht des Produkts auf das, welches dem nativen rekombinanten, in E. coli exprimierten Cyanovirin-N äquivalent war. Eine Inspektion der Aminosäuresequenz von Cyanovirin deckte ein einziges Erkennungsmotiv für eine N-gebundene Modifikation auf (Bindung an das an der Position 30 lokalisierte Asparagin).
Um dies als Glycosylierungsstelle weiter zu etablieren, wurde eine Mutation an dieser Position eingeführt, um den Asparaginrest zu Glutamin zu ändern (N30Q). Eine Expression dieser mutanten Form führte zur Produktion von immunreaktivem Material mit einem Molekulargewicht, das mit dem des nativen rekombinanten FLAG-Cyanovirin-N übereinstimmte.
Beispiel 12
Dieses Beispiel veranschaulicht ferner einen Antikörper, der spezifisch an ein Cyanovirin bindet.
Drei 2 Monate alte New Zealand White Kaninchen (1,8–2,2 kg) wurden einem Immunisierungsprotokoll folgendermaßen unterworfen: Insgesamt 100 μg Cyanovirin-N wurde in 100 μl einer 1:1 Suspension von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und unvollständigem Freund'schem Adjuvans aufgelöst und durch intramuskuläre Injektion an 2 Stellen auf jedem Hinterbein verabreicht; 8–16 Monate nach der anfänglichen Injektion wurde eine letzte Auffrischung von 50 μg Cyanovirin-N pro Kaninchen in 1000 μl einer 1:1 Suspension von PBS und unvollständigem Freund'schen Adjuvans gelöst und durch intraperitoneale Injektion verabreicht; an den Tagen 42, 70, 98 und 122 wur den 10 ml Blut aus einer Ohrvene von jedem Kaninchen entnommen; 14 Tage nach der letzten intraperitonealen Auffrischung wurden die Kaninchen getötet und ausgeblutet. Die IgG-Fraktion der so erhaltenen Immunseren von den vorstehend erwähnten Kaninchen wurde durch Affinitätschromatographie mit Protein-A-Sepharose gemäß dem Verfahren von Goudswaard et al. (Scand. J. Immunol. 8, 21–28, 1978) isoliert. Die Reaktivität dieser polyklonalen Antikörperherstellung für Cyanovirin-N wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung einer 1:1000 bis 1:5000 Vedünnung der IgG-Fraktionen der Kaninchen demonstriert.
Der gemäß dem zuvor erwähnten Verfahren hergestellte Antikörper band spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein. Eine SDS-PAGE eines Ganzzelllysates von dem E. coli-Stamm DH5α, der verändert wurde, um Cyanovirin-N zu produzieren, wurde unter Verwendung von 18%igen, auflösenden Polyacrlyamidgelen und diskontinuierlichen Standard-Puffersystemen gemäß Laemmli (Nature 227, 680–685, 1970) ausgeführt. Die Proteine wurden durch Färben mit Coomassie-Brillant-Blau sichtbar gemacht. Für Western-Blot-Analysen wurden die Proteine aus dem SDS-PAGE-Gel auf eine Nitrocellulosemembran elektroeluiert. Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Waschen in einer 1%igen Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Die Membran wurde dann in einer Lösung der IgG-Fraktion von dem zuvor erwähnten anti-Cyanovirin-N Kaninchenimmunserum inkubiert, das mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1:3000 verdünnt wurde. Anschließend wurde die Membran in einer sekundären Antikörperlösung inkubiert, die 1:10000 verdünntes Ziegen-anti-Kaninchen-Peroxidasekonjugat (Sigma) enthielt. Der gebundene sekundäre Antikörperkomplex wurde durch Inkubieren der Membran in einem chemilumineszenten Substrat und dann Belichten eines Röntgenfilmes sichtbar gemacht.
Einem Fachmann wird zusätzlich ersichtlich sein, dass auf ähnliche Weise durch gut etablierte Routineverfahren (siehe z. B. Harlow und Lane, 1988, vorstehend) monoklonale Antikörper unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins als Antigen hergestellt werden können, und dass auf ähnliche Weise gezeigt werden kann, dass es sich bei einem derartigen so erhaltenen monoklonalen Antikörper um einen spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein bindenden Antikörper handelt.
Beispiel 13
Dieses Beispiel demonstriert die anti-Influenzavirus-Aktivität von Cyanovirinen, einschließlich glykosylierungsbeständiger Cyanovirine.
Wirtszellen und Influenzavirus-Stammlösungen, die für diese Assays verwendet wurden, sind routinemäßig am Southern Research Institute-Frederick (SoRI-Frederick, Frederick, Maryland) erhältlich. MDCK-Zellen wurden für alle Assays verwendet. Diejenigen Influenzavirusstämme und -isolate, die bei den Assays verwendet wurden, schließen die folgenden ein: A/Sydney/5/97(H3N2), A/Victoria/3/75(H3N2); A/Beijing/262/95 (H1N1); A/Mem/2/99(H3N2); A/Mem/8/99(H1N1); B/HK/5/72; B/Yamanashi/166/98 und B/Mem/3/99.
Ein typischer antiviraler Assay für jeden Virus war folgendermaßen. Eine vorbehandelte Virenteilmenge wurde aus dem Gefrierschrank (–80°C) entnommen und man ließ sie auftauen. Die Viren wurden in Gewebekulturmedium verdünnt, so dass die zu jeder Vertiefung in einem Volumen von 100 μl zugegebene Virenmenge die Menge war, von der vorbestimmt war, dass sie eine vollständige Zelltötung nach 3–7 Tagen (je nach Virus) nach der Infektion ergab. Cyanovirin-N (SEQ ID NR: 2) Stammlösung wurde auf die gewünschte hohe Konzentration in das Medium verdünnt und dann weiter in 0,5 log₁₀-Schritten in Medium verdünnt.
Am Tag nach dem Ausplattieren der Zellen wurden die Platten aus dem Inkubator entnommen, und das Medium wurde entfernt und weggeworfen. Bei dem Infektionsmedium handelte es sich um DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium) ergänzt mit 0,3% BSA, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,1 mM nicht essentielle Aminosäuren, 0,1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin und 2,0 μg/ml TPCK-behandeltes (N-Tosyl-L-phenylalaninketon-)Trypsin. Arzneistoffverdünnungen (6–12 Verdünnungen) wurden in Medium hergestellt und zu entsprechenden Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 100 μl pro Vertiefung gegeben. Jede Verdünnung wurde in dreifacher Ausfertigung angesetzt. Infektionsmedium, das entsprechend verdünnte Viren enthielt, wurde zu entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Jede Platte enthielt Zellkontrollvertiefungen (nur Zellen), Virenkontrollvertiefungen (Zellen plus Viren), Arzneistofftoxizitätskontrollvertiefungen (nur Zellen plus Arzneistoff), Arzneistoffkolorimetriekontrollvertiefungen (nur Arzneistoff) sowie experimentelle Vertiefungen (Arzneistoff plus Zellen plus Viren).

Nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂ wurden die Testplatten durch Färben mit dem Celltiter 96 Reagenz analysiert. Zwanzig Mikroliter des Reagenz wurden zu jeder Vertiefung der Platte gegeben und die Platte wurde 4 h lang bei 37°C erneut inkubiert. Das Celltiter 96 Reagenz enthält eine neue Tetrazoliumverbindung (MTS) und das elektronenkoppelnde Reagenz Phenazinethosulfat (PES). MTS-Tetrazolium wird durch Zellen zu einem farbigen Formazan-Produkt bioreduziert, das in Gewebekulturmedium löslich ist. Diese Umwandlung wird durch NADPH und NADH vermittelt, die durch Dehydrogenaseenzyme in metabolisch aktiven Zellen produziert werden. Die Menge an löslichem Formazan, die durch eine zelluläre Reduktion des MTS produziert wird, wurde durch die Absorption bei 490 nm gemessen. Die Menge an Formazanprodukt, die durch die Menge der Absorption bei 490 nm gemessen wurde, war der Anzahl lebender Zellen in der Kultur direkt proportional, wodurch die schnelle quantitative Analyse der Inhibierung von vireninduziertem Zelltöten durch die Teststoffe ermöglicht wurde. Die IC₅₀ (50%ige Inhibierung der Virusreplikation), TC₅₀ (50%ige Reduktion der Lebensfähigkeit von Zellen) und der entsprechende therapeutische Index (TI: TC₅₀/IC₅₀) wurden routinemäßig berechnet. Ergebnisse aus einer typischen Testreihe von Cyanovirin-N (SEQ ID NR: 2) gegen vielfältige Stämme und Isolate der Influenzaviren A und B werden nachstehend gezeigt. Wie veranschaulicht wird, hat Cyanovirin-N eine starke anti-Influenzaviren-Breitspektrumaktivität. Zum Beispiel inhibierte Cyanovirin-N multiple Virensubtypen stark, einschließlich von Repräsentanten der vorrangigen menschlichen Subtypen H1N1 und H3N2 und von kürzlichen klinischen Isolaten und Laborstämmen von Influenza A und B. Anti-Influenzavirus-Aktivität von Cyanovirin-N

Virus	Stamm	IC₅₀ (μg/ml)	TC₅₀ (μg/ml)	TI
Influenza A (Laborstämme)	A/Sydney/5/97(H3N2) A/Victoria/3/75(H3N2) A/Beijing/262/95(H1N1)	0,04 0,005 0,01	> 10 > 1 6,6	> 228 > 187 548

Influenza A (klinische Stämme)	A/Mem/2/99(H3N2) A/Mem/8/99(H1N1)	0,15 0,03	> 10 > 10	> 68 > 399

Influenza B (Laborstämme)	B/HK/5/72 B/Yamanashi/166/98	0,70 0,0037	> 10 > 1	> 14 > 270

Influenza B (klinischer Stamm)	B/Mem/3/99	0,02	> 10	> 473

Das anti-Influenzavirus-Testen wurde auch an veranschaulichenden glykosylie rungsbeständigen, funktionellen Cyanovirinen einschließlich von Cyanovirinen, die zur SEQ ID NR: 2 homolog sind, durchgeführt, bei denen die Aminosäure an der Position 30 anstelle von Asparagin Alanin, Glutamin oder Valin ist (diese Cyanovirine werden nachstehend als N30A, N30Q beziehungsweise N30V identifiziert). Das anti-Influenzavirus-Testen wurde auf ähnliche Weise an zusätzlichen veranschaulichenden glykosylierungsbeständigen, funktionellen Cyanovirinen durchgeführt, die zur SEQ ID NR: 2 homolog sind, bei denen die Aminosäure an der Position 30 anstelle von Asparagin Alanin, Glutamin oder Valin ist, und, in jedem Fall, die Aminosäure an der Position 51 anstelle von Prolin Glycin ist (diese Cyanovirine werden nachstehend als N30A/P51G, N30Q/P51G beziehungsweise N30V/P51G identifiziert). Die Konstruktion und Expression der zuvor erwähnten sechs veranschaulichenden glykosylierungsbeständigen, funktionellen Cyanovirine wird in Beispiel 14 beschrieben. Die Testergebnisse waren folgendermaßen: Anti-Influenzavirus-Aktivität funktioneller, glykosylierungsbeständiger Cyanovirine

Cyanovirin	Virus/Stamm	IC₅₀ (μg/ml)	TC₅₀ (μg/ml)	TI
N30A	Influenza A/Sydney	0,003	> 0,1	> 36
	Influenza B/Yamanashi	0,005	> 0,1	> 20
N30Q	Influenza A/Sydney	0,002	> 0,1	> 42
	Influenza B/Yamanashi	0,002	> 0,1	> 57
N30V	Influenza A/Sydney	0,001	> 0,1	> 112
	Influenza B/Yamanashi	0,001	> 0,1	> 169
N30A/P51G	Influenza A/Sydney	0,006	> 0,1	> 17
	Influenza B/Yamanashi	0,03	> 0,1	> 3
N30Q/P51G	Influenza A/Sydney	0,004	> 0,1	> 27
	Influenza B/Yamanashi	0,02	> 0,1	> 6
N30V/P51G	Influenza A/Sydney	0,005	> 0,1	> 20
	Influenza B/Yamanashi	0,02	> 0,1	> 6

Beispiel 14
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Vektoren, die glykosylierungsbeständige Cyanovirine zur Expression in isolierten eukaryotischen Zellen oder eukaryotischen Organismen umfassen.
Fachleuten wohlbekannte Routineverfahren wurden verwendet, um Vektoren zu konstruieren und zu exprimieren, die Nukleinsäuren enthalten, die für veranschaulichende mutante Cyanovirin-Proteine kodieren, denen eine mögliche N-Glykosylierungsstelle fehlt [Asparagin-X-Serin (oder Threonin), wobei es sich bei X um eine Aminosäure außer Prolin oder Asparaginsäure handelt; genau genommen Asparagin30–Threonin31–Serin32]. Ausgehend von dem zuvor beschriebenen (Mori et al., Prot. Exp. Purif. 12, 223–228, 1998) Plasmid pET(CV-N), das für die native Form von Cyanovirin (SEQ ID NR: 2) kodiert, wurden QuikChange^TM ortsspezifische Mutagenesekits von Stratagene (La Jolla, CA) mit den geeigneten spezifischen Oligo-DNA-Primersets gemäß den Anleitungen des Herstellers benutzt, um Asn an der Position 30 durch Ala, Gln oder Val zu ersetzen. Die DNA-Sequenzen der so erhaltenen Vektoren, pET(Asn30Ala), pET(Asn30Gln) und pET(Asn30Val), wurden bestätigt und die Konstrukte wurden verwendet, um E. coli BL21(DE3)(Novagen, Madison, WI) zu transformieren. Die rekombinanten mutanten Proteine wurden routinemäßig mit 1,0 mM IPTG induziert, aus den periplasmatischen Fraktionen unter Verwendung einer Reihe von Standardtechniken der Reversen-Phase-Chromatographie wie zuvor beschrieben (Boyd et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1521–1530, 1997; Mori et al., 1998, vorstehend) gereinigt. Eine routinemäßige Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie der gereinigten Proteine bestätigte die molekularen Ionen, die mit den berechneten Werten für die abgeleiteten Aminosäuresequenzen übereinstimmten, und eine Reinheit von mindestens 95%. Ergebnisse von Standard-Aminosäureanalysen jedes rekombinanten Proteins stimmten mit den Sequenzen überein und stellten Proteinkonzentrationen bereit. Eine SDS-PAGE-Analyse und ein Immunblotting wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung herkömmlicher Routineverfahren durchgeführt.
Obwohl viele unterschiedliche Änderungen oder Kombinationen von Änderungen von Aminosäuren durchgeführt werden können, um eine mögliche N-Glykosylierungsstelle bei einem bestimmten Protein zu eliminieren (z. B. die Asn30–Thr31–Ser32 in SEQ ID NR: 2), werden konservative Austausche bevorzugt, die weniger wahrscheinlich die Tertiärstruktur des funktionellen Proteins stören. Ausgewählte Mutationen zur Auswertung können zufällig sein oder auf einer Berücksichtigung der nativen Proteinstruktur beruhen. Letztendlich ist die entscheidende Bestimmung den Wirkung einer Mutation an der möglichen Glykosylierungsstelle jedoch, ob das mutante Protein a) in der Tat glykosylierungsbeständig ist und b) in der Tat "funktionell" ist, d. h. die gewünschte biologische Aktivität, d. h. die antivirale Aktivität, in der Tat beibehält oder nicht.
Dementsprechend wurden für die vorliegende Demonstration zuerst kodierende Sequenzen und Vektoren für drei repräsentative Mutanten konstruiert und exprimiert, wobei das Asparagin an der Position 30 der SEQ ID NR: 2 durch Alanin, Glutamin oder Valin ersetzt wurde. Diese drei mutanten Proteine (in Beispiel 13 als N30A, N30Q beziehungsweise N30V identifiziert), die durch die zuvor erwähnten Verfahren und Referenzen exprimiert und gereinigt worden waren, zeigten hohe Reinheit und die erwarteten Molekülmassen, und waren alle richtig immunreaktiv mit anti-Cyanovirin-Antikörpern. Das Testen der drei mutanten Proteine gegen ausgewählte, repräsentative Influenzaviren A und B unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren bestätigte, dass diese Mutanten eine anti-Influenzavirus-Aktivität hatten, die von nativem Cyanovirin-N (SEQ ID NR: 2) ununterscheidbar war (siehe Beispiel 13).
Als zusätzliche Bestätigung wurden kodierende DNA-Sequenzen und entsprechende Vektoren für drei zusätzliche Mutanten, welche die Sequenzen der zuvor erwähnten drei glykosylierungsbeständigen Mutanten umfassten und in jedem Fall eine weitere Mutation umfassten, bei der das Prolin an der Position 51 stattdessen Glycin war (in Beispiel 13 als N30A/P51G beziehungsweise N30Q/P51G identifiziert), konstruiert und wie vorstehend routinemäßig exprimiert. Das Testen dieser Mutanten, bei denen es sich um Homologe der SEQ ID NR: 2 handelt, bei denen die Aminosäure an der Position 30 Alanin, Glutamin oder Valin ist und die Aminosäure an der Position 51 Glycin ist, gegen repräsentative Influenzaviren, wie hierin beschrieben, deckte eine starke anti-Influenzavirus-Aktivität auf, die der des nativen Cyanovirin-N (SEQ ID NR: 2) vergleichbar war (siehe Beispiel 13).
Als letzte Demonstration kann die Glykosylierungsbeständigkeit jeder der zuvor erwähnten Mutanten, die ein Homolog der SEQ ID NR: 2 umfassen, bei dem die Aminosäure an der Position 30 Alanin, Glutamin oder Valin war und gegebenenfalls die Aminosäure an der Position 51 Glycin war, unter Verwendung von Routineverfahren auf ähnliche Weise in Hefe exprimiert und gegen ausgewählte Influenzaviren, wie hierin beschrieben, getestet werden. Es kann gezeigt werden, dass diese in Hefe exprimierten Mutanten gegen Influenzaviren vergleichbar stark wie das in Bakterien exprimierte Kontroll-Cyanovirin-N sind. SEQUENZPROTOKOLL
IN DER BESCHREIBUNG ZITIERTE REFERENZEN

Diese Liste der durch den Anmelder zitierten Referenzen ist nur zum Nutzen des Lesers da. Sie bildet keinen Teil des Europäischen Patentdokumentes. Obwohl beim Zusammenstellen der Referenzen große Sorgfalt aufgewendet wurde, können Irrtümer und Auslassungen nicht ausgeschlossen werden und in dieser Hinsicht lehnt die EPO jede Haftung ab. In der Beschreibung zitierte Patentdokumente

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Claims

Ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein oder Peptid kodiert, umfassend (a) eine Mutante der SEQ ID NR: 2, wobei die Mutation aus einer Deletion oder Substitution der Aminosäure 30 der SEQ ID NR: 2 besteht, um die Aminosäuren 30–32 glykosylierungsbeständig zu machen, (b) eine Mutante der SEQ ID NR: 2, wobei die Mutation aus einer Deletion oder einer Substitution der Aminosäure 30 der SEQ ID NR: 2 besteht, um die Aminosäuren 30–32 glykosylierungsbeständig zu machen, und Deletion oder Substitution der Aminosäure 51 der SEQ ID NR: 2, oder (c) ein Fragment der Mutante umfassend mindestens 9 zusammenhängende Aminosäuren, wobei die mindestens 9 zusammenhängenden Aminosäuren die glykosylierungsbeständigen Aminosäuren umfassen und das Fragment antivirale Aktivität aufweist.
Das isolierte und gereinigte Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei Aminosäure 51 der SEQ ID NR: 2 deletiert oder substituiert wurde.
Das isolierte und gereinigte Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Aminosäure 30 der SEQ ID NR: 2 substituiert wurde durch eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Glutamin und Valin.
Das isolierte und gereinigte Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–3, wobei Aminosäure 51 der SEQ ID NR: 2 durch Glycin ersetzt wurde.
Ein Vektor, umfassend das isolierte und gereinigte Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–4.
Eine Wirtszelle oder ein nicht menschlicher Organismus, umfassend den Vektor nach Anspruch 5.
Ein Verfahren zur Herstellung eines antiviralen Proteins oder antiviralen Peptids, wobei das Verfahren die Expression des Vektors nach Anspruch 5 in einer Wirtszelle oder einem Organismus umfasst.
Ein antivirales Protein oder antivirales Peptid, umfassend (a) eine Mutante der SEQ ID NR: 2, wobei die Mutation aus einer Deletion oder Substitution der Aminosäure 30 der SEQ ID NR: 2 besteht, um die Aminosäuren 30–32 glykosylierungsbeständig zu machen, (b) eine Mutante der SEQ ID NR: 2, wobei die Mutation aus einer Deletion oder einer Substitution der Aminosäure 30 der SEQ ID NR: 2 besteht, um die Aminosäuren 30–32 glykosylierungsbeständig zu machen, und Deletion oder Substitution der Aminosäure 51 der SEQ ID NR: 2, oder (c) ein Fragment der Mutante umfassend mindestens 9 zusammenhängende Aminosäuren, wobei die mindestens 9 zusammenhängenden Aminosäuren die glykosylierungsbeständigen Aminosäuren umfassen und das Fragment antivirale Aktivität aufweist.
Das antivirale Protein oder antivirale Peptid nach Anspruch 8, wobei Aminosäure 51 der SEQ ID NR: 2 deletiert oder substituiert wurde.
Das antivirale Protein oder antivirale Peptid nach Anspruch 8 oder 9, bei dem Aminosäure 30 der SEQ ID NR: 2 substituiert wurde durch eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Glutamin und Valin.
Das antivirale Protein oder antivirale Peptid nach einem der Ansprüche 8–10, wobei die Aminosäure 51 der SEQ ID NR: 2 durch Glycin ersetzt wurde.
Ein Konjugat, umfassend das antivirale Protein oder antivirale Peptid nach einem der Ansprüche 8–11 und mindestens eine Wirkkomponente (effector component) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Albumin, Dextran, einem Toxin und einem immunologischen Reagenz.
Eine Zusammensetzung, umfassend eine antiviral wirksame Menge des antiviralen Proteins oder antiviralen Peptids nach einem der Ansprüche 8–11.
Eine Zusammensetzung, umfassend eine antiviral wirksame Menge des Konjugats nach Anspruch 12.
Verwendung des antiviralen Proteins oder antiviralen Peptids nach einem der Ansprüche 8–11 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion in einem Wirt.
Verwendung des Konjugats nach Anspruch 12 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion in einem Wirt.
Die Verwendung des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion in einem Wirt.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 15–17, wobei die virale Infektion eine Influenza virale Infektion ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 15–18, wobei das Medikament zur topischen Verabreichung im Wirt geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Medikament geeignet ist zur topischen Verabreichung im Atmungssystem ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Medikament zur Verabreichung als ein Aerosol oder Mikropartikel-Pulver geeignet ist.
Verwendung von Wirtszellen, die mit einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–4 transformiert wurden zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Inhibierung einer viralen Infektion in einem Tier.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Wirtszellen autologe oder homologe Säugetierzellen sind.