DE69632256T2

DE69632256T2 - Antivirale proteine, dafür kodierende dna, und deren verwendung

Info

Publication number: DE69632256T2
Application number: DE69632256T
Authority: DE
Inventors: R. Michael BOYD; R. Kirk GUSTAFSON; H. Robert SHOEMAKER; B. James McMAHON
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-04-27
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: US6015876A; DE69632256D1; US6420336B1; ATE264914T1; US20030103997A1; US5998587A; US20020151476A1; AU5669196A; JPH11504804A; WO1996034107A2; US6743577B2; US6586392B2; US5843882A; JP4081484B2; EP0836647B1; CA2219105A1; US6245737B1; JP2006094860A; AU707781B2; JP3803115B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf antivirale Proteine (die allgemein als Cyanovirine bezeichnet werden) sowie auf Konjugate davon, Antikörper dazu, DNA-Sequenzen, die für diese kodieren, Zusammensetzungen, die diese umfassen, Wirtszellen, die zur Erzeugung derselben transformiert sind, Zusammensetzungen, die diese umfassen, und Verfahren zur Verwendung und zum Erhalt derselben, insbesondere bei klinischen Anwendungen, wie bei antiviraler Therapie und Prophylaxe.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist eine tödliche Erkrankung, deren Anzahl an bekannten Fällen in den letzten zwei Jahrzehnten dramatisch angestiegen ist. Das Virus, das AIDS hervorruft, ist 1983 zum ersten Mal identifiziert worden und ist unter mehreren Namen und Abkürzungen bekannt. Es handelt sich dabei um das dritte bekannte T-lymphotropische Virus (HTLV-III), das die Fähigkeit besitzt, sich innerhalb von Zellen des Immunsystems zu replizieren, wodurch eine schwerwiegende Zellzerstörung verursacht wird. Das AIDS-Virus ist ein Retrovirus, d. h. ein Virus, das während der Replikation die Reverse Transkriptase verwendet. Dieses besondere Retrovirus ist als Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV), AIDS-verwandtes Virus (ARV) und derzeit als menschliches Immunschwächevirus (HIV) bekannt. Zwei unterschiedliche Familien von HIV sind bisher beschrieben worden, nämlich HIV-1 und HIV-2. Die Abkürzung HIV wird hierin verwendet, um allgemein auf menschliche Immunschwächeviren zu verweisen.
HIV übt eine schwerwiegende zytopathische Wirkung auf die CD4⁺-Helfer/Induktor-T-Zellen aus, wodurch das Immunsystem stark beeinträchtigt wird. Eine HIV-Infektion führt auch zu einem neurologischen Verfall und letztendlich zum Tod der infizierten Personen. Millionen von Menschen weltweit sind mit dem HIV-Virus infiziert, und ohne wirksame Therapie sind die meisten von ihnen zum Tode verurteilt. Während der langen Latenz, d. h. dem Zeitraum von der Erstinfektion bis zum Auftreten von Symptomen oder dem Tod aufgrund von AIDS, verbreiten infizierte Personen die Infektion durch sexuelle Kontakte, den Austausch von verunreinigten Nadeln während i. v.-Drogenkonsum, Transfusionen von Blut oder Blutprodukten oder durch die Übertragung von HIV auf einen Fötus oder ein Neugeborenes durch die Mutter weiter. Es besteht daher nicht nur ein dringender Bedarf an wirksamen therapeutischen Wirkstoffen, um das Fortschreiten der HIV-Erkrankung bei bereits infizierten Personen zu hemmen, sondern auch an Methoden zur Prävention der Ausbreitung der HIV-Infektion von infizierten Personen auf nicht infizierte Personen. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat die Suche nach einem wirksamen prophylaktischen Anti-HIV-Viruzid, um die weitere Verbreitung der AIDS-Pandemie einschränken zu helfen, zu einer dringenden internationalen Priorität ernannt (Balter, Science 266, 1312–1313 (1994); Merson, Science 260, 1266–1268 (1993); Taylor, J. NIH Res. 6, 26–27 (1994); Rosenberg et al., Sex. Transm. Dis. 20, 41–44 (1993); Rosenberg, Am. J. Public Health 82, 1473–1478 (1992)).
Das Gebiet der viralen Therapie hat sich in Reaktion auf den Bedarf an Wirkstoffen entwickelt, die gegen Retroviren, insbesondere HIV, wirksam sind. Es gibt zahlreiche Wege, in denen ein Wirkstoff anti-retrovirale Aktivität zeigen kann (siehe z. B. DeClercq, Adv. Virus Res. 42, 1–55 (1993); DeClercq, J. Acquir. Immun. Def. Synd. 4, 207–218 (1991); Mitsuya et al., Science 249, 1533–1544 (1990)). Nucleosid-Derivate, wie AZT, die die virale reverse Transkriptase hemmen können, gehören zu den wenigen klinisch aktiven Wirkstoffen, die derzeit zur Anti-HIV-Therapie im Handel erhältlich sind. Obwohl sie bei manchen Patienten sehr nützlich sind, ist die Verwendbarkeit von AZT und verwandten Verbindungen durch ihre Toxizität und unzureichende therapeutische Beweise, dass sie als Therapie vollständig geeignet sind, begrenzt. Angesichts jüngster Enthüllungen in Bezug auf die Dynamik der HIV-Infektion (Coffin, Science 267, 483–489 (1995); Cohen, Science 267, 179 (1995); Perelson et al., Science 271, 1582–1586 (1996)) wird es nun immer offensichtlicher, dass Wirkstoffe, die so früh wie möglich im viralen Replikationskreislauf wirken, benötigt werden, um die Infektion von neu produzierten, nicht infizierten Immunzellen, die im Körper in Reaktion auf die Virus-induzierte Abtötung infizierter Zellen produziert werden, zu hemmen. Zudem ist es essentiell, von infizierten Zellen produzierte neue infektiöse Viren zu neutralisieren oder zu hemmen.
Die Infektion von CD4⁺-Zellen durch HIV-1 und verwandte Primaten-Immunschwächeviren beginnt mit der Wechselwirkung der jeweiligen viralen Hüllglykoproteine (im Allgemeinen als „gp120" bezeichnet) mit dem Zelloberflächen-Rezeptor CD4, gefolgt von Fusion und Eintritt (Sattentau, AIDS 2, 101–105 (1988); Koenig et al., PNAS USA 86, 2443–2447 (1989)). Produktiv infizierte, Viren-erzeugende Zellen exprimieren gp120 an der Zelloberfläche. Die Wechselwirkung von gp120 der infizierten Zellen mit CD4 auf nicht infizierten Zellen führt zur Bildung von dysfunktioneller multizellulärer Synzytia und einer weiteren Verbreitung der Virusinfektion (Freed et al., Bull. Inst. Pasteur 88, 73 (1990)). Die gp120/CD4-Wechselwirkung stellt somit ein besonders attraktives Ziel für die Unterbrechung der HIV-Infektion und der Zytopathogenese, entweder durch Verhinderung der anfänglichen Virus-Zell-Bindung oder durch Blockierung der Zell-Zell-Fusion (Capon et al., Ann. Rev. Immunol. 9, 649–678 (1991)), dar. Virus-freies oder „lösliches" gp120, das in vivo von Viren oder von infizierten Zellen abgestoßen wurde, stellt ebenfalls ein wichtiges therapeutisches Ziel dar, da es ansonsten zu nicht infektiösen immunpathogenen Vorgängen im Körper, einschließlich des Zentralnervensystems, beitragen kann (Capon et al. (1991), s. o.; Lipton, Nature 367, 113–114 (1994)). Ein Großteil der Impfstoffforschung hat sich auf gp120 konzentriert. Der Fortschritt wurde jedoch durch die Hypervariabilität der gp120-neutralisierenden Determinanten und der folglichen extremen Stammabhängigkeit der viralen Empfindlichkeit gegenüber Antikörpern gegen gp120 behindert (Berzofsky, J. Acq. Immun. Def. Synd. 4, 451–459 (1991)). Nur wenig Medikamententdeckungs- und -entwicklungsforschung hat sich speziell mit gp120 beschäftigt. Eine bemerkenswerte Ausnahme sind die beträchtlichen Anstrengungen, die trunkierten, rekombinanten „CD4"-Proteinen („lösliches CD4" oder „sCD4") gewidmet wurden, die gp120 binden und HIV-Infektiosität in vitro hemmen (Capon et al. (1991), s. o.; Schooley et al., Ann. Int. Med. 112, 247–253 (1990); Husson et al., J. Pediatr. 121, 627–633 (1992)). Klinische Isolate haben sich jedoch im Gegensatz zu HIV-Laborstämmen als hoch resistent gegen die Neutralisierung durch sCD4 erwiesen (Orloff et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 11, 335–342 (1995); Moore et al., J. Virol. 66, 235–243 (1992)). Anfängliche klinische Versuche mit sCD4 (Schooley et al. (1990), s. o.; Husson et al. (1992), s. o.) und sCD4-gekuppelten Immunglobulinen (Langner et al., Arch. Virol. 130, 157–170 (1993)) und ebenso mit sCD4-gekuppelten Toxinen, ausgebildet zum Binden und Zerstören von Virus exprimierenden Zellen (Davey et al., J. Infect. Dis. 170, 1180–1188 (1994); Ramachandran et al., J. Infect. Dis. 170, 1009–1013 (1994)), waren enttäuschend. Neuere Gentherapie-Ansätze, sCD4 direkt in vivo zu erzeugen (Morgan et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10, 1507–1515 (1994)) werden sich wahrscheinlich als ähnlich enttäuschend erweisen.
Für eine wirksame antivirale Therapie gegen AIDS werden daher neue antivirale Wirkstoffe benötigt, die alleine oder in Kombination mit AZT und/oder anderen erhältlichen antiviralen Wirkstoffen verwendet werden können. Neue Wirkstoffe, die zur Verhinderung einer HIV-Infektion eingesetzt werden können, sind ebenso für die Prophylaxe wichtig. In beiden Bereichen des Bedarfs würde der ideale neue Wirkstoff so früh wie möglich im viralen Lebenszyklus wirken, wäre so Virus-spezifisch wie möglich (d. h. er würde ein molekulares Ziel angreifen, das für den Virus spezifisch ist, jedoch nicht für das infizierte oder infizierbare Wirtstier), würde den intakten Virus nicht infektiös machen, den Tod oder die Dysfunktion von mit dem Virus infizierten Säugetierzellen verhindern, die weitere Produktion von Viren durch infizierte Zellen verhindern, die Ausbreitung der Virusinfektion auf nicht infizierte Säugetierzellen verhindern, wäre hoch wirksam und aktiv gegen den breitest möglichen Bereich von HIV-Stämmen und -Isolaten, resistent gegen Abbau unter physiologischen und harten Umweltbedingungen und könnte problemlos und kostengünstig in großem Umfang hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung möchte antivirale Proteine und Konjugate davon bereitstellen, die zumindest manche der vorhergehend erwähnten, besonders vorteilhaften Attribute besitzen, sowie Zusammensetzungen, die dieselben umfassen, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben. Diese sowie weitere Ziele der vorliegenden Erfindung und auch zusätzliche Erfindungsmerkmale gehen aus der hierin bereitgestellten Beschreibung hervor.
KURZZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt antivirale Wirkstoffe, insbesondere antivirale Proteine (im Allgemeinen als Cyanovirine bezeichnet) und Konjugate davon bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Erhalt eines Cyanovirins und eines Konjugats davon, von Nucleinsäuremolekülen, die für die Cyanovirine und Konjugate davon kodieren, von Wirtszellen, die die vorhergehend erwähnten Nucleinsäuremoleküle enthalten, ein Verfahren zur Verwendung eines Cyanovirins, um ein Effektormolekül auf ein Virus zu zielen, sowie ein Verfahren zum Erhalt eines im Wesentlichen reinen Cyanovirins oder eines Konjugats davon bereit. Das Cyanovirin, ein Konjugat davon und die Wirtszellen, die transformiert wurden, um ein Cyanovirin oder ein Konjugat davon zu produzieren, können in einer Zusammensetzung wie einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die zusätzlich einen oder mehrere antivirale Wirkstoffe umfassen kann. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung von Cyanovirinen, Konjugaten davon, zur Produktion eines Cyanovirins oder Konjugats davon transformierten Wirtszellen und Zusammensetzungen davon alleine oder in Kombination mit anderen antiviralen Wirkstoffen in der therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung eines tierischen Lebewesens, wie eines Menschen, der infiziert ist oder gefährdet ist, mit einem Virus infiziert zu werden, sowie in der Behandlung von unbelebten Objekten, wie medizinischen Geräte oder Laborausrüstungen und -materialien, und Suspensionen oder Lösungen, wie Blut oder Blutprodukte und Gewebe, bereit, um die virale Infektion eines tierischen Lebewesens, wie z. B. eines Menschen, zu verhindern. Die vorliegende Erfindung stellt weiters Verfahren zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eines tierischen Lebewesens wie eines Menschen, der infiziert ist oder gefährdet ist, mit einem Virus infiziert zu werden, bereit, umfassend die Verabreichung oder Applikation eines oder mehrerer Cyanovirine, Konjugate, zur Erzeugung eines Cyanovirins oder Konjugats davon transformierter Wirtszellen und/oder von Zusammensetzungen davon.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1A ist eine graphische Darstellung der OD (206 nm) gegenüber der Zeit (min), die ein HPLC-Chromatogramm von nicht reduziertem Cyanovirin-N darstellt.
1B ist ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegenüber HPLC-Fraktionen, das die maximale Verdünnung jeder HPLC-Fraktion veranschaulicht, die einen 50%igen Schutz vor den zytopathischen Auswirkungen der HIV-Infektion für nicht reduzierte Cyanovirin-N-HPLC-Fraktionen bereitstellten.
1C ist ein SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoretogramm von nicht reduzierten Cyanovirin-N-HPLC-Fraktionen.
1D ist eine graphische Darstellung der OD (206 nm) gegenüber der Zeit (min), die ein HPLC-Chromatogramm von reduziertem Cyanovirin-N darstellt.
1E ist ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegenüber der HPLC-Verdünnung, das die maximale Verdünnung jeder Fraktion veranschaulicht, die einen 50%igen Schutz vor den zytopathischen Auswirkungen der HIV-Infektion für reduzierte Cyanovirin-N-HPLC-Fraktionen bereitstellten.
1F ist ein SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoretogramm von reduzierten Cyanovirin-N-HPLC-Fraktionen.
2 zeigt ein Beispiel einer DNA-Sequenz, die für ein synthetisches Cyanovirin-Gen kodiert.
3 veranschaulicht einen ortsgerichteten Mutagenese-Vorgang, der eingesetzt wird, um Codons für ein FLAG-Octapeptid und einen Hind-III-Restriktionsort von der Sequenz aus 2 zu entfernen.
4 zeigt ein typisches HPLC-Chromatogramm der Reinigung von rekombinantem nativem Cyanovirin-N.
5A ist eine graphische Darstellung der % Kontrolle gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (nM), die die antivirale Aktivität von nativem Cyanovirin-N von Nostoc ellipsosporum veranschaulicht.
5B ist eine graphische Darstellung der % Kontrolle gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (nM), die die antivirale Aktivität von rekombinantem Cyanovirin-N veranschaulicht.
5C ist eine graphische Darstellung der % Kontrolle gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (nM), die die antivirale Aktivität von rekombinantem FLAG-Cyanovirin-N veranschaulicht.
6A ist eine graphische Darstellung der % Kontrolle gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (nM), die die relative Anzahl der mit HIV-1 infizierten lebensfähigen CEM-SS-Zellen in einem BCECF-Test darstellt.
6B ist eine graphische Darstellung der % Kontrolle gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (nM), die den relativen DNA-Gehalt der mit HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellkulturen darstellt.
6C ist eine graphische Darstellung der % Kontrolle gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (nM), die die relative Anzahl an mit HIV-1 infizierten lebensfähigen CEM-SS-Zellen in einem XTT-Test darstellt.
6D ist eine graphische Darstellung der % Kontrolle gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (nM), die die Wirkung einer Reihe von Cyanovirin-N-Konzentrationen bei Anzeichen eines infektiösen Virus oder viraler Replikation darstellt.
7 ist eine graphische Darstellung der % der nicht infizierten Kontrolle gegenüber der Zugabezeit (h), die die Ergebnisse von Studien zur verzögerten Zugabe von Cyanovirin-N zeigen, wobei die Anti-HIV-Aktivität in mit HIV-1_RF infizierten CEM-SS-Zellen dargestellt ist.
8A ist eine graphische Darstellung der OD (450 nm) gegenüber der Cyanovirin-N-Konzentration (μg/ml), die die Cyanovirin/gp120-Wechselwirkung veranschaulicht, wobei gp 120 als ein molekulares Hauptziel der Cyanovirine definiert ist.
8B ist ein Dot-Blot der Bindung von Cyanovirin-N an ein gp120-HRP-Konjugat, der zeigt, dass Cyanovirin-N in Abhängigkeit der Konzentration insbesondere an ein Meerrettichperoxidasekonjugat von gp120 (gp120-HRP) bindet.
9 veranschaulicht schematisch eine DNA-Kodierungssequenz, die eine für FLAG-Cyanovirin-N kodierende Sequenz umfasst, die an eine für Pseudomonas Exotoxin kodierende Sequenz gekuppelt ist.
10 ist eine graphische Darstellung der OD (450 nM) gegenüber der PPE-Konzentration (nM), die das selektive Abtöten virales gp120 exprimierender (H9/IIIB) Zellen durch ein FLAG-Cyanovirin-N/Pseudomonas-Exotoxin-Proteinkonjugat (PPE) veranschaulicht.
11 ist ein Western-Blot aus einem SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoretogramm lysierter COS-7-Zellen, die gentechnisch verändert und transformiert wurden, um ein FLAG-Cyanovirin-N zu exprimieren, wobei die Detektion durch einen Anti-FLAG-Antikörper erfolgte.
12 ist ein Western-Blot aus einem SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoretogramm sekretierter Produkte, die mit Peptid-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparaginamidase verdaut wurden, aus Pichia pastoris, gentechnisch verändert und transformiert, um ein Cyanovirin zu produzieren, wobei die Detektion durch einen polyklonalen Anti-Cyanovirin-N-Antikörper erfolgte.
13 ist ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoretogramm (A) und ein Western-Blot (B) eines Ganzzellen-Lysats von E. coli, die gentechnisch verändert wurden, um Cyanovirin-N zu produzieren, wobei die Detektion durch einen polyklonalen Anti-Cyanovirin-N-Antikörper erfolgte.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung basiert zumindest teilweise auf der Beobachtung, dass bestimmte Extrakte von kultivierten Cyanobakterien (Blaualgen) in einem Anti-HIV-Screen antivirale Aktivität zeigten. Der Anti-HIV-Screen wurde 1986 entwickelt (von M. R. Boyd vom National Institutes of Health) und seit 1988 vom U. S. National Cancer Institute (NCI) weiterentwickelt und durchgeführt (siehe Boyd, in: AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, DeVita et al., Hrsg., Philadelphia: Lippincott, 305–317 (1988)).
Cyanobakterien (Blaualgen) wurden im Speziellen für das Anti-HIV-Screening ausgewählt, da sie dafür bekannt waren, eine große Vielfalt an strukturell einzigartigen und biologisch aktiven stickstofffreien und von Aminosäuren abgeleiteten natürlichen Produkten zu erzeugen (Faulkner, Nat. Prod. Rep. 11, 355–394 (1994); Glombitza et al., in Algal and Cyanobacterial Biotechnology, Cresswell, R. C., et al., Hrsg., 211–218 (1989)). Diese photosynthetischen prokaryotischen Organismen sind wichtige Produzenten cyclischer und linearer Peptide (Molekulargewicht im Allgemeinen < 3 kDa), die häufig hepatotoxische oder antimikrobielle Eigenschaften aufweisen (Okino et al., Tetrahedron Lett. 34, 502–504 (1993); Krishnamurthy et al., PNAS USA 86, 770–774 (1989); Sivonen et al., Chem. Res. Toxicol. 5, 464–469 (1992); Carter et al., J. Org. Chem. 49, 236–241 (1984); Frankmolle et al., J. Antibiot. 45, 1451–1457 (1992)). Sequenzierungsstudien cyanobakterieller Proteine mit höherem Molekulargewicht haben sich im Allgemeinen auf die mit primären metabolischen Prozessen in Zusammenhang stehenden Proteine konzentriert oder auf jene, die als phylogenetische Marker dienen können (Suter et al., FEBS Lett. 217, 279–282 (1987); Rumbeli et al., FEBS Lett. 221, 1–2 (1987); Swanson et al., J. Biol. Chem. 267, 16146–16154 (1992); Michalowski et al., Nucleic Acids Res. 18, 2186 (1990); Sherman et al., in: The Cyanobacteria, Fay et al., Hrsg., Elsevier: New York, 1–33 (1987); Rogers, in: the Cyanobacteria, Fay et al., Hrsg., Elsevier: New York, 35–67 (1987)). Im Allgemeinen sind Proteine mit antiviralen Eigenschaften nicht mit cyanobakteriellen Quellen assoziiert worden.
Der cyanobakterielle Extrakt, der zur vorliegenden Erfindung führt, war unter vielen Tausenden unterschiedlichen Extrakten, die anfangs willkürlich ausgewählt und in dem oben beschriebenen Anti–HIV-Screen blindgetestet wurden. Eine Anzahl dieser Extrakte war vorher bestimmt worden, um Anti-HIV-Aktivität im NCI-Screen zu zeigen (Patterson et al., J. Phycol. 29, 125–130 (1993)). Aus dieser Gruppe wurde ein wässriger Extrakt aus Nostoc ellipsosporum zur genauen Untersuchung ausgewählt, der wie beschrieben (Patterson (1993), s. o.) hergestellt worden war und der im NCI-Primärscreen eine ungewöhnlich hohe Anti-HIV-Wirksamkeit und einen ungewöhnlich hohen „therapeutischen In-vitro-Index" zeigte. Eine spezielle, durch einen Biotest geführte Strategie wurde herangezogen, um ein homogenes, gegen. HIV hochwirksames Protein zu isolieren und zu reinigen.
Bei der vom Biotest geführten Strategie wurden die anfängliche Auswahl des Extrakts für die Fraktionierung sowie Entscheidungen in Bezug auf das anzuwendende allgemeine chemische Isolierungsverfahren und die Art der einzelnen Schritte darin durch Interpretation der biologischen Testdaten bestimmt. Der Anti-HIV-Screening-Test (siehe z. B. Boyd (1988), s. o.; Weislow et al., J. Natl. Cancer Inst. 81, 577–586 (1989)), der herangezogen wurde, um den Isolierungs- und Reinigungsprozess zu steuern, misst das Ausmaß des Schutzes menschlicher T-Lymphoblastoidzellen von den cytopathischen Auswirkungen von HIV. Fraktionen des Extrakts von Interesse werden mittels einer Vielzahl von chemischen Mittel hergestellt und im Primärscreen blindgetestet. Aktive Fraktionen werden weiter getrennt und die resultierenden Subfraktionen ebenso im Screen blindgetestet. Dieser Vorgang wird so oft wie nötig wiederholt, um die aktive(n) Verbindung(en), d. h. die die reine(n) Verbindungen) reprä sentierende(n) antivirale(n) Fraktion(en), zu erhalten, die dann einer detaillierten chemischen Analyse und strukturellen Aufklärung unterzogen werden können.
Unter Verwendung dieser Strategie wurde entdeckt, dass die wässrigen Extrakte von Nostoc ellipsosporum ein antivirales Protein enthalten. Es muss festgestellt werden, dass der Begriff „Protein", wie er hierin zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nicht auf eine Aminosäuresequenz mit einer bestimmten Länge beschränkt ist und Moleküle mit 100 oder mehr Aminosäuren sowie Moleküle mit weniger als 100 Aminosäuren umfasst (die manchmal als „Peptide" bezeichnet werden).
Die vorliegende Erfindung stellt dementsprechend ein isoliertes und gereinigtes antivirales Protein von Nostoc ellipsosporum, insbesondere ein isoliertes und gereinigtes antivirales als Cyanovirin-N bekanntes Protein, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch andere Cyanovirine bereit. Der Begriff „Cyanovirin" wird hierin verwendet, um im Allgemeinen ein natives antivirales von Nostoc ellipsosporum isoliertes Protein („natives Cyanovirin") und jegliche funktionell äquivalenten Proteine oder Derivate davon zu bezeichnen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung enthält ein solches funktionell äquivalentes Protein oder Derivat davon (a) eine Sequenz von zumindest 9 (vorzugsweise zumindest 20, noch bevorzugter zumindest 30 und insbesondere zumindest 50) Aminosäuren, die mit einer beliebigen Untersequenz aus 9 aneinandergrenzenden Aminosäuren, die innerhalb eines nativen Cyanovirins (insbesondere Cyanovirin-N) enthalten sind, direkt homolog sind (vorzugsweise dieselbe ist) und ist (b) antiviral, kann vorzugsweise spezifisch an ein Virus, noch bevorzugter an ein Primaten-Immunschwächevirus und insbesondere an HIV-1, HIV-2 oder SIV oder an eine infizierte Wirtszelle binden, die ein oder mehrere virale Antigene, genauer gesagt ein Hüllglycoprotein wie gp120, des jeweiligen Virus exprimiert. Zudem kann ein funktionell äquivalentes Protein oder Derivat davon die Aminosäuresequenz eines nativen Cyanovirins, insbesondere von Cyanovirin-N (siehe Seq.-ID Nr. 2) umfassen, bei der 1–20, vorzugsweise 1–10, noch bevorzugter 1, 2, 3, 4 oder 5 und insbesondere 1 oder 2, Amino säuren von einem oder von beiden Enden, vorzugsweise nur von einem Ende und insbesondere vom Aminoterminus, des nativen Cyanovirins entfernt worden sind.
Das vorliegende Cyanovirin der Erfindung umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen homolog zu der eines antiviralen Proteins von Nostoc ellipsosporum, insbesondere eines nativen Cyanovirins und im Speziellen Cyanovirin-N ist. Im Kontext der Cyanovirine der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen homolog", dass eine ausreichende Homologie vorliegt, um das Cyanovirin antiviral zu machen, vorzugsweise mit einer antiviralen Aktivität, die für ein von Nostoc ellipsosoporum isoliertes antivirales Protein charakteristisch ist. Vorzugsweise liegt eine Homologie von zumindest etwa 50%, bevorzugter von zumindest etwa 75% und insbesondere von zumindest etwa 90%, vor.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein isoliertes und gereinigtes Protein bereit, das durch ein Nucleinsäuremolekül mit einer für ein Cyanovirin kodierenden Sequenz kodiert ist, wie z. B. ein isoliertes und gereinigtes Protein, das durch ein Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1, ein Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz aus Seq.-ID Nr. 3, ein Nucleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 kodiert, oder ein Nucleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 4 kodiert, kodiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein Cyanovirin-Konjugat bereit, das ein Cyanovirin umfasst, das an ein oder mehrere ausgewählte Effektormoleküle gekuppelt ist, wie z. B. ein Toxin oder ein immunologisches Reagens. Der Begriff „immunologisches Reagens" wird hierin verwendet, um einen Antikörper, ein Immunglobulin und ein immunologisches Erkennungselement zu bezeichnen. Ein immunologisches Erkennungselement ist ein Element, wie ein Peptid, z. B. die FLAG-Sequenz des rekombinanten Cyanovirin-FLAG-Fusionsproteins, das durch die immunologische Erkennung die Isolierung und/oder Reinigung und/oder Analyse des Proteins, an das es gebunden ist, ermöglicht. Ein Cyanovirin-Fusionsprotein ist eine Art Cyanovirin-Konjugat, worin ein Cyanovirin an ein oder mehrere andere Proteine mit den jeweils erwünschten Eigenschaften oder Effektorfunktionen, wie cytotoxische oder immuno logische Eigenschaften oder andere erwünschte Eigenschaften, gekuppelt ist, um die Isolierung, Reinigung oder Analyse des Fusionsproteins zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zum Erhalten eines Cyanovirins aus Nostoc ellipsosporum bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst (a) das Identifizieren eines Extrakts von Nostoc ellipsosporum mit antiviraler Aktivität, (b) gegebenenfalls das Entfernen hochmolekularer Biopolymere aus dem Extrakt, (c) durch einen Biotest geführtes antivirales Fraktionieren des Extrakts, um einen teilweise gereinigten Extrakt des Cyanovirins zu erhalten, und (d) das weitere Reinigen des teilweise gereinigten Extrakts durch Umkehrphasen-HPLC, um ein Cyanovirin zu erhalten (Beispiel 1). Das Verfahren beinhaltet vorzugsweise die Verwendung von Ethanol, um hochmolekulare Biopolymere aus dem Extrakt zu entfernen, sowie die Verwendung eines Anti-HIV-Biotests, um die Fraktionierung des Extrakts zu steuern.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung isolierte und gereinigte Cyanovirin, wie z. B. Cyanovirin-N (CV-N), kann herkömmlichen Verfahren unterzogen werden, die üblicherweise zum Bestimmen der Aminosäuresequenz eines gegebenen reinen Proteins verwendet werden. Das Cyanovirin kann daher durch N-terminalen Edman-Abbau intakter Proteine und überlappender Peptidfragmente, die durch Endoproteinase-Verdau erzeugt worden sind, sequenziert werden. Die Aminosäure-Analyse erfolgt wünschenswerterweise in Übereinstimmung mit der abgeleiteten Sequenz. Ähnlich zeigt auch ESI-Massenspektometrie von reduziertem HPLC-gereinigtem Cyanovirin-N einen Wert des Molekülions, der mit dem berechneten Wert übereinstimmt.
Diese Studien deuteten darauf hin, dass Cyanovirin-N aus Nostoc ellipsosporum eine einzigartige Sequenz von 101 Aminosäuren mit nur geringer oder keiner signifikanten Homologie zu den vorhergehend beschriebenen Proteinen oder Transkriptionsprodukten bekannter Nucleotidsequenzen umfasst. Nicht mehr als 8 aneinandergrenzende Aminosäuren von Cyanovirin sind in beliebigen Aminosäuresequenzen bekannter Proteine zu finden, und zudem gibt es keine beliebigen bekannten Prote ine einer beliebigen Quelle, die mehr als 13% Sequenzhomologie mit Cyanovirin-N aufweisen. Anhand der chemisch abgeleiteten Aminosäuresequenz von Cyanovirin-N wurde ein entsprechendes rekombinantes Cyanovirin-N (r-Cyanovirin-N oder r-CV-N) erzeugt und verwendet, um definitiv festzustellen, dass die abgeleitete Aminosäuresequenz tatsächlich gegen Viren wie HIV (siehe Beispiele 2–5) aktiv ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül und ein synthetisches Nucleinsäuremolekül bereit, das eine für ein Cyanovirin (im Speziellen ein natives Cyanovirin, insbesondere Cyanovirin-N) kodierende Sequenz umfasst. Solch ein Nucleinsäuremolekül schließt ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1, ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz aus Seq.-ID Nr. 3, ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 kodiert, ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das für eine Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 4 kodiert, und ein Nucleinsäuremolekül, das im Wesentlichen homolog zu einer beliebigen oder mehreren der vorhergehend erwähnten Nucleinsäuremoleküle ist, ein. Im Zusammenhang mit dem Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen homolog", dass eine ausreichende Homologie besteht, um das durch das Nucleinsäuremolekül kodierte Protein antiviral zu machen, und zwar vorzugsweise mit einer antiviralen Aktivität, die für ein aus Nostoc ellipsosporum isoliertes antivirales Protein charakteristisch ist. Vorzugsweise ist eine Homologie von zumindest etwa 50%, noch bevorzugter zumindest etwa 75% und insbesondere zumindest etwa 90%, vorhanden.
Das vorliegende erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül umfasst wünschenswerterweise eine Nucleinsäuresequenz, die für zumindest 9 (vorzugsweise zumindest 20, noch bevorzugter zumindest 30 und insbesondere zumindest 50) aneinandergrenzende Aminosäuren der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 kodiert. Das vorliegende erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül umfasst wünschenswerterweise auch eine Nucleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz eines nativen Cyanovirins, insbesondere Cyanovirin-N, umfasst, von dem 1–20, vorzugsweise 1–10, noch bevorzugter 1, 2, 3, 4 oder 5 und insbesondere 1 oder 2, Aminosäuren von einem oder beiden Enden, vorzugsweise nur von einem Ende und insbesondere vom Aminoterminus, des nativen Cyanovirins entfernt worden sind.
Angesichts der vorliegenden Offenbarung ist es für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich, dass eine partielle Cyanovirin-N-Gencodonsequenz wahrscheinlich ausreichen wird, um für ein vollständig funktionelles, d. h. antivirales, wie z. B. Anti-HIV, Cyanovirin zu kodieren. Eine minimal notwendige DNA-Kodierungssequenz oder minimal notwendige DNA-Kodierungssequenzen für ein funktionelles Cyanovirin können durch Fachleute auf dem Gebiet problemlos bestimmt werden, und zwar z. B. durch Synthese und Evaluierung der Untersequenzen, die das native Cyanovirin umfassen, und durch ortsgerichtete Mutageneseuntersuchungen der Cyanovirin-N-DNA-Kodierungssequenz.
Unter Verwendung einer geeigneten DNA-Kodierungssequenz kann durch gentechnische Verfahren ein rekombinantes Cyanovirin erzeugt werden (siehe z. B. für allgemeine Hintergrundinformationen, Nicholl, in: An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge University Press: Cambridge, S. 1–5 & 127–130 (1994): Steinberg et al., in: Recombinant DNA Technology Concepts and Biomedical Applications, Prentice Hall: Englewood Cloffs, NJ, S. 81–124 & 150–162 (1993); Sofer, in: Introduction to Genetic Engineering, Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, 1–21 & 103–126 (1991); Old et al., in: Principles of Gene Manipulation, Blackwell Scientific Publishers: London, S. 1–13 & 108–221 (1992); Emtage, in: Delivery Systems for Peptide Drugs, Davis et al., Hrsg., Plenum Press: New York, S. 23–33 (1986)). Es kann z. B. ein Nostoc-ellipsosporum-Gen oder für ein Cyanovirin kodierende cDNA indentifiziert und subkloniert werden. Das Gen oder die cDNA können dann in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden und in einen geeigneten Proteinsynthetisierenden Organismus abgegeben werden (z. B. E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris oder andere Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen), wo das Gen unter der Steuerung eines endogenen oder exogenen Promotors entsprechend transkribiert und translatiert wird. Solche Expressionsvektoren (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Phagen, Cosmidvektoren, virale Vektoren und Plasmidvektoren) sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, wie auch für den Gentransfer geeignete Reagenzien und Verfahren (z. B. Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Mikroinjektion, Transformation etc.). Folglich kann das rekombinant hergestellte Protein mittels auf dem Gebiet bekannten Standardverfahren (z. B. Chromatographie, Zentrifugation, differentielle Löslichkeit, isoelektrische Fokussierung etc.) isoliert und gereinigt werden sowie auf antivirale Aktivität untersucht werden.
Alternativ dazu kann ein natives Cyanovirin durch nicht rekombinante Verfahren (siehe z. B. Beispiel 1 und die vorhergehende Erläuterung) aus Nostoc ellipsosporum erhalten und durch herkömmliche Verfahren sequenziert werden. Die Sequenz kann dann dazu verwendet werden, die entsprechende DNA zu synthetisieren, die in einen geeigneten Expressionsvektor subkloniert und in eine Protein-erzeugende Zellen abgegeben werden kann, um das erwünschte Protein in Massen rekombinant herzustellen.
In dieser Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung auch einen Vektor bereit, der das vorliegende erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül, z. B. eine DNA-Sequenz wie eine Nostoc-ellipsosporum-Gen-Sequenz für Cyanovirin, eine für ein Cyanovirin kodierende cDNA oder eine für ein Cyanovirin kodierende synthetische DNA, umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Wirtszelle, die das vorliegende erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül oder den Vektor umfasst, sowie ein Verfahren zur Verwendung eine solchen Wirtszelle bereit, um ein Cyanovirin herzustellen.
Die isolierte und gereinigte oder synthetische DNA oder für ein Cyanovirin kodierende cDNA kann entweder für das gesamte Cyanovirin oder einen Teil davon (vorzugsweise den antiviral aktiven Teil davon) kodieren. Wenn die DNA oder cDNA nicht die gesamte für das native Cyanovirin kodierende Sequenz umfasst, kann die DNA oder cDNA als Teil einer Genfusion subkloniert werden. Bei einer Transkriptionsgenfusion enthält die DNA oder cDNA ihre eigene Steuerungssequenz, die die entsprechende Herstellung des Proteins (z. B. Ribosomen-Bindungsstelle, Translationsinitiationscodon etc.) leitet, und die Transkriptionssteuerungssequenzen (z. B. Promtorelemente und/oder Enhancer) werden durch den Vektor bereitgestellt. Bei einer Translationsgenfusion werden die Transkriptionssteuerungssequenzen sowie zumindest einige der Translationssteuerungssequenzen (d. h. das Translationsinitiationscodon) durch den Vektor bereitgestellt. Bei einer Translationsgenfusion wird ein chimäres Protein erzeugt.
Es können auch Gene für spezielle Fusionsproteine erzeugt werden, die eine funktionelle Cyanovirin-Komponente plus eine Fusionskomponente, die dem zusammengesetzten Protein ein zusätzliches erwünschtes Attribut oder Attribute verleihen, enthalten. Beispielsweise kann eine Fusionssequenz für ein Toxin oder ein immunologisches Reagens, wie es obenstehend definiert ist, zugesetzt werden, um die Reinigung und Analyse des funktionellen Proteins (wie z. B. das in den Beispielen 2–5 beschriebene FLAG-Cyanovirin-N-Fusionsprotein) zu erleichtern.
Gene können speziell dafür konstruiert werden, um für Fusionsproteine zu kodieren, die ein an ein Effektorprotein gekuppeltes Cyanovirin enthalten, wie z. B. ein Toxin oder immunologisches Reagens zum spezifischen Targeting virusinfizierter Zellen wie HIV und/oder HIV-infizierte Zellen. In diesen Fällen dient die Cyanovirin-Gruppierung nicht nur als neutralisierender Wirkstoff, sondern auch als Zielwirkstoff, um die Effektoraktivitäten dieser Moleküle selektiv gegen ein gegebenes Virus wie HIV zu lenken. So kann z. B. ein therapeutischer Wirkstoff erhalten werden, indem die HIV-Targetingfunktion eines funktionellen Cyanovirins mit einem Toxin kombiniert wird, das auf das Neutralisieren infektiöser Viren abzielt, und/oder indem Zellen, die infektiöse Zellen, wie HIV, produzieren, zerstört werden. Ebenso kann auch ein therapeutischer Wirkstoff erhalten werden, der die Virus-Targeting-Funktion eines Cyanovirins mit den Multivalenz- und Effektorfunktionen verschiedener Immunglobulin-Unterklassen kombiniert. Beispiel 6 veranschaulicht weiter die Virus-Targeting-Eigenschaften, insbesondere die gp120-Targeting-Eigenschaften, eines Cyanovirins.
Ähnliche Grundprinzipien liegen den umfassenden therapeutischen Entwicklungsbemühungen, die die HIV-gp120-Targeting-Eigenschaften von sCD4 ausnutzen, zugrunde. Beispielsweise wurden sCD4-Toxin-Konjugate hergestellt, in denen sCD4 an eine Pseudomonas-Exotoxinkomponente (Chaudhary et al., in: The Human Retrovirus, Gallo et al., Hrsg., Academic Press: San Diego, S. 379–387 (1991); Chaudhary et al., Nature 335, 369–372 (1988)), eine Diphtherietoxinkomponente (Aullo et al., EMBO J. 11, 575–583 (1992)) oder eine Ricin–A-Kettenkomponente (Till et al., Science 242, 1166–1167 (1988)) gekuppelt ist. Ebenso wurden sCD4-Immunglobulinkonjugate bei Versuchen hergestellt, die In-Vivo-Clearance der funktionellen sCD4-Aktivität zu verringern, den Planzentatransfer zu verstärken und eine zielgerichtete Verstärkung immunologischer Mechanismen der Pathogen-Eliminierung, wie phagozytische Aufnahme und Abtötung durch Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität, zu bewirken, um HIV-infizierte Zellen und Viren zu töten und/oder zu entfernen (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Langner et al. (1993), s. o.). Obwohl derartige CD4-Immunglobulinkonjugate (manchmal auch „Immunoadhäsine" genannt) in vivo tatsächlich vorteilhafte pharmakokinetische Eigenschaften und Verbreitungseigenschaften sowie in vitro Anti-HIV-Wirkungen gezeigt haben, waren die klinischen Ergebnisse enttäuschend (Schooley et al. (1990), s. o.; Husson et al. (1992), s. o.; Langner et al. (1993), s. o.). Dies ist nicht überraschend, da klinische Isolate von HIV im Gegensatz zu Laborstämmen hoch resistent gegen die Bindung an und Neutralisierung durch sCD4 sind (Orloff et al. (1995), s. o.; Moore et al. (1992), s. o.). Die außergewöhnlich breite antivirale Aktivität und Targeting-Eigenschaften eines funktionellen Cyanovirins gegen Viren, wie z. B. Primatenretroviren, im Allgemeinen und klinische sowie Laborstämme im Besonderen (siehe z. B. Beispiel 7) sind besonders vorteilhaft für die Kombination mit Toxinen, Immunglobulinen und anderen ausgewählten Effektorproteinen.
Auf Viren gerichtete Konjugate können entweder durch gentechnische Verfahren (siehe z. B. Chaudhary et al. (1988), s. o.) oder durch chemisches Kuppeln der Targeting-Komponente mit einer Effektorkomponente hergestellt werden. Das am besten durchführbare oder geeignete Verfahren, um ein gegebenes Cyanovirin-Konjugat oder Fusionsprotein zu konstruieren, wird auf Basis der Berücksichtigung der Eigenschaften des jeweiligen zum Kuppeln an ein Cyanovirin ausgewählten Effektormoleküls ermittelt. Ist z. B. ein nicht proteinisches Effektormolekül ausgewählt worden, stellt chemisches Kuppeln anstelle von gentechnischen Verfahren die am besten geeignete Möglichkeit zum Erzeugen des erwünschten Cyanovirin-Konjugats dar.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das für ein Cyanovirin-Fusionsprotein kodiert, zusätzlich zu den Cyanovirin-Fusionsproteinen selbst bereit. Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das Seq-ID. Nr. 3 und im Wesentlichen homologe Sequenzen davon umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Vektor, der eine für ein Cynovirin-Fusionsprotein kodierende Nucleinsäuresequenz umfasst, und ein Verfahren zum Erhalt eines Cyanovirin-Fusionsproteins mittels Expression eines für ein Cyanovirin-Fusionsprotein kodierenden Vektors in einem Protein-synthetisierendem Organismus, wie oben beschrieben, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine erste Nucleinsäuresequenz umfasst, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung, z. B. eine für ein Cyanovirin kodierende Sequenz wie eine der vorhergehend erwähnten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung, kodiert, das an eine zweite für ein Effektorprotein, wie ein Toxin oder immunologisches Reagens, wie oben beschrieben worden ist, kodierende Nucleinsäure gekuppelt ist. Die vorliegende Erfindung stellt weiters ein isoliertes und gereinigtes Protein bereit, das durch ein solches Nucleinsäuremolekül kodiert ist.
Das gekuppelte Molekül (Konjugat) ist wünschenswerterweise auf ein Virus, noch bevorzugter HIV und insbesondere Glykoprotein gp120, gerichtet. Die Kupplung kann auf DNA-Niveau oder durch chemisches Kuppeln erfolgen, wie obenstehend beschrieben worden ist. Ein Cyanovirin-Effektorproteinkonjugat der vorliegenden Erfindung kann z. B. durch (a) Auswählen eines erwünschten Effektorproteins, (b) Synthetisieren einer zusammengesetzten DNA-Kodierungssequenz, die eine erste DNA-Kodierungssequenz umfasst, die eine der vorhergehend erwähnten Nucleinsäuresequenzen enthält, die für ein funktionelles Cyanovirin kodiert, gekuppelt an eine zweite DNA-Kodierungssequenz für ein Effektorprotein, z. B. ein Toxin oder immunologisches Reagens, (c) Exprimieren der zusammengesetzten DNA-Kodierungssequenz in einem geeigneten Protein-synthetisierenden Organismus und (d) Reinigen des erwünschten Fusionsproteins, bis es im Wesentlichen rein ist. Alternativ dazu kann ein Cyanovirin-Effektormolekülkonjugat der vorliegenden Erfindung erhalten werden, indem (a) ein erwünschtes Effektormolekül und ein Cyanovirin oder Cyanovirin-Fusionsprotein ausgewählt wird, (b) das Cyanovirin oder Cyanovirin-Fusionsprotein an das Effektormolekül chemisch gekuppelt wird und (c) das erwünschte Cyanovirin-Effektormolekülkonjugat in im Wesentlichen reiner Form isoliert wird. Konjugate, die ein funktionelles Cyanovirin enthalten, das an eine erwünschte Effektorkomponente, wie ein Toxin, immunologisches Reagens oder ein anderes funktionelles Reagens, gekuppelt ist, können – gemäß den folgenden Beobachtungen – noch spezifischer daraufhin konstruiert werden, um die einzigartigen gp120-Targeting-Eigenschaften eines Cyanovirins auszunützen.
Beispiel 6 offenbart neuartige auf gp120 gerichtete Wirkungen eines Cyanovirins. Zusätzliche Erkenntnisse können aus Festphasen-ELISA-Versuchen gewonnen werden (Boyd et al., 1996, unveröffentlicht). Es kann z. B. aufgezeigt werden, dass der C-terminale Epitop-spezifische Einfang oder CD4-Rezeptor-Einfang von gp120, wenn dieses entweder mit polyklonalem HIV-1-Ig oder mit Mäuse-MAb gegen das immunodominante dritte hypervariable (V3) Epitop detektiert wurde (Matsushita et al., J. Virol. 62, 2107–2114 (1998)), durch Cyanovirin-N wesentlich gehemmt wurden. Im Allgemeinen behindert die Einbindung des CD4-Rezeptors die Antikörpererkennung des V3-Epitops nicht, und umgekehrt (Moore et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 4, 369–379 (1988); Matsushita et al. (1988), s. o.). Cyanovirin-N kann jedoch offensichtlich umfassendere Konformationswirkungen auf gp120 ausüben, wie durch den Verlust der Immunoreaktivität bei zahlreichen verschiedenen nicht überlappenden Epitopen demonstriert werden kann.
Die Bandbreite der antiviralen Wirkung (Boyd et al. (1996), s. o.) von Cyanovirin-N gegen unterschiedliche tropische CD4⁺-Immunschwächevirusstämme in verschiedenen Zielzellen ist bemerkenswert. Diverse Stämme von HIV-1, HIV-2 und SIV reagieren ähnlich empfindlich auf Cyanovirin. Klinische Isolate und Laborstämme weisen üblicherweise eine im Wesentlichen äquivalente Empfindlichkeit auf (für eine weitere Darstellung siehe Beispiel 7). Die Co-Kultivierung von chronisch infizierten und nicht infizierten CEM-SS-Zellen mit Cyanovirin-N wird zeigen, dass das Protein die virale Replikation nicht hemmt, sondern eine Konzentrations-abhängige Hemmung der Zell-Zell-Fusion und Virusübertragung verursacht. Ähnliche Ergebnisse aus Bindungs- und Fusionshemmungstest mit HeLa-CD4-LTR-b-Galactosidase-Zellen stimmen mit der Cyanovirin-N-Hemmung von Viruszellen und/oder der Zell-Zell-Bindung überein (Boyd et al. (1996), s. o.). Beispiel 8 veranschaulicht die Konstruktion einer Konjugat-DNA-Kodierungssequenz und die Expression davon, um ein Cyanovirin-Toxin-Konjugat bereitzustellen, das auf HIV-infizierte Zellen abzielt und diese tötet.
Die antivirale, z. B. Anti-HIV-, Aktivität der Cyanovirine und Konjugate davon der vorliegenden Erfindung kann in einer Reihe von zusammenhängenden antiviralen In-Vitro-Tests veranschaulicht werden (Gulakowski et al., J. Virol. Methods 33, 87–100 (1991)), die die antivirale Aktivität im Menschen einigermaßen voraussagen. In diesen Untersuchungen wird die Fähigkeit der Verbindungen gemessen, die Replikation von HIV und/oder die zytopathischen Wirkungen von HIV auf menschliche Zielzellen zu verhindern. Diese Messungen korrelieren direkt mit der Pathogenese der HIV-induzierten Erkrankung in vivo. Die Ergebnisse der Analyse der antiviralen Aktivität von Cyanovirinen oder Konjugaten, wie in Beispiel 5 erläutert und in den 8, 9 und 10 veranschaulicht, sagen die antivirale Aktivität dieser Produkte in vivo beim Menschen voraus und begründen dadurch zudem die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung. Da die vorliegende Erfindung auch Verfahren der Ex-Vivo-Verwendung von Cyanovirinen und Konjugaten (siehe z. B. die in Beispiel 5 und den 6 und 7 dargestellten Ergebnisse) bereitstellt, besitzen die Cyanovirine und Konjugate davon eine noch breitere Verwendbarkeit.
Es kann gezeigt werden, dass die vorliegenden erfindungsgemäßen Cyanovirine und Konjugate davon ein Virus, insbesondere ein Retrovirus wie das menschliche Immunschwächevirus, d. h. HIV-1 oder HIV-2, hemmen. Die Cyanovirine und Konjugate der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet, um andere Retroviren sowie andere Viren zu hemmen. Beispiele von Viren, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen, jedoch nicht ausschließlich, Typ-C- und Typ-D-Retroviren, HTLV-1, HTLV-2, HIV, FLV, SIV, MLV, BLV, BIV, Pferdeinfektionsviren, Anämieviren, Vogelsarkomviren, wie Rous-Sarkomviren (RSV), Hepatitis-A-, -B-, -nicht-A- und -nicht-B-Viren, Arboviren, Varicella-Viren, Masern-, Mumps- und Rötelnviren ein.
Cyanovirine und Konjugate davon umfassen Proteine und sind als solche besonders anfällig für die Hydrolyse von Amidbindungen (z. B. katalysiert durch Peptidasen) und das Aufbrechen essentieller Disulfidbindungen oder das Ausbilden inaktivierender oder unerwünschter Disulfidbindungen (Carone et al., J. Lab. Clin. Med. 100, 1–14 (1982)). Es gibt mehrere Wege, um die Molekularstruktur falls notwendig zu verändern, um dem Cyanovirin oder Konjugat davon eine verstärkte Stabilität zu verleihen (Wunsch, Biopolymers 22, 493–505 (1983); Samanen, in: Polymeric Materials in Medication, Gebelein et al., Hrsg., Plenum Press: New York, S. 227–242 (1985)), die in manchen Fällen für die Herstellung und Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Cyanovirine und Konjugate davon enthalten, für die therapeutische oder prophylaktische Anwendung gegen Viren, wie z. B. HIV, wichtig sind. Mögliche Optionen für nützliche chemische Modifikationen eines Cyanovirins oder Konjugats davon schließen, jedoch nicht ausschließlich, die Folgenden ein (übernommen von J. M. Samanen (1985), s. o.): (a) Olefin-Substitution, (b) Carbonyl-Reduktion, (c) D-Aminosäure-Substitution, (d) N-α-Methyl-Substitution, (e) C-α-Methyl-Substitution, (f) C-α-C'-Methylen-Insertion, (g) Dehydroaminosäure-Insertion, (h) retro-inverse Modifikation, (i) N-terminale bis C-terminale Zyklisation und (j) Thiomethylen-Modifikation. Cyanovirine und Konjugate davon können auch durch kovalente Bindung von Kohlenhydrat- und Polyoxyethylen-Derivaten modifiziert werden, von denen angenommen wird, dass sie die Stabilität und die Resistenz gegen Proteolyse stärken (Abuchowski et al., in: Enzymes as Drugs, Holcenberg et al., Hrsg., John Wiley: New York, S. 367–378 (1981)).
Auch andere wichtige allgemeine Überlegungen bezüglich der Gestaltung von Abgabesystemen und Zusammensetzungen sowie zu Verabreichungswegen für Protein medikamente wie Cyanovirine und Konjugate davon kommen zum Tragen (Eppstein, CRC Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 5, 99–139 (1988); Siddiqui et al., CRC Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 3, 195–208 (1987); Banga et al., Int. J. Pharmaceutics 48, 15–50 (1988); Sanders, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 15, 95–102 (1990); Verhoef, Eur. J. Drug Metab. Pharmcokinetics 15, 83–93 (1990)). Das geeignete Abgabesystem für ein gegebenes Cyanovirin oder Konjugat davon hängt von dessen Beschaffenheit, der jeweiligen klinischen Anwendung und dem Wirkungsort des Medikaments ab. Wie bei jedem Proteinmedikament bringt die orale Verabreichung mit Wahrscheinlichkeit spezielle Probleme mit sich, und zwar in erster Linie aufgrund der Instabilität des Gastrointestinaltrakts sowie der geringen Absorption und der Bioverfügbarkeit des intakten bioaktiven Medikaments aus diesem. Es ist daher insbesondere bei der oralen Verabreichung, aber möglicherweise auch bei anderen Verabreichungswegen, notwendig, einen die Absorption verstärkenden Wirkstoff in Kombination mit einem gegebenen Cyanovirin oder Konjugat davon zu verwenden. Eine große Anzahl an absorptionsverstärkenden Wirkstoffen ist untersucht worden und/oder in Kombination mit Proteinmedikamenten zu oralen Verabreichung und zur Verabreichung auf anderen Wegen verwendet worden (Verhoef (1990), s. o.; van Hoogdalem, Pharmac. Ther. 44, 407–443 (1989); Davis, J. Pharm. Pharmacol. 44 (Suppl. 1), 186–190 (1992)). Typische Verstärker fallen normalerweise in die allgemeinen Kategorien (a) Chelatbildner, wie EDTA, Salicylate und N-Acyl-Derivate von Collagen, (b) Tenside, wie Laurylsulfat und Polyoxyethlyen-9-laurylether, (c) Gallensalze, wie Glycholate und Taurocholate sowie Derivate wie Taurodihydrofusidat, (d) Fettsäuren, wie Oleinsäure und Caprinsäure sowie deren Derivate wie Acylcarnitine, Monoglyceride und Diglyceride, (e) Nicht-Tenside, wie ungesättigte zyklische Harnstoffe, (f) Saponine, (g) Cyclodextrine und (h) Phospholipide.
Andere Ansätze, um die orale Verabreichung von Proteinmedikamenten, wie die Cyanovirine und die Konjugate davon der vorliegenden Erfindung, zu verbessern, können die vorhergehend erwähnten chemischen Modifikationen einschließen, die die Stabilität der gastrointestinalen Enzyme und/oder erhöhte Lipophilie verstärken. Alternativ dazu kann das Proteinmedikament in Kombination mit anderen Medikamenten oder Substanzen verabreicht werden, die Proteasen und/oder andere mögli che Ursachen eines enzymatischen Abbaus von Proteinen direkt hemmen. Ein weiterer alternativer Ansatz, die gastrointestinale Absorption von Proteinmedikamenten, wie Cyanovirine oder Konjugate davon, zu verhindern oder zu verzögern, besteht darin, sie in ein Abgabesystem zu integrieren, das so gestaltet ist, dass es das Protein vor dem Kontakt mit den proteolytischen Enzymen im Darmlumen schützt und das intakte Protein nur dann freisetzt, wenn ein für dessen Absorption geeigneter Bereich erreicht worden ist. Ein spezifischeres Beispiel für diesen Ansatz ist die Verwendung von biologisch abbaubaren Mikrokapseln oder Mikrokugeln, um anfällige Medikamente vor dem Abbau zu schützen sowie eine längere Freisetzung des aktiven Medikaments zu bewirken (Deasy, in: Microencapsulation and Related Processes, Swarbrick, Hrsg., Marcell Dekker, Inc.: New York, S. 1–60, 88–89, 208–211 (1984)). Mikrokapseln können auch einen nützlichen Weg bereitstellen, nach der Injektion eine verlängerte Abgabe eines Protein-Medikaments, wie eines Cyanovirins oder Konjugats davon, zu bewirken (Maulding, J. Controlled Release 6, 167–176 (1987)).
Angesichts der vorhergehend erwähnten möglichen Komplexitäten bei der erfolgreichen oralen Verabreichung eines Proteinmedikaments wird in vielen Fällen bevorzugt, die vorliegenden erfindungsgemäßen Cyanovirine und Konjugate davon auf einem der zahlreichen anderen möglichen Verabreichungswege für ein Proteinmedikament zu verabreichen. Diese Wege schließen intravenös, intraarteriell, intrathekal, intrazisternal, buccal, rektal, nasal, pulmonal, transdermal, vaginal, ocular und dergleichen ein (Eppstein (1988), s. o.; Siddiqui et al. (1987), s. o.; Banga et al. (1988), s. o.; Sanders (1990), s. o.; Verhoef (1990), s. o.; Barry, in: Delivery Systems for Peptide Drugs, Davis et al., Hrsg., Plenum Press: New York, S. 265–275 (1986); Patton et al., Adv. Drug Delivery Rev. 8, 179–196 (1992)). Auf jedem dieser Wege oder in der Tat auch auf jedem anderen Verabreichungs- oder Anwendungsweg kann ein Proteinmedikament, wie ein Cyanovirin oder Konjugat davon, eine immunogene Reaktion hervorrufen. Es kann in solchen Fällen notwendig sein, die Moleküle zu modifizieren, um die immunogenen Gruppen zu maskieren. Es ist zudem möglich, durch wohlüberlegtes Auswählen des Formulierungs- und/oder Verabreichungsverfahrens vor unerwünschten Immunreaktionen zu schützen. Beispielsweise kann eine ortsgerichtete Abgabe sowie Maskierung von Erkennungsstellen aus dem Immunsystem durch Verwendung oder Bindung eines so genannten Tolerogens, wie Polyethylenglycol, Dextran, Albumin und dergleichen, verwendet werden (Abuchowski et al. (1981), s. o.; Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3578–3581 (1977); Lisi et al., J. Appl. Biochem. 4, 19–33 (1982); Wileman et al., J. Pharm. Pharmacol. 38, 264–271 (1986)). Derartige Modifikationen können auch vorteilhafte Auswirkungen auf die Stabilität und Halbwertszeit sowohl in vivo als auch ex vivo haben. Andere Strategien zur Vermeidung von unpassenden Immunreaktionen können auch das Herbeiführen von Toleranz durch die anfängliche Verabreichung von lediglich geringen Dosen umfassen. Für Fachleute auf dem Gebiet geht aus der vorliegenden Offenbarung jedenfalls deutlich hervor, dass für die jeweilige erwünschte medizinische Anwendung oder Verwendung eines Cyanovirins oder Konjugats davon jede aus einer Vielzahl von möglichen Zusammensetzungen, Verabreichungswegen oder Anwendungsstellen ausgewählt werden kann, was immer vorteilhaft ist.
Dementsprechend können die antiviralen Cyanovirine und Konjugate davon der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Zusammensetzungen formuliert sein, um entweder in therapeutischen Behandlungsmethoden für virusinfizierte, z. B. HIV-infizierte, Personen oder in prophylaktischen Methoden gegen die virale, z. B. HIV-, Infektion von nicht infizierten Personen verwendet zu werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine Zusammensetzung bereit, die das vorliegende erfindungsgemäße Cyanovirin oder Cyanovirinkonjugat, insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer antiviralen wirksamen Menge eines isolierten und gereinigten Cyanovirins oder Cyanovirin-Konjugats und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, umfasst. Anstelle oder zusätzlich zum vorher angeführten isolierten und gereinigten Cyanovirin oder Cyanovirin-Konjugat kann die Zusammensetzung lebensfähige Wirtszellen umfassen, die transformiert wurden, um ein Cyanovirin oder Konjugat davon direkt in vivo zu exprimieren. Die Zusammensetzung kann weiters eine antivirale wirksame Menge zumindest einer zusätzlichen antiviralen Verbindung, die kein Cyanovirin oder Konjugat davon ist, umfassen. Geeignete antivirale Verbindungen schließen AZT, ddI, ddC, Gancyclovir, fluorierte Didesoxy nucleoside, Nevirapin, R82913, Ro 31-8959, BI-RJ-70, Acyclovir, α-Interferon, rekombinantes sCD4, Michellamine, Calanolide, Nonoxynol-9, Gossypol und Derivate davon sowie Gramicidin ein. Das in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendete Cyanovirin kann aus natürlich vorkommenden oder gentechnisch veränderten Organismen isoliert und gereinigt werden. Ähnlich können Cyanovirin-Konjugate aus gentechnisch veränderten Organismen oder durch chemisches Kuppeln gewonnen werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung eines virusinfizierten tierischen Lebewesens wie eines Menschen verwendet werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich, um das Wachstum oder die Replikation eines Virus, wie ein Retrovirus, insbesondere eines menschlichen Immunschwächevirus, im Speziellen HIV-1 und HIV-2, zu hemmen. Die Zusammensetzungen sind in der therapeutischen bzw. prophylaktischen Behandlung von tierischen Lebewesen, wie z. B. Menschen, von Nutzen, die mit einem Virus infiziert sind oder die gefährdet sind, mit einem Virus infiziert zu werden. Die Zusammensetzungen können zudem zur Behandlung von Gegenständen oder Materialien, wie medizinische Ausstattung, Materialien oder Fluide, einschließlich biologischer Fluide wie Blut, Blutprodukte und Geweben, eingesetzt werden, um eine virale Infektion eines tierischen Lebewesens, wie z. B. eines Menschen, zu verhindern. Derartige Zusammensetzungen sind auch dazu nützlich, die sexuelle Übertragung von Virusinfektionen, wie HIV, zu verhindern, was den weltweiten Hauptübertragungsweg von AIDS darstellt (Merson (1993), s. o.).
Mögliche Viruzide, die gegen die sexuelle Übertragung von HIV verwendet werden oder in Betracht gezogen werden, sind sehr begrenzt. Derzeit verfügbare Wirkstoffe dieser Kategorie schließen z. B. Nonoxynol-9 (Bird, AIDS 5, 791–796 (1991)), Gossypol und Derivate davon (Polsky et al., Contraception 39, 579–587 (1989); Lin, Antimicrob. Agents Chemother. 33, 2149–2151 (1989); Royer, Pharmacol. Res. 24, 407–412 (1991)) und Gramicidin (Bourinbair, Life Sci./Pharmacol. Lett. 54, PL5-9 (1994); Bourinbair et al., Contraception 49, 131–137 (1994)) ein.
In einem neuartigen Ansatz zur Anti-HIV-Prophylaxe, der derzeit unter der Schirmherrschaft des US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) untersucht wird (wie z. B. von Painter in USA Today am 13. Februar 1996 berichtet wurde), wird in einer Studie mit 900 Frauen die Einführung von Lactobacilli-Lebendkulturen als Vaginalzäpfchen evaluiert. Diese Untersuchung basiert insbesondere auf Anti-HIV-Wirkungen gewisser H₂O₂-produzierender Lactobacilli in vitro (siehe z. B. das von Hilier veröffentlichte Abstract von der vom NIAID gesponserten Konferenz zum Thema „Advances in AIDS Vaccine Development" in Bethesda, MD, 11.–15. Februar 1996). Lactobacilli bevölkern rasch die Vagina und sind die bei den meisten gesunden Frauen dominierende Bakterienpopulation (Redondo-Lopez et al., Rev. Infect. Dis. 12, 856–872 (1990); Reid et al., Clin. Microbiol. Rev. 3, 335–344 (1990); Bruce and Reid, Can. J. Microbiol. 34, 339–343 (1988); Reu et al., J. Infect. Dis. 171, 1237–1243 (1995); Hilier et al., Clin. Infect. Dis. 16 (Suppl. 4), S273–S281; Agnew et al., Sex. Transm. Dis. 22, 269–273 (1995)). Lactobacilli sind auch vorherrschende, nicht pathogene Bewohner anderer Körperhöhlen wie Mund, Nasenrachenraum, oberer und unterer Gastrointestinaltrakt und Rektum.
Es ist weithin bekannt, dass Lactobacilli problemlos mittels verfügbarer gentechnischer Verfahren transformiert werden können, um eine erwünschte fremde DNA-Kodierungssequenz zu inkorporieren, und dass diese Lactobacilli so ausgebildet werden können, dass sie ein entsprechendes erwünschtes Fremdprotein exprimieren (siehe z. B. Hols et al., Appl. and Environ. Microbiol. 60, 1401–1413 (1994)). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung versteht es sich daher für Fachleute auf dem Gebiet, dass lebensfähige Wirtszellen, die eine DNA-Sequenz oder einen Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten und ein Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren, direkt als Vehikel zur Abgabe eines Cyanovirins oder Konjugats davon an die erwünschte(n) Stelle(n) in vivo verwendet werden kann. Bevorzugte Wirtszellen für eine derartige Abgabe von Cyanovirinen oder Konjugaten davon direkt an die erwünschte(n) Stelle(n), wie z. B. eine ausgewählte Körperhöhle, können Bakterien umfassen. Noch bevorzugter können solche Wirtszellen geeignet hergestellte/n Stamm/Stämme von Lactobacilli, Enterococci oder anderen üblichen Bakte rien wie E. coli, deren normale Stämme bekannterweise häufig Körperhöhlen bevölkern, umfassen. Insbesondere können derartige Wirtszellen einen oder mehrere ausgewählte nicht pathogene Stämme von Lactobacilli, wie die von Andreu et al. (1995, s. o.) beschriebenen, umfassen, und zwar v. a. solche, die starke Adhäsionseigenschaften an Epithelzellen, wie z. B. Adhäsion an Vaginal-Epithelzellen, aufweisen und mittels der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung geeignet transformiert worden sind.
Wie von McGroarty (FEMS Immunol. Med. Microbiol. 6, 251–264 (1993)) berichtet wird, ist die „probiotische" oder direkte therapeutische Anwendung von Lebend-Bakterien, insbesondere von Bakterien, die normalerweise in der Natur vorkommen, genauer gesagt Lactobacilli, zur Behandlung oder Prophylaxe von pathogenen Bakterien- oder Hefepilzinfektionen des Urogenitaltrakts, im Speziellen des weiblichen Urogenitaltrakts, ist ein weithin bekanntes Konzept. In jüngster Zeit ist die Verwendung einer herkömmlichen probiotischen Strategie, insbesondere die Verwendung von Lebend-Lactobacilli, zur Hemmung der sexuellen Übertragung von HIV nahe gelegt worden, und zwar insbesondere auf Basis der normalen endogenen Produktion von viruziden Mengen an H₂O₂ und/oder Milchsäure und/oder anderen gegebenenfalls viruziden Substanzen durch bestimmte normale Stämme von Lactobacilli (z. B. Hilier (1996), s. o.). Die vorliegende erfindungsgemäße Verwendung von Nicht-Säugetierzellen, vorzugsweise Bakterien, noch bevorzugter Lactobacilli, die vorzugsweise mit einem Fremdgen, insbesondere einem Cyanovirin-Gen, gentechnisch verändert wurden, um eine antivirale Substanz, genauer gesagt ein Protein und insbesondere ein Cyanovirin, zu exprimieren, ist ein bisher noch nicht dagewesenes Verfahren zur Behandlung eines tierischen Lebewesens, insbesondere eines Menschen, um die Infektion durch ein Virus, im Speziellen ein Retrovirus, insbesondere HIV-1 oder HIV-2, zu verhindern.
Elmer et al. (JAMA 275, 870–876 (1996)) haben vor kurzem die Vermutung angestellt, dass „Gentechnologie die Möglichkeit bietet, Mikroben zur Übertragung spezifischer Wirkungen oder Produkte auf den Dickdarm oder andere Schleimhaut–Oberflächen zu verwenden. [...] Weitere fruchtbare Bereiche für zukünftige Untersuchungen schließen das Definieren von Wirkungsmechanismen verschiedener biotherapeutischer Wirkstoffe ein, mit der Möglichkeit, Gentechnik anzuwenden, um die Wirkungen zu verstärken." Elmer et al. (1996, s. o.) haben weiters aufgezeigt, dass die Begriffe „probiotischer" und „biotherapeutischer Wirkstoff" in der Literatur dazu verwendet wurden, Mikroorgansimen zu beschreiben, die in vivo eine antagonistische Wirkung gegen Pathogene haben. Diese Autoren bevorzugen im Speziellen den Begriff „biotherapeutischer Wirkstoff", um „Mikroorganismen mit spezifischen therapeutischen Eigenschaften" zu bezeichnen.
Angesichts der vorliegenden Offenbarung versteht es sich für Fachleute auf dem Gebiet, dass die vorliegende Erfindung einen komplett neuartigen Typ „probiotischer" oder „biotherapeutischer" Behandlung lehrt, bei der speziell gentechnisch veränderte Stämme von hierin bereitgestellten Mikroorganismen verwendet werden, die in der Natur nicht vorkommen. Trotzdem können in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorliegende Lehren in Bezug auf die Auswahl von optimalen Mikrobenstämmen, insbesondere von Bakterienstämmen, für herkömmliche probiotische oder biotherapeutische Anwendungen verwendet werden. Die Auswahl optimaler Lactobacillus-Stämme zur gentechnischen Herstellung, Transformation, direkten Expression von Cyanovirinen oder Konjugaten davon und der direkten probiotischen oder biotherapeutischen Anwendungen, um eine HIV-Infektion zu behandeln oder zu verhindern, kann auf denselben oder ähnlichen Kriterien beruhen wie den von Elmer et al. beschriebenen (1996, s. o.), die üblicherweise dazu herangezogen werden, normale, endogene oder „nicht gentechnisch veränderte" Bakterienstämme für herkömmliche probiotische oder biotherapeutische Therapie auszuwählen. Zudem sind die von McGroarty gelehrten Empfehlungen und Eigenschaften, insbesondere für die Auswahl optimaler Lactobacillusstämme zur herkömmlichen probiotischen Verwendung bei weiblichen Urogenitalinfektionen, passend für die vorliegende Erfindung: „[...] Lactobacilli, die für die Inkorporation in probiotische Präparate ausgewählt worden sind, sollten leicht und – wenn möglich – kostengünstig zu kultivieren sein. [...] Stämme sollten stabil sein, nach dem Gefriertrocknen immer noch lebensfähig sein und natürlich gegenüber dem Wirt nicht pathogen sein. [...] Es ist wichtig, dass die für die Verwendung in probiotischen Präparaten ausgewählten Lactobacilli gut an das Vaginalepithel anhaften sollten. [...] Idealerweise sollten künstlich eingepflanzte Lactobacilli am Vaginalepithel anhaften, in die vorliegenden indigenen Mikroorganismen integriert werden und sich stark vermehren" (McGroarty (1993), s. o.). Obwohl sich McGroartys Lehren insbesondere auf die Auswahl „normaler" Lactobacillus-Stämme für probiotische Verwendungen gegen pathogene Bakterien- oder Hefepilzinfektionen des weiblichen Urogenitaltrakts beziehen, gelten ähnliche Überlegungen auch bei der Auswahl optimaler Bakterienstämme für die Gentechnologie und die „probiotische" oder „biotherapeutische" Anwendung gegen Virusinfektionen, wie sie im Speziellen durch die vorliegende Erfindung umfasst werden.
Dementsprechend umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verhinderung der sexuellen Übertragung von Virusinfektionen, wie z. B. HIV, die vaginale, rektale, orale, penile oder andere topische, Insertions- oder Einflößungsbehandlungen mit einer antiviralen wirksamen Menge eines Cyanovirins und/oder Cyanovirin-Konjugats und/oder lebensfähigen Wirtszellen, die transformiert wurden, um ein Cyanovirin oder Konjugat davon zu exprimieren, und zwar alleine oder in Kombination mit einer anderen antiviralen Verbindung (wie sie z. B. obenstehend beschrieben worden ist). Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hierin zur Verwendung bei den prophylaktischen oder therapeutischen Behandlungsmethoden der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere Cyanovirine, Konjugate davon oder Wirtszellen, die transformiert wurden, um ein Cyanovirin oder Konjugat davon zu exprimieren, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Pharmazeutisch annehmbare Träger wie auch geeignete Verabreichungsmethoden sind Fachleuten auf dem Gebiet weithin bekannt. Die Wahl des Trägers wird teilweise durch das jeweilige Cyanovirin oder Konjugat davon oder die jeweilige(n) Wirtszelle(n) sowie durch die jeweilige zur Verabreichung der Zusammensetzung verwendete Methode bestimmt.
Für Fachleute auf dem Gebiet versteht es sich, dass verschiedene Wege der Verabreichung eines Medikaments zur Verfügung stehen, und obwohl mehr als ein Verabreichungsweg für ein bestimmtes Medikament verwendet werden kann, kann ein spezieller Weg eine unmittelbarere und wirksamere Reaktion hervorrufen als ein anderer Weg. Darüber hinaus versteht es sich für Fachleute auf dem Gebiet, dass der jeweilige verwendete pharmazeutische Träger teilweise von dem jeweiligen verwendeten Cyanovirin, Konjugat davon oder der verwendeten Wirtszelle sowie dem gewählten Verabreichungsweg abhängt. Dementsprechend gibt es eine große Vielfalt an geeigneten Formulierungen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
Formulierungen, die für die orale, rektale oder vaginale Verabreichung geeignet sind, können z. B. aus (a) flüssigen Lösungen oder Suspensionen, wie einer wirksamen Menge der reinen Verbindung(en), und/oder Wirtszelle(n), die verändert wurden, um ein Cyanovirin oder ein Konjugat davon direkt herzustellen, aufgelöst oder suspendiert in Verdünnungsmitteln wie Wasser, Kulturmedium oder Kochsalz, (b) Kapseln, Zäpfchen, Beuteln, Tabletten, Lutschtabletten oder Pastillen, die jeweils eine vorbestimmte Menge des/der aktiven Inhaltsstoffs/e enthalten, wie Feststoffe, Körnchen oder gefriergetrocknete Zellen, und (c) Öl-in-Wasser-Emulsionen oder Wasser-in-Öl-Emulsionen bestehen. Tablettenformen können eines oder mehrere aus Lactose, Mannit, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Zellulose, Akaziengummi, Gelatine, kolloidales Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talk, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Arzneimittelträger, Farbstoffe, Verdünnungsmittel, Pufferstoffe, Befeuchtungsmittel, Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe und pharmakologisch verträgliche Träger umfassen. Lutschtabletten können den aktiven Wirkstoff in einem Geschmacksstoff wie z. B. Saccharose und Akaziengummi oder Tragant umfassen, während Pastillen den aktiven Wirkstoff in einer inerten Basis wie Gelatine oder Glycerin oder Saccharose und Akaziengummi enthalten kann. Geeignete Formulierungen für die orale oder rektale Verabreichung können auch in synthetische oder natürliche polymere Mikrokugeln oder in andere Mittel inkorporiert sein, die die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung vor dem Abbau innerhalb der Gastrointestinaltrakts schützen (siehe z. B. Wallace et al., Science 260, 912–915 (1993)). Formulierungen für die rektale oder vaginale Verabreichung können als ein Zäpfchen mit einer geeigneten wässrigen oder nicht wässrigen Basis vorliegen. Letztere kann z. B. Kakaobutter oder Salicylat umfassen. Darüber hinaus können für die vaginale Verabreichung geeignete Formulierungen als Pessare, Zäpfchen, Tampons, Cremen, Gele, Pasten, Schäume oder Sprays vorliegen, die zusätzlich zum aktiven Wirkstoff, wie z. B. gefriergetrocknete Lactobacilli, die gentechnisch verändert wurden, um direkt ein Cyanovirin oder Konjugat davon der vorliegenden Erfindung zu produzieren, Träger beinhalten, die auf dem Gebiet als geeignet bekannt sind. Ähnlich kann auch der aktive Wirkstoff mit einem Gleitmittel als Überzug auf einem Kondom kombiniert werden.
Die Cyanovirine, die Konjugate davon oder die Wirtszellen, die Cyanovirine oder Konjugate davon exprimieren, alleine oder in Kombination mit anderen antiviralen Verbindungen, können als Aerosolformulierungen hergestellt werden, die durch Inhalation verabreicht werden. Diese Aerosolformulierungen können in annehmbare unter Druck stehende Treibmittel, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen, gegeben werden.
Die Cyanovirine oder Konjugate davon können – allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Verbindungen oder Absorptionsmodulatoren – zu geeigneten Formulierungen für die dermale Anwendung und Absorption gemacht werden (Wallace et al. (1993), s. o.). Auch transdermale Elektroporation oder Iontophorese kann eingesetzt werden, um die systemische Abgabe der Verbindungen und/oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch die Haut zu fördern und/oder zu steuern (siehe z. B. Theiss et al., Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 13, 353–359 (1991)).
Für die topische Verabreichung geeignete Formulierungen schließen Cremen, Emulsionen, Gele und dergleichen ein, die zusätzlich zum aktiven Wirkstoff auf dem Gebiet bekannte Träger enthalten, sowie Mundwässer, die den aktiven Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
Für die parenterale Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wässrige und nicht wässrige, isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Substanzen enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des gewünschten Empfängers isotonisch machen, sowie wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen ein, die Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen können. Die Formulierungen können in versiegelten Einheitsdosen- oder Mehrfachdosenbehälter, wie Ampullen oder Phiolen, vorliegen und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der für die Injektion lediglich die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, wie z. B. Wasser, unmittelbar vor der Verwendung erfordert. Unvorbereitete Injektionslösungen und -suspensionen können aus sterilen Pulvern, Körnchen und Tabletten der vorhergehend beschriebenen Art hergestellt werden.
Formulierungen, die ein Cyanovirin oder Cyanovirin-Konjugat umfassen, das für die viruzide (z. B. gegen HIV) Sterilisation von unbelebten Gegenständen, wie medizinische Materialien oder Geräte, Laborausrüstung und -materialien, Instrumente, Vorrichtungen und dergleichen geeignet ist, kann z. B. durch einen Fachmann auf dem Gebiet aus einer beliebigen der vorhergehend erwähnten Zusammensetzungen oder Formulierungen ausgewählt oder geeignet angepasst werden. Das Cyanovirin oder Konjugat davon kann durch DNA-Rekombinationstechnologie oder durch chemisches Kuppeln eines Cyanovirins mit einem Effektormolekül wie oben beschrieben hergestellt werden. Vorzugsweise wird das Cyanovirin oder Konjugat davon durch DNA-Rekombinationstechnologie erzeugt. Ähnlich können auch Formulierungen aus Cyanovirinen und/oder Konjugaten davon, die sich für die viruzide Ex-vivo-Sterilisation von Blut, Blutprodukten, Sperma oder anderen Körperprodukten oder -geweben eignen, oder eine beliebige andere Lösung, Suspension, Emulsion oder ein beliebiges anderes Material, das einem Patienten im Zuge eines medizinischen Verfahrens verabreicht werden kann, von einem Fachmann auf dem Gebiet aus einer beliebigen der vorhergehend erwähnten Zusammensetzungen oder Formulierungen ausgewählt oder geeignet angepasst werden. Geeignete Formulierungen für derartige Ex-vivo-Anwendungen oder die viruzide Behandlung von unbelebten Objekten sind jedoch keineswegs auf eine beliebige der vorhergehend erwähnten Formulierungen oder Zusammensetzungen begrenzt. Für Fachleute auf dem Gebiet versteht es sich, dass eine geeignete oder passende Formulierung auf Basis der jeweils vorliegenden Anwendung ausgewählt, ausgebildet oder entwickelt werden kann.
Für die Verwendung ex vivo, wie z. B. viruzide Behandlungen von unbelebten Objekten oder Materialien, Blut oder Blutprodukten oder Geweben, sollte die einzusetzende Menge an Cyanovirin oder einem Konjugat oder einer Zusammensetzung davon ausreichen, um jegliche vorhandenen Viren oder Viren produzierenden Zellen nicht infektiös zu machen oder zu zerstören. Bei HIV würde dies z. B. erforderlich machen, dass das Virus und/oder die Viren produzierenden Zellen Cyanovirin-N-Konzentrationen im Bereich von 0,1–1000 nM ausgesetzt werden. Ähnliche Überlegungen gelten auch für In-vivo-Anwendungen. Der Ausdruck „antivirale wirksame Menge" oder „viruzid wirksame Menge" wird daher im Allgemeinen dazu verwendet, die Menge eines bestimmten Cyanovirins, Konjugats davon oder einer Zusammensetzung davon zu beschreiben, die für die antivirale Wirksamkeit bei einer beliebigen gegebenen Anwendung notwendig ist.
Bei der Verwendung in vivo sollte die Dosis eines Cyanovirins oder Konjugats davon, von Wirtszellen, die ein Cyanovirin oder Konjugat davon produzieren, oder einer Zusammensetzung davon, die einem tierischen Lebewesen, insbesondere einem Menschen, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, ausreichen, um über einen vernünftigen Zeitrahmen eine prophylaktische und/oder therapeutische Reaktion zu bewirken. Die zur Erreichung einer erwünschten viruziden Konzentration in vivo (z. B. 0,1–1000 nM) eingesetzte Dosis wird durch die Wirksamkeit des jeweiligen Cyanovirins oder Konjugats davon oder der Cyanovirin- und/oder Konjugatproduktion der verwendeten Wirtszellen, die Schwere der Erkrankung der infizierten Personen sowie bei der systemischen Verabreichung das Körpergewicht und Alter der infizierten Person bestimmt. Die wirksame oder viruzide Dosis hängt zudem vom Vorhandensein jeglicher nachteiliger Nebenwirkungen ab, die die Verabreichung des bestimmten verwendeten Cyanovirins, des Konjugats davon, der ein Cyanovirin oder Konjugat davon produzierenden Wirtszellen oder der Zusammensetzung davon begleiten können. Wann immer möglich ist es wünschenswert, die nachteiligen Nebenwirkungen minimal zu halten.
Die Dosierung kann in Einheitsdosisform wie z. B. Tablette oder Kapsel erfolgen. Der Begriff „Einheitsdosisform" bezieht sich in seiner Verwendung hierin auf physikalisch diskrete Einheiten, die sich als Einheitsdosierungen für Menschen und Tiere eignen, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge eines Cyanovirins, eines Konjugats davon oder ein Cyanovirin oder Konjugat davon produzierende Wirtszellen allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Wirkstoffen enthält, die als eine Menge berechnet worden ist, die ausreicht, um in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Vehikel die erwünschte Wirkung zu erzielen.
Die Spezifikationen für die Einheitsdosisformen der vorliegenden Erfindung hängen vom jeweiligen verwendeten Cyanovirin, Konjugat davon, den Wirtszellen oder der Zusammensetzung davon und der Wirkung, die erzielt werden soll, sowie der mit jedem Cyanovirin, Konjugat, Wirtszellen oder Zusammensetzung davon verbundenen Pharmakodynamik im behandelten tierischen Lebewesen ab. Die verabreichte Dosis sollte eine „antivirale wirksame Menge" oder „viruzid wirksame Menge" oder eine Menge sein, die notwendig ist, um ein „wirksames Virusabtötungsausmaß" im jeweiligen tierischen Lebewesen, z. B. dem menschlichen Patienten, zu erreichen.
Da das „wirksame Virusabtötungsausmaß" als bevorzugter Endpunkt für die Dosierung verwendet wird, können die eigentliche Dosis und Zeitplan je nach interindividuellen Unterschieden bei der Pharmakokinetik, Medikamentenverteilung und dem Metabolismus variieren. Das „wirksame Virusabtötungsausmaß" kann z. B. als der gewünschte Blut- oder Gewebeanteil (z. B. 0,1–1000 nM) des Patienten definiert sein, der einer Konzentration eines oder mehrerer Cyanovirine oder Konjugate davon entspricht, die einen Virus wie HIV-1 und/oder HIV-2 in einem Test, der bekannterweise die klinische antivirale Aktivität von chemischen Verbindungen und biologischen Wirkstoffen prognostiziert, hemmt. Das „wirksame Virusabtötungsausmaß" für Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung kann auch variieren, wenn das Cyanovirin, das Konjugat oder die Zusammensetzung davon in Kombination mit AZT oder anderen bekannten antiviralen Verbindungen oder Kombinationen davon verwendet wird.
Fachleute auf dem Gebiet können problemlos die geeignete Dosis, den Zeitplan und die Verabreichungsmethode für die exakte Formulierung der verwendeten Zusam mensetzung ermitteln, um das erwünschte „wirksame Virusabtötungsausmaß" im jeweiligen Patienten zu erzielen. Fachleute auf dem Gebiet können zudem durch eine direkte (z. B. analytische chemische Analyse) oder indirekte (z. B. mit Ersatzindikatoren wie p24 oder RT) Analyse der entsprechenden Patientenproben (z. B. Blut und/oder Gewebe) leicht einen geeigneten Indikator für die „Effektorkonzentration" der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bestimmen und verwenden.
Bei der Behandlung mancher virusinfizierter Personen kann es erwünscht sein, eine „Megadosis"-Behandlung zu verwenden, worin eine hohe Dosis eines ausgewählten Cyanovirins oder Konjugats davon verabreicht wird und das Medikament die Zeit danach wirken gelassen wird und anschließend der Person ein geeignetes Reagens verabreicht wird, um das Medikament zu inaktivieren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann andere Pharmazeutika in Verbindung mit dem Cyanovirin, dem Konjugat davon oder den ein Cyanovirin oder Konjugat davon produzierenden Wirtszellen enthalten, wenn es zur therapeutischen Behandlung einer Virusinfektion wie der, die AIDS hervorruft, eingesetzt wird. Repräsentative Beispiele dieser zusätzlichen Pharmazeutika schließen antivirale Verbindungen, Viruzide, Immunomodulatoren, Immunstimulanzien, Antibiotika und Absorptionsverstärker ein. Beispielhafte antivirale Verbindungen umfassen AZT, ddI, ddC, Glancylclovir, fluorierte Didesoxynucleoside, Non-Nucleosid-analoge Verbindungen wie Nevirapin (Shih et al., PNAS 88, 9878–9882 (1991)), TIBO-Derivate wie R82913 (White et al., Antiviral Res. 16, 257–266 (1991)), Michellamine (Boyd et al., J. Med. Chem. 37, 1740–1745 (1994)) und Calanolide (Kashman et al., J. Med. Chem. 35, 2735–2743 (1992)), Nonoxynol-9, Gossypol und Derivate sowie Gramicidin (Bourinbair et al. (1994), s. o.). Beispiele für Immunomodulatoren und Immunstimulanzien schließen verschiedene Interleukine, sCD4, Cytokine, Antikörper-Präparate, Bluttransfusionen und Zelltransfusionen ein. Beispielhafte Antibiotika beinhalten Antipilzmittel, antibakterielle Mittel und Anti-Pneumocystitis-carnii-Mittel. Beispielhafte Absorptionsverstärker schließen Gallensalze und andere Tenside, Saponine, Cyclodextrine und Phospholipide ein (Davis (1992), s. o.).
Die Verabreichung eines Cyanovirins oder Konjugats davon mit antiretroviralen Wirkstoffen und insbesondere mit bekannten RT-Hemmstoffen wie ddC, AZT, ddI, ddA oder anderen Inhibitoren, die gegen andere HIV-Proteine wirken, wie z. B. Anti-TAT-Mittel, soll die meisten oder sämtliche Replikationsstufen des viralen Lebenszyklus hemmen. Die bei AIDS- oder ARC-Patienten verwendeten ddC- und AZT-Dosierungen sind veröffentlicht worden. Der virostatische Bereich von ddC liegt im Allgemeinen zwischen 0,05 μM bis 1,0 μM. Ein Bereich von etwa 0,005–0,25 mg/kg Körpergewicht ist bei den meisten Patienten virostatisch. Die vorläufigen Dosierungsbereiche für die orale Verabreichung sind etwas breiter gefasst, z. B. 0,001 bis 0,25 mg/kg verabreicht in einer oder mehreren Dosen in Intervallen von 2, 4, 6, 8, 12 etc. Stunden. Derzeit werden 0,01 mg/kg Körpergewicht an ddC, verabreicht alle 8 h, bevorzugt. Bei der Verabreichung in einer kombinierten Therapie kann die antivirale Verbindung z. B. gleichzeitig mit dem Cyanovirin oder Konjugat davon verabreicht werden, oder die Dosierung kann wie erwünscht gestaffelt erfolgen. Die unterschiedlichen Medikamente können auch in einer Zusammensetzung kombiniert sein. Die Dosen können bei der Verwendung in Kombination jeweils geringer sein, als wenn sie alleine verwendet werden.
Für Fachleute auf dem Gebiet versteht es sich ebenfalls, dass eine DNA-Sequenz eines Cyanovirins oder Konjugats davon der vorliegenden Erfindung ex vivo in Säugetierzellen, die vorher aus einem bestimmten tierischen Lebewesen, insbesondere einem Menschen, entnommen worden sind, insertiert werden. Derartige transformierte autologe oder homologe Wirtszellen, die wieder in das Tier oder den Menschen eingeführt worden sind, werden das entsprechende Cyanovirin oder Konjugat in vivo direkt exprimieren. Die Durchführbarkeit einer solchen therapeutischen Methode, eine therapeutische Menge eines Wirkstoffs in unmittelbarer Nähe der erwünschten Zielzellen und Pathogene (z. B. des Virus, genauer gesagt des Retrovirus, insbesondere des HIV und dessen Hüllglycoprotein gp120) abzugeben, ist in Untersuchungen mit Zellen, die ex vivo verändert wurden, um sCD4 zu exprimieren, gezeigt worden (Morgan et al. (1994), s. o.). Als eine Alternative zur Ex-vivo-Insertion der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können die Sequenzen in vivo direkt, z. B. mittels eines entsprechenden viralen oder eines anderen geeigneten Vektors, in Zellen insertiert werden. Diese in vivo transfizierten Zellen produzieren erwartungsgemäß in vivo direkt antivirale Mengen von Cyanovirin oder einem Konjugat davon. Beispiel 9 veranschaulicht die Transformation und Expression eines Cyanovirins durch eine Säugetierzelle.
Angesichts der vorliegenden Offenbarung versteht es sich zudem, dass eine einem Cyanovirin oder Konjugat davon entsprechende DNA-Sequenz auch in geeignete Nicht-Säugetier-Wirtszellen insertiert werden kann und dass diese Wirtszellen therapeutische oder prophylaktische Mengen eines Cyanovirins oder Konjugats davon innerhalb eines erwünschten Körperteils eines tierischen Lebewesens, insbesondere eines Menschen, direkt in vivo exprimieren werden. Beispiel 3 veranschaulicht die Transformation und Expression wirksamer viruzider Mengen eines Cyanovirins in einer Nicht-Säugetier-Zelle, genauer gesagt einer Bakterienzelle. Beispiel 10 veranschaulicht die Transformation und Expression eines Cyanovirins in einer Nicht-Säugetier-Zelle, insbesondere einer Hefezelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur durch die Frau steuerbaren Prophylaxe gegen HIV-Infektionen die intravaginale Verabreichung und/oder Ansiedlung einer persistenten intravaginalen Population von Lactobacilli in einer Frau, die mit einer Kodierungssequenz der vorliegenden Erfindung transformiert worden sind, um über einen verlängerten Zeitraum wirksame viruzide Mengen eines Cyanovirins oder Konjugats davon direkt auf oder innerhalb der vaginalen und/oder cervicalen und/oder uterinen Schleimhaut zu erzeugen. Es ist bemerkenswert, dass sowohl die Weltgesundheitsorganisation (WHO) als auch das U. S. National Institute of Allergy and Infectious Diseases die Notwendigkeit der Entwicklung von durch die Frau steuerbaren topischen Mikrobiziden, die sich zum Blockieren der Übertragung von HIV eignen, als eine wichtige globale Priorität angeführt haben (Lange et al., Lancet 341, 1356 (1993); Fauci, NIAID News, 27. April 1995).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper bereit, die gegen Proteine der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen das jewei lige vorliegende Protein ist von großem Vorteil, da dadurch die Basis für eine große Vielfalt an qualitativen und quantitativen analytischen Verfahren, Trennungs- und Reinigungsverfahren sowie anderen nützlichen auf das vorliegende Protein abgezielten Anwendungen bereitgestellt wird. Dementsprechend ist es angesichts der vorliegenden Offenbarung und der Proteine der vorliegenden Erfindung für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich, dass Antikörper, insbesondere Antikörper, die speziell an ein Protein der vorliegenden Erfindung binden, mittels weithin bekannter Verfahren hergestellt werden können (z. B. die von Harlow und Lane, in: Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, S. 1–725 (1988), detailliert beschriebenen Verfahren). Diese Antikörper können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper umfassen. Zudem können die Antikörper entweder in Lösungsphase oder an eine erwünschte Festphasenmatrix gekuppelt erhalten und verwendet werden. Da solche Antikörper, wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, zur Verfügung stehen, versteht es sich für Fachleute auf dem Gebiet, dass diese Antikörper in Verbindung mit weitverbreiteten Verfahren (z. B. wie von Harlow und Lane (1988, s. o.) beschrieben) nützliche Methoden für die Detektion, Quantifizierung oder Reinigung eines Cyanovirins, eines Konjugats davon oder von Wirtszellen, die für die Herstellung eines Cyanovirins oder Konjugats davon transformiert wurden, umfassen. Beispiel 11 veranschaulicht weiters einen Antikörper, der speziell an ein Cyanovirin bindet.
Die Nucleinsäuresequenzen, Cyanovirine, Konjugate, Wirtszellen, Antikörper, Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden in Zusammenhang mit den folgenden Beispielen näher beschrieben. Die Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht eingrenzen.
Beispiel 1
Dieses Beispiel stellt die Biotest-geleitete Anti-HIV-Isolierung und Aufklärung von reinem Cyanovirin aus wässrigen Extrakten des kultivierten Cyanobakteriums Nostoc ellipsosporum detailliert dar.
Das in Weislow et al. (1989, s. o.) beschriebene Verfahren wurde herangezogen, um den Isolierungs- und Reinigungsvorgang zu überwachen und zu steuern. Cyanobakterielle Kulturbedingungen, Medien und Klassifizierung entsprachen den vorhergehend beschriebenen (Patterson, J. Phycol. 27, 530–536 (1991)). Kurz gesagt wurde die Zellmasse eines artreinen Algenstamms an Nostoc ellipsosporum (Kultur Q68D170) durch Filtration geerntet, gefriergetrocknet und mit MeOH-CH₂Cl₂ (1 : 1) gefolgt von H₂O extrahiert. Der Biotest zeigte an, dass lediglich der H₂O-Extrakt die HIV-Hemmeigenschaft aufwies. Eine Lösung des wässrigen Extrakts (30 mg/ml) wurde durch die Zugabe eines gleich großen Volumens an Ethanol (EtOH) behandelt. Die resultierende 1 : 1-H₂O-EtOH-Lösung wurde 15 h lang bei –20°C gehalten. Dann wurde die Lösung zentrifugiert, um die gefällten Materialien (vermutlich hochmolekulare Biopolymere) zu entfernen. Der resultierende HIV-hemmende Überstand wurde eingedampft, durch Umkehrphasen-Vakuum-Flüssigkeitschromatographie (Coll et al., J. Nat. Prod. 49, 934–936 (1986); Pelletier et al., J. Nat. Prod. 49, 892–900 (1986)) an Weitporen-C₄-Packung (300 Å, BakerBond WP-C₄) fraktioniert und mit steigenden Konzentrationen von Methanol (MeOH) in H₂O eluiert. Die Anti-HIV-Aktivität konzentrierte sich im mit MeOH-H₂O (2 : 1) eluierten Material. Eine SDS-PAGE-Analyse dieser Fraktion zeigte eine Hauptproteinbande mit einer relativen Molmasse (Mr) von etwa 10 kDa. Die Endreinigung wurde durch wiederholte Umkehrphasen-HPLC an μBondapak-C₁₈-Säulen (1,9 × 15 cm) (Waters Associates), die mit einem Gradienten einer ansteigenden Konzentration von Acetonitril in H₂O eluiert wurden, durchgeführt. Die mobile Phase enthielt 0,05 Vol.-% TFA, pH = 2. Eluierte Proteine wurden durch UV-Absorption bei 206, 280 und 294 nm mit einem spektralen Schnelldetektor (Pharmacia LKB Modell 2140) detektiert. Einzelne Fraktionen wurden gesammelt, auf Basis des UV-Chromatogramms vereinigt und lyophilisiert. Die gepoolten HPLC-Fraktionen wurden unter Reduktionsbedingungen einer SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227, 680–685 (1970)), einer herkömmlichen Aminosäureanalyse unterzogen und auf Anti-HIV-Aktivität untersucht.
1A ist eine graphische Darstellung der OD (206 nm) gegenüber der Zeit (min), die das μBondapak-C₁₈-HPLC-Chromatogramm des nicht reduzierten, mit einem li nearen CH₃CN/H₂O-Gradienten (gepuffert mit 0,05% TFA) von 28–38% CH₃CN eluierten Cyanovirins zeigt. 1D ist eine graphische Darstellung der OD (206 nm) gegenüber der Zeit (min), die das Chromatogramm von Cyanovirin zeigt, das zuerst mit β-Mercaptoethanol reduziert und dann unter identen HPLC-Bedingungen getrennt wurde. Die HPLC-Fraktionen der zwei Durchläufe wurden wie angedeutet gesammelt. 10-%-Aliquoten jeder Fraktion wurden lyophilisiert, in 100 μl 3 : 1 H₂O/DMSO hergestellt und im XTT-Test auf Anti-HIV-Aktivität untersucht. 1B ist ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegenüber der HPLC-Fraktion, das die maximale Verdünnung jeder Fraktion darstellt, die einen 50%igen Schutz vor den zytopathischen Auswirkungen der HIV-Infektion bei den nicht reduzierten Cyanovirin-HPLC-Fraktionen bereitstellte. Entsprechende Anti-HIV-Ergebnisse für die HPLC-Fraktionen von reduziertem Cyanovirin sind in 1E dargestellt, welche ein Balkendiagramm der maximalen Verdünnung für einen 50%igen Schutz gegenüber der HPLC-Fraktion ist. 20-%-Aliquoten ausgewählter HPLC-Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse der nicht reduzierten HPLC-Fraktionen sind in 1C dargestellt, und die der reduzierten HPLC-Fraktionen werden in 1F gezeigt.
Bei der anfänglichen HPLC-Trennung mittels eines linearen Gradienten von 30–50 CH₃CN coeluierte die Anti-HIV-Wirksamkeit mit dem UV-Absorptions-Hauptpeak bei etwa 33% CH₃CN. Dem aktiven Peak entsprechende Fraktionen wurden vereinigt und in zwei Aliquoten aufgeteilt.
Die Reinjektion der ersten Aliquote unter ähnlichen HPLC-Bedingungen, jedoch mit einem linearen Gradienten von 28–38% CH₃CN löste das aktive Material in zwei nahe beieinander eluierende Peaks bei 33,4 und 34,0% CH₃CN auf. Das Anti-HIV-Wirksamkeitsprofil der während dieses HPLC-Durchlaufs gesammelten Fraktionen (wie in 1B dargestellt) stimmten mit den zwei UV-Peaks (wie in 1A gezeigt) überein. SDS-PAGE der unter den einzelnen Peaks gesammelten Fraktionen zeigte lediglich eine einzelne Proteinbande (wie in 1C ersichtlich).
Die zweite Aliquote der ursprünglichen HPLC-Trennung wurde vor der Reinjektion in die HPLC mit β-Mercaptoethanol reduziert. Unter Verwendung eines identen 28–38 Gradienten ergab das reduzierte Material nur einen Hauptpeak (wie in 1D gezeigt), der später im Durchlauf mit 36,8% CH₃CN eluierte. In den HPLC-Fraktionen des reduzierten Materials wurde nur eine Spur von Anti-HIV-Wirksamkeit detektiert (wie in 1E ersichtlich ist).
Die zwei eng beieinander eluierenden HPLC-Peaks des nicht reduzierten Materials (1A) ergaben lediglich eine idente Bande bei der SDS-PAGE (unter Reduktionsbedingungen durchgeführt) (1C), und die Reduktion mit β-Mercaptoethanol resultierte in einem HPLC-Peak mit einer längeren Retentionszeit als beide der nicht reduzierten Peaks (1F). Dies deutete darauf hin, dass Disulfide im nativen Protein vorhanden waren. Die Aminosäureanalyse der beiden aktiven Peaks zeigte, dass sie beinahe idente Zusammensetzungen aufwiesen. Es ist möglich, dass die beiden HPLC-Peaks aus Cis-Trans-Isomerie um einen Prolinrest oder aus der Mikroheterogenität in der Proteinprobe, die weder in der Aminosäureanalyse noch während der Sequenzierung detektiert worden war, resultierten. Das gesammelte Material der zwei HIV-hemmenden Peaks wurde für weitere Analysen kombiniert und mit Cyanovirin-N benannt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese von Cyanovirin-Genen.
Die chemisch abgeleitete Aminosäuresequenz von Cyanovirin-N wurde zurück translatiert, um eine DNA-Kodierungssequenz zu erhalten. Um die anfängliche Produktion und Reinigung des rekombinanten Cyanovirin-N zu ermöglichen, wurde ein im Handel erhältlicher Expressionsvektor (pFLAG-1 von International Biotechnologies Inc., New Haven, CT), für den Reagenzien für die Affinitätsreinigung und Detektion erhältlich waren, ausgewählt. Geeignete Restriktionsstellen für die Ligation an pFLAG-1 sowie ein Stoppcodon wurden in die DNA-Sequenz integriert. 2 ist ein Beispiel einer DNA-Sequenz, die für ein synthetisches Cyanovirin-Gen kodiert. Diese DNA-Sequenzform kuppelt die für Cyanovirin-N kodierende Region an Codone für ein „FLAG"-Octapeptid am N-Terminus von Cyanovirin, wodurch die Herstellung eines FLAG-Cyanovirin-Fusionsproteins ermöglicht wird.
Ein Ablaufdiagramm für die Synthese dieser DNA-Sequenz sieht wie folgt aus:
Die DNA-Sequenz wurde als 13 überlappende, komplementäre Oligonucleotide synthetisiert und zusammengefügt, um die doppelsträngige Kodierungssequenz auszubilden. Oligonucleotidelemente der synthetischen DNA-Kodierungssequenz wurden mittels einem Zweisäulen-Nucleinsäuresynthesegerät (Modell 392, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) synthetisiert. Die fertigen Oligonucleotide wurden von den Säulen abgespalten und durch Inkubation in konzentriertem Ammoniumhydroxid über Nacht bei 56°C entschützt. Vor der Behandlung mit T4-Polynucleotidkinase wurden 33- bis 66-Mere einer Tropfdialyse gegen destilliertes Wasser unterzogen. Die 13 Oligonucleotidpräparate wurden einzeln durch HPLC gereinigt, und 10-nmol-Mengen von jedem wurden mit T4-DNA-Ligase zu einer doppelsträngigen 327-bp-DNA-Sequenz ligiert. Die DNA wurde durch Phenol : Chloroform-Extraktion, Ethanol-Fällung und einer weiteren Waschung mit Ethanol aus dem Reaktionspuffer wiedergewonnen und gereinigt. Die einzelnen Oligonucleotid-Präparate wurden vereinigt und 10 min lang gesiedet, um eine Denaturierung sicherzustellen. Die Temperatur des Gemisches wurde dann auf 70°C abgesenkt, um die Komplementärstränge zu anellieren. Nach 20 min wurde die Röhre auf Eis gekühlt, und 2000 Einheiten an T4-DNA-Ligase wurden zusammen mit einem zusätzlichen Ligase-Puffer zugesetzt. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16°C. Die DNA wurde rückgewonnen und durch Phenol : Chloroform-Extraktion, Ethanol-Fällung sowie Waschung vom Ligationsreaktionsgemisch gereinigt.
Die gereinigte doppelsträngige synthetische DNA wurde dann in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Matrize verwendet. Ein μl der DNA-Lösung, die nach der Reinigung des Ligationsreaktionsgemisches erhalten worden war, wurde als eine Matrize verwendet. Mittels eines Perkin-Elmer-Geräts wurde eine Temperaturwechselbeanspruchung durchgeführt. Thermostabile „Vent"-DNA-Polymerase, Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase und Polynucleotidkinase wurden von New England Bio labs (Beverly, MA) bezogen. Für diese Anwendung wurde Vent-Polymerase ausgewählt, da diese im Vergleich zum normalen Taq-Enzym eine höhere Präzision aufweisen soll. Das PCR-Reaktionsprodukt wurde auf einem 2%igen Agarosegel in TBE-Puffer laufen gelassen. Das 327-bp-Konstrukt wurde dann aus dem Gel ausgeschnitten und durch Elektroelution gereinigt. Da sich dieses als relativ resistent gegenüber dem Verdau mit Hind-III- und Xho-I-Restriktionsenzymen erwiesen hatte, wurde es zuerst unter Verwendung des pCR-Script-Systems (Stratagene) kloniert. Der Verdau eines Plasmidpräparats aus einem dieser Klone lieferte die Kodierungssequenz, die dann in die Mehrfachklonierungsstelle des pFLAG-1-Vektors ligiert wurde.
E. coli wurden mit dem pFLAG-Konstrukt transformiert, und rekombinante Klone wurden durch Analyse der Restriktionsverdaue der Plasmid-DNA identifiziert. Die Sequenzanalyse eines dieser ausgewählten Klone zeigte, dass vier Basen von der angestrebten Kodierungssequenz abwichen. Dies beinhaltete die Deletion von drei Basen, die für einen von vier im Protein enthaltenen Cysteinresten kodieren sowie eine Abänderung der dritten Base im vorangehenden Codon (angezeigt durch die Kästchen in 2). Um diese „Mutationen" zu korrigieren, die vermutlich während der PCR-Amplifikation der synthetischen Matrize entstanden waren, wurde ein doppelsträngiger „Flicken" synthetisiert, der in die die Mutationen flankierenden Restriktionsstellen ligiert werden konnte (diese Bst-XI- und Espl-Stellen sind ebenfalls in 2 gezeigt). Der Flicken wurde eingesetzt, und die Reparatur wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
Zur Herstellung einer DNA-Sequenz, die für natives Cyanovirin kodiert, wurde das vorher erwähnte FLAG-Cyanovirinkonstrukt einer ortsgerichteten Mutagenese unterzogen, um die Codone für das FLAG-Octapeptid und gleichzeitig auch eine einzigartige Hind-III-Restriktionsstelle zu eliminieren. Dieser Vorgang ist in 3 dargestellt, die ein ortsgerichtetes Mutagenesemanöver zeigt, das zur Eliminierung von Codonen für ein FLAG-Octapeptid und eine Hind-III-Restriktionsstelle aus der Sequenz von 2 verwendet wird. Ein mutagener Oligonucleotid-Primer wurde synthetisiert, der Abschnitte des Codons für das sekretorische Omp-Peptid und Cyano virin enthielt, jedoch keine Codone für das FLAG-Peptid aufwies. Das Anellieren dieses mutagenen Primers mit der Bildung einer DNA-Haarnadel im Matrizenstrang und die Verlängerung durch DNA-Polymerase führte zur Erzeugung einer neuen Plasmid-DNA, die weder die FLAG-Codonsequenz noch die Hind-III-Stelle aufwies (siehe 2 für Details). Der Verdau der Plasmid-DNA mit Hind-III führte zur Linearisierung von „Wildtyp"-Strängen, jedoch nicht von „mutierten" Strängen. Da die Transformation von E. coli mit ringförmiger DNA wirksamer erfolgt, konnten problemlos Klone ausgewählt werden, die die überarbeitete Kodierungssequenz aufwiesen, welche die Produktion von nativem Cyanovirin-N direkt hinter dem sekretorischen Omp-Peptid spezifizierte. DNA-Sequenzierung bestätigte das Vorhandensein der erwünschten Sequenz. Ortsgerichtete Mutagenesereaktionen wurden mittels Materialien (Polymerase, Puffer etc.) durchgeführt, die von Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ) bezogen wurden.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Expression von synthetischen Cyanovirin-Genen, wie das folgende Ablaufdiagramm zeigt:
E. coli (Stamm DH5α) wurde (durch Elektroporation) mit dem pFLAG-1-Vektor transformiert, welcher die Kodierungssequenz für das FLAG-Cyanovirin-N-Fusionsprotein enthält (siehe 2 für Details bezüglich der DNA-Sequenz). Ausgewählte Klone wurden in Kleinschüttelflaschen mit (LB) Wachstumsmedium mit 100 μg/ml Ampicillin eingeimpft und durch Inkubation bei 37°C vermehrt. Anschließend wurden größere Erlenmeyerkolben (0,5–3,0 I) befüllt und bis zu einer Dichte von 0,5–0,7 OD₆₀₀-Einheiten wachsen gelassen. Die Expression des FLAG-Cyanovirin-N-Fusionsproteins wurde dann durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1,7 mM und fortgesetzter Inkubation bei 30°C für 3–6 h herbeigeführt. Zum Ernten der periplasmatischen Proteine wurden Bakterien pelletiert, gewaschen und dann durch Behandlung mit Saccharose osmotisch geschockt, gefolgt von Resuspension in destilliertem Wasser. Periplasmatische Proteine wurden durch Sedimentieren der Bakterien und anschließendem Filtrieren des wässrigen Überstands durch Whatman-Papier erhalten. Die periplasmatischen Rohextrakte zeigten bei Western-Blotting oder Dot-Blotting sowohl Anti-HIV-Aktivität als auch das Vorhandensein eines FLAG-Cyanovirin-N-Fusionsproteins.
Das in Beispiel 2 beschriebene Konstrukt für natives Cyanovirin-N wurde dazu verwendet, Bakterien auf dieselbe Art wie oben für das FLAG-Cyanovirin-N-Fusionspro tein beschrieben zu transformieren. Das Klonieren, Vermehren, Induzieren mit IPTG und Ernten wurde auf ähnliche Art und Weise durchgeführt. Periplasmatische Rohextrakte zeigten im Biotest eine starke Anti-HIV-Wirksamkeit.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Reinigung rekombinanter Cyanovirin-Proteine.
Unter Verwendung einer Affinitätssäule auf Basis eines monoklonalen Anti-FLAG-Antikörpers (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT) konnte das FLAG-Cyanovirin-N-Fusionsprotein wie folgt gereinigt werden:
Der jeweilige periplasmatische Extrakt, der wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde, wurde auf 2–20 ml Schwerkraftsäulen mit einer Affinitätsmatrix geladen und umfassend mit CA⁺⁺ enthaltendem PBS gewaschen, um verschmutzende Proteine zu entfernen. Da die Bindung des FLAG-Peptids an den Antikörper Ca⁺⁺-abhängig ist, konnte das Fusionsprotein durch Durchlaufen von EDTA durch die Säule eluiert werden. Säulenfraktionen und Waschvolumina wurden durch Dot-Blot-Analyse unter Verwendung desselben Anti-FLAG-Antikörpers überwacht. Fusionsprotein enthaltende Fraktionen wurden nun vereinigt, extensiv gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.
Zur Reinigung des rekombinaten nativen Cyanovirin-N wurde der entsprechende periplasmatische Extrakt aus Beispiel 3 einer Umkehrphasen-Vakuum-Flüssigkeits-C₄-Chromatographie mit Stufen-Gradienten unterzogen, um drei Fraktionen zu erhalten: (1) eluiert mit 100% H₂O, (2) eluiert mit MeOH-H₂O (2 : 1) und (3) eluiert mit 100 MeOH. Die Anti-HIV-Wirksamkeit konzentrierte sich in Fraktion (2). Die Reinigung des rekombinanten Cyanovirin-N wurde durch HPLC auf einer μBondapak-C₁₈-Säule (1,9 × 15 cm) (Waters Associates), eluiert mit einem Gradienten mit steigender CH₃CN-Konzentration in H₂O (0,05 Vol.-% TFA in der mobilen Phase), durchgeführt. Ein Chromatogramm der HPLC-Endreinigung auf einer C₄-Säule (1 × 10 cm) (Cohensive Technologies Inc.), kontrolliert bei 280 nm, ist in 4 gezeigt, was ein typisches HPLC-Chromatogramm während der Reinigung eines rekombinanten nativen Cyanovirins ist. Die Gradientenelution, 5 ml/min, von 100% H₂O bis H₂O-CH₃CN (7 : 3) wurde 23 min lang mit 0,05 Vol.-% TFA in der mobilen Phase durchgeführt.
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die Anti-HIV-Wirksamkeit von natürlichem und rekombinantem Cyanovirin-N und FLAG-Cyanovirin-N.
Reine Proteine wurden anfangs unter Verwendung eines vorher beschriebenen XTT-Tetrazolium-Anti-HIV-Tests auf ihre antivirale Wirksamkeit untersucht (Boyd, in: AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention (1988), s. o.; Gustafson et al., J. Med. Chem. 35, 1978–1986 (1992); Weislow (1989), s. o.; Gulakowski (1991), s. o.). Die in sämtlichen Tests verwendete menschliche lymphozytische CEM-SS-Zielzelllinie wurde in einem RPMI-1650-Medium (Gibco, Grand Island, NY) ohne Phenolrot gehalten und mit 5% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamicin (Vollmedium) ergänzt.
Exponentiell wachsende Zellen wurden pelletiert und in einer Konzentration von 2,0 × 10⁵ Zellen/ml in das Vollmedium resuspendiert. Die haitianische Variante von HIV, HTLV-III_RF (3,54 × 10⁶ SFU/ml) wurde den ganzen Versuch hindurch verwendet. Gefrorene Virus-Vorratslösungen wurden unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut und in das Vollmedium resuspendiert, um 1,2 × 12⁵ SFU/ml zu ernten. Die geeigneten Mengen des reinen Proteins wurden für Anti-HIV-Bewertungen in H₂O-DMSO (3 : 1) aufgelöst und dann im Vollmedium zur erwünschten Anfangskonzentration verdünnt. Sämtliche Medikamentreihenverdünnungen, Reagenszugaben und Platte-Platte-Transfers wurden mit einer automatischen Biomek-1000-Workstation (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) durchgeführt.
Die 5A–5C sind graphische Darstellungen der% Kontrolle gegenüber der Konzentration (nM), die die antivirale Wirksamkeit von nativem Cyanovirin aus Nostoc ellipsosporum (A), rekombinantem nativem (B) und rekombinantem FLAG-Fusions-Cyanovirinen veranschaulichen. Die Graphen zeigen die Wirkung einer Reihe von Konzentrationen der jeweiligen Cyanovirine auf mit HIV-1 (•) infizierte CEM-SS-Zellen, wie nach 6 Tagen in der Kultur ermittelt wurde. Die Datenpunkte zeigen den Prozentsatz der jeweiligen nicht infizierten, nicht mit Medikament behandelten Kontrollwerte. Alle drei Cyanovirine zeigten eine starke Anti-HIV-Wirksamkeit mit einem EC₅₀ im unteren Nanomol-Bereich und keinen signifikanten Beweis direkter Zytotoxizität auf die Wirtszellen bei den höchsten getesteten Konzentrationen (bis zu 1,2 μM).
Als ein Beispiel für einen weiteren Beweis der Anti-HIV-Wirksamkeit von reinem Cyanovirin-N wurde eine Reihe von zusammenhängenden Anti-HIV-Tests unter Verwendung anderweitig im Detail beschriebenen Verfahren (Gulakowski (1991), s. o.) in den einzelnen Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Vorgangsweise war kurz gesagt die folgende: Cyanovirin-Lösungen wurden in Vollmedium reihenverdünnt und zu 96-Well-Testplatten zugesetzt. Nicht infizierte CEM-SS-Zellen wurden in einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen in 50 μl Vollmedium ausplattiert. Dann wurde verdünntes HIV-1 in einem Volumen von 50 μl zu den jeweiligen Wells zugegeben, um eine Infektionsmultiplizität von 0,6 zu erhalten. Entsprechende Zell-, Virus- und Me dikament-Kontrollen wurden in jedes Experiment integriert. Das endgültige Volumen in jedem Mikrotiterwell betrug 200 μl. Für virusinfizierte Zellen wurden Vierfachwells verwendet. Die Platten wurden bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ 4, 5 oder 6 Tage lang inkubiert.
Anschließend wurden mittels Biomek Aliquoten an zellfreiem Überstand aus jedem Well entnommen und wie beschrieben (Gulakowski (1991), s. o.) auf ihre Reverse-Transkriptase-Aktivität, p24-Antigen-Produktion und Synthese von infektiösen Virionen untersucht. Mittels XTT- (Weislow et al. (1989), s. o.), BCECF- (Rink et al., J. Cell Biol. 95, 189–196 (1982)) und DAPI-Tests (McCaffrey et al., In vitro Cell Develop. Biol. 24, 247–252 (1988)) wie beschrieben (Gulakowski et al. (1991), s. o.) wurde das Zellwachstum oder die Lebensfähigkeit anhand des restlichen Inhalts jedes Well beurteilt. Um die graphische Darstellung und Vergleiche der Daten zu erleichtern, wurden die einzelnen Testergebnisse (mit zumindest jeweils vier Werten) gemittelt, und die Mittelwerte wurden zur Berechnung der Prozentsätze in Bezug auf die jeweiligen Kontrollen verwendet. Die Standardfehler der bei diesen Berechnungen verwendeten Mittelwerten lagen üblicherweise bei weniger als 10% der entsprechenden Mittelwerte.
Die 6A–6D sind graphische Darstellungen der % Kontrolle gegenüber der Konzentration (nM), die die Anti-HIV-Wirksamkeit von einem Cyanovirin in einem Mehrfachparameter-Testformat veranschaulichen. Die Graphen 6A, 6B und 6C zeigen die Wirkungen eines Bereichs an Cyanovirin-Konzentrationen auf nicht infizierte CEM-SS-Zellen (O) und auf mit HIV-1 infizierte CEM-SS-Zellen (•), wie nach 6 Tagen in der Kultur ermittelt wurde. Der Graph 6A zeigt die relative Anzahl lebensfähiger CEM-SS-Zellen, wie sie durch den BCECF-Test ermittelt wurde. Graph 6B stellt den relativen DNA-Gehalt der jeweiligen Kultur dar. Der Graph 6C zeigt die relative Anzahl an lebensfähigen CEM-SS-Zellen, wie sie durch den XTT-Test ermittelt wurde. Der Graph 6D zeigt die Auswirkungen einer Reihe von Cyanovirin-Konzentrationen auf die Indikatoren von infektiösen Viren oder viraler Replikation, wie sie nach 4 Tagen in der Kultur ermittelt wurden. Diese Indikatoren schließen virale reverse Tran skriptase (
), virales Kapsidprotein p24 (♦) und Synzytium-bildende Einheiten (
) ein. In den Graphen 6A, 6B und 6C sind die Daten als Prozentsatz der nicht infizierten, nicht medikamentbehandelten Kontrollwerte dargestellt. In graph 6D sind die Daten als Prozentsatz der infizierten, nicht medikamentös behandelten Kontrollwerte dargestellt.
Wie in 6 gezeigt wird, konnte Cyanovirin-N die zytopathischen Wirkungen von HIV-1 auf menschliche lymphoblastische CEM-SS-Zielzellen in vitro vollständig hemmen. Direkte Zytotoxizität des Proteins auf die Zielzellen konnte bei den höchsten getesteten Konzentrationen nicht beobachtet werden. Cyanovirin-N hemmte auch bemerkenswert die Produktion von RT, p24 und SFU in HIV-1 infizierten CEM-SS-Zellen in denselben wirksamen Hemmkonzentrationen, was darauf hindeutet, dass das Protein die virale Replikation stoppte.
Die Anti-HIV-Wirksamkeit des Cyanovirins ist äußerst widerstandsfähig gegen raue Umweltbedingungen. Ungepufferte Cyanovirin-N-Lösungen hielten z. B. wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen oder der Auflösung in organischen Lösungsmitteln (bis zu 100 % DMSO, MeOH oder CH₃CN) ohne Verlust ihrer Wirksamkeit stand. Cyanovirin-N tolerierte Tenside (0,1% SDS), hohe Salzkonzentration (6 M Guanidin-HCl) und Wärmebehandlung (Sieden, 10 min lang in H₂O) ohne wesentlichen Verlust der HIV-Hemmwirkung. Die Reduktion der Disulfide mit β-Mercaptoethanol, unmittelbar gefolgt von C₁₈-HPLC-Reinigung, verringerte die zytoprotektive Wirkung von Cyanovirin-N. Lösungen aus reduziertem Cyanovirin-N erlangten jedoch ihre Anti-HIV-Hemmwirkung im Zuge längerer Lagerung wieder. Wenn Cyanovirin-N reduziert wurde (β-Mercaptoethanol, 6 M Guanidin-HCl, pH 8,0), jedoch keiner C₁₈-HPLC unterzogen wurde, sondern stattdessen einfach entsalzt, wiederhergestellt und analysiert wurde, erlangte es beinahe seine vollständige Wirksamkeit wieder.
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass das virale HIV-Hüllprotein gp120 ein molekulares Hauptziel von Cyanovirin-N ist.
Anfängliche Versuche unter Verwendung des XTT-Tetrazolium-Tests (Weislow et al. (1989), s. o.) zeigten, dass mit Cyanovirin (10 nM, 1 h) vorinkubierte Wirtszellen, die anschließend zentrifugiert wurden, bis sie frei von Cyanovirin-N waren, eine normale Anfälligkeit für eine HIV-Infektion aufwiesen. Im Gegensatz dazu war die Infektiosität von konzentriertem, ähnlich vorbehandeltem Virus, der dann verdünnt wurde, um nicht hemmende Konzentrationen von Cyanovirin-N zu erhalten, im Wesentlichen aufgehoben. Dies deutete darauf hin, dass Cyanovirin-N direkt auf das Virus selbst, d. h. als ein direkter „viruzider" Wirkstoff wirkte, um die virale Infektiosität bereits vor dem Eindringen in die Wirtszellen zu verhindern. Dieses Ergebnis wurde auch durch Additionszeitpunkt-Versuche bestätigt, in denen ebenfalls XTT-Tetrazolium-Tests verwendet wurden (Weislow et al. (1989), s. o.), die zeigten, dass Cyanovirin-N für eine maximale antivirale Wirksamkeit vor oder so schnell wie möglich nach der Zugabe von Viren zu den Zellen zugesetzt werden musste, wie in 7 – der graphischen Darstellung der % nicht infizierter Kontrolle gegenüber der Additionszeit (h) – dargestellt ist, in der die Ergebnisse von Additionszeitpunkt-Studien gezeigt werden, die die Anti-HIV-Wirksamkeit in mit HIV-1_RF infizierten CEM-SS-Zellen veranschaulichen. Die Zugabe von Cyanovirin (•) oder ddC
(Konzentrationen von 10 nM bzw. 5 μM) nach der anfänglichen Inkubation wurde verschieden lange hinausgezögert, wobei anschließend eine Inkubation von 6 Tagen und daraufhin ein Test der Zelllebensfähigkeit (Liniengraph) und RT (offene Balken, Nebenbild) erfolgte. Die Punkte stellen die Mittelwerte (± S. D.) von zumindest dreifachen Bestimmungen dar. Im starken Gegensatz zum Reverse-Transkriptase-Hemmer ddC führte eine Verzögerung der Zugabe von Cyanovirin-N um lediglich 3 h zu geringer oder gar keiner antiviralen Wirksamkeit (7). Die vorher erwähnten Ergebnisse legten nahe, dass Cyanovirin-N die HIV-Infektiosität durch Unterbrechung der anfänglichen Wechselwirkung des Virus mit der Zelle hemmte. Dies würde daher wahrscheinlich eine direkte Wechselwirkung von Cyanovirin-N mit dem viralen gp120 umfassen. Dieses Ergebnis wurde durch Ultrafiltrationsversuche und Dot-Blot-Tests bestätigt.
Die Ultrafiltrationsversuche wurden durchgeführt, um festzustellen, ob lösliches gp120 und Cyanovirin-N direkt binden konnten, wie durch Hemmung des Durchlaufens von Cyanovirin-N durch ein 50-kDa-Cutoff-Ultrafilter ermittelt wurde. Lösungen von Cyanovirin (30 μg) in PBS wurden 1 h lang bei 37°C mit unterschiedlichen Konzentrationen von gp120 behandelt und anschließend durch ein 50-kDa-Cutoff-Zentrifugenultrafilter (Amicon) filtriert. Nach dem dreimaligen Waschen mit PBS wurden die Filtrate mit 3-kDa-Ultrafiltern entsalzt. Die Filterrückstände wurden lyophilisiert, in 100 μl H₂O rekonstitutiert und auf ihre Anti-HIV-Wirksamkeit getestet.
8A ist eine graphische Darstellung der OD (450 nm) gegenüber der Cyanovirin-Konzentration (μg/ml), die die Cyanovirin/gp120-Wechselwirkungen veranschaulicht, die gp120 als ein molekulares Hauptziel von Cyanovirin definieren. Freies Cyanovirin-N wurde problemlos eluiert, wie durch die vollständige Wiederherstellung der Cyanovirin-N-Bioaktivität im Filtrat bewiesen wurde. Im Gegensatz dazu zeigten Filtrate von Cyanovirin-N-Lösungen, die mit gp120 behandelt worden waren, einen konzentrationsabhängigen Verlust der Filtrat-Bioaktivität. Zusätzlich dazu waren sämtliche 50-kDa-Filterrückstände inaktiv, was darauf hindeutete, dass Cyanovirin-N und lösliches gp120 direkt wechselwirkten, um einen Komplex auszubilden, der nicht an gp120 eines intakten Virus binden kann.
Ein PVDF-Membran-Dot-Blot-Test brachte weitere Beweise für eine direkte Wechselwirkung von Cyanovirin-N und gp120. Eine PVDF-Membran wurde mit 5 μg CD4 (CD), 10 μg Aprotinin (AP), 10 μg Rinderglobulin (BG) und sinkenden Mengen an Cyanovirin: 6 μg [1], 3 μg [2], 1,5 μg [3], 0,75 μg [4], 0,38 μg [5], 0,19 μg [6], 0,09 μg [7] und 0,05 μg [8] betupft, dann mit PBST gewaschen und anhand der Anleitungen des Herstellers sichtbar gemacht. 8B ist ein Dot-Blot der Bindung von Cyanovirin und einem gp120-HRP-Konjugat (Invitrogen), das zeigt, dass Cyanovirin-N in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise spezifisch an ein Meerrettichperoxidase-Konjugat von gp120 (gp120-HRP) band.
Beispiel 7
Dieses Beispiel veranschaulicht den außergewöhnlich breiten Bereich antiretroviraler Wirksamkeit gegen verschiedene Labor-angepasster und klinischer Stämme menschlicher und nicht menschlicher Primaten-Immunschwächeretroviren. Tabelle 1 unten zeigt die Vergleichsbereiche der Anti-Immunschwächevirus-Wirksamkeit von Cyanovirin-N und sCD4, die gegen einen großen Bereich von Virusstämmen in unterschiedlichen Wirtszellen getestet wurde. Besonders bemerkenswert ist die ähnliche Wirksamkeit von Cyanovirin-N gegen Labor-angepasste Stämme sowie klinische Isolate von HIV. Dies stand in krassem Gegensatz zu der fehlenden Wirksamkeit von sCD4 gegen die klinischen Isolate.
Die EC₅₀-Werte (Tabelle 1) wurden aus den Konzentrations-Reaktionskurven von 8 Verdünnungen der Testwirkstoffe (Durchschnitt der drei Wells pro Konzentration) ermittelt. G910-6 ist ein AZT-resistenter Stamm; A17 ist ein Pyridinon-resistenter Stamm; HIV-1 Ba-L wurde in peripheren menschlichen Blutmakrophagenkulturen (PBM) anhand der Überstand-Reverse-Transkriptase-Wirksamkeit getestet; sämtliche anderen Tests verwendeten XTT-Tetrazolium (Gulakowski et al. (1991), s. o.). Weitere Details über die Virusstämme, Zelllinien, klinischen Isolate und Testverfahren sind veröffentlicht worden (Buckheit et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10, 1497–1506 (1994); Buckheit et al., Antiviral Res. 25, 43–56 (1994); und den hierin angeführten Verweisen). In Tabelle 1 bedeutet N. D. = nicht bestimmt.
TABELLE 1. Vergleichsbereiche antiviraler Wirksamkeit von CV-N und sCD4
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht weiter die Konstruktion einer Konjugat-DNA-Kodierungssequenz und der Expression davon, um ein Cyanovirin-Toxin-Proteinkonjugat bereitzustellen, das HIV-infizierte Zellen selektiv anvisiert und abtötet. Genauer gesagt veranschaulicht das Beispiel die Konstruktion und Expression einer Konjugat-DNA-Kodierungssequenz für ein Cyanovirin/Pseudomonas-Exotoxin, das Wirtszellen, die virales gp120 exprimieren, selektiv abtötet.
Eine DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 3), die für FLAG-Cyanovirin-N kodiert, und eine DNA-Sequenz, die für das PE38-Fragment von Pseudomonas exotoxin kodiert (Kreitman et al., Blood 83, 426–434 (1994)), wurden im pFLAG-1-Expressionsvektor kombiniert. Die PE38-Kodierungssequenz wurde aus einem Plasmid ausgeschnitten, adaptiert und mittels Standard-DNA-Rekombinationsverfahren an die C-terminale Position der FLAG-Cyanovirin-N-Kodierungssequenz ligiert. Dieses Konstrukt ist in 9 schematisch dargestellt. Die Transformation von E. coli mit diesem Konstrukt, die Auswahl von Klonen und die Induktion der Genexpression durch IPTG führte zur Herstellung eines Konjugatproteins mit dem erwarteten Molekulargewicht und der erwarteten Immunreaktivität bei der Western-Blot-Analyse mittels eines Anti-FLAG-Antikörpers. Das chimäre Molekül wurde durch FLAG-Affinitätschromatographie gereinigt (wie z. B. in Beispiel 4) und auf seine Toxizität gegenüber mit HIV infizierten menschlichen Lymphoblastoid-Zellen (H9/IIIB-Zellen) sowie deren nicht infizierte Gegenstücke (H9- und CEM-SS-Zellen) untersucht. Die Zellen wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten ausplattiert und unterschiedlichen Konzentrationen des Konjugatproteins (genannt PPE) ausgesetzt. Nach drei Tagen wurde die Lebensfähigkeit anhand eines XTT-Test bewertet (Gulakowski et al. (1991), s. o.). 10 veranschaulicht die Ergebnisse dieses Tests. Wie erwartet waren die infizierten H9/IIIB-Zellen, die Zelloberflächen-gp120 exprimierten, deutlich empfindlicher gegenüber den toxischen Wirkungen von PPE als die nicht infizierten H9- oder CEM-SS-Zellen. Die aus den Konzentrations-Wirkungskurven ermittelten IC50-Werte betrugen für H9/IIIB 0,014 nM im Vergleich zu 0,48 und 0,42 nM für H9 bzw. CEM-SS.
Beispiel 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die Transformation einer Säugetierzelle, um darin ein Cyanovirin zu exprimieren. Ein zum Vorführen einer Expression eines Cyanovirins in Säugetierzellen geeignetes genetisches Konstrukt wurde durch Ligieren einer DNA-Sequenz, die für FLAG-Cyanovirin-N kodiert, in den pFLAG-CMV-1-Expressionsvektor (IBI-Kodak, Rochester, NY) hergestellt. Die für das FLAG-Cyanovi rin-N kodierende Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) wurde aus einem vorher hergestellten Plasmid ausgeschnitten und mittels Standard-DNA-Rekombinationsverfahren an den pFLAG-CMV-1-Vektor ligiert. Grüne-Meerkatzenzellen (COS-7-Zellen von der American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden transformiert, indem das Konstrukt einer DEAE-Dextranlösung ausgesetzt wurde. Um die Expression von FLAG-Cyanovirin-N zu bestimmen, wurden die Zellen nach 72 h lysiert und einer PAGE- und Western-Blot-Analyse unterzogen. Wie in 11 veranschaulicht ist, wurde immunreaktives Anti-FLAG-Material in den transformierten COS-7-Zellen leicht detektiert, wenn auch mit einem scheinbaren wesentlich höheren Molekulargewicht als das in E. coli hergestellte native rekombinante FLAG-Cyanovirin-N. Die diagnostische Analyse der Verdaue, die auf dieselbe Art wie im noch folgenden Beispiel 10 durchgeführt wurde, deutete an, dass dieses erhöhte Molekulargewicht auf die post-translationelle Modifikation (N-gebundene Oligosaccharide) des FLAG-Cyanovirin-N zurückzuführen war.
Beispiel 10
Dieses Beispiel veranschaulicht die Transformation und Expression eines Cyanovirins in einer Nicht-Säugetierzelle, genauer gesagt einer Hefezelle.
Ein für die Vorführung einer Expression eines Cyanovirins in Pichia pastoris geeignetes genetisches Konstrukt wurde durch Ligieren einer für Cyanovirin-N kodierenden DNA-Sequenz in den pPIC9-Expressionsvektor (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) hergestellt. Die für Cyanovirin-N kodierende Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) wurde aus einem vorher hergestellten Plasmid ausgeschnitten und mittels Standard-DNA-Rekombinationsverfahren an den Vektor ligiert. Hefezellen wurden durch Elektroporation transformiert, und Klone wurden zur Charakterisierung ausgewählt. Bei mehreren Klonen stellte sich heraus, dass sie mit polyklonalen Anti-Cyanovirin-N-Antikörpern reaktives Material exprimieren und in das Kulturmedium sekretieren (siehe z. B. Beispiel 11).
Ähnlich wie bei den Betrachtungen in Bezug auf die in Beispiel 9 beschriebenen Säugetierformen legte das erhöhte apparente Molekulargewicht des von Hefe abgeleiteten Produkts bei PAGE- und Western-Blot-Analysen nahe, dass bei diesem Expressionssystem eine post-translationelle Modifikation des Cyanovirin-N auftrat.
Um diese Modifikation genauer zu definieren, wurden die sekretierten Produkte zweier Klone mit Peptid-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparaginamidase verdaut. Dieses Enzym, das von New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen wurde, spaltet im Speziellen an Asparaginreste gebundene Oligosaccharidgruppierungen. Wie in 12 veranschaulicht ist, verringerte diese Behandlung das scheinbare Molekulargewicht des Produkts auf dasselbe Gewicht wie das in E. coli exprimierte native rekombinante Cyanovirin-N. Die Untersuchung der Aminosäuresequenz von Cyanovirin zeigte ein einziges Erkennungsmotiv für N-gebundene Modifikation (Bindung an das an Position 30 angeordnete Asparagin).
Um dies weiter als Glykolysationsort zu stärken, wurde an dieser Stelle eine Mutation eingeführt, um den Asparaginrest zu Glutamin (N30Q) abzuändern. Die Expression dieser mutanten Form resultierte in der Herstellung von immunreaktivem Material mit einem Molekulargewicht, das mit dem von nativem rekombinantem FLAG-Cyanovirin-N übereinstimmte.
Beispiel 11
Dieses Beispiel veranschaulicht einen spezifisch an ein Cyanovirin bindenden Antikörper.
Drei 2 Monate alte New-Zealand-White-Rabbits (1,8–2,2 kg) wurden dem folgenden Immunisierungsprotkoll unterzogen: Eine Gesamtmenge von 100 μg Cyanovirin-N wurde in 100 μl einer 1 : 1-Suspension aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkomplettem Freundschen Adjuvans aufgelöst und durch intramuskuläre Injektion an 2 Stellen auf jedem Hinterbein verabreicht. 8–16 Monate nach der ers ten Injektion wurde eine letzte Impfung von 50 μg Cyanovirin-N pro Kaninchen in 1000 μl einer 1 : 1-Suspension aus PBS und inkomplettem Freundschen Adjuvans aufgelöst und durch intraperitoneale Injektion verabreicht. An den Tagen 42, 70, 98 und 122 wurden jeweils 10 ml Blut von einer Ohrvene jedes Hasen abgenommen; 14 Tage nach der letzten intraperitonealen Impfung wurden die Hase getötet und ausbluten gelassen. Die IgG-Fraktion der resultierenden Immunsera der obigen Kaninchen wurde durch Protein-A-Sepharose-Affinitätschromatographie gemäß dem Verfahren von Goudswaard et al. (Scand. J. Immunol. 8, 21–28 (1978)) isoliert. Die Reaktiviät dieses polyklonalen Antikörperpräparats für Cyanovirin-N wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung einer 1 : 1000- bis 1 : 5000-Verdünnung der Kaninchen-IgG-Fraktionen aufgezeigt.
13 veranschaulicht weiters, dass der gemäß dem vorhergehend angeführten Verfahren hergestellte Antikörper ein Antikörper ist, der spezifisch an ein Protein der vorliegenden Erfindung bindet. SDS-PAGE eines Ganzzellenlysats aus einem E. coli Stamm DH5α, der gentechnisch so verändert wurde, dass er Cyanovirin-N erzeugt, wurde mittels 18%igen Polyacrylamid-Trennungsgelen und diskontinuierlichen Standard-Puffersystemen nach Laemmeli (Nature 227, 680–685, 1970) durchgeführt. Die Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie-Brillantblau sichtbar gemacht ( 13A). Für Western-Blot-Analysen wurden Proteine aus dem SDS-PAGE-Gel auf eine Nitrocellulose-Membran elektroeluiert. Nicht spezifische Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Waschen in einer 1%igen Lösung aus Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Die Membran wurde dann in einer Lösung der IgG-Fraktion aus dem vorhergehend erwähnten Kaninchen-Anti-Cyanovirin-N-Immunserum, das mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1 : 3000 verdünnt worden war, inkubiert. Anschließend wurde die Membran in einer zweiten Antikörperlösung mit 1 : 10000 verdünntem Ziegen-Antikaninchen-Peroxidase-Konjugat (Sigma) inkubiert. Der gebundene sekundäre Antikörperkomplex wurde durch Inkubieren der Membran in einem Chemilumineszenzsubstrat und folglichem Aussetzen einem Röntgenfilm (13B) sichtbar gemacht.
Für Fachleute auf dem Gebiet versteht es sich zudem, dass – ebenfalls durch weithin verwendete Routineverfahren (siehe z. B. Harlow und Lane (1988), s. o.) – auch monoklonale Antikörper hergestellt werden können, die ein Protein der vorliegenden Erfindung als das Antigen verwenden, und dass ein solcher resultierender monoklonaler Antikörper ebenso als ein Antikörper dargestellt werden kann, der spezifisch an ein Protein der vorliegenden Erfindung bindet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und gereinigtes antivirales Protein oder isoliertes und gereinigtes antivirales Peptid, umfassend zumindest neun zusammenhängende Aminosäuren aus Aminosäuresequenz Seq.-ID Nr. 2.
Protein oder Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2.
Proteinkonjugat oder Peptidkonjugat, umfassend ein Protein oder Peptid nach Anspruch 1 oder 2, das an ein Effektormolekül angekuppelt ist.
Protein, Peptid oder Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das an ein Virus oder ein virales Hüllglykoprotein gebunden ist.
Protein, Peptid oder Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das an ein Polyethylenglykol, Dextran oder Albumin gebunden ist.
Protein, Peptid oder Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das an eine feste Trägermatrix gebunden ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 3 bis 6, worin das Effektormolekül aus der aus einem Toxin und einem immunologischen Reagens bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Proteinkonjugat nach Anspruch 7, worin das Effektormolekül ein Pseudomonas-Exotoxin ist.
Verfahren zur Herstellung des Proteins oder Peptids nach Anspruch 2, das Folgendes umfasst: (a) die Identifizierung eines Extrakts von Nostoc ellipsosporum mit antiviraler Aktivität, (b) gegebenenfalls die Entfernung von hochmolekularen Biopolymeren aus diesem Extrakt, (c) durch einen antiviralen Bioassay gesteuerte Fraktionierung zum Erhalt eines teilweise gereinigten Extrakts des Proteins oder Peptids, und (d) weitere Reinigung des teilweise gereinigten Extrakts durch Umkehrphasen-HPLC zum Erhalt des Proteins oder Peptids.
Verfahren zum Konjugieren eines Virus oder eines viralen Hüllglykoproteins mit einem Cyanovirin, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren eines isolierten und gereinigten Virus oder eines isolierten und gereinigten viralen Hüllglykoproteins mit einem Protein oder Peptid nach Anspruch 1 oder 2, und worin beim Kontaktieren dieses isolierten und gereinigten Virus oder isolierten und gereinigten viralen Hüllglykoproteins mit dem Protein oder Peptid das Protein oder Peptid an das isolierte und gereinigte Virus oder das isolierte und gereinigte virale Hüllglykoprotein bindet und so ein Konjugat bildet.
Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein, ein Peptid, ein Proteinkonjugat oder ein Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11 umfasst.
Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 12 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 13, worin die Wirtszelle eine Säugetierzelle, ein Bakterium oder Hefe ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verfahren die Expression eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats in einer Wirtszelle nach Anspruch 13 oder 14 umfasst.
Antikörper, der ein Protein, ein Peptid oder ein Protein oder Peptid in einem Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bindet.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine antiviral wirksame Menge eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür, sowie gegebenenfalls ein Immunostimulans.
Topische Formulierung, umfassend ein Protein, ein Peptid, ein Proteinkonjugat oder ein Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Topische Formulierung nach Anspruch 18, worin die Formulierung eine Emulsion, eine Suspension, eine Lösung, ein Gel, eine Creme, eine Paste, ein Schaum, ein Gleitmittel, ein Spray, ein Zäpfchen, ein Pessar oder ein Tampon ist.
Topische Formulierung nach Anspruch 18 oder 19, worin die Formulierung in oder auf einem Kondom vorhanden ist.
Topische Formulierung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, worin die Formulierung außerdem Nonoxynol-9 enthält.
Topische Formulierung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, worin die Formulierung außerdem einen weiteren antiviralen Wirkstoff und/oder antibiotischen Wirkstoff enthält.
Topische Formulierung nach Anspruch 22, worin der antibiotische Wirkstoff ein Fungizid oder ein Bakterienschutzmittel ist.
Verfahren zum Entfernen eines Virus aus einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung, die ein Protein, ein Peptid, ein Proteinkonjugat oder ein Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, worin: (i) das Protein, Peptid, Proteinkonjugat oder Peptidkonjugat an eine feste Trägermatrix gebunden ist; und (ii) die zumindest neun zusammenhängenden Aminosäuren des Proteins oder Peptids an das Virus binden; und (b) Trennen der Zusammensetzung von der Probe, wonach das Virus aus der Probe entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, worin die Probe Blut, ein Blutbestandteil, Sperma, Zellen oder Gewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 24, worin die Probe eine Impfstoffzusammensetzung ist und das Virus, das entfernt wird, infektiös ist.
Verfahren zum Hemmen der Ausbreitung einer Virusinfektion, umfassend das Behandeln eines unbelebten Objekts, einer Lösung, einer Suspension, einer Emulsion oder eines anderen Materials mit einer antiviral wirksamen Menge eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Verfahren zum Hemmen der Ausbreitung einer Virusinfektion, umfassend das Behandeln von Ex-vivo-Blut, eines Blutprodukts, von Sperma, von Zellen oder von Gewebe mit einer antiviral wirksamen Menge eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
In-vitro-Verfahren zum Kontaktieren eines Virus mit einem antiviralen Wirkstoff, umfassend das Kontaktieren des Virus mit einer antiviral wirksamen Menge eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Protein, Peptid, Proteinkonjugat oder Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in einem Verfahren zum Hemmen einer Virusinfektion in einem Tier.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11 zur Verwendung in einem Verfahren zum Hemmen einer Virusinfektion in einem Tier.
Wirtszelle nach Anspruch 13 oder 14 zur Verwendung in einem Verfahren zum Hemmen einer Virusinfektion in einem Tier.
Verwendung eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen einer Virusinfektion.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 11 bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen einer Virusinfektion.
Verwendung einer Wirtszelle nach Anspruch 13 oder 14 bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen einer Virusinfektion.
Verwendung eines Proteins, eines Peptids, eines Proteinkonjugats oder eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung eines Medi kaments, das bei der Behandlung einer Virusinfektion in einem Tier durch topische Verabreichung verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 36, worin die topische Verabreichung in der Vagina, am Penis, im Rectum oder im Mund des Tiers durchgeführt wird.