KR101209761B1

KR101209761B1 - 항암 활성을 갖는 노스톡 엘립소스포룸 추출물

Info

Publication number: KR101209761B1
Application number: KR1020040116771A
Authority: KR
Inventors: 최원락; 윤세준; 김봉철; 한창균; 윤미선; 임광진; 곽의종
Original assignee: 에스케이케미칼주식회사
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2004-12-30
Publication date: 2012-12-06
Also published as: KR20060078092A

Abstract

본 발명은 항암 활성을 갖는 노스톡 엘립소스포룸 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 남조류 노스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum) 추출물 또는 분획물이 다양한 암세포에 대한 성장 억제 효과가 있음을 밝힘으로써 항암제로 활용할 수 있는 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

항암 활성, 노스톡 엘립소스포룸

Description

항암 활성을 갖는 노스톡 엘립소스포룸 추출물{Nostoc ellipsosporum extracts with anticancer activity}

도 1은 실시예 2와 3에 따른 노스톡 엘립소스포룸 추출물 및 분획물을 얻는 과정을 간략하게 도식화한 것이다.

노년 인구의 증가와 환경의 악화로 세계 암 발생률이 매년 5% 이상 증가하고 있으며, 1997년 암으로 사망한 사람은 600만명으로 세계사망률의 12%에 이르러, 암은 21 세기 인간의 수명연장을 위해 최우선적으로 극복해야 할 과제로 인식되고 있 다. 국내에서는 매년 10만 명의 암환자가 새롭게 발생하고 5만여 명이 매년 사망하는 것으로 매년 암 환자 증가율은 10% 정도이며, 세계 항암제시장은 세계 제약 시장의 4%를 차지하고 있는 의약품 군으로서 2000년에 18조원 정도로서, 연평균 8 ～10%의 시장 성장률을 보인다.

미국에서는 1967년에 "Drugs from the Sea"라고 하는 심포지엄이 개최되어 해양생물로부터 의약품을 개발하려는 연구가 주목을 받기 시작하여, 1970년대에는 해양천연물화학이라는 새로운 연구분야가 생겨나게 되었고, 1980년대부터 미국의 국립암연구소(NCI)를 주축으로 많은 선진국의 연구자에 의해 해양생물로부터 신규 유용물질의 탐색이 이루어져 지금까지 7,000종을 넘는 신규화합물이 해양생물에서 분리되어 해양생물은 신규 화합물의 보고라고 까지 불리게 되었다.

해양생물에서 분리된 화합물들 중에는 강력한 항암 작용을 가지는 신규 화합물들이 많이 있어 해양생물에서 새로운 항암물질을 탐색하려는 연구가 활발히 진행되고 있지만, 그 물질들의 양이 적고 구조가 복잡하여 천연자원으로부터 활성물질의 분리법 혹은 유기합성법으로 의약품개발에 필요한 충분한 양을 얻기가 힘들어 강력한 활성을 가지며 의약품으로서 개발할 가치가 충분히 있는 물질들이 해양생물에서 많이 분리되었음에도 불구하고 지금까지 해양생물로부터 개발된 의약품은 그렇게 많지 않다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 배양을 통해 의약품 개발에 필요한 양을 얻을 수 있는 해양미생물에 큰 관심이 모아지게 되었으며 새로운 의약품 개발을 위해 해양미생물을 체계적으로 탐색하는 것이 필요하다. 또한, 해양생물에서 분 리된 많은 신규 화합물 및 항암물질들을 해양생물에 공생 혹은 기생하고 있는 해양미생물들이 생성한다는 것이 알려져 해양미생물이 새로운 의약품 개발의 중요한 타겟이 되고 있다.

따라서, 새로운 물질의 보고로 알려진 해양미생물로부터 신규 항암제를 개발하는 연구가 이루어지고 있긴 하나, 아직까진 미진한 상태이다.

본 발명에서 사용된 남조류 노스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum)는 담수(freshwater)에서 서식하며, 이로부터 분리된 CV-N(cyanovirin-N)의 HIV(Human Immunodeficiency Virus)에 대한 억제 효과는 밝혀져 있다[Gustafson KR, Sowder RC 2nd, Henderson LE, Cardellina JH 2nd, McMahon JB, Rajamani U, Pannell LK, Boyd MR. Biochem Biophys Res commun. 1997, 238, 223-228.]. 하지만, 노스톡 엘립소스포룸의 항암 효능에 대한 연구보고는 아직까지 없다.

이에, 본 발명자들은 독성이 거의 없고 다양한 암 세포주에 대한 성장 억제 효과가 있는 항암 치료제를 개발하기 위하여 연구를 수행한 결과, 노스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum)으로부터 다양한 암세포에 대한 성장 억제 효과가 있는 추출물 및 분획물을 분리함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 다양한 암 세포주에 대한 성장 억제 효과가 있는 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 다양한 암 세포주에 대한 성장 억제 효과가 있는 노스톡 엘 립소스포룸 추출물 또는 분획물을 이용한 항암제 및 건강식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은

1) 남조류 노스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum)을 저급 알코올 수용액 또는 비극성 용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계;

2) 상기 추출물을 물로 현탁하고 에테르를 혼합 교반하여 에테르층만을 분리한 후, 메탄올 수용액으로 현탁하고 헥산으로 층 분리하여 용매 분획물을 수득하거나,

또는 상기 에테르층을 제거한 후 남은 물층에 에틸아세테이트로 층 분리하여 용매 분획물을 수득하는 단계

를 포함하여 이루어진 항암 활성을 갖는 분획물의 제조방법을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 각각의 추출 분획 단계에서 얻어진 수득물을 함유하는 항암제 또는 건강식품을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 남조류 노스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum) 추출물 또는 분획물이 다양한 암세포에 대한 성장 억제 효과가 있음을 밝힘으로써 항암제로 활용할 수 있는 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 노스톡 엘립소스포룸으로부터 다음과 같은 방법에 의하여 보다 활성이 우수한 노스톡 엘립소스포룸 추출물 및 분획물을 효율적으로 제조하는 것에 관한 것으로서 이를 더욱 상세히 살펴보면 다음과 같다.

건조된 노스톡 엘립소스포룸에 건조 중량 대비 약 20 ～ 50 배량의 저급 알코올 수용액 또는 비극성 용매로 추출하고, 필터한 후 남은 부분은 다시 회수하여 위 과정을 여러 번 반복한다. 상기 저급 알코올 수용액은 탄소수 1 내지 6개를 갖는 알코올 수용액이 바람직하며, 에탄올, 메탄올이 더욱 바람직하고, 상기 비극성 용매로는 디클로로메탄(Dichloromethane), 석유 에테르(Petroleum ether), 클로로포름(Chloroform) 또는 헥산(Hexane)이 바람직하다.

상기 다양한 용매를 이용한 추출법에서 얻어진 추출액은 다시 여과 및 감압 농축하여 추출액 내의 용매를 완전 제거하고, 건조된 추출물 중량 대비 50 ~ 100(V/W)배 정도가 되도록 증류수로 현탁한 후 동량의 에테르와 혼합 교반하여 상층의 에테르 층만을 분리한다. 2 ～ 3회 더 재분획하고, 감압 증류기를 이용하여 에테르 분획물을 완전 농축한 후 40 ～ 80% 메탄올 수용액을 첨가하여 분획물 건조 중량 대비 50 ~ 100배량(V/W) 정도가 되도록 현탁한 후 동량의 헥산과 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 교반 후 24시간 동안 방치하여 상층의 헥산 층만을 분리한다. 2 ～ 3회 더 재분획하고, 감압 증류기를 이용하여 헥산과 메탄올 수용액 분획물을 완전 농축시킨다. 다음으로 에테르 층이 제거된 물층은 동량의 에틸아세테이트(Ethylacetate)와 혼합 교반하여 상층의 에틸아세테이 트 층만을 분리한다. 2 ～ 3회 더 재분획하고, 감압 증류기를 이용하여 에틸아세테이트 분획물을 수득한다.

상기의 방법대로 제조된 노스톡 엘립소스포룸 추출물 및 분획물의 활성을 검색한 결과 다양한 암세포주에 대한 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물은 이를 유효성분으로 함유하는 항암제 또는 건강식품으로 사용 가능하다.

의약품으로 제조시, 본 발명의 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캅셀제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 리그난과 락톤 화합물 및 그의 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수용성제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 비경구로 투여 시, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 주사제로 제제화하기 위해서는 상기 노스톡 엘립소스포룸 추추물 또는 분획물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물은 0.1 ～ 50 mg/kg, 바람직하게는 1 ～ 20 ㎎/㎏으로, 하루 1 ～ 3회 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물을 일반 식품에 첨가하거나, 캅셀화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 노스톡 엘립소스포룸 배양

노스톡 엘립소스포룸은 담수(fresh water)에서 서식하는 균주로 배지 총 부피의 70 ~ 80%의 증류수(distilled water)에 트리스(Tris)를 넣어 잘 녹인 후 나머지 배지 조성은 다음 표 1의 농도와 같이 넣은 후 잘 섞어주었다.

증류수로 최종 부피까지 채운 후, 1N 염산(HCl)을 첨가하여 pH 7.5로 맞추었다. 제조되어진 배지를 고온 고압 멸균기(Autoclave)에 넣어 121 ℃에서 20분간 멸균한 후 하루 동안 방치하여 균주를 접종하였다. 균주는 24 μE/m²ㆍsec (12 hour light, 12 hour dark)의 조명과, 25 ℃의 온도, 그리고 적정량의 CO₂ 조건에서 약 1달간 배양하였다. 배양이 완료된 배지는 연속 고속 원심 분리기(Continuous centrifuge)를 이용하여 제거하고 균주만을 획득한 후, 동결건조기(Freeze dryer)를 이용해 완전 건조시켰다. 이렇게 건조된 균주는 -20 ℃에서 보관하였다.

조성	농도(mg/L)
Ca(NO₃)₂ㆍ4H₂O	150
KNO₃	100
MgSO₄ㆍ7H₂O	40
β-Na₂glycerophosphateㆍ5H₂O	50
비타민 B₁₂	0.1
바이오틴	0.1
티아민 HCl	10
PIV metals	45
트리스(Tris)	500
증류수	1L

실시예 2: 노스톡 엘립소스포룸 추출물 제조

노스톡 엘립소스포룸 100 g을 80% 메탄올 수용액 3 L에서 4시간 동안 파쇄기(Homogenizer)를 이용하여 추출한 후 필터(Whatman No1)를 이용하여 여과하였다. 여과지에 남은 부분은 다시 회수하여 위 과정을 2번 반복하였다. 또한, 메탄올과 디클로로메탄(Dichloromethane)을 이용하여 상기 과정과 같은 방법으로 실시하였다. 상기 다양한 용매를 이용한 추출법에서 얻어진 추출액은 다시 여과하여 4 ℃ 냉장실에서 보관하였다.

실시예 3: 노스톡 엘립소스포룸 분획물 제조

상기 실시예 2에서 얻은 추출액을 감압 증류기(rotary evaporator)로 37 ℃에서 감압 농축하여 잔류 용매를 완전 제거하여 추출물 18.2 g을 획득하였으며 1L 증류수로 현탁한 후 동량의 디에틸에테르(Diethylether)와 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 교반 후 24시간 동안 방치하여 상층의 에테르 층만을 분리하였다. 2 ~ 3회 더 재 분획하고, 감압 증류기를 이용하여 에테르 분획물을 완전 농축한 후 500 ml 70% 메탄올 수용액을 첨가하여 현탁한 후 동량의 노말-헥산과 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 교반 후 24시간 동안 방치하여 상층의 노말-헥산 층만을 분리하였다. 2 ～ 3회 더 재 분획하고, 감압 증류기를 이용하여 노말-헥산과 70% 메탄올 분획물을 완전 농축하였다. 다음으로 에테르 층이 제거된 물 층은 동량의 에틸아세테이트(Ethylacetate)와 혼합하여 분리장치(separation funnel)에 넣고, 교반 후 24시간 동안 방치하여 상층의 에틸아 세테이트 층만을 분리하였다. 2 ～ 3회 더 재 분획하고, 감압 증류기를 이용하여 에틸아세테이트 분획물을 완전 농축하였다. 그 다음에 다시 남은 물 층을 동량의 수포화 노말-부탄올과 혼합하여 같은 방법으로 부탄올 분획물을 제조하고, 이 분획물과 남은 물층을 완전 농축하였다. 모든 농축물은 진공 오븐에서 용매를 완전히 제거하여 건조시켰고, 분말화한 후 - 20 ℃에서 보관하여 사용하였다[도 1 참조].

실시예 4: 다양한 암세포에 대한 성장 억제 효과 측정

상기 실시예 3에서 얻어진 여러 분획물을 DMSO에 녹인 후 여러 농도로 세포 배지(RPMI 1640)에 희석하였다. 암세포의 성장 억제 효과를 측정하는 데 사용된 세포는 폐암세포인 A549, 유방암 세포인 SK-BR-3 그리고 위암세포인 MKN45로 96 웰 플레이트에 각각 2500개씩 분주하였다. 2시간 후 배지에 희석시킨 여러 농도의 추출물을 세포에 처리하고 4일간 배양하였다(37 ℃, 5% CO₂ incubator). 배양 4일 후 여러 농도의 추출물에 대한 세포의 독성을 측정하기 위하여 MTT 용액(5 mg/ml)을 웰당 20 ㎕씩 처리한 후 4시간 동안 배양하여 MTT가 세포 내에서 포르마잔을 형성하도록 하였다. 그 후 세포배지를 제거하고 100% DMSO를 웰당 150 ㎕씩 넣고 현탁하여 세포를 융해(lysis)시킨 후 ELISA로 550 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 히스톤 데아세틸라제 억제제(Histone Deacetylase Inhibitor)인 MS-275(Synthetic benzamide derivative)를 사용하여 항 암활성을 비교하였으며, 상기 실시예 3에서 얻어진 분획물을 세포에 처리 시 처음에 비해 세포의 성장이 50% 감소하는 추출물의 농도를 IC₅₀값으로 나타내고 이를 다음 표 2에 나타내었다(각 값은 3 well의 평균을 구함).

구분	항암 활성 정도(㎍/㎖)
구분	A549	SK-BR-3	MKN45
추출물	49.12	48.24	>50
헥산 분획물	45.70	46.60	49.50
70% 메탄올 분획물	12.00	23.40	> 50
에틸아세테이트 분획물	1.00	1.70	2.40
노말-부탄올 분획물	> 50	> 50	> 50
잔사	> 50	> 50	> 50
양성대조군(MS-275）	0.84	0.19	3.33
주) IC₅₀ 값이 50 이상일 경우:'> 50'으로 표기

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 양성대조군(MS-275)이 고도로 정제된 단일물질임을 감안할 때, 다양한 암세포주에 대해 노스톡 엘립소스포룸 추출물, 헥산 분획물, 70% 메탄올 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 항암 활성이 있으며, 특히 에틸아세테이트 분획물은 가장 우수한 활성을 가짐을 확인하였다.

제조예 1: 분말 및 캅셀제의 제조

노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물 50 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 No.5 젤라틴 캅셀에 채웠다.

제조예 2 : 주사제의 제조

노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물 10 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na₂HPO₄ㆍ12H₂O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 혼합하여 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30분간 가열하여 멸균 처리하였다.

제조예 3: 건강식품의 제조

1일 복용 기준으로 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물 100 mg, 분말비타민 E, 젖산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B1 및 비타민 B2를 혼합하여 제조하였다.

상기 건강식품의 구성성분은 다음과 같다(사람 1일 복용량 기준).

유효성분 100 mg

비타민 C 100 mg

분말비타민 E 120 mg

젖산철 2 mg

산화아연 2 mg

니코틴산아미드 20 mg

비타민 A 5 mg

비타민 B1 2 mg

비타민 B2 2 mg

옥수수전분 200 mg

스테아린산 마그네슘 20 mg

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 노스톡 엘립소스포룸 추출물 또는 분획물은 다양한 암세포에 대한 성장 억제 효과를 나타냄으로써 항암 치료제 및 식품 첨가물의 용도로 매우 유용하다.

Claims

1) 남조류 노스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum)을 탄소수 1 내지 6개를 갖는 저급 알코올 수용액 또는 비극성 용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계;

2) 상기 추출물을 물로 현탁하고 에테르를 혼합 교반하여 에테르층만을 분리한 후, 메탄올 수용액으로 현탁하고 헥산으로 층 분리하여 용매 분획물을 수득하거나, 또는 상기 에테르층을 제거한 후 남은 물층에 에틸아세테이트로 층 분리하여 용매 분획물을 수득하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 노스톡 엘립소스포룸 분획물의 제조방법.

삭제

제 1 항에 있어서, 상기 비극성용매는 디클로로메탄, 석유에테르(Petroleum ether), 클로로포름(Chloroform) 또는 헥산(Hexane)인 것을 특징으로 하는 제조방법.

청구항 1에 따른 헥산으로 층 분리하여 얻어진 70% 농도의 메탄올로 추출, 분획한 분획물과 에틸아세테이트로 층 분리하여 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제.

청구항 1에 따른 헥산으로 층 분리하여 얻어진 70% 농도의 메탄올로 추출, 분획한 분획물과 에틸아세테이트로 층 분리하여 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 것을 특징으로 하는 암 개선용 기능성 건강식품.