KR100612087B1 - 제비꽃으로부터 항암활성물질을 추출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제비꽃(Violet)으로부터 항암 활성을 갖는 물질을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 제비꽃으로부터 각종 암세포의 성장을 저해하고, 특히 암세포의 전이 억제 활성을 유도하여 각종 암, 특히 위암, 간암, 췌장암, 혈액암 질환의 예방 및 치료에 효과적이고 안전한 항암 활성을 갖는 물질을 추출하는 방법을 제공한다.
제비꽃과, 항암, 암세포전이, 의약품, 건강보조식품, 피부미용제품

Description

제비꽃으로부터 항암활성물질을 추출하는 방법{METHOD OF EXTRACTION ANTICANCER ACTIVITY SUBSTANCE FROM VIOLET}
도 1은 본 발명의 제비꽃 물 가용추출물의 성분 분석 HPLC 크로마토그램도이며,
도 2는 전이암세포모델에서 약물 무처리군, 항암제인 아드리아마이신을 처리한 양성대조군, 제비꽃 추출물 투여군(50㎍/㎖)의 전이암 세포주 억제 효과를 나타낸 도이며,
도 3a, 도3b는 전이암세포모델에서 약물 무처리군과 제비꽃 추출물 투여군(50㎍/㎖)의 전이암 세포주의 자기사멸 효과를 나타낸 도이며,
도 4는 동물모델에서 약물 무처리군과 제비꽃 추출물 투여군(500㎎/㎏)의 급성독성에 의한 간과 비장의 장기손상 유무를 나타낸 도이다.
삭제
본 발명은 제비꽃으로부터 항암 활성을 갖는 물질을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 제비꽃으로부터 각종 암세포의 성장을 저해하고, 특히 암세포의 전이 억제 활성을 유도하여 각종 암, 특히 위암, 간암, 췌장암, 혈액암 질환의 예방 및 치료에 효과적이고 안전한 항암 활성을 갖는 물질을 추출하는 방법을 제공한다.
암은 인류가 해결해야 될 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10 만명 이상이 진단되고, 약 6 만명이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르며, 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있고, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하기 때문에 암의 발생 후 이를 치료하는 대응 방법보다는 암의 발생을 미리 방지하는 암 예방(chemoprevention)이 암을 정복한다는 전제하에서 훨씬 효율적인 방법이 될 것이다.
암을 치료하기 위한 항암제의 연구 방법에는 암세포에 대한 직접적인 세포독성 물질을 탐색하는 법, 생체의 면역능을 조절하는 물질을 탐색하는 법, 암세포의 전이를 억제하는 물질을 탐색하는 법 및 최근에 주목되고 있는 혈관신생을 억제하는 물질을 탐색하는 법 등 다양한 방법들이 진행되고 있으며, 암의 예방을 위해서는 암 발생의 여러 기전을 효율적으로 차단함으로써 정상세포가 암세포로 전이되는 과정을 미연에 방지하거나 또는 발암기전의 진행을 지연시키거나 회복시킬 수 있는 물질을 사용할 수 있는데, 이러한 물질은 단기 또는 장기 독성이 없어야하며, 복용이 용이하고 쉽게 구할수 있는 원료로 이루어져야 한다. 암의 발생은 매우 복잡하며 여러 단계에 의하여 진행된다고 알려져 있으며 발암의 작용기전을 이해하는 것이 암의 예방 및 치료에 쓰이는 약제의 개발이 가능하다.
현재, 새로운 개념의 암 정복 전략인 암 예방 물질의 개발이 절실히 요구되고 있으며, 이러한 암 예방물질의 개발은 암 뿐만 아니라, 모든 질병을 억제하거나 치료하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이와 같은 이유로 인해, 암 예방 물질의 개발이 암 연구의 새로운 방향으로 인식되고 관심이 집중됨에 따라, 암 예방물질 소재의 개발이 실제 의약분야 뿐만 아니라 식품 화학 분야에서도 활발하여 천연물 소재에 대한 연구가 적극적으로 이루어지고 있는 실정이며, 또한 식품 분야에도 실제 도입되고 있다.
보고된 암의 예방과 관련된 활성물질의 예로는 β-카로텐(β-carotene)(Suda, Carcinogenesis, 7, pp711-715, 1986), 세셀린형 쿠마린(coumarin)(Nishino, Carcinogenesis, 11, pp1557-1561, 1990), 강황(Curcuma longa)으로부터 분리된 쿠르쿠민(curcumin)(Rao, Carcinogenesis, 14, pp2219-2225, 1993), 파슬리(parsley)에서 분리된 미리스티신(myristicin)(Zheng, Carcinogenesis, 13, pp1921-1923, 1992) 그리고 녹차의 에피갈로카테킨-3-갈릭산(epigallocatechin-3-gallic acid)(Katiyar, Nutrition and Cancer, 18, pp73-73, 1992) 등이 있다.
상기한 바와 같이, 이미 여러 종의 식물추출물로부터 암 예방 또는 치료활성을 지닌 물질이 보고 되어 식물 추출물로부터 암 예방제로서의 활성을 보이는 물질이 탐색될 확률이 높은 편이고, 식물 추출물은 장기복용에 따른 독성 발생의 위험부담이 적고, 원료의 생산이 용이하며, 보존 상태가 외부환경에 대해 비교적 안정적이라는 점에서 암 예방 및 치료제 개발에 있어서 식물의 추출에 대한 항암활성 검색과 그에 따른 순수물질의 분리 및 활성검색 등의 방법으로 접근하는 것은 높은 효율적인 많은 이점을 가지고 있다.
본 발명에서 사용된 제비꽃은 제비꽃과(Violaceae)의 다년생 식물로서 많은 종이 분포되어 있으며, 논, 밭, 길가의 다소 습기가 있는 곳에서 많이 서식하고, 장관종창, 복통, 위염증의 치료목적으로 사용하기도 한다. 그러나, 암 예방 효능을 나타내는 천연 물질에 대한 많은 연구와 관심에도 불구하고, 본 발명의 제비꽃류 추출물이 암 질환에 대한 연구, 암말기환자의 통증치료 및 예방 효과의 효능이 전혀 알려진 바 없으며, 여러 종류의 천연물을 대상으로 하여 암예방 및 암말기환자의 통증치료에 유용한 활성이 기대되는 식물을 탐색하는 과정에서 제비꽃류가 암세포주에 대하여 유의한 억제효과를 나타내어 이에 대한 항암활성및 통증치료 연구를 진행하였다
이에 본 발명자들은 식물의 구성 성분을 분리 및 정제하여 연구를 계속해오던 중, 제비꽃 추출물이 암세포의 성장을 저해하며 탁월한 암 예방 및 치료효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성시켰다.
본 발명의 목적은 제비꽃으로부터 항암 활성을 갖는 물질을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 암질환의 예방 및 치료 효과를 나타내며, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출되거나, 상기 용매가 더욱 가용되어 추출ㆍ정제되거나, 세절하여 여과한 후 동결건조 하는 것을 특징으로 하는 제비꽃으로부터 항암 활성을 갖는 물질을 추출하는 방법을 제공한다.
상기 유기용매는 메탄올, 부탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되어진 극성용매인 것을 특징으로 하거나, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되어진 유기용매인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제비꽃으로부터 조추출물, 극성 또는 비극성용매가용 조추출물을 분리하는 방법은 하기와 같다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 제비꽃 추출물은 생체상태 또는 음건하에 세절한 제비꽃의 전초 무게(㎏)의 약 1배 내지 25배, 바람직하게는 약 10배 내지 15배의 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급 알콜 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:5의 혼합비(㎏/ℓ)를 갖는 이들의 혼합용매, 더욱 더 바람직하게는 80 내지 100% 에탄올로 5 내지 80℃, 바람직하게는 25 내지 55℃ 추출온도에서 약 15분 내지 2일, 바람직하게는 30분 내지 12시간동안 용매 추출, 단수 열수추출, 상온추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법에 의하여 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 추출, 감압농축 및 동결건조하여 수득할 수 있다.
본 발명은 상기 추출공정에서 얻어지는 조추출물들을 포함하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 유효성분이 정제된 극성 또는 비극성용매 가용 조추출물은 상기 조추출물을 물에 현탁한 후, 이를 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 n-헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트와 같은 유기용매를 가하여 수층과 유기용매 가용층을 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 분획하여 수득할 수 있으며, 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed. pp6-7, 1998).
이하 구체적으로 제비꽃의 조추출물, 극성용매 및 비극성용매에 가용된 조추출물의 분리공정을 설명하면,
예를 들어 제비꽃을 물, 메탄올 또는 부탄올과 같은 극성용매로 냉침추출한 후에 여과하고, 감압농축 및 동결건조하여 극성용매에 가용한 조추출물을 얻는 제 1단계;
상기의 조추출물을 물에 현탁하여 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트와 같은 유기용매로 녹여 현탁시킨 후, 분액깔대기로 분획 및 여과하여 용매 극성에 따라 순차적 분획화에 의한 유기용매 가용 조추출물을 얻는 제 2단계;
이어서 순차적으로 수층을 부탄올 또는 물과 같은 극성 용매를 사용하여 분획 및 여과하여, 부탄올 가용추출물 및 물 가용 조추출물을 얻는 제 3단계;
상기의 클로로포름 가용 조추출물, 에틸아세테이트 가용 조추출물, 부탄올 가용추출물 및 물 가용추출물을 감압농축하여 건조하는 제 4단계로 구성된 분리공정을 포함한다.
상기 제법으로 얻어진 조추출물, 클로로포름 가용추출물, 에틸아세테이트 가용추출물, 부탄올 가용추출물 및 물 가용추출물을 시험관 상태에서 암세포 성장억제활성 및 고형암세포 억제유도효과를 실험한 결과, 유의성 있는 저해활성을 나타내었으므로, 이들은 상기 암세포억제 활성과 관련된 각종 암 질환, 특히 위암, 췌장암, 혈액암 등의 예방 및 전이에 따른 통증경감치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 제법으로 얻어지고 암 질환의 예방 및 치료에 효과적인 조추출물, 극성 및 비극성용매 가용추출물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 제비꽃 조추출물, 극성 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 암 질환 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 조추출물, 극성용매 또는 비극성용매 가용추출물을 0.1 ~ 20 중량%로 포함하며, 상기 조성물의 1일 투여량이 체중 1kg당 125 내지 500mg인 약학조성물을 제공한다.
상기의 암은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 혈액암, 두부 또는 경부 암, 피부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 결장암, 유방암, 음문암종, 식도암, 소장암 또는 이들 암의 하나 이상의 조합을 포함하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 제비꽃 조추출물, 극성 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 포함하는 암세포 발생억제 유도활성을 갖는 암치료 보조제를 제공한다.
본 발명의 제비꽃 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 구척 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 1 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 100 내지 300mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이, 건강상태, 식이, 투여시간, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라서 증감될 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 암질환의 예방효과를 나타내는 제비꽃의 조추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다.
또한, 암질환의 예방효과를 나타내는 제비꽃의 극성용매 또는 비극성용매 가용추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다.
상기의 제비꽃 조추출물, 극성 또는 비극성용매 가용추출물에 다른 식물 추출물을 유효적으로 포함하는 건강보조음료를 제공한다.
본 발명의 추출물들을 포함하는 조성물은 암질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 제비꽃의 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 육류, 초코렛, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 제비꽃 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물 자체는 독성 및 부작용은 일정한 농도이상에서 예를 들면 조추출물은 5g/kg이상에서 나타나므로 암의 예방 및 치료목적으로 복용시 적절한 농도에서 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 추출물은 암질환의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 상기 추출물은 유해한 환경으로부터 피부를 보호하고 본 발명에 따른 추출물의 항균작용 등에 따른 미용효과가 탁월한, 본 발명에 따른 제비꽃 조추출물을 유효성분으로 하는 피부미용제품첨가제를 제공한다.
상기 피부미용첨가제는 화장품첨가제, 비누첨가제, 샴푸첨가제인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게 상기 피부미용첨가제의 제형은 유연화장수, 스킨, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 피부접착용패취 또는 피부접착용 겔인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다음의 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예 1. 제비꽃 조추출물의 제조방법
본 발명에서 사용한 국내에 자생하는 제비꽃을 채취 후 이물을 제거한 후, 제비꽃 50g을 세절하여 95% 에탄올 200ml를 가하여 상온에서 냉침추출한 후, 상층액을 여과하여 제비꽃의 찌꺼기를 제거하였다. 추출액을 여과지에 거른 후 감압농축기(EYELA, 일본)로 감압농축하여 5.4g을 얻어 시료로 사용하였다. 또한 제비꽃 50g을 세절하여 녹즙기로 즙을 짜낸 후 여과지에 거른 후 동결건조기(OTRON, 한국)로 동결건조하여 4.1g을 얻어 시료로 사용하였다
실시예 2. 제비꽃 극성용매 및 비극성용매 가용추출물의 제조방법
상기 실시예 1에서 제조된 제비꽃 조추출물을 300㎖의 물에 현탁한 후, 클로로포름 600ml를 가하여, 분액깔대기에 넣고 클로로포름 불용성층(상층)과 클로로포름 가용성층(하층)으로 분획하여 클로로포름 가용부를 수집하였다. 상층(물층)과 동일한 부피의 클로로포름용매를 상기한 방법과 동일한 방법으로 5회 반복하여 용액의 색이 옅어질 때까지 최대한 클로로포름층에 용해가 가능한 물질을 얻어낸 후, 제비꽃의 클로로포름 추출물을 수득하여 시료로 사용하였으며, 에틸아세테이트를 상기의 클로로포름과 같은 방법으로 분획하여, 에틸아세테이트 가용추출물을 얻어 시료로 사용하였다. 상기의 수층에 다시 순차적으로 부탄올과 물을 가하여 분획하여, 부탄올 추출물 그리고 남아있는 물층을 건고하여 물 추출물을 수득하였으며, 제비꽃의 극성용매 가용추출물 시료로 사용하였다.
참조예 1. 기기 분석
암세포 생장억제 성분의 분석을 위하여, 역상 고성능 액체크로마토그래피(Reversed-phase HPLC, SCL10A, Shimadzu, Japan)을 사용하였다.
HPLC의 이동상 조건으로 메탄올과 물을 같은 비율로 섞은 용매로 시작점으로 하였으며, 메탄올과 물의 비율이 9:1이 될 때까지 20분의 시간을 두었고, 메탄올이 100퍼센트가 되기까지 30분의 시간을 두었다. 이때 역상컬럼을 통과하는 이동상의 유속은 실온에서 유속 2㎖/분으로 설정하였으며, 함께 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하여 재확인하였다.
상기 실시예 2에서 제조된 제비꽃 클로로포름 가용추출물을 상기와 같은 방법으로 수행하여 성분을 분석하였다(도 1 : 제비꽃<후리캔사 707>의 성분분석 시험 결과.참조).
실험예 1. 시험관상에서 암세포 성장 억제 효과 시험
실시예 1 및 2에서 제조된 제비꽃의 조추출물, 극성 또는 비극성용매 가용추출물의 암세포 성장억제 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
위암세포주인 SK-OV-3(ATCC, 미국), 췌장암세포주인 MS 1 세포주(ATCC, 미국)와 혈액암세포인 HL60 세포주(ATCC, 미국)를 배양한 후, 음성 대조군으로는 0.5% 디메틸술폭시드(DMSO)를, 양성 대조군으로는 아드리아마이신(Adriamycin)(최종 농도 0.5㎍/㎖)을 처리하였고, 대상 시험물질들을 농도별로 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후 용해 완충액(lysis buffer)으로 용해시키고, 여기에 MTT가 들어있는 반응 혼합물을 넣어 37℃에서 50분간 배양기에서 반응시킨 후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 610nm에서 흡광도를 측정하였다(Scott. G, J. Clin. Microbial., 36, pp362-366, 1998).
실험 결과, 제비꽃 즙액 조추출물은 38㎍/㎖에서 위암세포주인 SK-OV-3에대하여 50% 세포성장 억제율을 보였으며, 62㎍/㎖에서 췌장암세포주인 MS 1에 대하여 50% 세포성장 억제율을 보였으며, 32㎍/㎖에서 혈액암세포인 HL60 세포주에 대하여 50% 세포성장 억제율을 나타냈으며, 제비꽃 에탄올 조추출물의 클로로포름 가용추출물은 혈액암세포인 HL60 세포주에 대하여 18㎍/㎖ 농도에서 50% 세포성장 억제율을 보여 탁월한 암세포 성장억제 저해 효과를 나타내었다(표 1 참조).
암세포 시료처리군 50% 세포성장억제농도(㎍/㎖)
SK-OV-3 즙액 조추출물 62
MS-1 즙액 조추출물 32
HL60 즙액 조추출물 38
HL60 클로로포름 가용추출물 18
항암제(아드리아마이신) 0.36
실험예 2. 전이암에 대한 암세포변화 경과시험
HeLa 암세포에 실시예 1의 제비꽃 즙액 조추출물을 50㎍/㎖ 농도를 투여하여 84시간내에 일어나는 Hela 암세포의 외관상의 변화와 암세포수의변화를 관찰하였다(전통약물로부터 신약개발연구법, 서울대학교 천연물과학연구소, 1992). (도 2: 제비꽃<후리캔사 707>의 항암활성 시험 결과, 도3 : 제비꽃<후리캔사 707>의 전이암 억제 시험 결과 참조)
실험예 3. 제비꽃 추출물의 독성실험
실시예 1과 실시예 2의 제비꽃 조추출물의 독성을 확인하기 위하여 동물실험을 실시하였다.
경구투여
ICR계 BALB 마우스(대한실험동물센터) 20내지 25g 정도의 수컷을 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음 본 발명의 제비꽃 조추출물을 각각 250, 1000 mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구 투여 후, 급성독성 여부를 관찰한 결과 250, 1000 mg/kg의 용량군 모두 한 마리도 사망하지 않았으며, 부검결과 조직학적으로는 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다. (표 2, 도 4 : 제비꽃<후리캔사 707>의 독성 시험 결과 참조- (a) 간 세포 무처리 군, (b) 간세포 후리캔사 707 500mg/kg 처리 군, (c) 비장세포 무처리 군, (d) 비장세포 후리캔사 707 500mg/kg 처리 군 )
투 여 량 생존율(사망개체/시험개체)
제비꽃 조추출물 1000mg 0/5
제비꽃 조추출물 250mg 0/5
본 발명의 제비꽃의 추출물은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
1. 산제의 제조
제비꽃의 클로로포름 가용추출물100mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
옥수수전분 100mg
유 당 100mg
탈 크 10mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀 포에 충진하여 산제를 제조한다.
제비꽃의 즙액 동결건조 추출물100mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
옥수수전분 100mg
유 당 100mg
탈 크 10mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀 포에 충진하여 산제를 제조한다.
2. 정제의 제조
제비꽃의 클로로포름 가용추출물 100mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
옥수수전분 100mg
유 당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
상기의 성분들을 혼합한후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제비꽃의 즙액 동결건조 추출물100mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
옥수수전분 100mg
유 당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
상기의 성분들을 혼합한후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
3. 캡슐제의 제조
제비꽃의 클로로포름 가용추출물250mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
유 당 50mg
스테아린산 마그네슘 1mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 타정하여 젤라틴 캡슐제에 충진하여 제조한다.
제비꽃의 즙액 동결건조 추출물250mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
유 당 50mg
스테아린산 마그네슘 1mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 타정하여 젤라틴 캡슐제에 충진하여 제조한다.
4. 액제의 제조
제비꽃의 클로로포름 가용추출물 100mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
이성화당 10g
서 당 10g
레몬향 적량
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라서 정제수에 각각의 성분을 가하고 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체를 100ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜서 액제를 제조한다.
제비꽃의 즙액 동결건조 추출물100mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
이성화당 10g
서 당 10g
레몬향 적량
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라서 정제수에 각각의 성분을 가하고 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체를 100ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜서 액제를 제조한다.
제제예 5. 건강 식품의 제조
제비꽃의 클로로포름 가용추출물1000㎎
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
비타민 혼합물적량
비타민 A 아세테이트70㎍
비타민 E1.0㎎
비타민 B1 0.13㎎
비타민 B2 0.15㎎
비타민 B6 0.5㎎
비타민 B12 0.2㎍
비타민 C10㎎
비오틴10㎍
니코틴산아미드1.7㎎
엽산50㎍
판토텐산 칼슘0.5㎎
무기질 혼합물적량
황산제1철1.75㎎
산화아연0.82㎎
탄산마그네슘25.3㎎
제1인산칼륨15㎎
제2인산칼슘55㎎
구연산칼륨90㎎
탄산칼슘100㎎
염화마그네슘24.8㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제비꽃의 즙액 동결건조 추출물100mg
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
비타민 혼합물적량
비타민 A 아세테이트70㎍
비타민 E1.0㎎
비타민 B1 0.13㎎
비타민 B2 0.15㎎
비타민 B6 0.5㎎
비타민 B12 0.2㎍
비타민 C10㎎
비오틴10㎍
니코틴산아미드1.7㎎
엽산50㎍
판토텐산 칼슘0.5㎎
무기질 혼합물적량
황산제1철1.75㎎
산화아연0.82㎎
탄산마그네슘25.3㎎
제1인산칼륨15㎎
제2인산칼슘55㎎
구연산칼륨90㎎
탄산칼슘100㎎
염화마그네슘24.8㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 6. 건강 음료의 제조
제비꽃의 클로로포름 가용추출물1000㎎
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
구연산1000㎎
올리고당100g
매실농축액2g
타우린1g
정제수를 가하여 전체 900㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
제비꽃의 즙액 동결건조 추출물1000㎎
여감자 추출물500㎎
은행잎 추출물500㎎
구연산1000㎎
올리고당100g
매실농축액2g
타우린1g
정제수를 가하여 전체 900㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
이와 같이 본 발명은 제비꽃 추출물을 배합한 각종 식품류 및 음료류를 제조함으로서 암 예방 효과가 기대되는 기능성 식품을 제공할 수 있는 것이다.
또한 본 발명에 의한 조추출물을 포함한 피부미용첨가제는 용매를 이용하여 추출하고 정제한 후 피부트러블 유발균 (여드름, 무좀, 칸디다증, 질염등)에 적용, 항균성이 있는 생약을 스크리닝하고, 각 생약을 복합 처방하여 피부병이나 피부 트러블을 일으키는 다양한 세균 및 진균에 효과가 조성물을 얻게 되었다.
개발된 생약 추출물은 피부 부작용시험을 실시하였으며 아토피성피부염의 완화효과 및 미용기능(미백, 수렴, 각질제거, 항산화, 잔주름제거, 보습, 영양 공급, 항알레르기, UV 차단효과 등)에 대한 효능시험을 행한 결과, 본 발명의 복합 생약 추출물이 다양한 미용 효능이 있음을 알게 되었다.
본 발명의 제비꽃 조추출물, 극성 및 비극성용매 가용추출물은 시험관상의 암세포의 성장을 저해하고 전이암모델에서 유의적으로 억제하므로, 각종 암관련 질환의 치료 및 예방에 유용한 의약품및 건강보조식품 및 미용첨가제로 사용할 수 있다.

Claims (15)

  1. 제비꽃을 세절한 후 물, 메탄올 또는 부탄올 중 어느 하나의 극성 용매를 가하여 냉침추출한 후, 추출액을 여과하고 감압농축함으로써 조추출물을 얻는 제1단계;
    상기 단계에서 얻어진 조추출물을 물에 현탁한 후, 클로로포름 또는 에틸아세테이트 중 어느 하나의 유기용매를 가하여 유기용매 불용성층과 유기용매 가용성층으로 분획함으로써 유기용매 가용부를 수집하는 제2단계;
    상기의 클로로포름 가용추출물 또는 에틸아세테이트 가용추출물을 감압농축하여 건조하는 제3단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제비꽃으로부터 항암활성물질을 추출하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 제1단계는 제비꽃을 세절한 후 즙을 짜내어 여과한 후 동결건조하여 조추출물을 얻는 것을 특징으로 하는 제비꽃으로부터 항암활성물질을 추출하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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