KR20120031706A

KR20120031706A - 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법

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Publication number: KR20120031706A
Application number: KR1020100093255A
Authority: KR
Inventors: 안주희; 허신용; 윤원병; 박성진; 박동식; 이현용
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-27
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2012-04-04

Abstract

본 발명은 추출 수율의 증진뿐만 아니라 생리활성 성분을 효과적으로 용출시킬 수 있는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 더덕 추출물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법은 초고압처리를 함으로써 물리적인 압력이 균등하게 배분되어 더덕에 함유되어 있는 유용성분의 용출을 용이하게 하여 높은 수율로 추출해낼 수 있고, 열수 추출에 비해 저온에서 추출하기 때문에 열 민감성 생리활성 물질의 불활성화를 최소화할 수 있으며, 물을 용매로 사용하여 안전한 추출물을 얻을 수 있는 효과가 있다.

Description

초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법{Preparation method of Codonopsis lanceolata extracts using ultra-high pressure}

본 발명은 추출 수율의 증진뿐만 아니라 생리활성 성분을 효과적으로 용출시킬 수 있는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 더덕 추출물에 관한 것이다.

더덕(Codonopsis lanceolata)은 쌍떡잎식물 합판화군 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴식물로 우리나라를 비롯한 일본, 중국에 분포하며, 사삼 또는 백삼이라고도 부른다. 재배역사는 오래지 않고 주로 야생에서 자라는 것을 채취하여 잔대대용 한약재와 식용으로 하던 것을 순화재배 하게 되었다. 우리나라에서는 예부터 더덕의 뿌리를 약용 또는 식용으로 널리 사용하여 왔고, 한방에서는 해독, 강장, 거담, 진해 등의 효능이 있고, 기관지염, 편도선염, 궤양, 폐결핵, 천식 등에 효과가 있는 것으로 알려져 예로부터 사삼이라 불리며 인삼대용으로 널리 이용되어 왔다. 또한, 더덕 뿌리는 항염증, 항궤양제 등으로 많이 사용하였을 뿐 아니라 간과 위, 폐 신장의 작용을 강화시켜 주는 약재로도 사용해 왔다.

또한, 더덕은 독특한 풍미로 인해 구이나 절임 식품을 비롯하여 생으로도 많이 이용되고 있으며, 일부 가공식품의 원료로도 사용되고 있다. 그러나, 잠재적 이용가치에 비해 아직은 그 활용이 매우 제한되어 있는 실정이다. 따라서 현재까지 알려진 더덕의 여러 약효는 물론 새로운 생리적 기능을 과학적으로 규명함으로써 더덕의 식품학적 우수성을 입증함과 함께 이를 이용한 고부가가치 식품소재 및 가공식품을 개발하는 것은 학문적, 기술적 측면 뿐 아니라 경제적 면에서 그 의의가 매우 클 것이다.

더덕의 대표적 약효 성분인 사포닌은 항암, 면역증강, 혈압강하, 혈당 강하, 항염증 및 항산화 효과 등 매우 다양한 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 더덕에 관한 연구는 인삼 및 홍삼류에 비해 아직 활발히 진행된 상태가 아닌데 그동안　더덕과 관련한 연구에 있어서 대표적인 것들로는 더덕의 향기성분 연구, 멜라닌 생성억제 기능 관련 연구, 기능성 성분에 의한 항산화 효과 등이 연구되어 왔다.

한편, 더덕과 같은 생약재로부터 활성물질을 분리하기 위해 많은 추출방법들이 사용되었으며, 전통적인 추출방법으로는 용매추출법, 열수추출법, 증기압추출법, 고온용매추출법, 기계적 압착법 등이 있다. 이러한 방법들은 유용성분을 효율적으로 얻지 못하고 독성물질을 용출해 내는 단점이 있으며, 생약재내의 많은 유효성분을 용출해 내기가 어렵기 때문에 최근에는 여러 가지 추출방법을 복합적으로 적용한 복합 추출 공정을 개발하는 추세이다. 특정 물질의 수율 향상과 새로운 가공법을 적용하기 위하여 최근에는 아임계/초임계 추출법, 감마선 조사 추출법, 초고압법, 고전압펄스전기장, 초음파추출의 기술이 잘 알려져 있으며, 가열살균공정으로 고주파가열, 마이크웨이브 가열이 이용되고 있다.

전통적인 방법 중 주로 사용되어오던 열수추출방법은 오랜 시간이 소요되고, 추출 효율이 낮은 단점을 지니고 있다. 게다가 많은 활성성분들이 열에 불안정하므로 가열 추출하는 과정 중에 높은 열로 인하여 생약재내의 유효 성분의 파괴, 단백질의 변성, 가용성분 위주의 추출 등과 같은 많은 문제점이 있다.

이러한 단점을 보완하고자 도입된 신기술 중 하나로서 초음파를 활용한 추출방법이 있다. 초음파 추출은 에너지를 용매에 신속히 전달할 뿐만 아니라 추출 대상 시료에 직접적으로 전달할 수 있다. 즉, 초음파 기술은 추출용매의 효율을 높일 수 있으며, 음파진동의 기계적 충격에 의해 세포막이 파괴되어 세포 내용물의 용출을 용이하게 한다. 그러나 이러한 방법은 산업적으로 적용하기가 어려운 문제점이 있다. 또한, 이산화탄소를 이용한 초임계추출 방법이 사용되기도 하나 이 방법은 추출하는 시간이 많이 걸리고 지용성물질의 추출에는 용이하나 수용성 성분의 추출에는 한계점이 있으며, 압력을 이용한 가압열수추출방법도 압력범위가 오토클레이브 수준에 머물고 있어 획기적인 추출수율의 상승은 기대할 수 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 더덕의 추출에 초고압을 이용하는 경우 더덕으로부터 유용성분의 용출을 용이하게 하여 수율을 증대시킬 수 있으며, 열수추출에 비해 저온에서 더덕을 추출하기 때문에 열 민감성 생리활성 물질의 불활성화를 최소화할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 더덕의 유용성분의 추출효율을 최적화할 수 있는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 더덕 추출물 및 상기 더덕 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 더덕을 200 ~ 500MPa의 압력, 25 ~ 35℃의 온도 및 20 ~ 30분 조건하에서 저온 초고압 처리하여 더덕으로부터 유용성분을 추출하는 단계를 포함하는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 저온 초고압 처리 시 용매로 물을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 저온 초고압 처리 시 더덕과 물을 혼합해 진공 포장하여 초고압 처리할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유용성분은 총페놀, 플라보노이드, 바닐린산(vanilic acid), p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid), p-쿠마르산(p-coumaric acid) 또는 트랜스-계피산(trans-cinnamic acid) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 추출된 더덕 추출물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 총페놀, 플라보노이드, 바닐린산(vanilic acid), p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid), p-쿠마르산(p-coumaric acid) 또는 트랜스-계피산(trans-cinnamic acid) 중 어느 하나 이상을 함유할 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법은 초고압처리를 함으로써 물리적인 압력이 균등하게 배분되어 더덕에 함유되어 있는 유용성분의 용출을 용이하게 하여 더덕으로부터 높은 수율로 추출해낼 수 있고, 열수 추출에 비해 저온에서 추출하기 때문에 열 민감성 생리활성 물질의 불활성화를 최소화할 수 있으며, 물을 용매로 사용하여 안전한 추출물을 얻을 수 있는 효과가 있다. 나아가 추출시간 및 압력의 조절로 목적하는 물질을 고수율로 분리할 수 있는 새로운 추출기술로 발전 가능하며 식품 및 의약품 산업의 활성화에 응용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 일실시예에서 다양한 추출시간 및 추출압력으로 수득한 더덕 추출물의 총페놀 함량을 나타낸 그래프이다. 여기서 a-c는 추출 시간 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타내고(p<0.05), A-C는 추출 압력 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타낸다(p<0.05).
도 2는 본 발명에 따른 일실시예에서 다양한 추출시간 및 추출압력으로 수득한 더덕 추출물의 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다. 여기서 a-c는 추출 시간 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타내고(p<0.05), A-C는 추출 압력 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타낸다(p<0.05).
도 3은 본 발명에 따른 일실시예에서 다양한 추출시간 및 추출압력으로 수득한 더덕 추출물의 DPPH 소거 활성을 나타낸 그래프이다. 여기서 a-c는 추출 시간 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타내고(p<0.05), A-C는 추출 압력 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타낸다(p<0.05).

본 발명은 더덕으로부터 다양한 유용성분을 효율적으로 추출할 수 있는 신규한 추출방법에 관한 것으로, 초고압(Ultra-high pressure)을 이용한 더덕 추출물의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.

기존에 일반적으로 사용하고 있는 열수 및 용매추출은 고온에서 장시간 추출에 따른 생리활성 물질의 손실과 경제적 손실을 초래하며, 그리고 추출공정 변수의 조절이 용이하지 않아 추출 수율의 증대와 새로운 물질의 추출을 기대하기 어렵다.

이에 본 발명자들은 기존의 열수추출 방법의 열전달 문제점과 열 민감성 물질이 손실되는 문제점을 개선하기 위해 비열 추출방법으로 알려진 초고압 추출공정을 더덕으로부터 유용성분을 효율적으로 분리하는데 응용함으로써 초고압을 이용한 더덕 추출의 최적화 공정을 개발하고자 하였으며, 초고압 추출공정의 주요 인자인 압력과 추출시간의 변화를 통한 시험을 통해 더덕에 함유되어 있는 유용성분의 추출효율을 최적화할 수 있는 공정 조건을 확립하였다.

본 발명에서는 더덕으로부터 유용물질의 추출 효율을 높이기 위하여 초고압 반응을 도입하였는데, 여기서 “초고압” 기술은 100 ~ 1000 MPa의 압력을 이용하여 압력 매체로 물이나 오일을 이용해 압력을 순간적으로 균일하게 전달시키는 비가열처리 기술 중의 하나이며, 미생물의 형태, 생화학적 반응, 세포막 및 세포벽에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 최근 들어 초고압 추출법은 생리활성 물질의 손실을 최소화하고, 높은 추출 수율을 얻을 수 있다는 점 때문에 많은 주목을 받고 있다. 초고압은 고분자의 정전기의 소수성 상호 작용을 혼란시키고 세포에 있는 침투성을 증가시키고, 기능성을 갖는 물질들의 추출을 증가시킨다.

초고압 추출 공정은 1) 압력을 증가시키는 단계, 2) 압력을 유지하는 단계, 3) 감압 단계를 포함하며, 압력을 증가시키는 제1단계는 식물(생약재) 조직의 물리적 변화를 일으키고(수축), 압력을 유지하는 제2단계는 투과성을 향상시키고(비가역 물질전달), 감압 단계인 제3단계는 확산율을 증가시킨다(조직 파열).

이러한 초고압 추출 공정에 따른 추출 수율은 추출용매의 종류, 추출시간, 온도 및 압력을 포함하는 몇몇 매개변수에 의해 영향을 받는다. 본 발명에서는 더덕으로부터 유용성분들이 다량으로 함유된 추출물을 획득하기 위하여 추출 조건을 최적화할 때 압력과 추출시간을 고려하였다.

따라서 본 발명은 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법은 구체적으로 더덕을 저온 초고압 처리하여 더덕으로부터 유용성분을 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 더덕(Codonopsis lanceolata)은 야생에서 채취한 산더덕과 인공에서 재배한 밭더덕을 모두 사용할 수 있고, 시장에서 용이하게 구입하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 식용으로 사용되는 뿌리 부분을 추출물의 제조에 사용한다. 추출에 사용되는 더덕은 수확한 후 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사용할 수 있다. 건조는 양건, 음건, 열풍건조 및 자연 건조 중 어느 하나의 방법으로 할 수 있으며, 바람직하게는 50 ~ 60℃의 온도 조건에서 5일 간 열풍건조로 건조시킬 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시키기 위해 더덕 또는 그 건체를 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수도 있다.

더덕을 초고압 처리할 때 초고압 반응기는 상용화되어 있으므로, 상업적으로 판매되고 있는 초고압 반응기를 이용할 수 있다.

본 발명의 더덕 추출물의 제조방법에 있어서 압력은 200 ~ 500MPa인 것이 바람직하다. 200MPa 미만이면 추출 효율이 미미하고, 500MPa을 초과하면 추출 효율 증가 폭이 둔화되어 비경제적이거나 특정 성분의 경우 추출 효율이 오히려 떨어지기 때문이다.

또한, 본 발명에서 상기 초고압처리는 25 ~ 35℃의 온도범위에서 20 ~ 30분 동안 수행할 수 있으며, 용매로는 물을 사용하는 것이 바람직하다. 초고압처리 온도가 25℃ 미만인 경우 추출 효율이 미미하고, 35℃를 초과하는 경우 열에 민감한 생리활성 물질들이 불활성화 되므로 바람직하지 않다. 또한, 초고압처리 시간이 20분 미만인 경우 추출 효율이 미미하고, 30분을 초과할 경우 추출효율은 크게 증가하지 않는 반면 원료에 좋지 않은 영향을 미치므로 바람직하지 않다.

또한, 상기 저온 초고압 처리 시 건조된 더덕과 물을 혼합해 진공 포장하여 초고압처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 초고압 처리에 따라 더덕으로부터 추출되는 유용성분들은 항산화 활성을 나타내며, 이러한 유용성분에는 총페놀, 플라보노이드, 페놀산 등이 포함되며, 페놀산에는 바닐린산(vanilic acid), p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid), p-쿠마르산(p-coumaric acid), 트랜스-계피산(trans-cinnamic acid) 등이 포함된다.

상기 더덕은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

또한, 본 발명은 더덕 추출물에 혹시라도 포함될 수 있는 독성 화합물들의 제거를 위해 발효 공정을 더 적용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 고초압 처리의 효과를 확인하기 위하여 초고압 추출공정의 주요 인자인 압력(0.1 ~ 500MPa)과 추출시간(0 ~ 30분)을 변화시키면서 추출을 수행하였으며, 더덕으로부터 추출한 추출물의 총페놀 함량, 플라보노이드 함량, 페놀산 함량, 항산화 활성 및 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 더덕으로부터 추출되는 유용성분 중 총페놀과 플라보노이드의 함량은 30℃, 300MPa에서 20분간 추출하였을 때 각각 648 ㎍GAE/㎖, 130 ㎍RE/㎖로 가장 높게 나타났으며, 항산화 활성은 500MPa에서 30분간 추출하였을 때 81%로 가장 높게 나타났다. 또한, 압력 수준과 추출시간 사이의 상호작용 효과를 고려하였을 때 최적의 추출 조건은 총페놀의 경우 30℃, 385MPa 및 25분, 플라보노이드의 경우 30℃, 405MPa 및 24분으로 확인되었다(도 1 내지 3 참조).

이러한 결과들을 통해 본 발명의 초고압 추출방법을 사용하면 추출 과정에서 더덕에 함유되어 있는 총페놀, 플라보노이드, 페놀산 등과 같은 항산화활성을 나타내는 유용성분들의 손실 없이 높은 추출수율로 추출물을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명에 의하여 저온 초고압처리를 통한 추출방법을 이용함으로써 기존의 열수 및 용매 추출방법들과 비교하여 고압을 이용하기 때문에 더덕 시료에 물리적인 압력이 균등하게 배분되어 더덕에 함유된 유용성분의 용출을 용이하게 하여 추출 수율을 증대시킬 수 있으며, 열수 추출에 비해 저온에서 더덕을 추출하기 때문에 열 민감성 생리활성 물질의 불활성화를 최소화할 수 있다. 또한, 물을 용매로 사용하여도 추출효율이 높게 유지되므로, 인체에 유해한 유기용매를 사용할 필요가 없고, 물을 용매로 사용하여 청정추출기법을 통한 생체 내 부작용 또는 독성 방지 효과를 달성할 수 있다. 나아가 이렇게 제조된 유용물질이 다량 함유된 추출물을 이용하여 더덕이 가지고 있는 항산화 효능을 이용한 기능성 식품, 의약품, 화장품 등의 다양한 기능성 제품의 생산에 기여해 생산성을 높일 수 있다.

또한, 본 발명의 초고압 추출 공정은 항산화 활성 이외에도 다양한 약리효능이 우수한 물질을 함유한 천연약용작물을 대상으로 기존에 알려진 활성물질의 효율적 추출과 새로운 기능성 소재를 개발하기 위한 우수한 특성을 보유한다. 이와 같은 차별화된 추출공정의 개선은 약용작물의 효율적 이용뿐만 아니라 특정 생리활성 물질의 탐색이라는 관점에서 이차적 상승효과가 기대되고, 추출시간 및 압력의 조절을 통해 목적물질을 분리하는 추출 효율을 최적화하여 고부가가치 식품, 의약품 및 화장품소재의 개발에 응용이 가능하다.

그러므로 본 발명은 초고압을 이용한 추출방법에 따라 제조된 더덕으로부터 추출된 것을 특징으로 하는 더덕 추출물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 더덕 추출물의 항산화 활성을 살펴보기 위하여 자유라디칼 소거 활성을 분석하였는데, 그 결과 본 발명의 더덕 추출물은 총페놀, 플라보노이드, 페놀산 등과 같은 항산화 효과를 나타내는 성분이 다량 함유되어 있어 종래의 추출방법으로 추출한 경우와 비교하여 더 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 것으로 나타났다(실시예 5 참조). 또한, 본 발명의 더덕 추출문은 정상세포에 대해 낮은 세포독성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다(실시예 6 참조). 이에 따라 본 발명에 따른 더덕 추출물이 우수한 항산화 효과를 나타낸다는 것을 입증하였다.

따라서 본 발명에 따른 더덕 추출물은 항산화용 조성물로 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명은 초고압을 이용한 추출방법에 따라 제조된 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 더덕 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 항산화 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 더덕 추출물의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 1 ~ 50 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 에멀젼, 액상, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 항산화 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 항산화 활성을 나타내는 약제를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 더덕 추출물은 상기 기술한 바와 같이 항산화 기능을 갖는 약학적 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 항산화 기능을 갖는 건강기능식품의 제조를 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명은 초고압을 이용한 추출방법에 따라 제조된 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 식품용 조성물은 각종 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 더덕 추출물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 더덕 추출물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 더덕 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공할 수 있다.

상기 건강보조식품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.

또한, 본원발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100㎖를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예 및 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1>

<1-1> 재료 준비

더덕(Codonopsis lanceolata Bench. et Hook.)은 강원도 홍성의 시장에서 구입하여 뿌리 부분을 추출물의 제조에 사용하였다. 먼저 물로 세척한 후, 대류 건조기(convective dryer)를 사용하여 60℃의 공기를 주입하여 5일 동안 건조시켰다. 건조된 더덕 뿌리 10g을 살균된 증류수 50㎖와 혼합하고, 살균된 비닐팩(Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA)에 넣은 후, Impulse Bag Sealer (American International Electric, Whittier, CA, USA)를 사용하여 밀봉하였다.

<1-2> 시약

폴린-시오칼토 시약(Folin-Ciocalteu reagent), 갈산(gallic acid), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 바닐린산(vanillic acid), 바닐린(vanillin), 쿠마르산(p-coumaric acid), p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid), 트랜스-계피산(trans-cinnamic acid), p-히드록시벤즈알데하이드(p-hydroxybenzaldehyde), 트랜스-페룰산(trans-ferulic acid), 및 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)은 Sigma Chemical 사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

<1-3> 초고압 추출물의 제조

밀봉된 샘플을 초고압 챔버(Ilshin Autoclave Co., Deajeon, South Korea)에 넣은 다음, 다양한 수준의 초고압(100, 200, 300, 400, 및 500 MPa)을 30℃에서 서로 다른 시간(10, 20 및 30분)동안 처리하였다. 압력을 높이는(pressure comp-up) 시간 및 감압(depressurization) 시간은 추출시간에 포함시키지 않았다. 본 발명에 따른 초고압을 이용하여 더덕 추출물을 제조하기 위해 적용한 가압(pressurization) 및 감압(depressurization) 조건의 속도를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

한편, 초고압을 가하지 않은 샘플(0.1MPa)은 종래의 방법을 사용하여 80℃에서 24시간 동안 물로 추출하였으며, 대조군으로 사용하였다.

초고압 추출 공정 동안 가압 및 감압 조건

실시예	처리		가압(pressurization)		감압(depressurization)		대기압 (MPa?분)
실시예	압력(MPa)	시간(분)	속도(MPa/분)	시간(분)	속도(MPa/분)	시간(분)	대기압 (MPa?분)
1	100	10	333.33	0.30	552.78	0.18	116.46
2	100	20	312.50	0.32	554.44	0.18	2326.98
3	100	30	333.33	0.30	498.00	0.20	3453.96
4	200	10	363.64	0.55	739.63	0.27	2575.46
5	200	20	344.83	0.58	798.40	0.25	5180.95
6	200	30	350.88	0.57	799.20	0.25	7731.98
7	300	10	344.83	0.87	998.00	0.30	4346.91
8	300	20	340.91	0.88	998.67	0.30	8680.94
9	300	30	333.33	0.90	935.94	0.32	13090.42
10	400	10	363.64	1.10	1187.88	0.33	6224.68
11	400	20	353.98	1.13	1020.00	0.38	12469.64
12	400	30	353.98	1.13	989.21	0.38	18489.92
13	500	10	344.83	1.45	1151.16	0.43	8706.43
14	500	20	322.58	1.55	1144.19	0.43	17775.78
15	500	30	340.14	1.47	1161.90	0.42	25947.48

< 실험예 1>

총페놀 함량 측정

본 발명자들은 초고압 추출방법이 더덕의 유용성분 함량에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 추출 압력 및 추출 시간에 따른 총페놀의 함량 변화를 분석하였으며, 총페놀 함량은 조금 수정된 폴린-시오칼토(folin-ciocalteu) 방법을 사용하여 측정하였다.

먼저, 상기에서 처리한 압력 및 시간의 조건을 달리하여 추출한 각 추출물 시료 0.1㎖를 10% 폴린-시오칼토 시약 1㎖와 혼합하고 25℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 10% 탄산나트륨 용액 1㎖을 첨가하여 반응시키고 25℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이후, Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 760㎚에서 흡광도를 측정하였다. 총페놀 함량은 갈산(galic acid)을 표준물질로 하여 작성한 표준 곡선으로부터 페놀화합물을 정량하여 Gallic Acid Equivalents(㎍GAE/㎖)로 나타내었다.

표준 곡선을 작성하기 위하여 갈산을 물에 용해하여 순차적으로 512, 256, 128, 64, 32 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 처리하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 더덕 추출물의 총페놀 함량은 압력이 증가할수록 증가하는 것으로 나타났으며, 총페놀 함량은 400MPa에서 10분간 추출하였을 때 614 ㎍GAE/㎖, 300MPa에서 20분간 추출하였을 때 648 ㎍GAE/㎖, 300MPa에서 30분간 추출하였을 때 635 ㎍GAE/㎖로 높게 나타났다. 이는 종래의 추출방법을 사용한 대조군(548 ㎍GAE/㎖)과 비교하여 상당히 증가한 것이다.

상기와 같은 결과를 통해 더덕 추출물을 제조하기 위해 초고압을 이용할 경우 기존 방법에 비해 더덕 조직을 바로 분해할 수 있고, 페놀, 리그닌(lignin), 플라보노이드, 폴리사카라이드, 페놀산과 같은 기능성 물질들의 용출을 증가시킨다는 사실을 알 수 있었다.

< 실험예 2>

총 플라보노이드 함량 측정

본 발명자들은 초고압 추출방법이 더덕의 유용성분 함량에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 추출 압력 및 추출 시간에 따른 총 플라보노이드의 함량 변화를 분석하였으며, 총 플라보노이드 함량은 조금 수정된 분광법을 사용하여 측정하였다.

먼저, 상기 실험예 1에서 사용한 각 추출물 시료 0.1㎖를 90% 디에틸렌 글리콘 0.8㎖와 혼합하고, 4M 수산화나트륨 0.02㎖와 반응시킨 후, 40℃에서 10분간 방치하였다. 이후, Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 420㎚에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 루틴(rutin)을 표준물질로 하여 작성한 표준 곡선으로부터 플라보노이드를 정량하여 Rutin Equivalents(㎍RE/㎖)로 나타내었다.

표준 곡선을 작성하기 위하여 루틴(rutin)을 0, 32, 64, 128 및 256㎍/㎖의 농도로 준비하여 처리하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 더덕 추출물의 플라보노이드 함량은 총페놀 함량의 변화와 유사하게 압력이 증가할수록 증가하는 것으로 나타났으며, 플라보노이드 함량은 500MPa에서 10분간 추출하였을 때 121 ㎍RE/㎖, 300MPa에서 20분간 추출하였을 때 130 ㎍RE/㎖, 300MPa에서 30분간 추출하였을 때 124 ㎍RE/㎖로 높게 나타났다. 이는 종래의 추출방법을 사용한 대조군(97 ㎍RE/㎖)과 비교하여 상당히 증가한 것이다.

상기 <실험예 1> 및 <실험예 2>의 결과로부터 압력 수준과 추출 시간 사이의 상호작용 효과를 고려했을 때, 추출 수율은 총페놀의 경우 385MPa에서 25분간 추출하였을 경우(633 ㎍ GAE/㎖), 플라보노이드의 경우에는 385MPa에서 25분간 추출하였을 경우(124 ㎍ RE/㎖) 최대로 나타났다.

< 실험예 3>

추출효율 분석

본 발명자들은 본 발명에 따른 초고압 추출방법을 사용하여 더덕으로부터 추출물을 수득할 때의 추출효율을 분석하였다. 추출효율은 총 페놀 또는 플라보노이드 함량을 대기압(barometric power, BP)으로 나누어 산출하였다. 대기압은 전체 시간 동안에(가압 시간, 추출 시간, 감압 시간을 모두 포함) 방정식 [f(x)=∫Pdt]을 사용하여 산출하였다.

100 ~ 500MPa 범위의 압력에서 각각의 추출시간에 따른 총페놀과 플라보노이드의 추출속도를 하기 표 2에 나타내었으며, 그 결과 추출속도는 10분일 때 3.76ng/㎖/BP에서 30분일 때 0.79ng/㎖/BP로 상당히 감소하는 것을 확인하였다(표 2 참조). 이러한 결과는 더덕 추출물을 제조할 때 짧은 추출 시간동안 압력 변화에 많이 의존하는 것을 나타낸다. 즉, 짧은 시간동안 추출물을 수득하기 위해서는 압력이 중요한 요인으로 작용한다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 10 ~ 30분 범위의 추출시간에서 각각의 추출압력에 따른 총페놀과 플라보노이드의 추출속도를 하기 표 3에 나타내었으며, 그 결과 추출속도는 압력이 증가함에 따라 점차 감소하였으며, 총페놀의 경우 100MPa에서 13.66 ng/㎖/BP, 200MPa에서 5.13 ng/㎖/BP, 300MPa에서 4.65 ng/㎖/BP, 400MPa에서 0.53 ng/㎖/BP, 그리고 500MPa에서 0.66 ng/㎖/BP로 나타났다(표 3 참조). 이러한 결과는 더덕으로부터 추출물을 추출할 때 300MPa 이상의 높은 압력에서는 200MPa 이하의 낮은 압력에서 보다 추출시간에 대한 민감성이 낮아지는 것을 보여준다. 즉, 300MPa 이상의 높은 압력에서는 추출시간이 추출속도의 변화에 큰 영향을 주는 요인이 아니라는 사실을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해 총페놀과 플라보노이드의 함량에 대한 추출시간과 압력의 효과는 초고압 추출 과정의 시작 단계에서 더 확실하게 나타남을 알 수 있었으며, 확산과 평형의 빠른 비율 때문에 초고압 추출 과정에서 투과성이 증가하는 반면, 높은 압력은 용해도의 변화를 야기한다.

총페놀과 플라보노이드의 추출시간에 따른 추출속도

추출시간(분)	추출속도(ng/㎖/BP)
추출시간(분)	총페놀	플라보노이드
10	3.76 ± 0.56_A	1.58 ± 0.57_A
20	1.32 ± 0.69_AB	0.57 ± 0.04_B
30	0.79 ± 0.02_B	0.28 ± 0.06_B

* A-B는 유의적인 차이가 있음을 나타냄(p<0.05).

총페놀과 플라보노이드의 압력에 따른 추출속도

추출압력(MPa)	추출속도(ng/㎖/BP)
추출압력(MPa)	총페놀	플라보노이드
100	13.66 ± 1.32_A	2.42 ± 0.11_A
200	5.13 ± 2.97_AB	1.47 ± 0.51_B
300	4.65 ± 0.03_B	0.98 ± 0.79_BC
400	0.53 ± 0.66_B	0.51 ± 0.20_C
500	0.66 ± 0.27_B	0.24 ± 0.03_C

* A-B는 유의적인 차이가 있음을 나타냄(p<0.05).

< 실험예 4>

페놀산 함량 분석

본 발명자들은 초고압 추출방법이 더덕의 유용성분 함량에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 상기 실험예 1에서 사용한 각 추출물, 즉 각기 다른 추출 압력 및 추출 시간으로 수득된 더덕 추출물의 페놀산 함량 변화를 분석하였으며, 유리 페놀산 함량은 UV absorbance detector(280nm)를 구비한 high-performance liquid chromatography (HPLC, Waters M600E; Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다.

이동상은 용매 A(1mM TFA를 함유한 10% 아세토니트릴) 및 용매 B(1mM TFA를 함유한 40% 메탄올 및 40% 아세토니트릴)를 사용하여 분석하였으며, 성분 프로파일은 유속 1㎖/분에서 다음과 같이 설정하였다(A:B, 시간); 90%:10%, 0분; 90%:10%, 0-10분; 60%:40%, 10-15분; 60%:40%, 15-24분; 0%:100%, 24-40분; 90%:10%, 40-45분; 90%:10%, 45-50분.

피크는 p-hydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzaldehyde, vanillic acid, vanillin, p-coumaric acid, trans ferulic acid 및 trans-cinnamic acid를 포함하는 표준물질에 대하여 머무름 시간으로 확인하였다.

그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 더덕 추출물에서 유리 페놀산의 함량은 추출시간과 압력이 증가할수록 조금 증가하는 것으로 나타났다. 바닐린산(vanilic acid)의 함량은 20.4 ~ 40.7㎍/㎖ 정도로 유리 페놀산 중에서 가장 많이 함유되어 있는 것으로 나타났고, 다음으로 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)이 9.4~19.6㎍/㎖, p-쿠마르산(p-coumaric acid)이 1.6 ~ 2.3㎍/㎖, 트랜스-계피산(trans-cinnamic acid)이 1.1 ~ 2.1㎍/㎖ 함유되어 있는 것으로 나타났다. 종래의 추출방법으로 추출한 대조군의 바닐린산, p-히드록시벤조산, p-쿠마르산 및 트랜스-계피산의 함량은 각각 16.9, 1.07, 1.3 및 0.7㎍/㎖로 본 발명의 초고압 추출방법에 따른 더덕 추출물 보다 상대적으로 낮은 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해 초고압 추출방법을 사용할 경우 더덕으로부터 페놀산을 효과적으로 추출할 수 있음을 알 수 있었다. 초고압 추출 과정 동안 페놀산, 리그난(lignans), 폴리사카라이드, 플라보노이드의 함량은 그들의 극성에 따라 증가하거나 감소하는데, 에탄올, 메탄올, 물과 같은 극성 용매는 플라보노이드 글리코시드, 폴리사카라이드, 페놀산과 같은 극성 물질들을 추출할 수 있다. 이때, 압력이 증가하면 극성 물질들의 추출에서 환원을 이끌어 내는 극성도를 감소키는 결과를 가져오게 되므로 추출 함량을 더 높일 수 있다.

페놀산의 함량(㎍/㎖)

페놀산 종류	압력 (MPa)	추출시간(분)
페놀산 종류	압력 (MPa)	10	20	30
p-히드록시벤조산	100	9.40 ± 0.42_C,b	11.93 ± 0.37_B,a	12.75 ± 1.00_B,a
	200	11.87 ± 0.41_B,c	13.54 ± 1.75_B,b	20.19 ± 1.04_A,a
	300	18.12 ± 1.04_A,a	19.00 ± 0.33_A,a	19.16 ± 1.07_A,a
	400	19.53 ± 0.54_A,a	19.22 ± 1.04_A,a	19.60 ± 0.83_A,a
	500	18.26 ± 1.25_A,a	19.02 ± 0.62_A,a	18.98 ± 0.76_A,a
바닐린산	100	20.40 ± 0.24_C,b	23.03 ± 0.26_B,a	23.51 ± 0.90_B,a
	200	33.06 ± 0.47_AB _,b	37.22 ± 0.57_A,a	38.75 ± 2.14_A,a
	300	32.42 ± 2.39_B,b	39.94 ± 0.28_A,a	38.46 ± 1.68_A,a
	400	35.33 ± 1.07_AB _,a	37.33 ± 0.54_A, _ab	39.63 ± 0.97_A,a
	500	36.40 ± 1.68_A,a	38.54 ± 1.91_A,a	40.68 ± 0.85_A,a
p-쿠마르산	100	1.55 ± 0.22_B,a	1.79 ± 0.15_A,a	1.89 ± 0.23_A,a
	200	2.01 ± 0.17_AB _,a	1.99 ± 0.29_A,a	2.06 ± 0.21_A,a
	300	1.94 ± 0.20_AB _,a	2.06 ± 0.16_A,a	2.24 ± 0.44_A,a
	400	1.85 ± 0.18_AB _,a	2.18 ± 0.15_A,a	2.32 ± 0.15_A,a
	500	2.03 ± 0.17_A,a	2.09 ± 0.14_A,a	2.27 ± 0.23_A,a
트랜스-계피산	100	1.13 ± 0.11_C,a	1.13 ± 0.32_B,a	1.28 ± 0.10_C,a
	200	1.18 ± 0.10_BC _,b	1.18 ± 0.04_B,b	1.57 ± 0.17_BC _,a
	300	1.42 ± 0.14_AB _,a	1.44 ± 0.16_B,a	1.63 ± 0.11_ABC _,a
	400	1.58 ± 0.05_A,a	2.10 ± 0.22_A,a	2.08 ± 0.32_A,a
	500	1.44 ± 0.15_AB _,a	1.53 ± 0.10_B,a	1.77 ± 0.12_AB _,a

* A-C는 컬럼(column) 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타내고(p<0.05), a-c는 줄(row) 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타냄(p<0.05).

< 실험예 5>

자유라디칼 소거 활성 분석

본 발명자들은 더덕 추출물의 항산화 활성을 분석하였으며, 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능 분석법을 이용하여 측정하였다.

먼저, 실험예 1에서 사용한 각 추출물 시료 0.1㎖를 0.2mM DPPH 라디칼이 포함된 95% 에탄올 0.5㎖와 혼합한 다음 25℃에서 30분간 배양하였다. 이후, Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다.

항산화 활성은 다음과 같은 식으로 계산하였다;

DPPH 소거 활성(%) = [1(AE/AC)]×100

상기 식에서, AC는 대조군의 흡광도, AE는 더덕 추출물의 흡광도를 나타낸다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 더덕 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 추출 시간이 일정할 때 압력이 증가할수록 점진적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 라디칼 소거 활성은 500MPa에서 10분, 20분, 30분 추출하였을 때 각각 77%, 76%, 81%로 높게 나타났다(도 3 참조). 종래의 추출방법으로 추출한 대조군의 DPPH 라디칼 소거능은 68%로 본 발명에 따른 초고압 추출방법으로 추출한 경우가 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.

일반적으로 폴리페놀, 페놀산 및 플라보노이드는 전자/수소 기여자, 금속 이온 킬레이트화, 자유 라디칼 소거, 지방산화효소(lipoxygenase inhibition) 억제와 관련된 연쇄절단형 항산화제(chain-breaking antioxidant)와 같은 항산화 활성에 주로 영향을 미친다.

그러나 본 발명에 따라 제조된 더덕 추출물의 라디칼 소거능은 초고압 추출 의해 추출된 총페놀 및 플라보노이드의 함량에 따른 상관성이 그리 높지 않다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 초고압 추출 과정에서 비페놀 및 비플라보노이드와 같은 다른 잠재적인 산화방지제가 추출될 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 6>

세포독성 분석

본 발명자들은 더덕 추출물의 세포독성 활성을 분석하였으며, 세포독성은 sulforhodamine B(SRB) 분석법을 이용하여 측정하였다.

인간 배아 신장(Human Embryonic Kidney) 세포인 HEK 293 세포주를 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

HEK 293 세포는 10% FBS(Sigma-Aldrich)를 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 배양된 세포는 트립신-EDTA(Gibco, Grand Island, NY, USA)로 처리하고, 신선한 배지로 세척한 다음 각 웰당 1×10⁴ cells/㎖씩 96 웰 플레이트로 옮겼다. 24시간 동안 배양한 후, 상기 실험예 1에서 사용한 각 더덕 추출물 100μL을 각 웰에 넣고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 상등액을 제거한 후, 10% 트리클로로 아세트산(TCA) 100μL를 각 웰에 넣었다. 96-웰 플레이트는 4℃에서 1시간 동안 방치하고, 살균된 증류수로 5회 세척하고 25℃에서 건조하였다. 세포는 1% 아세트산에 0.4% SRB를 용해한 용액 50μL를 가하여 25℃에서 30분간 염색하고, 1% 아세트산으로 3회 세척한 후 공기 중에서 건조하였다. SRB가 결합된 세포는 10mM 트리스 버퍼 100μL에 용해하였다. 흡광도는 Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 540㎚에서 측정하였다. HEK 293에서 더덕 추출물의 세포독성은 다음과 같은 식으로 계산하였다;

세포독성 활성(%) = [1(AE/AC)]×100

그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 더덕 추출물의 HEK 239 세포주에 대한 세포독성 활성은 추출시간이 10분일 때 압력이 증가함에 따라 21%에서 25% 정도로 증가하는 것으로 나타났다.

그러나 본 발명에서 나타난 세포독성 활성은 이전의 보고(Kim, S. S., Ha, J. H., Jeong, M. H., Ahn, J., Yoon, W. B., Park, S. J., Seong, D. H., and Lee, H. Y.: Comparison of biological activities of fermented and fresh Codonopsis lanceolata, Korean J. Medcinal Crop Sci., 17, 280-285, 2009)에서 HEK 293에 대해 더덕 추출물의 세포독성이 24%로 나타난 결과와 비교하였을 때 거의 유사하거나 또는 그 이하의 세포독성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.

또한, 이전의 연구에서 페놀산, 당, 단백질, 사포제닌 및 프로사포제닌을 포함하는 더덕 추출물이 위암(SNU-1), 자궁경부암(Hela), 전골수구성백혈병(HL-60), 인간 단핵(U937)세포에 대하여 높은 억제활성을 나타낸다는 것이 보고된 바 있다. 이는 본 발명에 따른 더덕 추출물이 정상세포인 HEK 293 세포에 대해 낮은 세포독성을 나타낸다는 사실을 통해, 정상세포에 대해서는 세포독성이 낮으며, 반면, 암세포에 대해서는 암세포 증식을 선택적으로 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

세포독성 활성(%)

압력 (MPa)	추출시간(분)
압력 (MPa)	10	20	30
100	20.59 ± 0.76_B	23.11 ± 1.86_A	24.81 ± 1.61_A
200	22.60 ± 1.72_AB	23.72 ± 2.31_A	25.11 ± 1.98_A
300	22.13 ± 2.68_AB	24.34 ± 1.04_A	25.26 ± 2.80_A
400	25.07 ± 1.45_A	26.29 ± 1.34_A	24.83 ± 1.73_A
500	24.96 ± 1.47_A	24.02 ± 2.67_A	25.87 ± 1.47_A

* A-B는 컬럼(column) 내에서 유의적인 차이가 있음을 나타냄(p<0.05).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

더덕을 200 ~ 500MPa의 압력, 25 ~ 35℃의 온도 및 20 ~ 30분 조건하에서 저온 초고압 처리하여 더덕으로부터 유용성분을 추출하는 단계를 포함하는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 저온 초고압 처리 시 용매로 물을 사용하는 것을 특징으로 하는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 저온 초고압 처리 시 더덕과 물을 혼합해 진공 포장하여 초고압처리하는 것을 특징으로 하는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 유용성분은 총페놀, 플라보노이드, 바닐린산(vanilic acid), p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid), p-쿠마르산(p-coumaric acid) 또는 트랜스-계피산(trans-cinnamic acid) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 초고압을 이용한 더덕 추출물의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 추출된 더덕 추출물.
제5항에 있어서,
상기 추출물은 총페놀, 플라보노이드, 바닐린산(vanilic acid), p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid), p-쿠마르산(p-coumaric acid) 또는 트랜스-계피산(trans-cinnamic acid) 중 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 더덕 추출물.
제5항의 더덕 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물.