KR100799655B1 - 왕대 추출물 및 이로부터 분리한 ｇｍｈｂ 화합물을포함하는 항산화용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성 갖는 왕대(Phyllostachys bambusoides SIEB. et ZUCC.) 추출물 및 이로부터 분리한 GMHB 화합물에 관한 것으로, 본 발명의 왕대 추출물 및 이로부터 분리한 GMHB 화합물은 뛰어난 DPPH 유리기 소거능 및 높은 항산화 활성(TEAC value) 수치를 나타내므로 세포막 지질과산화에 의한 노화 억제용 약학조성물, 건강기능식품, 식품의 산화방지용 조성물 및 화장료 조성물로서 사용될 수 있다.

대나무, 왕대, 줄기, 항산화, 노화 억제, 화합물, 약학 조성물, 건강기능식품, 산화방지.

Description

왕대 추출물 및 이로부터 분리한 ＧＭＨＢ 화합물을 포함하는 항산화용 조성물{Composition comprising an extract of Phyllostachys bambusoides SIEB. et ZUCC. and a GMHB compound isolated from the extract thereof showing anti-oxidative activity}

도 1은 왕대 추출물로부터 용매별 분획물을 획득하는 방법을 나타낸 도이며,

도 2a는 왕대 에틸아세테이트 추출물의 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 나타낸 도이고,

도 2b는 분획물들의 DPPH 유리기 소거능을 나타낸 도이며,

도 3은 왕대 에틸아세테이트 추출물로부터 정제된 분획물 1의 HPLC 분석결과를 나타낸 도이고,

도 4는 왕대 에틸아세테이트 추출물로부터 정제된 분획물 2의 HPLC 분석결과를 나타낸 도이며,

도 5는 HPLC 분석에 의해 정제된 화합물 1의 순도 분석을 나타낸 도이고,

도 6은 HPLC 분석에 의해 정제된 화합물 2의 순도 분석을 나타낸 도이며,

도 7은 왕대로부터 정제된 화합물 1의 UV 스펙트럼을 나타낸 도이고,

도 8은 왕대로부터 정제된 화합물 2의 UV 스펙트럼을 나타낸 도이며,

도 9는 왕대로부터 정제된 화합물 1의 LC/MS 스펙트럼을 나타낸 도이고,

도 10은 왕대로부터 정제된 화합물 2의 LC/MS 스펙트럼을 나타낸 도이며,

도 11은 왕대로부터 정제된 화합물 1의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이고,

도 12는 왕대로부터 정제된 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이며,

도 13은 왕대로부터 정제된 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이고,

도 14는 왕대로부터 정제된 화합물 1의 HMBC 상관관계를 나타낸 도이며,

도 15는 왕대로부터 정제된 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이고,

도 16은 왕대로부터 정제된 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.

본 발명은 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물을 함유하는 항산화용 조성물에 관한 것이다.

식용유지나 지방질 식품은 가공 및 저장 중에 여러 가지 원인에 의해 불쾌한 냄새나 맛을 내거나 또는 독성을 나타내기도 하는데 이러한 유지의 변질은 주로 자동산화에 의해 일어나고 있다. 또한 생체 내에서 산화와 관련된 현상으로 인식되고 있는 노화의 원인 중의 하나로 산소에서 유래되는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (superoxide anion radical), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 일중항 산소(singlet oxygen) 및 과산화수소(H₂O₂) 등을 포함한 활성산소의 역할이 대두되어 이들에 대한 관심이 현재 매우 높아지고 있다(L. Fridorich, Science, 201, pp875-881, 1978). 생체막 구성성분인 인지질의 불포화지방산은 활성산소종과 같은 자유라디칼(free radical)에 의해 과산화 반응이 개시되며 또한 연쇄적으로 진행된다. 그러므로 자유라디칼에 의한 과산화반응은 세포막의 투과성을 항진시킬 뿐만 아니라 전반적인 세포독성을 초래하여 노화현상이나 이에 따른 여러 가지 질환의 병리현상을 유도하여 발암과정에도 관여한다(M. T. Huang, et al., Food phytochemicals for cancer prevention Ⅰ, pp50, 57-57, 71-73, 1994; C. T. Ho, et al., Food phytochemicals for cancer prevention Ⅱ, 155, pp20-31, 183-186, 1994). 상기 과산화반응과 같은 산화적 스트레스와 관련된 질환에는 암, 복합성 동맥경화, 관절염, 심장혈관계 질환 및 파킨슨씨병이 있다.

따라서 과일과 채소에 많은 페놀(phenol)성 화합물, 플라본(flavone) 유도체, 토코페롤, 아스코르브산, 셀레늄과 같은 항산화물질은 지방의 산화를 지연시키거나 방지하며 암, 심장혈관계 질환 등을 예방 및 지연시킴으로써 노화방지에도 중요한 역할을 한다(G. Papadopoulos, et al., J. Am. Oil. Chem . Soc ., 68, pp669-673, 1991; P. F. Yang, et al., J. food Sci ., 49, pp489-492, 1984).

유지 또는 유지 함유 식품의 산패는 주로 공기 중의 산소와 결합에 의해 일어나는데 이를 방지하기 위해 많은 합성 또는 화합물이 개발되어 왔으나 그 효과와 경제성 때문에 실제로 많이 사용되고 있는 것은 합성 항산화제로서 BHT(butylated hydroxytoluene), BHA(butylated hydroxyanisole), PG(propylgallate) 등이 있다(A. L. Branen, J. Am. Oil. Chem . Soc ., 55, pp119-123, 1975; J. M. Deman, Lipids in principles of Food Chemistry, 57, pp507-512, 1990). 합성 항산화제는 항산화력이 뛰어나 상업용 식품에 가장 많이 사용되고 있지만 이들은 식품에 사용시 안전성에 대한 우려로 그 사용량이 법적으로 규제되어 있다. 토코페롤과 같은 천연물은 안전하기는 하나 단독으로는 산화 연쇄반응 저지 능력이 낮고 가격이 비싼 단점이 있다.

따라서 최근에는 각종 생약과 식용 식물 추출물 등에서 보다 안전하고 항산화 효과가 뛰어난 천연 항산화제를 개발하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

대나무는 껍질, 가지, 잎, 순, 내피인 죽여 등이 예로부터 한약재로 이용되어 왔다. 특히 대나무 잎은 맛이 쓰고 성질이 차서 열 내림, 피멎이 약, 중풍, 고혈압 등에 민간요법으로 사용되어 왔고, 살균 및 항 진균작용과 항암효과도 있는 것으로 알려져 있다. 또한 대나무를 가열하여 추출한 죽력은 동의보감, 본초강목, 중약대사전 등에서 중풍, 고혈압을 치료하는데 탁월한 효과가 있고 노화방지에 좋은 작물로 소개되고 있다.

왕대(Phyllostachys bambusoides SIEB. et ZUCC.)는 줄기가 매끈하고 곧게 자라고 녹색에서 황록색으로 된다. 5~6월경에 나오는 죽순은 식용하거나 약용한다(정보섭 및 신민교 저, 도해향약대사전, 영림사, pp204-205, 1998).

그러나 상기 문헌 어디에도 본 발명의 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물이 항산화 활성을 가지고 있음이 교시되거나 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 DPPH 유리기 소거능 및 항산화능 확인 실험(TEAC value)을 통하여 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물의 항산화 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항산화 활성을 나타내는 왕대 추출물 및 이로부터 분리한 GMHB 화합물을 유효성분으로 함유하는 세포막 지질과산화에 의한 노화 억제용 약학조성물, 건강기능식품 및 식품의 산화방지제용 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 왕대(Phyllostachys bambusoides SIEB. et ZUCC.) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (A)로 표현되는 신규 화합물인 1-β-D-글루코피라노실옥시-3-메톡시-4-하이드록시벤젠(1-β-D-glucopyranosyloxy-3-methoxy-4-hydroxybenzene, 이하, GMHB라 함)을 제공한다.

(A)

상기 왕대 추출물은 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물로써, 극성용매 가용 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50 내지 80% 혼합비의 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함하며, 비극성용매 가용추출물은 ｎ-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 에틸아세테이트로 추출한 것을 포함한다.

상기한 GMHB 화합물은 왕대(Phyllostachys bambusoides SIEB. et ZUCC.)를 건조하여 물, 메탄올, 에탄올 등의 C₁ 내지 C₄의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매 또는 ｎ-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로부터 선택된 비극성용매로 상온에서 12시간 추출, 분리하여 추출물을 수득한 후, HPLC를 실시하여 본 발명의 GMHB 화합물을 수득할 수 있다.

상기 왕대는 뿌리, 줄기, 잎 등의 재료를 포함하며, 특히 왕대 줄기임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 왕대 추출물 및 이로부터 분리되는 GMHB 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 왕대 추출물은 왕대를 동결건조 후 마쇄하여 분말화 한 후, 왕대 건조 중량의 약 5 내지 30배, 바람직하게는 약 15 내지 20배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 에탄올로 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 20 내지 70 ℃의 추출 온도에서 약 1 내지 24시간, 바람직하게는 2 내지 15시간 동안, 바람직하게는 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 연속 추출하여 수득한 후, 감압여과하고 여액을 진공회전농축기로 30 내지 60℃, 바람직하게는 40 내지 50℃에서 감압농축하여 물, 저급알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 왕대 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 왕대 추출물로부터 본 발명의 GMHB 화합물을 분리하는 방법은 구체적으로 하기와 같다.

상기 방법으로 수득한 왕대 추출물을 물에 현탁한 후, n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순으로 용매를 이용하여 추출하여 본 발명의 왕대 비극성용매 가용 추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 왕대 추출물 즉, 왕대 에탄올 추출물에 n-헥산:물:메탄올 을 일정 비율, 바람직하게는 10:9:1로 혼합하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 수가용성 분획물을 디클로로메탄으로 추출하여 수가용성 분획물 및 디클로로메탄 가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 마지막으로 상기 수가용성 분획물을 부탄올로 추출하여 부탄올 가용성 분획물과 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

상기 비극성 용매 가용성 분획물에 대하여 LH-20 컬럼 크로마토크래피(column chromatography)를 수행할 수 있으며, 이동상은 10% 메탄올로 하여 시간당 일정용량, 바람직하게는 8㎖/9분(min)의 속도로 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 2개의 분획물을 수득할 수 있다.

상기 분획물 1 및 분획물 2를 다시 반-분취(semi-preparative) HPLC로 물과 아세토니트릴(acetonitrile)의 농도기울기 용출로 분리하고, 세파덱스로 정제하여 본원 발명의 신규 화합물인 GMHB를 분리할 수 있다.

상기와 같이 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물의 항산화 활성을 조사하기 위하여, DPPH 유리기 소거능에 대한 효과를 측정해본 결과, 본 발명에 따른 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물이 유리기를 효과적으로 저해함을 확인하였다.

본 발명의 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 제법으로부터 수득가능한 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물을 유효성분으로 함유하는 세포막 지질과산화에 의한 노화억제용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 왕대 추출물은 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물로써, 극성용매 가용 추출물은 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50 내지 80% 혼합비의 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함하며, 비극성용매 가용추출물은 ｎ-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 에틸아세테이트로 추출한 것을 포함한다.

본 발명의 세포막 지질과산화에 의한 노화의 억제용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 및 GMHB 화합물을 0.5 % ~ 50 % 중량으로 포함한다.

본 발명의 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물을 포함하는 항산화 활성을 나타내는 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용하는 부형제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 및 GMHB 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 및 GMHB 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물 및 GMHB 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 및 GMHB 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 및 GMHB 화합물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따 라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물 및 GMHB 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 및 GMHB 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 항산화 효과를 나타내는 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 세포막 지질과산화에 의한 노화 억제용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 추출물 및 GMHB 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한 항산화 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 및 GMHB 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본원에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함하며, 하기에 예시한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 및 GMHB 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물 및 GMHB 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 및 GMHB 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 및 GMHB 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명의 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물을 유효성분으로 함유하는 식품의 산화방지용 조성물을 제공한다.

이 때 상기 조성물은 식품에 침지, 분무 또는 혼합하여 식품에 첨가할 수 있으며, 이러한 첨가 비율은 0.01 % ~10 %의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 상기 식품은 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 중 어느 하나 이상을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 왕대 추출물의 제조

왕대(Phyllostachys bambusoides SIEB. et ZUCC.)는 경남 진주의 남부임업연구소에서 제공 받아 건조줄기 100g를 고운 가루로 빻았고, 이 시료 100g에 70% 에탄올 2ℓ를 가하여 상온에서 12, 6, 3시간씩 세 번 추출한 다음, 45°C의 감압 농축기(rotary vacuum evaporator; Buchi B-490, Switzerland)에서 농축건조 및 동결건조하여 총 수득량 4.4g을 얻어 이를 분말화하였다.

실시예 2. 용매별 왕대 분획물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 70% 에탄올 추출물 4.4g을 핵산:70% 에탄올:물(10:9:1,v/v/v)로 분획하여 핵산추출물을 얻은 후, 헥산(hexane),디클로로메탄(dichlormethane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol) 및 물(water)의 순서대로 추출한 다음, 각각의 분획을 45℃ 감압 농축기(rotary vacuum evaporator)에서 농축건조하여 헥산 분획물 0.14g, 디클로로메탄 분획물 0.15g, 에틸아세테이트 분획물 0.39g, 부탄올 분획물 0.91g 및 수층 분획물 2.81g을 각각 수득하였다(도 1 참조).

이 중 에틸아세테이트 추출물이 비교적 높은 수득률과 가장 높은 항산화 활성을 나타내므로, 에틸아세테이트 추출물을 동결 건조시켜 분말화한 다음, -20℃의 냉동고에서 저장하여 실험에 사용하였다.

실시예 3. 왕대 추출물로부터 화합물의 분리, 정제 및 구조 분석

3-1. 화합물의 분리, 정제

3-1-1. LH -20 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)

수지(Resin)는 10% 메탄올 500mL에 2시간동안 팽윤시켰다. 팽윤시킨 수지를 유리관(30× 25cm, Amersham Bioscience, SR 25)에 채워 넣고 다시 12시간동안 팽윤시켰다.

에틸아세테이트 추출물 0.6mg을 10% 메탄올 2mL에 용해하여 주사기 필터(No.66 Whatman, Maidstone, Britain)로 여과시켰다. 이동상은 10% 메탄올로, 분획 물(fraction)들은 약 8mL/9분(min)/테스트 튜브(test tube)의 속도로 분획물 수집기(fraction collector; Gilson FC205, France)에 수집하였다.

10번 희석 후에 용리제의 UV 흡수율은 254nm 및 280nm으로 분석되었다. 이 용리액의 항산화 활성은 DPPH 유리기 소거능 분석(radical scavenging assay)을 이용하여 분석하였다.

그 실험결과, 화합물(compound) 1을 포함하는 분획물(fraction) 1은 높은 UV 흡광도와 DPPH 유리기 소거능을 나타내었고, 화합물(compound) 2를 포함하는 분획물(fraction) 2도 연이어서 나타났다(도 2a 및 도 2b 참조).

3-1-2. HPLC 분석

상기 2가지의 분획물들의 분류물들은 LH-20 크로마토그래피(chromatograpy)로 분리하였고, 이 물질들을 다시 분석용(analytical) HPLC로, 반-분취(semi-preparative) HPLC로 분리하였다.

3-1-2-a. 반- 분취 (semi-preparative) HPLC

상기 실시예 3-1-1의 LH-20 크로마토그래피부터 얻어진 분획물 1 및 분획물 2의 두 분획물들을 반-분취 HPLC로 분석했다.

각 분획물들은 4mL로 농축하였고, 제미나이(Gemini) 10μ C₁₈ 컬럼(250× 10.0mm, Phenomenex, 미국)을 정제하는데 사용하였다. 이동상 전개용매 A는 물(0.05% TFA; trifluoroacetic acid 함유), B는 아세토니트릴(0.05% TFA)로서 30분간 0~10% 농도 시스템(gradient system)으로 전개하였고, 흐름속도는 3 mL/분 (min), 주입량은 50 μL으로 280nm에서 흡광도를 측정하였다.

농도 시스템은 다음과 같았다. 화합물 1의 경우, 아세토니트릴 농도는 8분동안 0%에서 10%로 증가되었고, 목표 분류는 12분 내에 용리되었다. 화합물 2의 경우, 아세토니트릴 농도는 10분여간 분석 중에 10%에서 20%로 증가되었고, 목표 분류 12분 내에 용리되었다.

화합물 1의 분리 시간은 12.3분이었으며, 화합물 2는 20.4분이었다(도 3 및 도4 참조).

각 화합물들의 분류물(fractionation)들을 수집하여 상기 수집된 분류물들을 냉동건조하여 분말하였으며, 각 물질의 순도는 분석용(analytical) HPLC로 확인하였다.

3-1-2-b. 분석용 HPLC 분석(Analytical HPLC analysis)

분석용 HPLC(analytical HPLC; Agilent1100 시리즈, 미국)를 이용하여 예비특성 분석을 행하였고, 이 때, SB-C₁₈ 컬럼(SB-C₁₈ column; Agilent, 250× 4.6mm, 미국)을 사용하였다.

이동상은 0.05% (v/v) TFA의 물과 아세토니트릴이었다. 흐름속도는 1 ㎖/분이였고, 한번에 10 μL/씩 주입(injection) 하여 DAD(diode array detetor)로 205nm, 254nm, 280nm 및 320nm의 파장에서 분석하였다.

농도 시스템은 다음과 같았다. 첫 번째의 경우, 30분간 분석한 결과, 아세토니트릴의 농도가 0%에서 10%로 증가하였으며, 두 번째의 경우, 30분간 분석한 결 과, 아세토니트릴 농도가 0%에서 20%로 증가하였다.

상기 실시예 3-1-2-a의 반-분취 HPLC로부터 분리된 분류물들을 분말화한 후, HPLC로 순도를 분석하였다.

화합물 1의 분리시간은 11.8분, 화합물 2는 22.3분이었다(도 5 및 도 6 참조).

3-2. 화합물의 구조 분석

3-2-1. UV-스펙트라(spectra)

이 두 물질의 최대 흡광도가 190nm으로부터 400nm인 것으로 분석되었다. 화합물(compound) 1의 최대 흡광도는 248nm, 화합물(compound) 2는 278nm에서였다(도 7 및 도 8 참조).

3-2-2. LC/MS

애질런트 LC/MSD 1100 시리즈(Agilent LC/MSD 1100 series, 미국)는 이 두 화합물의 분자량을 결정하는데 사용하였다.

두 화합물들을 LC/MS에 주입하였으며, 농도 시스템은 95% (v/v) 물과 0.4%(v/v) 포름산(formic acid)이 함유된 5% 아세토니트릴를 사용하였다.

Mass ESI 모드는 건조 가스 유속{dry gas (nitrogen) flow} = 10 L/분(min); 분무기 압력(nebulizer pressure) = 30psi; 건조 가스 온도 = 350℃, 모세관 전압(capillary voltage) = 2500V; 조각 전압(fragment voltage)=100V; 분자량 범위(mass range) = 100-1000Da.와 같았다.

Mass APCI 모드는 건조 가스 유속{dry gas (nitrogen) flow} = 5 L/분(min); 분무기 압력(nebulizer pressure) = 60psi; 건조 가스 온도 = 350℃, 기화기(vaporizer) = 325℃; 모세관 전압(capillary voltage), 양이온 및 음이온 모드(positive and negative mode) = 4000V; 코로나 흐름(corona current), 양이온 모드(positive mode) = 4μA, 음이온 모드(negative mode) = 20μA; 조각 전압(fragment voltage) = 150V; 분자량 범위(mass range) = 100-1000Da.와 같았다. 양이온과 음이온 모드 모두 구조 분석을 위해 사용하였다.

LC/MS는 알려지지 않는 물질들의 분자무게를 예측하기 위해 사용되었는데 ESI(Electon Spray Ionization) 모드와 APCI(Amersphere Pressure Chemical Ionization) 모드를 동시에 사용하였다.

화합물 1의 분자무게는 302Da.이었고, 화합물 2의 분자무게는 351Da.이였다(도 9 및 도 10 참조).

화합물 1의 매스 스펙트럼에서, 123.2의 피크(peak)는 산소 음이온을 소실한 상태의 아글리콘을 나타내고, 138.2의 피크는 아글리콘 그룹을 나타낸다.

3-2-3. FT-IR

화합물 1의 기능기는 FT-IR을 통해 분석하였다. 해상도는 4cm^{- 1} 이었고 스캔 넘버(scan number)는 40이었다. 팰렛(Pellet)에 브롬화칼륨(KBr) 가루 2mg를 사용하였다.

FT-IR은 화합물 1의 기능군들을 측정하기 위해 사용하였다. 웨이브 넘버 (wave number) 3396, 2922, 2362, 1616, 1513 (cm^-1) 에서, 흡광도 피크를 나타내었다. 이는 화합물 1의 구조 안에 벤젠고리와 하이드록실 그룹(hydroxyl group)이 있을 수 있다는 것을 의미한다(도 11 참조).

3-2-4. NMR

화합물 구조는 ¹H 와 ¹³C NMR (JNM-ECX 600, JEOL Co, Japan)를 통해 분석하였고, 추가적인 분석을 위해 DEPT(Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)도 적용하였다. 정제된 화합물 8mg을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 용해한 후, 600MHz NMR 기계로 분석하였고, TMS(tetramethylsilane)를 기준으로 사용하였다.

3-2-4-a. 화합물(compound) 1의 구조 결정

H-NMR과 C-NMR이 화합물 1의 구조를 분석하기 위해 사용되었다(도 12 및 도 13 참조). 대략 6.43에서 6.7의 H-NMR 스펙트라 안에서 이중선이 피크를 이루는 부분이 3곳이 있었는데, 이는 벤젠 고리 구조를 표시한다. 3.72nm상에서, 메톡실(methoxyl) 군을 표시하는 단일선 피크는 하나 있었고, 대략 3.0에서 3.7nm 상에서는 몇 개의 이중선 혹은 삼중선의 피크들이 있었는데, 이는 글루코시드 구조를 표시한다(표 1 참조).

그리고 C-NMR에서 102.4에서 150.8ppm 사이에 가까운 피크들은 벤젠 고리 구조를 의미하고, 55에서 101ppm 사이의 단일선 피크들은 글루코시드 구조를 표시한다(표 2 참조).

화합물 1의 구조는 1-β-D-글루코피라노실록시-3-메톡시-4-하이드록시벤젠(1-β-D-glucopyranosyloxy-3-methoxy-4-hydroxybenzene, 이하, GMHB라 함)으로 확인되었다(도 14 참조).

위치(Position)	Mult.	δH(ppm)	J (H,H) in Hz
벤젠 고리-2	d	6.6829	2.64(2,6)
벤젠 고리-5	d	6.6450	8.58(5,6)
벤젠 고리-6	dd	6.6453	2.7(6,5)(2,6)
Glc-1	d	4.6588	7.74(1,2)
Glc-2	d	3.1832	7.86(2,3)
Glc-3	t	3.2535	5.88(3,4)
Glc-4	t	3.1121	9.18(4,5)
Glc-5	d	3.265	8.82(5,6a)
Glc-6a	dd	3.6969	6.28(6a,b)
Glc-6b	dd	3.4393	6.19(5,6b)
-OCH3	s	3.7273	-

위 치(Position)	δH(ppm)
벤젠 고리-1	150.723
벤젠 고리-2	102.508
벤젠 고리-3	147.777
벤젠 고리-4	141.316
벤젠 고리-5	115.166
벤젠 고리-6	107.930
Glc-1	101.703
Glc-2	77.056
Glc-3	73.295
Glc-4	69.945
Glc-5	76.713
Glc-6	60.840

참고예 1. 시약 및 통계 처리

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 및 트롤록스{Trolox; 2,4,6-tri(2-pyidyl)-s-triazine}은 플루카(Fluka)에서 구입하여 사용했으며, ABTS{2,2’-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)}는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사(社)서 구입하여 사용하였다.

크로마토크래피에 사용된 모든 용매는 HPLC 등급(grade)으로 미국 미시건(Muskegon)의 부이딕 & 잭슨 사(社)(Buidick & Jackson Company)에서 구입하였으며, 세파덱스(Sephadex) LH-20 수지(resin)는 스웨덴의 아머샴 바이오사이언스 사(社)(Amersham Bioscience)에서 구입하였다.

결과에 대한 통계분석은 윈도우용 SPSS를 사용하였으며, 모든 데이터는 평균치± 표준변차로 나타내었다.

실험예 1. 항산화능 분석

1-1. DPPH 유리기 소거 작용 분석

항산화능을 측정하기 위해 DPPH 유리기 소거능 분석을 블로이스(Blois MS, Nature, 181, pp1199-1201, 1958)의 방법에 따라 하기와 같이 시행하였다.

시료는 상기 실시예 1의 70% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 추출물 및 GMHB 화합물로, 용액의 흡광도는 518nm에서 관찰하였다.

유리기 소거능은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

	70% 에탄올 추출물	에틸아세테이트추출물	GMHB 화합물
유리기 소거능 (% 저해율, 100μg/mL)	82.44 ± 2.73	88.26 ± 1.70	96.29 ± 1.53

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 유리기 소거능은 70% 에탄올 추출물이 82.44± 2.73%로 가장 강한 활성을 나타내었다. 본 분석에서 70% 에탄올 추출물의 유리기 소거능은 82.44± 2.73%, 에틸아세테이트 추출물 및 GMHB 화합물의 유리기 소거능은 각각 88.26± 1.70% 및 96.29± 1.53%로 나타났다.

1-2. TEAC ( Trolox equivalent antioxidant capacity) 항산화능 분석

총 항산화 활성(TAA, total antioidant activity) 수치는 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity) 분석(Miller et al, Clinical Science, 84, pp407-412, 1993)을 통해 하기와 같이 산정하였다.

본 분석에서, 70% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 추출물 및 화합물(compound) 1의 항산화 능력을 측정하고, 트롤록스(Trolox)의 항산화 능력을 기준으로 이들을 비교하였다.

어두운 장소에서 16시간 동안 상온의 온도를 유지하여 70 mM 과황산칼륨(K₂S₂O₈)과 ABTS 20 mM 용액의 혼합액으로 ABTS ^·+ 라디칼(radical)을 얻었다.

용액을 사용하기 전, 734nm의 0.700 ± 0.020 흡광도를 얻기 위해 pH 7.4에서 ABTS^·+ 용액(solution)을 인산완충용액(PBS)으로 희석시켰으며, 6분간 매분마다 흡광도의 변화를 측정하였다.

TEAC 수치는 트롤록스(Trolox)의 ABTS 라디칼 양이온 소거능(scavenging)에 비례하는 청록색 ABTS 라디칼 양이온을 처리하는 항산화 능력에 기초하며, 70% 에탄올, 에틸아세테이트 추출물 70% 및 GMHB 화합물의 TEAC 수치는 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 각각 0.537± 0.00, 1.747± 0.09 및 2.252± 0.02 mM 으로 나타났다.

시료 (100μg/mL)	TEAC (mM)
70% 에탄올 추출물	0.537 ± 0.00
에틸아세테이트 추출물	1.747 ± 0.09
GMHB 화합물	2.252 ± 0.02

하기에 상기 약학조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

왕대 추출물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

왕대 추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

왕대 추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

GMHB 화합물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

GMHB 화합물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

GMHB 화합물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

GMHB 화합물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 왕대 추출물 및 이로부터 분리된 GMHB 화합물은 DPPH 유리기를 효과적으로 소거하므로, 항산화 활성을 지닌 조성물로써 세포막 지질과산화에 의한 노화의 억제용 약학조성물, 건강기능식품, 식품의 산화방지용 조성물 및 화장료 조성물로 사용할 수 있다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 왕대줄기의 물 및 에탄올 혼합용매 또는 에틸아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포막 지질과산화에 의한 노화 억제용 약학 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 항산화 효과를 나타내는 왕대줄기의 물 및 에탄올 혼합용매 또는 에틸아세테이트 가용 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 세포막 지질과산화에 의한 노화 억제용 건강기능식품.
8. 왕대줄기의 물 및 에탄올 혼합용매 또는 에틸아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 산화방지용 조성물.

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