KR101319490B1

KR101319490B1 - 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 리파아제 저해제

Info

Publication number: KR101319490B1
Application number: KR1020110059580A
Authority: KR
Inventors: 안동현; 정지연; 김꽃봉우리; 이청조
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2013-10-17
Also published as: KR20120139999A

Abstract

본 발명은 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 리파아제 저해제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜은 리파아제 저해활성이 우수하고, 열 안정성 및 pH 안정성이 우수하여, 고열 처리 및 pH 처리를 동반하는 식품 가공 공정에 효과적으로 이용할 수 있으며, 비만 억제에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로도 사용될 수 있다.

Description

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 리파아제 저해제{Lipase inhibitor comprising Ecklonia cava ethylacetate fration or dieckol isolated from the same}

본 발명은 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 리파아제 저해제에 관한 것이다.

비만은 에너지 대사의 불균형에 의해 체내에 체지방이 과다하게 축적된 상태로 심혈관계 질환, 당뇨병 및 암 등에 직·간접적인 원인이다. 또한, 신체적 영향과 더불어 정서적으로 심리적 위축감, 우울증 및 대식증과 같은 섭식장애를 야기시킬 수 있어 그 자체가 질병으로 인식되어지고 있다.

따라서, 전 세계적으로 비만을 치료하기 위해 다양한 종류의 항비만제 등이 이용되고 있으며, 항비만제로는 작용기전에 따라 식욕억제제, 열대사 촉진제 및 소화 억제제 등으로 구분된다. 식욕억제제와 열대사 촉진제는 위장장애와 담즙분비장애 등의 부작용을 초래하고 있고, 투약을 중단하면 다시 살이 찌는 등의 문제점이 있어 식사 및 운동 요법의 보조제로만 이용되고 있다. 소화 억제제의 경우, 소화효소에만 선택적으로 작용하여 영양소의 소화를 제한하는 작용을 하기 때문에 다른 영양소에는 영향을 주지 않으며, 작용 후에는 배설되므로 체내에 체류시간이 적어 전신적인 부작용이 적다는 장점이 있다.

한편, 지방함량이 높은 식품의 경우 미생물 유래 및 식품에 존재하는 지방분해효소에 의해 저급지방산이 생성된다. 생성된 저급지방산은 자동 산화에 의해 산화 생성물을 발생시켜 식품의 이미, 이취 및 변색 등을 유발하여 식품의 품질저하를 일으키게 된다. 따라서, 식품의 지질분해로 인한 품질저하 방지 및 부작용이 적은 항비만제를 개발하기 위하여 천연물로부터 리파아제 저해활성을 갖는 물질을 탐색하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재까지 알려진 리파아제 저해물질로는 사포닌, 폴리페놀, 테르펜 등이 알려져 있다. 대부분의 리파아제 저해제에 관한 연구는 육상식물에만 치중되어 왔으며, 최근 들어 해조류로부터 리파아제 저해제에 관한 연구가 점점 증가하고 있다. 해조류는 낮은 소화흡수율 때문에 영양학적인 측면에서 관심을 끌지 못하였지만, 최근 해조류의 페놀/탄닌, 테르펜, 할로겐, 다당류 등의 기능성 물질들이 확인되면서 새로운 신소재 자원으로서 주목받고 있다. 그러나, 육상식물에 비해 아직까지는 그 연구 정도가 매우 미미한 실정이다.

한편, 감태(Ecklonia cava)는 다시마목 미역과의 갈조류로 우리나라의 동해안과 제주도 근해에 자생하는 해조류이며, 다시마(Laminaria japonica)와 미역 (Undaria pinnatifida)과 함께 식용으로 사용되고 있다. 감태의 줄기는 원기둥 모양으로 길이 1~2m 정도이며 기부는 뿌리모양을 이루고 줄기 끝에 흑엽편을 가진 하나의 편평한 잎이 있다. 종래의 연구에 의하면, 감태는 티로시나아제 저해활성, 항산화, 항염증, 항암, 항고혈압, 항당뇨, 항응혈, MMP 저해활성 등 유용한 생리활성이 많이 보고되어 있다.

상기한 바와 같이, 감태에 대하여 다양한 생리활성이 알려져 있지만, 감태의 리파아제 저해활성에 관한 연구는 아직까지 미미한 수준이다.

본 발명자들은 감태의 리파아제 저해활성에 관하여 연구하던 중, 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜의 리파아제 저해활성이 우수하고, 열 안정성 및 pH 안정성이 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 리파아제 저해제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 리파아제 저해활성을 갖는 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 비만 억제용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 리파아제 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 리파아제 저해활성을 갖는 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 유효성분으로 함유하는 비만 억제용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜은 하기와 같은 방법으로 제조된다. 먼저, 감태를 물과 C₁~C₄ 알콜의 혼합용매에 가하고 실온에서 24시간 동안 교반하여 추출한다(3회 반복). 이때, C₁~C₄ 알콜은 1 내지 100% 메탄올, 1 내지 100% 에탄올 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 100% 에탄올, 더욱 바람직하게는 70 내지 95% 에탄올이다. 상기 추출액을 모아 원심분리한 후 상층액만을 취하여 여과한 후 감압농축하고 건조시켜 감태 알콜 추출물을 얻는다. 상기 감태 알콜 추출물, 바람직하게는 감태 에탄올 추출물을 증류수에 현탁시키고, 용매간의 극성차를 이용하여 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 액액분배한 후, 감압농축하고 건조하여 감태 용매 분획물을 얻는다. 각각의 감태 용매 분획물의 리파아제 저해활성을 측정한 결과, 감태의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물에서 리파아제 저해활성이 높게 나타난다.

감태의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 각각 18개의 n-헥산 분획물(H1~H18), 15개의 클로로포름 분획물(CH1~CH15), 22개의 에틸아세테이트 분획물(EA1~EA22)을 얻는다. 이들 용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)에서 리파아제 저해활성이 가장 높게 나타난다. 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)을 HPLC 실시하여 6번째 분획(Fr.6)에서 가장 높은 리파아제 저해활성을 나타냄을 확인하였다. 상기 6번째 분획(Fr.6)의 LC/ESI-MS 분석 결과 분자량이 742.1이고, ¹H NMR과 ¹³C NMR의 분석 결과 이미 보고된 디엑콜의 ¹H NMR과 ¹³C NMR의 데이터와 일치하여 분리된 물질을 디엑콜(dieckol)로 동정하였다.

본 발명의 감태 에탄올 추출물의 리파아제 저해활성은 100℃에서 20분, 121℃에서 15분의 열 처리에 의해 증가하고, 특히 121℃에서 15분의 열 처리시에는 무처리구에 비해 리파아제 저해활성이 약 18% 증가한다. 따라서, 본 발명의 감태 에탄올 추출물 유래의 리파아제 저해활성을 갖는 유효물질은 고열 처리를 동반하는 식품 가공 공정에 효과적으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.

또한, 본 발명의 감태 에탄올 추출물은 모든 범위의 pH(pH 2~10)에서 안정한 리파아제 저해활성을 나타냄으로써, 감태 에탄올 추출물 유래의 리파아제 저해활성을 갖는 유효물질은 강산과 강알칼리에서도 안정할 것으로 사료된다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜은 리파아제 저해활성이 우수하고, 열 안정성 및 pH 안정성이 우수하여, 고열 처리 및 pH 처리를 동반하는 식품 가공 공정에 효과적으로 이용할 수 있으며, 비만 억제에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜과 함께 비만 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜의 일일 투여량은 약 0.1~3㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.3~1㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 비만 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 비만 억제를 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜은 리파아제 저해활성이 우수하고, 열 안정성 및 pH 안정성이 우수하여, 고열 처리 및 pH 처리를 동반하는 식품 가공 공정에 효과적으로 이용할 수 있으며, 비만 억제에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로도 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 감태로부터 용매 분획물의 추출 및 분리과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)으로부터 분리된 6번째 분획(Fr.6)의 LC/ESI-MS 측정결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 감태 에틸아세테이트 분획물의 제조

1. 감태 에탄올 추출물의 제조

감태(Ecklonia cava)는 제주도에서 채취하여 담수로 깨끗이 씻은 후 동결건조하고 잘게 분쇄하였다. 건조 분쇄된 감태에 94% 에탄올을 10배량 가하고 실온에서 24시간 교반하여 추출하였다. 추출액을 모아 원심분리기(UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea)로 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만 취하고, 남은 잔사는 위와 동일한 방법으로 2회 반복 추출하였다. 에탄올 추출 후 남은 잔사는 37℃에서 건조하여 물 추출에 사용하였다. 물 추출물은 건조된 잔사에 10배량의 증류수를 가하여 에탄올과 동일하게 3회 반복 추출하였고 상층액만 취하였다. 상층액은 여과지(Advantec 5A, Toyo roshi kaisha, Tokyo, Japan)로 여과한 후 회전 증발기 (RE200, Yamato Co., Tokyo, Japan)로 농축하고, 농축액을 37℃에서 건조하였다. 건조된 시료는 4℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

2. 액액분배법에 의한 감태 용매 분획물의 제조

상기 1에서 얻은 감태 에탄올 추출물을 10배량의 증류수에 현탁하고, 180rpm에서 1시간 동안 셰이커(Dongwon Science Co., Busan, Korea)에서 교반하였다. 여기에, 동량의 n-헥산을 가하고 다시 180rpm에서 2시간 동안 교반한 후 1시간 동안 정치한 다음 상층액을 취하여 여과, 감압 및 농축(RE200, Yamato Co., Tokyo, Japan)하여 n-헥산 분획물을 얻었다(수율: 22.2%). 남은 물층에 동량의 클로로포름을 가하고 180rpm에서 2시간 동안 교반한 후 1시간 동안 정치한 다음 하층액을 취하여 여과, 감압 및 농축하여 클로로포름 분획물을 얻었다(수율: 12.6%). 남은 물층에 동량의 에틸아세테이트를 가하고 180rpm에서 2시간 동안 교반한 후 1시간 동안 정치한 다음 상층액을 취하여 여과, 감압 및 농축하여 에틸아세테이트 분획물을 얻었다(수율: 13.4%). 남은 물층에 동량의 부탄올을 가하고 180rpm에서 2시간 동안 교반한 후 1시간 동안 정치한 다음 상층액을 취하여 여과, 감압 및 농축하여 부탄올 분획물을 얻고(수율: 10.8%), 남은 물층은 물 분획물로 하였다(수율: 11.5%). 모든 분획물을 각각 여과지로 여과한 후 회전 증발기를 이용하여 농축하고 37℃에서 건조하였으며, 각 분획물은 4℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

각 분획물을 5㎎/㎖, 2.5㎎/㎖, 1㎎/㎖의 농도에서 리파아제에 대한 저해활성을 측정한 결과, n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물에서의 IC₅₀ 값이 각각 1.50㎎/㎖, 1.57㎎/㎖ 및 1.11㎎/㎖로 에탄올 추출물의 IC₅₀ 값 (4.23㎎/㎖)보다 약 3배 이상 증가된 리파아제 저해활성을 나타내었다.

실시예 2 : 감태 에틸아세테이트 분획물로부터 리파아제 저해활성을 갖는 물질의 분리

리파아제 저해활성이 높게 나타난 감태의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 각 용매 분획물을 분획하고 리파아제 저해활성을 갖는 물질을 분리하였다.

1. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 감태 용매 분획물의 제조

실리카겔(230-400 mesh, Merck Co., Germany)에 메틸렌클로라이드를 가하여 슬러리로 만들고, 이를 유리 컬럼(glass column, 50×65㎜, 120㎖)에 충진한 다음 3배의 메틸렌클로라이드로 세척하였다. 감태 n-헥산 분획물 1g을 메틸렌클로라이드와 메탄올로 농도가 500㎎/㎖이 되도록 녹이고 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 컬럼에 로딩하였다. 그 다음, 메틸렌클로라이드와 메탄올을 용매계로 하여 단계적으로 극성을 높여가면서 100㎖씩 순차 분획하여 18개의 n-헥산 분획물을 얻었다(H1~H18). 이와 동일한 방법으로 클로로포름 분획물 1g을 클로로포름과 에틸아세테이트로 농도가 500㎎/㎖이 되도록 녹여 사용하였으며, 에틸아세테이트와 메탄올을 용매계로 하여 분획하여 15개의 클로로포름 분획물을 얻었다 (CH1~CH15). 에틸아세테이트 분획물 0.66g을 에틸아세테이트로 농도가 400㎎/㎖이 되도록 녹여 사용하였으며, 클로로포름과 메탄올을 용매계로 하여 분획하여 22개의 에틸아세테이트 분획물을 얻었다(EA1~EA22). 모든 용매 분획물을 각각 여과지로 여과한 후 회전 증발기를 이용하여 농축하고 37℃에서 건조하였으며, 각 용매 분획물을 4℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

상기 감태 용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)에서의 IC₅₀ 값이 0.85㎎/㎖로, 가장 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다.

2. HPLC 에 의한 감태 에틸아세테이트 분획물(EA6)로부터 리파아제 저해활성을 갖는 물질의 분리 및 구조 분석

리파아제 저해활성이 가장 높은 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획 (EA6)을 메탄올로 희석하고, 0.45㎛ 일회용 필터(disposable syringe filter) (Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)로 여과한 후 20㎕를 취하여 HPLC(Column, μBondapak C18, 125Å, 10㎛, 7.8×300㎜, Waters Ltd., MA, Ireland; Detector, Gilson UV/VIS 151, Middleton, USA; Pump, Gilson 321 pump, Middleton, France; Mobile phase, 36% ACN, 1 ㎖/min)로 254㎚에서 분석하였다. HPLC 분석 결과, 8개의 주요 피크를 얻었으며, 6번째 분획(Fr.6)에서의 IC₅₀ 값이 0.255㎎/㎖로 가장 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다. 따라서, 리파아제 저해활성을 갖는 유효물질이 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번째 분획(Fr.6)에 존재하는 것으로 판단된다.

상기 6번째 분획(Fr.6)의 분자량을 LC/ESI-MS(Nanospace SI-2, Shiseido, Tokyo, Japan; LCQ Deca XP, Thermo finnigan, San Jose, CA, USA; Column, Luna 5㎕ C₁₈ 100, 150×1㎜ 5 micron, Phenomenex, Torrance, Canada)를 이용하여 측정하였으며, ¹H NMR(500MHz, JNM-ECP 400, JEOL Co., Tokyo, Japan)과 ¹³C NMR(900 MHz, Avance Ⅱ 900, Bruker, Karlsruhe, Germany)의 데이터를 분석하여 물질의 구조를 동정하였다.

LC/ESI-MS의 분석 결과 분자량이 742.1이었고, ¹H NMR과 ¹³C NMR의 분석 결과 이미 보고된 디엑콜의 ¹H NMR과 ¹³C NMR의 데이터와 일치하여 분리된 물질을 디엑콜 (dieckol)로 동정하였다.

본 발명에 따른 감태로부터 용매 분획물의 추출 및 분리과정은 도 1에 나타내었고, 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)의 HPLC 크로마토그램은 도 2에 나타내었으며, 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)으로부터 분리된 6번째 분획(Fr.6)의 LC/ESI-MS 측정결과는 도 3에 나타내었다.

실험예 1 : 감태 에탄올 추출물 및 감태 용매 분획물의 리파아제 저해활성 측정

1. 감태 에탄올 추출물의 리파아제 저해활성

돼지 췌장 리파아제(Triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) 0.3㎎에 10mM 모폴린프로판설폰산(morpholinepropanesulphonic acid)과 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, pH 6.8) 30㎕를 넣고, 100mM Tris-HCl과 5mM CaCl₂(pH 7.0) 850㎕를 첨가하여 효소 완충액(enzyme buffer)을 준비하였다. 효소 완충액에 시료 100㎕를 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 10mM ρ-니트로페닐 부티레이트(Sigma, St. Louis, Mo, USA) 20㎕를 첨가하여 혼합시킨 후, 다시 37℃에서 15분간 반응시켰다. ρ-니트로페닐 부티레이트가 ρ-니트로페놀로 가수분해된 정도를 UV/visible 분광광도계(GENESYS 10 UV, Rochester, NY., USA)로 400㎚에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시료는 5㎎/㎖, 2.5㎎/㎖, 1㎎/㎖의 농도에서 리파아제 저해활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 시판되는 비만치료제인 올리스타트(orlistat, 상품명 - 제니칼)를 사용하였다. 리파아제 저해활성은 하기 수학식 1로 계산하였다.

[수학식 1]

리파아제 저해활성(%) = [100-(시료를 첨가한 반응군의 흡광도 - 리파아제를 첨가하지 않은 시료의 흡광도)/시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도]×100

감태 에탄올 추출물과 감태 물 추출물의 리파아제 저해활성은 표 1에 나타내었다.

	리파아제 저해활성(%)
	5㎎/㎖	2.5㎎/㎖	1㎎/㎖
감태 에탄올 추출물	59.12±0.95^a	34.16±1.16^a	19.10±1.12^a
감태 물 추출물	28.72±1.70^b	21.72±1.57^b	11.41±0.47^b
올리스타트(orlistat)	92.37±0.55	96.15±0.77	93.74±0.72

※ a,b : p<0.05

표 1에 나타난 바와 같이, 감태 에탄올 추출물은 5㎎/㎖, 2.5㎎/㎖, 1㎎/㎖의 농도에서 각각 59%, 34% 및 19%의 리파아제 저해활성을 나타내었고, 감태 물 추출물은 각각 28%, 22% 및 11%의 리파아제 저해활성을 나타내었다. 따라서, 감태 에탄올 추출물에서 더 높은 리파아제 저해활성을 나타냄을 확인하였다.

2. 감태 용매 분획물의 리파아제 저해활성

감태 용매 분획물의 5㎎/㎖, 2.5㎎/㎖, 1㎎/㎖의 농도에서, 상기 1의 방법과 동일하게 하여 리파아제 저해활성을 측정하였다.

감태 용매 분획물의 리파아제 저해활성은 표 2에 나타내었다.

	수율(%)	리파아제 저해활성(%)			IC₅₀ (㎎/㎖)
	수율(%)	5㎎/㎖	2.5㎎/㎖	1㎎/㎖	IC₅₀ (㎎/㎖)
n-헥산 분획물	22.2	97.80±1.90^a	72.05±0.58^b	33.34±2.19^b	1.50±0.10^d
클로로포름 분획물	12.6	97.76±1.94^a	79.99±1.35^a	31.94±2.14^b	1.57±0.10^d
에틸아세테이트 분획물	13.4	82.94±1.56^b	72.24±1.37^b	45.13±0.59^a	1.11±0.01^e
부탄올 분획물	10.8	67.79±0.46^c	55.94±1.51^c	33.76±2.90^b	2.24±0.06^c
물 분획물	11.5	22.34±0.76^e	16.82±0.15^e	13.93±0.76^d	11.20±0.38^a
감태 에탄올 추출물	8.2	59.12±0.95^d	34.16±1.16^d	19.10±1.12^c	4.23±0.07^b
올리스타트(orlistat)	-	92.37±0.55	96.15±0.77	93.74±0.72	0.001±0.00

※ - 분획물의 수율은 에탄올 추출물에 대하여 환산하여 나타낸 것이다.

- a-e : p<0.05

표 2에 나타난 바와 같이, 감태의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물에서의 IC₅₀ 값이 각각 1.50㎎/㎖, 1.57㎎/㎖ 및 1.11㎎/㎖로 감태 에탄올 추출물의 IC₅₀ 값(4.23㎎/㎖)보다 약 3배 이상 증가된 리파아제 저해활성을 나타내었다.

3. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 감태 용매 분획물( H1 ~ H18 , CH1~CH15, EA1 ~ EA22 )의 리파아제 저해활성

감태 용매 분획물(H1~H18, CH1~CH15, EA1~EA22)을 2.5㎎/㎖의 농도로 녹인 후, 상기 1의 방법과 동일하게 하여 리파아제 저해활성을 측정하였다.

감태 용매 분획물(H1~H18, CH1~CH15, EA1~EA22)의 리파아제 저해활성은 표 3 내지 표 5에 나타내었다.

감태 n-헥산 분획물(H1~H18)의 리파아제 저해활성(%)

분획	수율(%)	리파아제 저해활성(%)	분획	수율(%)	리파아제 저해활성(%)
H1	46.7	61.90±0.00^b	H10	0.5	-
H2	16.8	54.92±1.18^c	H11	0.3	-
H3	5.7	41.09±1.93^d	H12	1.7	24.39±0.61^f
H4	4.1	41.27±0.93^d	H13	1.7	39.83±0.96^d
H5	2.7	37.71±1.71^e	H14	2.8	8.56±1.33^j
H6	2.4	18.42±2.97^gh	H15	2.5	12.66±1.00ⁱ
H7	1.1	17.42±0.86^h	H16	1.8	18.63±1.00^gh
H8	0.8	5.60±0.66^k	H17	1.1	25.14±0.00^f
H9	0.7	-	H18	0.4	20.18±0.45^g
n-헥산 분획물 (H)		72.05±0.5^a	올리스타트 (orlistat)		96.15±0.77

※ - 감태 n-헥산 분획물(H1~H18)의 수율은 n-헥산 분획물(H)에 대하여 환산하여 나타낸 것이다.

- a-k : p<0.05

감태 클로로포름 분획물(CH1~CH15)의 리파아제 저해활성(%)

분획	수율(%)	리파아제 저해활성(%)	분획	수율(%)	리파아제 저해활성(%)
CH1	16.1	95.96±0.85^a	CH9	2.8	25.96±1.04^h
CH2	17.8	85.36±1.40^b	CH10	2.0	22.16±0.79ⁱ
CH3	4.8	52.75±0.35^e	CH11	1.3	25.52±0.40^h
CH4	13.1	65.61±1.47^d	CH12	1.9	10.71±2.42^l
CH5	3.4	50.04±1.56^f	CH13	1.1	16.42±0.78^jk
CH6	6.1	40.98±1.91^g	CH14	1.6	18.07±1.04^j
CH7	5.8	40.35±0.63^g	CH15	1.4	15.36±3.07^k
CH8	5.4	41.95±1.02^g
클로로포름 분획물 (CH)		79.99±1.35^c	올리스타트 (orlistat)		96.15±0.77

※ - 감태 클로로포름 분획물(CH1~CH15)의 수율은 클로로포름 분획물(CH)에 대하여 환산하여 나타낸 것이다.

- a-l : p<0.05

감태 에틸아세테이트 분획물(EA1~EA22)의 리파아제 저해활성(%)

분획	수율(%)	리파아제 저해활성(%)	분획	수율(%)	리파아제 저해활성(%)
EA1	2.5	27.51±1.29^j	EA12	1.8	39.83±1.81^h
EA2	1.4	31.83±1.43ⁱ	EA13	2.6	23.16±1.31^k
EA3	0.6	43.81±0.97^g	EA14	0.5	18.93±1.86^l
EA4	4.4	16.98±1.16^l	EA15	0.5	33.08±0.98ⁱ
EA5	1.8	45.87±1.13^fg	EA16	0.4	17.25±0.74^l
EA6	33.4	81.56±1.17^a	EA17	0.5	26.76±0.59^j
EA7	15.3	69.59±0.57^c	EA18	0.5	17.80±1.16^l
EA8	7.4	49.53±1.27^e	EA19	0.8	23.83±0.00^k
EA9	6.3	53.98±0.62^d	EA20	0.7	18.54±0.51^l
EA10	5.7	47.68±2.83^ef	EA21	0.8	16.68±0.67^l
EA11	5.1	44.31±1.77^g	EA22	0.3	12.36±2.07^m
에틸아세테이트 분획물(EA)		72.24±1.37^b	올리스타트 (orlistat)		96.15±0.77

※ - 감태 에틸아세테이트 분획물(EA1~EA22)의 수율은 에틸아세테이트 분획물(EA)에 대하여 환산하여 나타낸 것이다.

- a-m : p<0.05

표 3에 나타난 바와 같이, 감태 n-헥산 분획물의 9번~11번 분획을 제외한 모든 분획에서 리파아제 저해활성을 나타내었으며, 특히 1번 분획(H1) 및 2번 분획 (H2)에서 각각 62%와 55%의 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다.

또한 표 4에 나타난 바와 같이, 감태 클로로포름 분획물의 1번 분획(CH1) 및 2번 분획(CH2)에서 각각 96%와 85%의 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다.

또한 표 5에 나타난 바와 같이, 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획 (EA6)에서 82%의 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다.

3-1. 감태 용매 분획물(CH1, CH2, EA6)의 리파아제 저해활성

상기 3에서 높은 리파아제 저해활성을 보인 감태 클로로포름 분획물(CH1, CH2)과 감태 에틸아세테이트 분획물(EA6)의 IC₅₀ 값을 측정하였으며, 결과는 표 6에 나타내었다.

	리파아제 저해활성(%)		IC₅₀ (㎎/㎖)
	2.5㎎/㎖	1㎎/㎖
클로로포름 분획물(CH1)	95.96±0.85^a	45.50±1.43^b	1.15±0.01^b
클로로포름 분획물(CH2)	85.36±1.40^b	43.55±0.44^c	1.10±0.03^b
에틸아세테이트 분획물(EA6)	81.56±1.17^c	58.82±0.77^a	0.85±0.01^a
감태 에탄올 추출물	34.16±1.16^d	19.10±1.12^d	4.23±0.07^c
올리스타트(orlistat)	96.15±0.77	93.74±0.72	0.001±0.00

※ a-d : p<0.05

표 6에 나타난 바와 같이, 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번 분획(EA6)에서의 IC₅₀ 값이 0.85㎎/㎖로 감태 클로로포름 분획물의 1번 분획(CH1, 1.15㎎/㎖)과 2번 분획(CH2, 1.11㎎/㎖)에서의 IC₅₀ 값보다 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다.

4. HPLC 에 의해 분리된 감태 에틸아세테이트 분획물(Fr.1~Fr.8)의 리파아제 저해활성

리파아제 저해활성이 가장 우수한 감태 에틸아세테이트 분획물(EA6)로부터 분리된 감태 에틸아세테이트 분획물(Fr.1~Fr.8)을 0.5㎎/㎖의 농도로 녹인 후, 상기 1의 방법과 동일하게 하여 리파아제 저해활성을 측정하였다.

감태 에틸아세테이트 분획물(Fr.1~Fr.8)의 리파아제 저해활성은 표 7에 나타내었다.

분획	리파아제 저해활성(%)	분획	리파아제 저해활성(%)
Fr.1	15.12±1.09^e	Fr.5	-
Fr.2	25.92±1.27^d	Fr .6	64.97±2.36^a
Fr.3	9.52±0.36^f	Fr.7	24.75±0.88^d
Fr.4	6.91±1.03^g	Fr.8	46.00±1.32^b
에틸아세테이트 분획물(EA6)	28.28±1.24^c	올리스타트 (orlistat)	94.80±2.04

※ a-g : p<0.05

표 7에 나타난 바와 같이, 감태 에틸아세테이트 분획물(Fr.1~Fr.8) 중 5번째 분획(Fr.5)을 제외하고는 모든 분획에서 리파아제 저해활성을 나타내었으며, 특히 6번째 분획(Fr.6)에서 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다.

4-1. 감태 에틸아세테이트 분획물(Fr.6)의 리파아제 저해활성

상기 4에서 높은 리파아제 저해활성을 보인 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번째 분획(Fr.6)의 IC₅₀ 값을 측정하였으며, 결과는 표 8에 나타내었다.

분획	리파아제 저해활성(%)			IC₅₀ (㎎/㎖)
분획	0.5㎎/㎖	0.25㎎/	0.1㎎/㎖	IC₅₀ (㎎/㎖)
에틸아세테이트 분획물(Fr.6)	63.42±1.49	49.02±0.30	15.67±0.77	0.255±0.002
에틸아세테이트 분획물(EA6)	28.28±1.24	-	-	0.85±0.011
올리스타트 (orlistat)	93.48±1.74	94.24±0.21	93.99±0.36	0.001±0.00

※ a-d : p<0.05

표 8에 나타난 바와 같이, 감태 에틸아세테이트 분획물의 6번째 분획(Fr.6)에서의 IC₅₀ 값이 0.255㎎/㎖로 감태 에틸아세테이트 분획물(EA6, 0.85㎎/㎖)에서의 IC₅₀ 값보다 높은 리파아제 저해활성을 나타내었다.

실험예 2 : 감태 에탄올 추출물의 열 안정성 및 pH 안정성

감태 에탄올 추출물의 열 안정성 및 pH 안정성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 열 처리에 의한 감태 에탄올 추출물의 리파아제 저해활성의 변화

감태 에탄올 추출물을 5㎎/㎖의 농도로 희석한 후, 60℃에서 10분, 30분 및 60분; 80℃에서 10분 및 20분; 100℃에서 10분 및 20분; 121℃에서 15분간 열처리하고 급냉한 다음, 리파아제 저해활성을 측정하였다.

결과는 표 9에 나타내었다.

온도(℃)	시간(min)	리파아제 저해활성(%)
60	10	60.24±1.54^cd
	30	60.63±1.33^cd
	60	62.47±0.71^bc
80	10	59.42±0.00^d
80	20	60.37±1.54^cd
100	10	61.42±0.93^cd
100	20	63.96±0.93^b
121	15	77.62±0.80^a
무처리구		59.85±2.41^d

※ a-d : p<0.05

표 9에 나타난 바와 같이, 감태 에탄올 추출물의 리파아제 저해활성은 100℃에서 20분, 121℃에서 15분의 열 처리에 의해 증가하였다. 특히, 121℃에서 15분의 열 처리시에는 무처리구에 비해 리파아제 저해활성이 약 18% 증가함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 감태 에탄올 추출물 유래의 리파아제 저해활성을 갖는 유효물질은 고열 처리를 동반하는 식품 가공 공정에 효과적으로 이용할 수 있을 것을 사료된다.

2. pH 처리에 의한 감태 에탄올 추출물의 리파아제 저해활성의 변화

감태 에탄올 추출물을 5㎎/㎖의 농도로 희석한 후 pH를 측정하고, 0.1N NaOH와 0.1N HCl을 이용하여 pH 2, 4, 6, 8 및 10으로 조절한 다음 상온에서 24시간 동안 방치하였다. 24시간 후 감태 에탄올 추출물을 본래의 pH로 중화시킨 다음 pH 변화에 따른 리파아제 저해활성을 측정하였다.

결과는 표 10에 나타내었다.

pH	리파아제 저해활성(%)
2	59.06±0.86^a
4	59.82±0.98^a
6	59.51±0.86^a
8	58.81±1.76^a
10	57.83±1.44^a
무처리구(4.67)	59.57±0.87^a

※ a : p<0.05

표 10에 나타난 바와 같이, 감태 에탄올 추출물은 모든 범위의 pH(pH 2~10)에서 안정한 리파아제 저해활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 감태 에탄올 추출물 유래의 리파아제 저해활성을 갖는 유효물질은 강산과 강알칼리에서도 안정할 것으로 사료된다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아르산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아르산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2 : 식품의 제조

본 발명의 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 20~95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 0.2~1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 0.5~5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 0.1~5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 5~10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 3 : 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 10~15%, 설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 75~80%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들었다. 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜(고형분 2.5%, 97.16%), 대추 엑기스(65 brix, 2.67%), 과체복합 추출물(고형분 70%, 0.12%), 비타민 C(0.02%), 판톤텐산칼슘(0.02%), 감초 추출물(고형분 65%, 0.01%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

감태 에틸아세테이트 분획물 또는 이로부터 분리된 디엑콜 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

Claims

감태 에탄올 추출물에 증류수를 가하여 현탁시키고 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은, 감태 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 리파아제 저해제.
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감태 에탄올 추출물에 증류수를 가하여 현탁시키고 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻은, 리파아제 저해활성을 갖는 감태 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 비만 억제 개선용 식품 조성물.
삭제