WO2020130208A1 - 감태추출물을 포함하는 식이조절 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
감태추출물을 포함하는 식이조절 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Definitions
- Dietary control is possible by including persimmon extract, in particular, it relates to a composition that can maximize its efficacy and a method for manufacturing the same.
- Seaweed is rich in various minerals, vitamins, and fiber.
- water-soluble polysaccharides such as alginic acid, fucan sulfate, and laminaran are abundant, and these components are known to exhibit physiological effects such as anti-diabetic, anticoagulant, anti-inflammatory, and anti-tumor.
- seaweed is a seaweed with brown seaweed kelp tree seaweed. The color is brown, but when it dries, it becomes black. It is distributed mainly in Jeju Island and some south coasts, and inhabits deep within 10m of the luncheon. It is a perennial plant that grows for 2 to 3 years and is a healthy food resource that contains a lot of nutrients such as alginic acid, iodine and potassium.
- persimmon contains fucoidan and polotanin components, and these components are known to be excellent in antioxidant, anticancer, anti-inflammatory, anti-aging, and hypertensive inhibitory effects.
- Korean Patent Application No. 10-2011-0102474 Korean Patent Application No. 10-2011-0102474, and a composition for enhancing immunity in Korean Patent Application No. 10-2011-0073612, etc. have.
- One embodiment of the present invention exhibits an excellent effect on the reduction of the size of adipocytes through the promotion of lipolysis and suppression of adipocyte synthesis, and in particular, the weight loss effect can be realized by causing spontaneous dietary control through the regulation of the central nerve Provides a composition for dietary control.
- Another embodiment of the present invention provides a method for obtaining a dietary composition having the above-described advantages.
- the present invention contains a persimmon extract
- the persimmon extract is a main extract
- the persimmon extract is pyrogallol-fluoroglucinol-6,6'-BICOL (PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6, 6'-bieckol) provides a composition for dietary control.
- preparing a solvent containing more than 40% by weight, less than 100% by weight of alcohol and using the solvent for extracting the raw material of the Ecklonia cava to obtain the Ecklonia cava extract; provides a method for preparing a composition for dietary control.
- composition for dietary control exhibits an excellent effect on the reduction of adipocyte size through promoting lipolysis and suppression of adipocyte synthesis, and in particular, it is possible to realize a weight loss effect by causing spontaneous dietary control through control of the central nerve.
- Figure 1 shows the efficacy of reducing the body weight, body fat and dietary weight of persimmon extract (ECE) and active ingredient (PPB).
- EAE persimmon extract
- PPB active ingredient
- Figure 2 shows the efficacy of reducing the expression of fat in liver tissue and adipocytes of Ecklonia cava extract (ECE).
- Figure 3 shows the efficacy of reducing the expression of metabolic syndrome markers of Ecklonia cava extract (ECE) and active ingredient (PPB).
- EAE Ecklonia cava extract
- PPB active ingredient
- Figure 4 is a schematic schematic diagram of the edible central control of the hypothalamus.
- Figure 5 shows the efficacy of the active ingredient (PPB) as a leptin replacement agent.
- FIG 6 shows the effect of increasing the expression of the active ingredient (PPB) leptin-related signaling system major marker (marker).
- PPB active ingredient
- marker marker
- Figure 8 shows the efficacy of reducing the fat size of the active ingredient (PPB) in a leptin-deficient animal model.
- Figure 9 shows the results of Oil Red O (Oil Red O) staining before and after differentiation medium (DM) treatment.
- Figure 10 shows the effect related to the expression of the lipolytic regulator of ECE-treated adipocytes.
- Figure 11 shows the expression-related effects of the energy metabolism regulator of ECE-treated adipocytes.
- Figure 14 shows the leptin and adiponectin secretion of ECE-treated adipocytes.
- Figure 16 shows the inflammation control of ECE-treated macrophages.
- Figure 17 shows the suppression of the expression of adipocyte differentiation transcription factor through inflammation control of ECE-treated macrophages.
- Figure 18 shows the suppression of the expression of hypertrophy-related transcription factors of adipocytes through inflammation control of ECE-treated macrophages.
- Figure 19 shows the effect of weight loss and the like of the animal model administered with ECE.
- Figure 20 shows the cholesterol metabolism and triglyceride control effect of the ECE-administered animal model.
- Figure 21 shows the effect of changes in the size of the fat sphere in the ECE-administered animal model.
- Figure 23 shows the expression of fat accumulation and fat synthesis regulators in the ECE-administered animal model.
- Figure 24 shows the blood leptin and adiponectin secretion of the ECE-administered animal model.
- 25 shows blood glucose control in an animal model administered with ECE.
- 26 shows the effect of weight loss and the like of the animal model administered with PPB.
- FIG. 28 shows the effect of changes in fat sphere size in an animal model administered with PPB.
- Figure 29 shows the expression of lipolysis-related transcription factors in the PPB-administered animal model.
- Figure 30 shows the expression of energy metabolism regulation transcription factors in the PPB-administered animal model.
- Figure 31 shows the effect of weight loss, etc. by PPB administration of the leptin-deficient animal model.
- Figure 33 shows the expression of lipolytic-related transcription factors by PPB administration in a leptin-deficient animal model.
- Figure 34 shows the expression of transcription factors related to energy metabolism regulation by PPB administration in a leptin-deficient animal model.
- Figure 35 shows the change in the size of the fat cells by PPB administration in a leptin-deficient animal model
- One embodiment of the present invention includes a persimmon extract, the persimmon extract is a main extract, pyrogallol-fluoroglucinol-6,6'-Biecol (PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol) It provides a composition for dietary control comprising a.
- PPB pyrogallol-fluoroglucinol-6,6'-Biecol
- persimmon As a raw material, persimmon (Ecklonia cava) is listed as No. 0068600 in Food Ingredients List of the Ministry of Food and Drug Safety as a food ingredient ( ⁇ Food Standards and Standards ⁇ No. 2017-102, 2017.12.15).
- a method for extracting persimmons various methods such as hot water extraction, alcohol extraction, and ultrasonic extraction exist.
- the composition for dietary control according to an embodiment is to include a persimmon extract extracted by the method of alcohol extraction, for this reason, it is possible to implement excellent dietary control performance compared to a composition comprising the persimmon extract extracted by another method.
- the extract of Ecklonia cava extract may have an extraction yield of 10% or more.
- The'yield' refers to the ratio of the weight of the extracted extract to the weight of persimmon, a raw material, as a percentage.
- the extraction yield of the Ecklonia cava extract may be about 10% to about 30%.
- the Ecklonia cava extract of the composition for dietary control may include pyrogallol-fluoroglucinol-6,6'-Biecol (PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol) as an active ingredient.
- PPB pyrogallol-fluoroglucinol-6,6'-Biecol
- the Ecklonia cava extract may contain PPB as an active ingredient by alcohol extraction according to a method described below, thereby achieving desired dietary control performance.
- the content of the PPB in the persimmon extract may be 1% by weight to 5% by weight, for example, 1% by weight to 4% by weight.
- the persimmon extract is a alcoholic extract as described above, and in particular, in the case of a alcoholic extract having an extraction yield of 10% or more, it may be easy to contain the PPB in the above-described content range. That is, the Ecklonia cava extract may have an extraction yield of 10% or more, and at the same time, contain 1 to 5% by weight of the PPB. More specifically, the persimmon extract may have an extraction yield of about 10% to about 30%, and at the same time, the PPB may contain about 1% to about 4% by weight.
- the Ecklonia cava extract can be obtained by extracting Ecklonia cava raw material with a solvent containing alcohol.
- the solvent may include an alcohol composition comprising at least one selected from the group consisting of anhydrous or hydrous alcohol having 1 to 4 carbon atoms, for example, the alcohol composition may include ethyl alcohol.
- the alcohol composition may include 90% to 100% by volume of ethyl alcohol.
- the alcohol composition does not contain methyl alcohol, even if it contains 0.5mg/mL or less, for example, 0.2mg/mL or less, for example, 0.1mg/mL or less, for example. 0.1 mg/mL to 0.0001 mg/mL or less. Since the alcohol composition has such a composition, it is possible to obtain a persimmon extract for realizing a desired effect of the dietary composition using it.
- the solvent may include the alcohol composition more than 40% by weight, 100% by weight or less, for example, about 40% by weight or more, about 60% by weight or less, for example, about 50% by weight %.
- the solvent may be composed of the above-mentioned alcohol composition and the residual content of water.
- it provides a pharmaceutical composition comprising the dietary composition.
- the pharmaceutical composition may include 0.01 to 99% by weight of the dietary composition in the total weight.
- the pharmaceutical composition may be implemented in various forms including the dietary composition.
- the pharmaceutical composition may be embodied in a pharmaceutically acceptable form, for example, granules, tablets, emulsions, syrups, powders, suspensions, capsules, aerosols, and the like.
- the pharmaceutical composition may be formulated in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, sterile injectable solutions, and the like.
- a functional food composition comprising the dietary composition is included.
- the functional food composition may include 0.01% to 99% by weight of the dietary composition in total weight.
- the food composition means adjusting a nutrient of the human body or imparting a physiologically useful effect, and in order to impart such functionality, it may include various food additives in addition to the dietary composition.
- the food additives are judged to be suitable in accordance with the standards and standards for the item in accordance with the general rules and general test methods of food additives approved by the Food and Drug Administration.
- Another embodiment of the present invention preparing a solvent containing more than 40% by weight, 100% by weight or less of the alcohol composition; And it provides a method for preparing a dietary control composition comprising the step of extracting the persimmon raw material by using the solvent to obtain a persimmon extract.
- the dietary control composition prepared by the method for preparing the dietary control composition may implement all of the above-described features and advantages.
- the step of obtaining the Ecklonia cava extract may be a step of extracting the Ecklonia cava raw material at 40°C to 60°C for 6 to 24 hours.
- the step of obtaining the Ecklonia cava extract may be a step of extracting the Ecklonia cava raw material at 40°C to 60°C for 6 to 24 hours.
- Example 1 Preparation of a dietary control composition comprising persimmon extract
- the persimmon extracts of Preparation Examples 1 to 11 were prepared through the respective conditions, and the yield and the content of PPB, which is the active ingredient of Formula 1 in the extracted persimmon extracts, were confirmed.
- the percentage of the [alcohol extraction after water extraction] condition is the weight percent of the alcohol composition of the solvent used for alcohol extraction
- the percent of the [alcohol extraction] condition is the weight percent of the alcohol composition of the solvent used for alcohol extraction.
- the alcohol composition of the above two conditions contained 95% by volume of ethyl alcohol and 0.0016mg/mL of methyl alcohol.
- the extract of Ecklonia cava of Preparation Example 10 using alcohol containing more than 40% by weight and less than 100% by weight of alcohol is compared with other extraction methods such as water extraction and ultrasonic extraction. It was found that this is a manufacturing example in which a persimmon extract containing the most active ingredient PPB is obtained. That is, it was found that the Ecklonia cava extract of Preparation Example 10 satisfies the extraction yield of 10% or more and the PPB content of 2% to 4% by weight.
- Example 2 Efficacy extract ( ECE ) and active ingredient ( PPB ) of the dietary control efficacy verification animal model and experimental group production
- HFC high fat diet
- NFD animal group Water was administered as a normal fat diet (NFD) animal group.
- HFD animal group As a high fat diet (HFD) animal group, water was administered.
- ECE animal group Ecklonia Cava Extract (ECE) administration As animal group, 70 mg/kg of Ecklonia cava extract of Preparation Example 10 was administered.
- PPB animal group Pirogalol-fluoroglucinol-6,6'-biexol (pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol, PPB), which is an active ingredient of the above-mentioned Ecklonia cava extract, was administered 2 mg/kg.
- GCE Garcinia
- Fat cells can be stained through Oil Red O staining.
- HFD-ECE ECE animal group
- Fat cell infiltration is significantly reduced compared to the HFD animal group. It was confirmed.
- B of FIG. 2 it was possible to confirm the efficacy of each ECE concentration, and specifically, it was confirmed that ECE has an excellent effect of inhibiting the differentiation of undifferentiated adipocytes into adipocytes.
- the hypothalamus responsible for appetite is regulated by leptin secreted from fat cells.
- leptin suppresses appetite and increases energy consumption, thereby showing an excellent weight loss effect.
- obesity may be exacerbated due to the so-called leptin resistance in which the leptin reactivity is lowered in the hypothalamus.
- a leptin-deficient animal model (Ob/Ob) was tested. Since the leptin-deficient animal model does not have leptin to suppress appetite and increase energy consumption, it can be an obese-inducing animal model without high-fat diet.
- Each animal group was prepared by subjecting 7-week-old Ob/Ob mice to the following substances for 4 weeks.
- PPB animal group PPB was administered at 10 mg/kg/day.
- Leptin animal group Leptin was administered at 0.85 g/kg/day.
- adipose tissue of various regions was collected from the PPB animal group of the Ob/Ob animal model, and H&E (hematocylin & eosin) staining was performed to measure the size of adipose tissue.
- H&E hematocylin & eosin staining
- Mouse embryonic fibroblast free 3T3L1 was purchased from ATCC, and mixed with 10% Fetal bovine serum (fetal bovine serum) and 1% penicilin/streptomycin (antibiotic) in DMEM cell culture medium (Cat.ATCC 30-2002TM) for 2 days. The culture medium was replaced at intervals.
- 3T3L1 adipocytes were placed in a dish for cell culture and cultured until the cells were filled by 90% or more. Subsequently, after culture, a differentiation medium containing 10 ⁇ g/ml insulin, 0.1 mM dexamethasone, and 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) was added. (differentiation medium, DM) and cultured for 2 days. Subsequently, the culture medium was cultured for 10 days by changing to a new medium containing 10 ⁇ g/ml insulin every 2 days. 9A shows the appearance of adipocytes before differentiation, and B shows the appearance of oil red O stained adipocytes 10 days after differentiation medium (DM) treatment.
- DM differentiation medium
- the Ecklonia cava extract treatment group (DM/ECE) was treated with the Ecklonia cava extract of Preparation Example 10 whenever the medium was exchanged during the process of differentiation into adipocytes.
- the control group (PBS) was treated with phosphate buffered saline (PBS) on undifferentiated adipocytes, and the disease group (DM/PBS) was treated with PBS on adipocytes treated with differentiated medium (DM).
- PKA Protein kinase A
- acetyl-coenzyme A which are the main factors for lipolysis using Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) in adipocytes of differentiation medium (DM)
- carboxylase acetyl-CoA carboxylase, AC
- HSL hormone-sensitive lipase
- mRNA was extracted from adipocytes treated with differentiation medium (DM). After synthesizing the extracted mRNA with complementary DNA (cDNA), it was confirmed using a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR). As a result, referring to FIG. 11, it was confirmed that the expression of the adipogenesis regulator was statistically significantly decreased in the group (DM/ECE) treated with Ecklonia cava extract.
- ACC acetyl-coenzyme A carboxylase
- FAS fatty acid synthase
- MRNA was extracted from adipocytes treated with differentiation medium (DM) in order to confirm the expression level of Uncoupling Protein (UCP), which is a heat generation-related factor in energy metabolism.
- UCP Uncoupling Protein
- leptin and adiponectin hormones decrease adiponectin according to the maturation state of adipocytes, and leptin increases to cause inflammation in adipocytes and play an important role in metabolic regulation.
- proteins were separated from each group and an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed. The sample used in the experiment is a supernatant secreted from each cell. Referring to FIG. 14, it was confirmed that the amounts of leptin and adiponectin were statistically significantly changed in the group (DM/ECE) treated with Ecklonia cava extract.
- composition for dietary control comprising the Ecklonia cava extract according to an embodiment of the present invention regulates various inflammatory cytokines secreted from macrophages in adipose tissue to suppress differentiation and hypertrophy of undifferentiated adipocytes into mast cells. It has the effect. This will be described below.
- Macrophages (Raw 264.7) were purchased from ATCC, and 10% Fetal bovine serum (1st fetal bovine serum) and 1% penicilin/streptomycin (antibiotic) were mixed in DMEM cell culture medium to replace the culture medium every 2 days.
- Fetal bovine serum (1st fetal bovine serum)
- penicilin/streptomycin antibiotic
- the differentiation rate of 3T3L1 cells (PA/PBS) treated with supernatant secreted from macrophages into mast cells was significantly increased, but treated with the lysate secreted from the macrophages. It was confirmed that the differentiation rate of the group (PA/ECE) treated with Ecklonia cava extract (ECE) of Preparation Example 10 in the cells was statistically significantly reduced. That is, it was confirmed that the composition for dietary regulation according to an embodiment of the present invention can suppress the differentiation of adipocytes through macrophage regulation.
- the expression of the transcription factors, i.e., HSL, Plin2, CD36, FABP4, and PPAR ⁇ differentiation of 3T3L1 cells (PA/PBS) treated with lysate secreted from macrophages into mast cells Although increased, the expression of the transcription factor related to differentiation into the mast cells of the group (PA/ECE) treated with the Ecklonia cava extract (ECE) in cells treated with the lysate secreted from the macrophages is statistically significantly decreased. I could confirm. That is, it was confirmed that the composition for dietary regulation according to one embodiment of the present invention can effectively suppress the expression of transcription factors related to differentiation into mast cells through macrophage regulation.
- LDL low density lipoprotein
- triglyceride related to the regulation of cholesterol metabolism in plasma.
- LDL in plasma is a form of lipids in the blood.
- FIG. 20 it was confirmed that despite the high fat diet, the LDL, total cholesterol and triglyceride levels were statistically significantly decreased in the Ecklonia cava extract administration group (HFD/ECE).
- HFD/ECE Ecklonia cava extract administration group
- composition for dietary control comprising Ecklonia cava extract (ECE) according to an embodiment of the present invention also regulates cholesterol and triglycerides in the blood due to weight loss.
- ECE Ecklonia cava extract
- H&E staining was performed for morphological observation of white adipose tissue. Due to the high-fat diet, the size of fat cells increases when it is full of lipids in the adipose tissue. Referring to FIG. 21, when the size of the adipocytes was measured for each group, the fat was statistically fat in the medicinal extract administration group (HFD/ECE) and the competitive raw material garcinia administration group (HFD/GCE) despite the high fat diet. It was confirmed that the sphere decreased.
- MRNA was extracted from adipose tissue to compare the expression of Pref-1, CEBP ⁇ and PPAR ⁇ , transcription factors involved in energy metabolism regulation. After synthesizing the extracted mRNA with complementary DNA (cDNA), it was confirmed using a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR). Referring to FIG. 22, despite the high-fat diet, statistically significant Pref-1 (Preadipocyte factor 1), CEBP ⁇ (CCAAT/enhancer-binding protein beta isoform) and PPAR ⁇ (PET ⁇ ) in the Ecklonia cava extract administration group (HFD/ECE) It was confirmed that the expression of peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ ) decreased.
- Pref-1 Preadipocyte factor 1
- CEBP ⁇ CCAAT/enhancer-binding protein beta isoform
- PPAR ⁇ PAT ⁇
- PAT ⁇ Ecklonia cava extract administration group
- LPL Lipoprotein lipase
- ACC Acetyl CoA carboxylase
- PCR polymerase chain reaction
- Adiponectin is a hormone that regulates insulin sensitivity
- leptin is an appetite suppressing hormone.
- HFD/Saline high-fat diet intake group
- CD/Saline normal diet group
- HFD/ECE Ecklonia cava extract administration group
- HFD/ GCE competitive raw material garcinia administration group
- H&E staining was performed for morphological observation of adipose tissue. Due to the high-fat diet, the size of fat cells increases when it is full of lipids in the adipose tissue. Referring to Figure 28, when measuring the size of the adipocytes for each group, despite the high-fat diet, it could be confirmed that the fat cells were statistically significantly reduced in the PPB-administered group (HFD/PPB).
- PKA Protein kinase A
- AC acetyl-CoA carboxylase
- HSL hormone-sensitive lipase
- the hypothalamus responsible for appetite is regulated by leptin secreted from adipocytes, and leptin suppresses appetite and increases energy consumption, resulting in an excellent weight loss effect.
- leptin secreted from adipocytes The hypothalamus responsible for appetite is regulated by leptin secreted from adipocytes, and leptin suppresses appetite and increases energy consumption, resulting in an excellent weight loss effect.
- obesity is exacerbated due to'Leptin-resistance' in which the reactivity to leptin is lowered in the hypothalamus.
- the leptin-deficient animal model (Ob/Ob) cannot suppress appetite and increase energy consumption, so that an obese-inducing animal model can be produced without a high-fat diet.
- Each experiment was conducted as described below by preparing each animal group as follows.
- -C57/Saline animal group As a negative control, 7-week-old C57BL/6 mice were prepared, and 0.9% saline was administered for 4 weeks.
- -ObOb/Saline animal group 7-week-old leptin-deficient mice (Ob/Ob) were administered 0.9% saline for 4 weeks.
- mice 7-week-old leptin-deficient mice (Ob/Ob) were administered PPng 2.5 ng/kg/day for 4 weeks.
- -ObOb/Leptin animal group 7-week-old leptin-deficient mice (Ob/Ob) were administered PPB 0.85 mg/kg/day for 4 weeks.
- MRNA was extracted from adipose tissue to confirm the expression levels of AC, PKA, and HSL, which are major factors for lipolysis, and confirmed using real-time PCR.
- the expression of AC, PKA, and HSL increased statistically significantly together with the positive control group (ObOb/Leptin). That is, it was confirmed that the effective substance PPB promotes the breakdown of adipocytes by effectively regulating three transcription factors.
- the Ecklonia cava extract As described above, as described above, as described above, as described above, the Ecklonia cava extract, the Ecklonia cava extract is the main extract, and the Eccata cava extract is pyrogallol-fluoroglucino-6,6'-biexol (PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6) '-bieckol), in the case of a composition for dietary control according to another embodiment of the present invention, it was found that it shows an excellent effect on the reduction of adipocyte size through the promotion of lipolysis and inhibition of adipocyte synthesis. In addition, it was confirmed that the composition for dietary control is not limited to adipose tissue, but is capable of realizing a weight loss effect by causing spontaneous dietary regulation through control of the central nervous system.
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Abstract
감태추출물을 포함하고, 상기 감태추출물이 주정추출물이며, 상기 감태추출물이 피로갈롤-플로로글루시놀-6,6'-비엑콜(PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol)을 포함하는 식이조절용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 식이조절용 조성물을 제공하기 위한 제조방법으로서, 40중량% 초과, 100중량% 이하의 알코올 조성물을 함유한 용매를 준비하는 단계; 및 상기 용매를 이용하여 감태 원료를 주정추출하여 감태추출물을 얻는 단계;를 포함하는 식이조절용 조성물의 제조방법을 제공한다.
Description
감태추출물을 포함함으로써 식이조절이 가능하고, 특히, 그 효능을 극대화할 수 있는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
해조류에는 각종 미네랄, 비타민, 섬유소 등이 풍부하다. 특히, 알긴산, 퓨칸설페이트, 라미나란 등의 수용성 다당류가 풍부하며, 이러한 성분들은 항당뇨, 항응고, 항염증, 항종양 등의 생리 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다.
이러한 해조류의 일 종류인 감태(학명: Ecklonia cava)는 갈조식물 다시마목 미역과의 해조(海藻)류이다. 색은 갈색인데 건조하면 흑색이 된다. 주로 제주도 일대 및 일부 남해안에 분포하며, 점심대의 수심 10m 내외의 깊은 곳에서 서식한다. 2년에서 3년간 생장하는 다년생 식물로서, 알긴산, 요오드 및 칼륨 등의 영양소가 많이 함유되어 있는 건강식품자원이다. 또한 감태에는 후코이단과 플로로탄닌 성분 등이 함유되어 있고, 이 성분들은 항산화효과, 항암효과, 항염효과, 노화억제효과 및 고혈압 억제효과 등에 우수한 것으로 알려져 있다.
감태의 효능과 관련된 종래 기술로는 대한민국 특허출원 제10-2011-0102474호 등에 발모제 등 화장료에 관한 기술이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2011-0073612호 등에 면역 증강용 조성물 등이 개시되어 있다.
다만, 해조류에 대한 연구는 육상 식물에 비하여 미흡한 실정이며, 특히, 감태로부터 도출될 수 있는 생리활성의 효능을 극대화하기 위한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 일 구현예는 지방분해 촉진, 지방세포 합성의 억제를 통한 지방세포 크기의 감소에 탁월한 효과를 나타내며, 특히, 중추신경의 조절을 통하여 자발적인 식이조절을 일으킴으로써 체중 감소 효과를 구현할 수 있는 식이조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예는 전술한 이점을 갖는 식이조절용 조성물을 얻을 수 있는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 감태추출물을 포함하고, 상기 감태추출물이 주정추출물이며, 상기 감태추출물이 피로갈롤-플로로글루시놀-6,6'-비엑콜(PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol)을 포함하는 식이조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 40중량% 초과, 100중량% 이하의 알코올을 함유한 용매를 준비하는 단계; 및 상기 용매를 이용하여 감태 원료를 주정추출하여 감태추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 식이조절용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 식이조절용 조성물은 지방분해 촉진, 지방세포 합성의 억제를 통한 지방세포 크기의 감소에 탁월한 효과를 나타내며, 특히, 중추신경의 조절을 통하여 자발적인 식이조절을 일으킴으로써 체중 감소 효과를 구현할 수 있다.
도 1은 감태추출물(ECE) 및 유효성분(PPB)의 체중, 체지방감소 및 식이량 감소 효능을 나타낸 것이다.
도 2는 감태추출물(ECE)의 간조직과 지방세포에서 지방 발현 감소 효능을 나타낸 것이다.
도 3은 감태추출물(ECE) 및 유효성분(PPB)의 대사증후군 표지인자의 발현 감소 효능을 나타낸 것이다.
도 4는 시상하부의 식용중추 조절에 대한 개략적인 모식도이다.
도 5는 유효성분(PPB)의 렙틴 대체제로서의 효능을 나타낸 것이다.
도 6은 유효성분(PPB)의 렙틴 관련 신호전달계 주요 마커(marker)의 발현 증가 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 렙틴 결핍 동물 모델에서 유효성분(PPB)의 지방축적 감소 효능을 나타낸 것이다.
도 8은 렙틴 결핍 동물 모델에서 유효성분(PPB)의 지방크기 감소 효능을 나타낸 것이다.
도 9는 분화배지(DM) 처리 전후의 오일레드오(Oil Red O) 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 ECE 처리 지방세포의 지방분해 조절인자 발현 관련 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 ECE 처리 지방세포의 에너지 대사조절인자의 발현 관련 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 ECE 처리 지방세포의 지방합성 조절인자의 발현 관련 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 ECE 처리 지방세포의 열생성 관련 전사인자 발현 관련 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 ECE 처리 지방세포의 렙틴 및 아디포넥틴 분비에 관하여 나타낸 것이다.
도 15는 ECE 처리 지방세포의 분화, 지방의 크기, 지질 축적 정도를 나타낸 것이다.
도 16은 ECE 처리 대식세포의 염증 조절에 관해 나타낸 것이다.
도 17은 ECE 처리 대식세포의 염증조절을 통한 지방세포 분화 전사인자의 발현 억제에 대해 나타낸 것이다.
도 18은 ECE 처리 대식세포의 염증조절을 통한 지방세포의 비대 관련 전사인자의 발현 억제에 대해 나타낸 것이다.
도 19는 ECE 투여 동물 모델의 체중 감소 등의 효과를 나타낸 것이다.
도 20은 ECE 투여 동물 모델의 콜레스테롤 대사 및 중성지방 조절 효과를 나타낸 것이다.
도 21은 ECE 투여 동물 모델의 지방구 크기 변화 효과에 대해 나타낸 것이다.
도 22는 ECE 투여 동물 모델의 에너지대사 조절인자의 발현에 대해 나타낸 것이다.
도 23은 ECE 투여 동물 모델의 지방축적 및 지방합성 조절인자의 발현에 대해 나타낸 것이다.
도 24는 ECE 투여 동물 모델의 혈중 렙틴 및 아디포넥틴 분비에 대해 나타낸 것이다.
도 25는 ECE 투여 동물 모델의 혈당 조절에 대해 나타낸 것이다.
도 26은 PPB 투여 동물 모델의 체중 감소 등의 효과를 나타낸 것이다.
도 27은 PPB 투여 동물 모델의 콜레스테롤 대사 조절에 대해 나타낸 것이다.
도 28은 PPB 투여 동물 모델의 지방구 크기 변화 효과에 대해 나타낸 것이다.
도 29는 PPB 투여 동물 모델의 지방분해 관련 전사인자 발현에 대해 나타낸 것이다.
도 30은 PPB 투여 동물 모델의 에너지 대사 조절 전사인자의 발현에 대해 나타낸 것이다.
도 31은 렙틴 결핍 동물 모델의 PPB 투여에 의한 체중 감소 등의 효과를 나타낸 것이다.
도 32는 렙틴 결핍 동물 모델의 PPB 투여에 의한 시상하부 단백질 발현에 대해 나타낸 것이다.
도 33은 렙틴 결핍 동물 모델의 PPB 투여에 의한 지방분해 관련 전사인자 발현에 대해 나타낸 것이다.
도 34는 렙틴 결핍 동물 모델의 PPB 투여에 의한 에너지 대사조절 관련 전사인자의 발현에 대해 나타낸 것이다.
도 35는 렙틴 결핍 동물 모델의 PPB 투여에 의한 지방구 크기 변화를 나타낸 것이다
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 후술하는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현 가능하며, 본 실시예는 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위는 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 일 구현예는 감태추출물을 포함하고, 상기 감태추출물이 주정추출물이며, 피로갈롤-플로로글루시놀-6,6'-비엑콜(PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol)을 포함하는 식이조절용 조성물을 제공한다.
원료인 감태류(Ecklonia cava)는 식품 원료로서 식약처 식품원료목록에 품목번호 A가0068600호에 등재되어 있다(「식품의 기준 및 규격」제2017-102호, 2017.12.15). 이러한 감태류를 추출하는 방법으로서, 열수추출, 주정추출, 초음파추출 등 다양한 방법이 존재한다. 일 구현예에 따른 상기 식이조절용 조성물은 주정추출의 방법으로 추출된 감태추출물을 포함하는 것으로서, 이로 인해, 다른 방법으로 추출된 감태추출물을 포함하는 조성물에 비하여 탁월한 식이조절 성능을 구현할 수 있다.
구체적으로, 상기 식이조절용 조성물에 있어서, 상기 감태추출물은 추출 수율이 10% 이상일 수 있다. 상기 '수율'은 원료인 감태의 중량 대비 추출된 추출물의 중량의 비율을 백분율로 나타낸 것이다. 구체적으로, 상기 감태추출물의 추출 수율은 약 10% 내지 약 30%일 수 있다.
상기 식이조절용 조성물의 감태추출물은 유효 성분으로서 피로갈롤-플로로글루시놀-6,6'-비엑콜(PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol)을 포함할 수 있다. 상기 감태추출물은 후술하는 방법에 따라 주정 추출됨으로써 PPB를 유효 성분으로 함유할 수 있고, 이로써 목적하는 식이조절 성능을 구현할 수 있다.
상기 PPB의 화학적 구조는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
상기 감태추출물 중의 상기 PPB의 함량은 1중량% 내지 5중량%일 수 있고, 예를 들어, 1중량% 내지 4중량%일 수 있다. 상기 감태추출물은 전술한 바와 같이 주정추출물이며, 특히, 추출 수율이 10% 이상인 주정추출물인 경우, 상기 PPB를 전술한 함량 범위로 함유하기에 용이할 수 있다. 즉, 상기 감태추출물은 추출 수율이 10% 이상임과 동시에, 상기 PPB를 1중량% 내지 5중량% 함유할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 감태추출물은 추출 수율이 약 10% 내지 약 30%임과 동시에, 상기 PPB를 약 1중량% 내지 약 4중량% 함유할 수 있다.
상기 감태추출물은 감태 원료를 알코올을 포함하는 용매로 주정 추출하여 얻어질 수 있다. 이때, 상기 용매는 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 알코올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 알코올 조성물을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 알코올 조성물은 에틸알코올을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 알코올 조성물은 에틸알코올을 90부피% 내지 100부피% 포함할 수 있다. 또한, 상기 알코올 조성물은 메틸알코올을 포함하지 않거나, 포함하더라도 0.5mg/mL 이하, 예를 들어, 0.2mg/mL 이하, 예를 들어, 0.1mg/mL 이하, 예를 들어. 0.1mg/mL 내지 0.0001mg/mL 이하로 포함할 수 있다. 상기 알코올 조성물이 이러한 조성을 가짐으로써 이를 이용하여 상기 식이조절용 조성물의 목적하는 효과를 구현하기 위한 감태추출물을 얻을 수 있다.
상기 용매는 상기 알코올 조성물을 40중량% 초과, 100중량% 이하로 포함할 수 있고, 예를 들어, 약 40중량% 초과, 약 60중량% 이하로 포함할 수 있고, 예를 들어, 약 50중량% 포함할 수 있다. 상기 용매는 전술한 함량의 알코올 조성물과 잔여 함량의 물로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 상기 식이조절용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 총 중량 중에 상기 식이조절용 조성물을 0.01중량% 내지 99중량% 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 식이조절용 조성물을 포함하는 다양한 형태로 구현될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 형태, 예를 들어, 과립제, 정제, 에멀젼, 시럽, 산제, 현탁액, 캡슐제, 에어로졸 등의 제형으로 구현될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 경구용 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제제화될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 식이조절용 조성물을 포함하는 기능성 식품 조성물을 포함한다.
상기 기능성 식품 조성물은 총 중량 중에 상기 식이조절용 조성물을 0.01중량% 내지 99중량% 포함할 수 있다.
상기 식품 조성물의 '기능성'이란, 인체의 영양소를 조절하거나, 생리학적으로 유용한 효과를 부여하는 것을 의미하며, 이러한 기능성 부여를 위하여 상기 식이조절용 조성물에 더하여 다양한 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 식품 첨가물은 식품의약품안전청에 의해 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의거하여 적합 여부를 판단한다.
본 발명의 다른 구현예는, 40중량% 초과, 100중량% 이하의 알코올 조성물을 함유한 용매를 준비하는 단계; 및 상기 용매를 이용하여 감태 원료를 주정추출하여 감태추출물을 얻는 단계를 포함하는 식이조절용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 식이조절용 조성물의 제조방법으로 제조된 식이조절용 조성물은 전술한 특징 및 이점을 모두 구현할 수 있다.
구체적으로, 상기 감태추출물을 얻는 단계는, 상기 감태 원료를 40℃ 내지 60℃에서 6시간 내지 24시간 동안 주정추출하는 단계일 수 있다. 이와 같은 온도 및 시간 범위로 추출함으로써, 상기 화학식 1의 유효 성분이 적절히 포함된 감태추출물을 얻을 수 있고, 이를 포함한 식이조절용 조성물이 목적하는 효과를 구현할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예 등을 통하여 더욱 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위는 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1: 감태추출물을 포함하는 식이조절용 조성물의 제조
하기 표 1에 기재된 바에 따라, 각각의 조건을 통하여 제조예 1 내지 11의 감태추출물을 제조하였고, 각각의 수율과 추출된 감태추출물 중의 상기 화학식 1의 유효 성분인 PPB의 함량을 확인하였다. 하기 표 1에서 [물 추출 후 주정 추출] 조건의 %는 주정 추출에 사용된 용매의 알코올 조성물의 중량%이고, [주정 추출] 조건의 %는 주정 추출에 사용된 용매의 알코올 조성물의 중량%이다. 상기 두 조건의 알코올 조성물은 에틸알코올 95부피%를 포함하고, 메틸알코올 0.0016mg/mL를 포함하였다.
| 제조예 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 추출조건 | 물 | 초음파 | 물 추출 후 주정 추출 | 주정 추출 | |||||||
| 물 | 주정 | 20% | 40% | 50% | 10% | 20% | 40% | 50% | 100% | ||
| 수율(%) | 19 | 22.4 | 8 | 1 | 3.0 | 3.5 | 3.8 | 11.1 | 7.9 | 10.3 | 1.8 |
| 함량(%) | 0.31 | 0.30 | 1.18 | 0.39 | 1.20 | 2.95 | 2.98 | 0.63 | 2.26 | 2.45 | 3.1 |
상기 제조예 1 내지 11을 통하여, 40중량% 초과, 100중량% 이하의 알코올을 함유한 용매를 사용하여 주정추출된 제조예 10의 감태추출물이, 물 추출, 초음파 추출 등의 다른 추출방식에 비하여 유효 성분인 PPB를 가장 많이 함유하는 감태추출물을 얻을 수 있는 제조예임을 알 수 있었다. 즉, 상기 제조예 10의 감태추출물의 경우, 추출 수율 10% 이상 및 PPB 함량 2중량% 내지 4중량%를 만족함을 알 수 있었다. 실시예
2:
감태추출물
(
ECE
) 및 유효성분(
PPB
)의
식이조절
효능 검증
실험 동물 모델 및 실험군 제작
6주령 C57BL/6 마우스에 45% 고지방식이(High Fat Diet, HFC)를 4주간 먹여 비만 동물모델 5마리를 제작하였다. 다음 4주간, 각 동물군에 대하여 하기와 같은 물질 투여를 진행하였다.
1) NFD 동물군: 일반지방식이(Normal Fat Diet, NFD) 동물군으로서 물을 투여하였다.
2) HFD 동물군: 고지방식이(High Fat Diet, HFD) 동물군으로서, 물을 투여하였다.
3) ECE 동물군: 감태추출물(Ecklonia Cava Extract, ECE) 투여 동물군으로서, 상기 제조예 10의 감태추출물 70mg/kg을 투여하였다.
4) PPB 동물군; 상기 감태추출물의 유효성분인 피로갈롤-플로로글루시놀-6,6'-비엑콜(pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol, PPB) 2mg/kg을 투여하였다.
5) GCE 동물군; 양성 대조군으로서 가르시니아(Garcinia, GCE) 400mg/kg를 투여하였다.
체중 및 체지방감소 효능 확인
도 1을 참조할 때, ECE 동물군 및 PPB 동물군에서 통계적으로 유의하게 체중감소(A), 체지방 감소(B, C)를 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, 식이량 감소(D) 효과를 확인할 수 있었는데, 이는 ECE 동물군 및 PPB 동물군에 있어서, 중뇌의 시상하부(hypothalamus)에 의한 음식 섭취 조절이 가능하고, 이로 인해 체중 및 체지방 감소가 나타남을 입증한 것이라 볼 수 있다.
지방세포 크기 감소 효능 확인
도 8을 참조할 때, PPB 동물군에서 지방세포의 크기(A-D)가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히, 종래의 체중 조절 약물로는 줄이기 어려운 혈관주변지방(B)이 눈에 띄게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
지방침윤 및 지방세포 분화 감소 효능 확인
오일레드오(Oil Red O) 염색을 통하여 지방세포를 염색할 수 있는데, 도 2의 A를 참조할 때, ECE 동물군(HFD-ECE)의 경우, HFD 동물군에 비하여 지방세포 침윤이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2의 B를 참조할 때, ECE 농도별 효능을 확인할 수 있었고, 구체적으로, ECE가 미분화지방세포의 지방세포로의 분화를 저해하는 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
대사증후군 표지인자 발현 감소 효능 확인
상기 각 동물군에 대하여 혈액검사를 통해 체내 콜레스테롤과 간독성을 검사하였다. 도 3의 그래프들을 참조할 때, ECE 동물군과 PPB 동물군에 있어서, 간독성(A, B)이 현저히 낮아짐을 확인할 수 있었고, 비만과 연관 있는 중성지방, 총 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 등(C, D, E)의 발현이 유의미하게 낮아짐을 확인할 수 있었다. 이를 통해, PPB를 함유하는 ECE가 체중감소 효능을 통해 대사증후군 관련 표지인자까지도 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
시상하부 식욕중추 조절을 통한 체중 조절 효능 확인
도 4를 참조할 때, 식욕을 담당하는 시상하부는 지방세포로부터 분비된 렙틴(Leptin)에 의해 조절된다. 이때, 렙틴은 식욕을 억제하고 에너지 소비를 증가시켜 탁월한 체중 감소 효과를 나타낸다. 그러나, 비만 동물 모델의 경우, 시상하부에서 렙틴 반응성이 저하되는 소위, 렙틴 저항성이 생겨 비만이 악화될 수 있다.
PPB의 렙틴 대체 역할을 확인하기 위하여, 렙틴 결핍 동물 모델(Ob/Ob)을 대상으로 실험하였다. 렙틴 결핍 동물 모델은 식욕억제 및 에너지 소비를 증가시키는 렙틴이 없기 때문에, 고지방식이를 하지 않아도 비만 유도 동물모델이 될 수 있다. 7주령의 Ob/Ob 마우스에 4주 동안 하기와 같이 물질 투여를 실시하여 각 동물군을 제조하였다.
1) Saline 동물군: 4주 동안 0.9%의 식염수 (Saline)를 투여하였다.
2) PPB 동물군: PPB를 10mg/kg/day 투여하였다.
3) Leptin 동물군: 렙틴(leptin)을 0.85g/kg/day 투여하였다.
도 5를 참조할 때, PPB 동물군에서 유의미한 체중감소와 체지방 감소(A), 식이량 변화(B)를 확인할 수 있었으며, 대사증후군의 표지 인자인 혈중 중성지방(C), 콜레스테롤 수치(D) 및 지방산(E)이 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 식이량의 변화(B)를 통하여, PPB가 시상하부에서 음식 섭취 조절 역할을 하며, 이로써 PPB가 렙틴 대체제로서 기능할 수 있음을 알 수 있었다.
도 6을 참조할 때, PPB 동물군에서 렙틴 관련 신호전달계 주요 마커(marker)의 발현이 증가함을 확인할 수 있었고, 특히, 시상하부에서 렙틴 신호전달계에 가장 중요한 마커인 pSTAT3의 발현이 눈에 띄게 증가함을 확인할 수 있었다.
도 7을 참조할 때, 오일레드오(Oil red O) 염색을 통해 확인한 결과, Ob/Ob 동물모델의 PPB 동물군에서 간에 축적된 지방이 감소함을 확인할 수 있었다.
또한, Ob/Ob 동물모델의 PPB 동물군에서 다양한 부위의 지방조직을 채취하여 H&E (헤마토실린 & 에오신, hematocylin & eosin) 염색을 실시하여 지방 조직의 크기를 측정하였다. 도 8을 참조할 때, PPB 동물군의 지방조직 내 지방세포 크기가 김소한 것(A)을 확인할 수 있었고, 내장지방(B)과 피부밑지방(C)의 크기뿐만 아니라 혈관 주위에 붙어 심혈관 염증을 유도하는 혈관주변지방(perivascular fat, D)의 지방세포 크기가 유의미하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 감태추출물의 생체 외(in vitro) 효능 평가
미분화지방세포 3T3L1의 항비만 효능 평가
1) 세포 준비
ATCC社로부터 마우스 배아 섬유모세포 유리 3T3L1을 구매하였고, DMEM 세포배양 배지 (Cat. ATCC 30-2002™)에 10% Fetal bovine serum(소태아혈청), 1% penicilin/streptomycin(항생제)를 섞어 2일 간격으로 배양배지를 교체하였다.
2) 지방세포로의 분화
3T3L1 전지방세포(preadipocyte)를 지방세포(adipocyte)로 분화시키기 위하여 3T3L1 지방전구세포를 세포 배양용 디쉬(dish)에 넣은 뒤 세포가 90% 이상 채워질 때까지 배양하였다. 이어서, 배양 후 10μg/ml의 인슐린(insulin), 0.1mM의 덱사메타손(dexamethasone) 및 0.5mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthin, IBMX)가 포함된 분화 배지(differentiation medium, DM)로 교환하여 2일간 배양하였다. 이어서, 매 2일마다 10μg/ml의 인슐린이 포함된 새 배지로 교환하여 총 10일간 배양하였다. 도 9의 A는 분화 전의 지방세포의 모습이고, B는 분화배지(DM) 처리 후 10일 째 오일레드오(Oil red O) 염색된 지방세포의 모습을 나타낸 것이다.
감태추출물 처리군(DM/ECE)은 지방세포로 분화되는 과정 중에 배지를 교환할 때마다 상기 제조예 10의 감태추출물을 함께 처리하였다. 대조군(PBS)는 미분화지방세포에 인산 버퍼 식염수(Phosphate buffered saline, PBS)를 처리한 것이고, 질환군(DM/PBS)은 분화배지(DM) 처리한 지방세포에 PBS를 처리한 것이다.
3) 지방분해 조절인자의 발현 비교
분화배지(DM)의 지방세포에서 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 이용하여 지방분해 주요 인자인 프로테인 키나아제 A(protein kinase A, PKA), 아세틸-조효소A 카복실라아제(acetyl-CoA carboxylase, AC), 호르몬감수성 지방질가수분해효소(Hormone-sensitive lipase, HSL) 각각의 발현량을 확인하였다. 그 결과, 도 10을 참조할 때, 감태추출물을 함께 처리한 군(DM/ECE)이 대조군(PBS) 및 질환군(DM/PBS)에 비하여 지방분해 조절인자들의 발현이 통계적으로 유의미하게 증가함을 확인할 수 있었고, 본 발명의 일 구현예에 따른 감태추출물이 세 전사인자를 효과적으로 조절하여 지방세포의 분해를 촉진함을 알 수 있었다.
4) 에너지 대사조절 인자의 발현 비교
에너지 대사조절에 관여하는 전사인자인, Pref-1, CEBPβ 및 PPARα의 발현을 비교하기 위하여 분화배지처리(DM)한 지방세포에서 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 상보적 DNA(cDNA)로 합성을 한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 도 11을 참조할 때, 감태추출물을 함께 처리한 군(DM/ECE)에서 지방생성 조절인자의 발현이 통계적으로 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다.
5) 지방합성 조절인자의 발현 비교
지방합성 조절에 관여하는 전사인자인 아세틸-조효소A 카복실라아제(ACC) 및 지방산합성효소(Fatty acid synthase, FAS)의 발현을 비교하기 위하여 분화배지처리(DM)한 지방세포에서 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 도 12를 참조할 때, 감태추출물을 함께 처리한 군(DM/ECE)에서 지방합성 관여인자의 발현이 통계적으로 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다.
6) 열생성 관련 전사인자 발현 비교
에너지 대사 중 열생성 관여 인자인 Uncoupling Protein (UCP)의 발현 양을 확인하기 위하여 분화배지처리(DM)한 지방세포에서 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 cDNA로 합성을 한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 도 13을 참조할 때, 감태추출물을 함께 처리한 군(DM/ECE)에서 통계적으로 유의하게 UCP의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.
7) 렙틴(leptin) 및 아디포넥틴(Adiponectin) 분비 비교
렙틴(leptin) 및 아디포넥틴(Adiponectin) 두 호르몬 모두 지방세포의 성숙상태에 따라 아디포넥틴은 감소하고, 렙틴은 증가하여 지방세포 내 염증을 유발하고 대사조절에 중요한 역할을 한다. 두 호르몬의 발현을 확인하기 위하여, 각각의 군에서 단백질을 분리하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 시행하였다. 실험에 이용한 샘플은 각 세포로부터 분비된 탈리액(supernatant)이다. 도 14를 참조할 때, 감태추출물을 함께 처리한 군(DM/ECE)에서 통계적으로 유의하게 렙틴과 아디포넥틴의 양이 변화한 것을 확인할 수 있었다.
8) 지방세포 분화 정도, 지방세포 크기 및 지질 축적 정도 비교
미분화지방세포(3T3L1)을 분화배지(DM)를 통해 성숙한 지방세포로 분화시킨 후, 감태추출물(ECE)을 처리 한 뒤 이의 분화 정도, 지방세포 크기 및 지질 축적 정도를 비교하였다. 분화 정도는 오일레드오(Oil red O) 염색을 통해 확인하였고, 지방세포의 크기 및 지질 축적 정도는 각각의 크기 및 정도를 측정하였다. 그 결과, 도 15를 참조할 때, 감태추출물을 함께 처리한 군(DM/ECE)에서 지방세포의 분화 정도, 지방세포의 크기 및 지질축적 정도가 통계적으로 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다.
지방세포 염증 조절 효능 평가
비만의 경우, 지방조직 내 대식세포의 활발한 염증반응이 비만을 더욱 악화시키는 경향이 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 감태추출물을 포함하는 식이조절용 조성물은 지방조직 내 대식세포로부터 분비되어 나오는 여러 염증성 사이토카인(Cytokine)을 조절하여 미분화지방세포의 비만세포로의 분화 및 비대를 억제하는 효과가 있다. 하기에서 이를 기술하고자 한다.
1) 세포 준비
ATCC社로부터 대식세포(Raw 264.7)를 구매하였으며, DMEM 세포배양 배지에 10% Fetal bovine serum(소태아혈청), 1% penicilin/streptomycin(항생제)를 섞어 2일 간격으로 배양배지를 교체하였다. 비만과 같은 조건을 형성하기 위하여, bovine serum albumin conjugated palmitate acid(PA)를 24시간 처리 한 뒤, 대식세포의 탈리액(supernatant)을 3T3L1 세포에 처리 후 미분화지방세포의 비만세포로의 분화(differentiation) 및 비대(hypertrophy) 관련 조절인자의 발현을 확인하였다.
2) 지방세포 분화 억제 효과 확인
도 16을 참조할 때, 대식세포로부터 분비되어 나온 탈리액(supernatant)을 처리한 3T3L1 세포(PA/PBS)의 비만 세포로의 분화율은 크게 증가하였으나, 상기 대식세포로부터 분비되어 나온 탈리액을 처리한 세포에 상기 제조예 10의 감태추출물(ECE)을 처리한 군(PA/ECE)의 분화율은 통계적으로 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식이조절용 조성물은 대식세포 조절을 통해 지방세포의 분화를 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2) 지방세포 분화 전사인자 발현 억제 효과 확인
도 17을 참조할 때, 대식세포로부터 분비되되 나온 탈리액을 처리한 3T3L1 세포(PA/PBS)의 비만세포로의 분화 관련 전사인자, 즉, HSL, Plin2, CD36, FABP4, 및 PPARα의 발현은 크게 증가하였으나, 상기 대식세포로부터 분비되어 나온 탈리액을 처리한 세포에 상기 감태추출물(ECE)을 처리한 군(PA/ECE)의 비만세포로의 분화 관련 전사인자의 발현은 통계적으로 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식이조절용 조성물은 대식세포 조절을 통해 비만세포로의 분화 관련 전사인자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
3) 지방세포의 비대 관련 전사인자 발현 억제 효과 확인
도 18을 참조할 때, 대식세포로부터 분비되되 나온 탈리액을 처리한 3T3L1 세포(PA/PBS)의 비만세포로의 비대관련 전사인자 ELOVL7, FASN 및 ACACA의 발현은 크게 증가하였으나, 상기 대식세포로부터 분비되어 나온 탈리액을 처리한 세포에 상기 감태추출물(ECE)을 처리한 군(PA/ECE)의 비만세포로의 비대관련 전사인자의 발현은 통계적으로 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식이조절용 조성물은 대식세포 조절을 통해 비만세포로의 비대관련 전사인자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 감태추출물 생체 내(in vivo) 효능 평가
고지방식이 유도 동물 모델에서의 ECE의 항비만 효능 확인
1) 동물 모델 제작
모든 동물 실험은 가천대학교 이길여암당뇨연구원의 동물실험실에서 진행되었다. 본 실험실은 Specific pathogen free(SPF), 세계적인 표준인 Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) 인증 시설이다.
4주간의 정상식이(chaw diet, CD) 혹은 고지방식이(high fat diet, HFD) 섭취 후, 다시 4주간 고지방식이와 각 물질 투여(0.9% 식염수, Saline; 상기 제조예 10의 감태추출물 ECE, 70mg/kg/day; 가르시니아 GCE, 400mg/kg/day)를 4주간 진행한 뒤 도태하여 유효성을 평가하였다.
2) 비만 표현형(phenotype) 비교
고지방식이(HFD) 유도 동물 모델에 상기 각 물질 투여 후 체중, 지방무게, 지방외 무게 및 식이량을 각각 확인하였다. 도 19를 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고, 상기 감태추출물(ECE) 투여군(HFD/ECE)에서 유의미한 체중(Body weight) 감소 및 체지방(Fat mass) 감소를 보임을 확인할 수 있었다. 특히, 자발적 식이량(Food intake)이 감소하였음을 확인할 수 있었고, 이는 ECE 투여군이 식이조절을 통한 체중감소 효능을 보이는 것임을 알 수 있었다.
3) 콜레스테롤 대사 및 중성지방 조절 비교
각 동물 모델에서 혈액을 채취하여 혈장 내 콜레스테롤 대사 조절과 관련 있는 저밀도지질단백질(Low density lipoprotein, LDL), 총콜레스테롤(Total cholesterol)과 중성지방(Triglyceride)을 확인하였다. 특히, 혈장에서의 LDL은 혈중 지질의 한 형태로, LDL이 많아지면 혈관을 타고 장기에 손상을 주거나 혈관 벽에 점차 쌓이게 되며, 동맥경화나 관상 동맥질환의 위험도가 높아지고 중성지방은 복부비만과 특히 관련이 있으며, 체중조절에 의해 유의하게 감소한다. 도 20을 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 감태추출물 투여군(HFD/ECE)에서 통계적으로 유의하게 LDL, 총콜레스테롤 및 중성지방이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 경쟁 원료인 가르시니아를 투여한 군(HFD/GCE)에서는 통계적으로 유의하게 LDL, 총콜레스테롤 및 중성지방이 변화하지 않았다. 즉, 본 발명의 일 구현예에 따른 감태추출물(ECE)을 포함하는 식이조절용 조성물이 체중감소의 효과로 혈중 콜레스테롤과 중성지방도 함께 조절하는 것을 확인할 수 있었다.
4) 백색지방 조직의 지방구의 크기 비교
백색지방 조직의 형태학적 관찰을 위해 H&E 염색을 진행하였다. 고지방식이로 인해 지방조직 내 지질(lipid)로 가득찬 경우 지방세포의 크기가 증가한다. 도 21을 참조할 때, 각 군에 대하여 지방세포의 크기를 측정한 경우, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 감태추출물 투여군(HFD/ECE)과 경쟁 원료인 가르시니아 투여군(HFD/GCE)에서 통계적으로 지방구가 감소함을 확인할 수 있었다.
5) 에너지대사 조절인자의 발현 비교
에너지 대사 조절에 관여하는 전사인자인, Pref-1, CEBPβ 및 PPARα의 발현을 비교하기 위하여 지방조직에서 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 상보적 DNA(cDNA)로 합성을 한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 이용하여 확인하였다. 도 22를 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 감태추출물 투여군(HFD/ECE)에서 통계적으로 유의미하게 Pref-1(Preadipocyte factor 1), CEBPβ(CCAAT/enhancer-binding protein beta isoform) 및 PPARα(Peroxisome proliferator-activated receptor α)의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 한편, 경쟁원료 가르시니아 투여군(HFD/GCE)에서의 발현은 Pref-1 외의 전사인자만을 조절함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 감태추출물(ECE)을 포함하는 식이조절용 조성물이 세 전사인자를 효과적으로 조절하여 지방세포의 증가를 줄임을 확인할 수 있었다.
6) 지방축적 및 지방합성 조절인자의 발현 비교
지방축적 관여하는 전사인자인 Lipoprotein lipase(LPL)과 지방합성 조절에 관여하는 전사인자인 Acetyl CoA carboxylase(ACC), Fatty acid synthase(FAS)의 발현을 비교하기 위하여 각 군의 지방조직에서 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 확인하였다. 도 23을 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 감태추출물 투여군(HFD/ECE)에서 지방축적 및 지방합성 조절인자의 발현이 감소하였으며, 특히 지방합성에 중요한 ACC의 발현이 눈에 띄게 감소함을 확인할 수 있었다.
7) 혈중 렙틴(Leptin) 및 아디포넥틴(Adiponectin) 분비 비교
아디포넥틴(Adiponectin)은 인슐린감수성을 조절하는 호르몬이며, 렙틴(Leptin)은 식욕억제호르몬이다. 도 24를 참조할 때, 고지방식이 섭취 군(HFD/Saline)의 경우, 정상식이군(CD/Saline)에 비해, 늘어난 지방조직으로 인해 렙틴(Leptin)의 분비가 증가하고, 아디포넥틴(Adiponectin)의 분비는 감소한다. 다만, 도 24를 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고, 감태추출물 투여군(HFD/ECE)의 경우, 렙틴(Leptin)과 아디포넥틴(Adiponectin) 분비량이 변화하였으나, 경쟁 원료인 가르시니아 투여군(HFD/GCE)의 경우에는 렙틴(leptin)의 발현이 유의미하게 조절되지 못하였음을 확인할 수 있었다.
8) 혈당 조절 비교
각 군에 대하여, 12시간 금식 후 혈당(Glucose)의 레벨을 측정하였다. 도 25를 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 감태추출물 투여군(HFD/ECE)과 가르시니아 투여군(HFD/GCE)에서 낮은 혈당 레벨을 보임을 확인할 수 있었다.
고지방식이 유도 동물 모델에서의 PPB의 항비만 효능 확인
1) 동물 모델 제작
4주간의 정상식이(chaw diet, CD) 혹은 고지방식이(high fat diet, HFD) 섭취 후, 다시 4주간 고지방식이와 유효 물질 투여(PPB 2.5mg/kg/day)를 4주간 진행한 뒤 도태하여 유효성을 평가하였다.
2) 비만 표현형(phenotype) 비교
고지방식이(HFD) 유도 동물 모델에 상기 각 물질 투여 후 체중, 지방무게, 지방외 무게 및 식이량을 각각 확인하였다. 도 26를 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고, PPB 투여군(HFD/PPB)에서 유의미한 체중(Body weight) 감소 및 체지방(Fat mass) 감소를 보임을 확인할 수 있었다. 특히, 자발적 식이량(Food intake)이 감소하였음을 확인할 수 있었고, 이는 PPB가 뇌의 시상하부의 식이조절을 통한 체중감소 효능을 보이는 것임을 알 수 있었다.
3) 콜레스테롤 대사 조절
각 동물 모델에서 혈액을 채취하여 혈장 내 콜레스테롤 대사 조절과 관련 있는 LDL, 총콜레스테롤 및 중성지방을 확인하였다. 도 27을 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고, 상기 PPB 투여군(HFD/PPB)에서 통계적으로 유의미하게 LDL, 총콜레스테롤 및 중성지방이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식이조절용 조성물이 체중 감소의 효과로서 혈중 콜레스테롤을 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.
4) 지방구의 크기 비교
지방 조직의 형태학적 관찰을 위해 H&E 염색을 진행하였다. 고지방식이로 인해 지방조직 내 지질(lipid)로 가득찬 경우 지방세포의 크기가 증가한다. 도 28을 참조할 때, 각 군에 대하여 지방세포의 크기를 측정한 경우, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 PPB 투여군(HFD/PPB)에서 통계적으로 유의미하게 지방구가 감소함을 확인할 수 있었다.
5) 지방분해 관련 전사인자 발현 비교
지방분해 주요 인자인 프로테인 키나아제 A(protein kinase A, PKA), 아세틸-조효소A 카복실라아제(acetyl-CoA carboxylase, AC), 호르몬감수성 지방질가수분해효소(Hormone-sensitive lipase, HSL) 각각의 발현량을 확인하기 위하여 각 군의 지방조직에서 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 cDNA로 합성을 한 뒤, 실시간 PCR을 이용하여 확인한 결과, 도 29를 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 유효물질 PPB 투여군(HFD/PPB)에서 통계적으로 유의미하게 PKA, AC 및 HSL의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.
6) 에너지대사 조절 전사인자 발현 비교
에너지대사 조절 주요 인자인 Pref-1, CEBP/β 및 PPARα의 각각의 발현량을 확인하기 위하여 각 군에 대하여 실시간 PCR을 이용하여 확인하였다. 도 30을 참조할 때, 고지방식이를 하였음에도 불구하고 유효물질 PPB 투여군(HFD/PPB)에서 통계적으로 유의미하게 Pref-1, CEBP/β 및 PPARα의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.
렙틴(Leptin) 결핍 동물 모델에서 PPB의 항비만 효능 확인
1) 동물 모델 제작
식욕을 담당하는 시상하부는 지방세포로부터 분비된 렙틴(Leptin)에 의해 조절되며, 렙틴은 식욕을 억제하고 에너지 소비를 증가시켜 탁월한 체중감소 효과를 나타낸다. 그러나, 비만 동물 모델의 경우, 시상하부에서 렙틴에 대한 반응성이 저하되는 '렙틴 저항성(Leptin-resistance)'가 생겨 비만이 악화된다. 렙틴 결핍 동물 모델(Ob/Ob)은 식욕 억제 및 에너지 소비를 증가시킬 수가 없어, 고지방식이를 하지 않아도 비만 유도 동물 모델이 제작될 수 있다. 하기와 같이 각각의 동물군을 제작하여 후술하는 바에 따른 각 실험을 진행하였다.
- C57/Saline 동물군: 음성 대조군으로 7주령 C57BL/6 쥐를 준비하고, 4주 동안 0.9%의 식염수 (Saline)를 투여하였다.
- ObOb/Saline 동물군: 7주령 렙틴 결핍 쥐(Ob/Ob)에 4주 동안 0.9%의 식염수 (Saline)를 투여하였다.
- ObOb/PPB 동물군: 7주령 렙틴 결핍 쥐(Ob/Ob)에 4주 동안 PPB 2.5ng/kg/day를 투여하였다.
- ObOb/Leptin 동물군: 7주령 렙틴 결핍 쥐(Ob/Ob)에 4주 동안 PPB 0.85mg/kg/day를 투여하였다.
2) 비만 표현형(phenotype) 비교
각 동물군에 대하여, 체중, 지방무게, 지방외 무게 및 식이량을 각각 확인하였다. 도 31을 참조할 때, 고지방식이를 PPB 투여군(ObOb/PPB)에서 유의미한 체중(Body weight) 감소 및 체지방(Fat mass) 감소를 보임을 확인할 수 있었다. 특히, 자발적 식이량(Food intake)이 감소에 있어서, 렙틴 투여군(ObOb/Leptin)과 유사한 수준을 나타냄을 확인할 수 있었고, 이는 PPB가 뇌의 시상하부의 식이조절을 통한 체중감소 효능을 보이는 것임을 알 수 있었다.
3) 렙틴 신호전달(Leptin signaling)의 변화
각 동물군에 대하여, 식욕 조절 중추인 시상하부의 단백질을 추출한 뒤 EKR, pEKR, STAT5, pSTAT5, STAT3, pSTATE3, AKT, pAKT, FoxO1 단백질의 발현 양을 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 확인하였다. 도 32를 참조할 때, 렙틴 결핍 모델 군(ObOb)은 렙틴의 양이 부족하므로, Ob-R(Receptor of leptin)의 발현이 감소하지만, PPB 투여군(ObOb/PPB)에서의 EKR, pEKR, STAT3, pSTATE3은 양성 대조군(ObOb/Leptin)과 유사하게 발현 양이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
4) 지방분해 관련 전사인자 발현 비교
지방분해 주요 인자인 AC, PKA 및 HSL의 발현 양을 확인하기 위하여 지방조직에서 mRNA를 추출하여, 실시간 PCR을 이용하여 확인하였다. 도 33을 참조할 때, PPB 투여군(ObOb/PPB)의 경우, 양성대조군(ObOb/Leptin)과 함께 통계적으로 유의미하게 AC, PKA, HSL의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 즉, 유효 물질 PPB는 세 전사인자를 효과적으로 조절하여 지방세포의 분해를 촉진함을 확인할 수 있었다.
5) 에너지 대사조절 관련 전사인자 발현 비교
에너지 대사조절 주요 인자인 Pref-1, CEBP/β 및 PPARα의 발현 양을 확인하기 위하여 실시간 PCR을 이용하여 확인하였다. 도 34를 참조할 때, PPB 투여군(ObOb/PPB)에서 통계적으로 유의미하게 PPref-1, CEBP/β 및 PPARα의 발현이 양성대조군(ObOb/Leptin)과 함께 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, 유효 물질 PPB가 세 전사인자를 효과적으로 조절하여 지방세포의 합성을 억제함을 알 수 있었다.
6) 지방구의 크기 비교
각 동물군에 대하여, 지방 조직의 관찰을 위해 H&E 염색을 진행하였고, 지방세포의 크기를 측정하였다. 도 35를 참조할 때, 유효물질 PPB 투여군(ObOb/PPB)에서 지방세포의 크기가 감소함을 확인할 수 있었다.
이상, 전술한 바와 같이, 감태추출물을 포함하고, 상기 감태추출물이 주정추출물이며, 상기 감태추출물이 피로갈롤-플로로글루시놀-6,6'-비엑콜(PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol)을 포함하는, 본 발명의 일 구현예에 다른 식이조절용 조성물의 경우, 지방분해 촉진, 지방세포 합성의 억제를 통한 지방세포 크기의 감소에 탁월한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 상기 식이조절용 조성물은 지방조직에 국한하여 작용되는 것이 아니라, 중추신경의 조절을 통하여 자발적인 식이조절을 일으킴으로써 체중 감소 효과를 구현할 수 있는 것임을 확인할 수 있었다.
Claims (8)
- 감태추출물을 포함하고,상기 감태추출물이 주정추출물이며,상기 감태추출물이 피로갈롤-플로로글루시놀-6,6'-비엑콜(PPB, pyrogallol-phloroglucinol-6,6'-bieckol)을 포함하는,식이조절용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 감태추출물의 추출 수율이 10% 이상이고,상기 감태추출물 중의 상기 PPB 함량이 1중량% 내지 5중량%인,식이조절용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 주정추출물의 추출을 위한 용매는 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 알코올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 알코올 조성물을 포함하는,식이조절용 조성물.
- 제3항에 있어서,상기 용매는 상기 알코올 조성물을 40중량% 초과, 100중량% 이하로 포함하는,식이조절용 조성물.
- 40중량% 초과, 100중량% 이하의 알코올 조성물을 함유한 용매를 준비하는 단계; 및상기 용매를 이용하여 감태 원료를 주정추출하여 감태추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 식이조절용 조성물의 제조방법.
- 제5항에 있어서,상기 감태추출물을 얻는 단계는, 40℃ 내지 60℃에서 6시간 내지 24시간 동안 주정추출하는 단계인,식이조절용 조성물의 제조방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 식이조절용 조성물을 포함하는 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 식이조절용 조성물을 포함하는 기능성 식품 조성물.
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