WO2020116810A1 - Ｆａｓ 신호전달 억제용 펩티드를 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로 상기 Fas 신호전달 억제용 펩티드는 비만시 간과 지방조직에서 많이 발현되는 Fas에 특이적으로 결합하므로 비만으로 인한 염증 부위에 대한 전달 효율이 높고, 염증의 주요 신호 전달 체계인 Fas 신호전달을 직접적으로 억제하여 염증 반응을 억제할 수 있으므로 비만, 지방간 또는 지방간염 개선, 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＦＡＳ 신호전달 억제용 펩티드를 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
비만은 전 세계적으로 매우 급속도로 퍼져 나가고 있으며, 현재에는 세계인구의 25%에 해당하는 17억명이 과체중(BMI 25 이상)이고, 서구지역에서는 BMI 30 이상의 비만환자가 약 3억 명에 달하고 있다. 또한 어린이 5명 중 1명이 소아비만에 해당하며 그 수가 가파르게 상승하고 있어 소아비만이 심각한 사회 문제로 대두되고 있다. 특히 소아 비만의 경우에는 지방이 많을수록 성호르몬 분비가 자극되어 성조숙증과 같은 성장장애를 일으킬 수 있으며, 혈액순환과 영양 균형에 영향을 미쳐 성장 저해의 원인이 된다. 비만은 주요 성인병들의 위험요소로서, 고혈압, 당뇨병, 동맥경화증, 뇌졸증, 심장마비 및 각종 종양 등과 같은 성인병의 발생에 관여하고(Wilson et al., 2005, Circulation 112: 3066-3072), 병의 진행을 촉진시키기도 하는데, 비만으로 인해 성인병에 걸릴 위험은 정상인보다 3배 내지 6배 높다고 알려져 있다. 따라서, 비만은 단순히 외모상의 문제만이 아니라, 건강에 직결되는 중대한 문제가 아닐 수 없다.
특히 비만 인구가 증가하면서 체내 남는 에너지가 간에 중성지방 형태로 쌓이는 비알콜성 지방간 환자 또한 증가하고 있다. 비알콜성 지방간이 오래되면 염증 반응이 유발되어 지방간염으로 진행되고, 결국 간경화, 간암으로까지 악화될 수 있으므로 예방과 효과적인 치료가 필요하다.
현재 비만 치료제로 사용되고 있는 노보 노디스크(Novo Nordisk)의 삭센다(Saxenda, 성분명 리라글루티드)는 GLP-1 유사체로 인체 호르몬인 GLP-1와 97% 가량 유사하며, 1일 1회 피하에 투여한다. 임상 연구에서 삭센다는 최초 체중과 관계 없이 비만인 사람의 체중을 5~10% 줄이고, 그 체중을 유지하게 되면 혈당수치와 혈압, 콜레스테롤 수치, 폐쇄성 수면무호흡증의 개선을 포함해 건강상 많은 이점을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 그러나 오심, 구토, 설사, 변비 등의 부작용이 있고, 체중 감량에 성공한 사람도 약 투여를 중단할 경우 요요현상(체중이 원래대로 돌아가는 현상)이 나타나므로 생활 습관을 개선하지 않는 한 비만을 근본적으로 치료할 수는 없는 실정이다.
본 발명자들은 비만 및 지방간의 근본적인 치료를 위해 연구한 결과, 지방조직 이외에 간에서도 Fas 수용체가 많이 발현되는 것을 발견하였고, 상기 Fas 수용체의 신호전달을 차단하여 염증 반응을 억제함으로써 비만, 지방간 또는 지방간염을 개선할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Fas 신호전달 억제용 펩티드, 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양상은 하기 일반식 I으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[일반식 I]
Xaa1-Cys-Asp-Glu-His-Phe-Xaa2-Xaa3
상기 일반식에서,
Xaa1 및 Xaa3는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 임의의 아미노산이고,
Xaa2는 존재하지 않거나 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Ser, Cys, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 명세서에 사용된 용어, "Fas"는 Fas, FasR(Fas receptor), APO-1 (apoptosis antigen 1), 또는 CD95(cluster of differentiation 95)로도 불리우며, 세포사멸(apoptosis)을 조절하는 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor, TNF)의 일종이다. Fas가 리간드와 결합하게 되면 다중화(multimerization)를 통해 활성화되고, 그 결과로 여러 어댑터(adaptor) 단백질들이 Fas에 결합한다. 결합한 어댑터 단백질들은 다양한 세포사멸 신호전달 체계를 활성화시키며, 대표적인 신호전달 조절인자에는 카스파제, NF-κB, SAPK(stress-activated protein kinase), Bcl-2 패밀리 등이 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "Fas 신호전달 억제용 펩티드"는 상기에서 설명한 Fas에 결합하여 통상적인 Fas 리간드와 반대로 Fas의 하위 신호전달 체계를 억제하는 활성, 세포사멸 억제 활성을 갖는 펩티드를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 일반식 I에서 Xaa1 및 Xaa3는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 임의의 아미노산일 수 있고, 바람직하게는 각각 독립적으로 Tyr, Phe 및 Trp로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 일반식 I에서 Xaa2는 존재하지 않거나 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Ser, Cys, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 Gly, Ala, Ser, Thr 및 Cys로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
예를 들어, 1) Xaa1 및 Xaa3는 모두 존재하지 않으면서 Xaa2만 존재할 수 있고, 2) Xaa1 및 Xaa3 중에서 어느 하나가 존재하면서 Xaa2가 존재할 수 있으며, 3) Xaa1 내지 Xaa3 모두 존재하지 않는 등 다양한 조합이 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 일반식 I의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 서열일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 서열일 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 Fas 신호전달 억제용 펩티드는 펩티드의 향상된 안정성, 강화된 약리 특성 (반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩티드의 N- 및/또는 C-말단이 수식(modification)될 수 있다. 상기 수식은 상기 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 아미드기, 포르밀기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 형태일 수 있으나, 펩티드의 개질, 특히 펩티드의 안정성을 향상시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩티드를 보호하는 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
본 발명에서, 상기 비만은 비만 이외에 당뇨병, 지방간, 고지혈증, 동맥경화증 및 이들의 합병증과 같은 비만 관련 질환을 포함하며, 상기 지방간은 비알콜성 지방간일 수 있다.
비알콜성 지방간은 운동 부족, 고열량 식사 등의 나쁜 생활 습관에 의하여 과잉된 에너지가 간에 중성지방 형태로 쌓여 발생하는 질환을 말한다. 방치할 경우 간염, 간경화에서 간암까지 진행할 수 있으나, 현재까지는 마땅한 치료약이 없어 운동 및 식생활 개선을 통한 치료가 주로 이루어지고 있다. 본 발명에서 상기 비알콜성 지방간은 단순히 지방만 끼어 있고 간세포 손상은 거의 없는 단순 비알콜성 지방간, 간세포 손상이 심하고 지속되는 만성 비알콜성 지방간염, 간경변증에 이르는 다양한 형태의 간질환을 포함한다.
본 발명자들은 비만시 지방조직과 더불어 간 조직에서도 Fas가 많이 발현되고, 특히 간에서는 비만 수준이 증가함에 따라 Fas의 발현 또한 비례적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 8). 이에 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 생체 내로 투여하면 비만 모델 쥐의 간과 지방조직에 특이적으로 전달되어(도 10) Fas와 결합하는 것을 알 수 있었다(도 9). 즉, 본 발명은 지방조직 및 간 조직에 직접적으로 약물(Fas 신호전달 억제용 펩티드)을 전달하여 Fas 신호전달에 의한 염증 반응, 세포사멸, 지방 축적 등을 억제하고, 결과적으로 비만, 지방간 또는 지방간염의 증상을 개선할 수 있음을 확인한 것이다(도 14 내지 도 44).
본 명세서에 사용된 용어, "치료"는 본 발명에 따른 Fas 신호전달 억제용 펩티드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 비만, 지방간 또는 지방간염 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상에게 소정의 물질, 즉 본 발명에 따른 Fas 신호전달 억제용 펩티드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 이에 따라, 본 발명의 약학적 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등의 방식으로 투여될 수 있으나, 정맥내, 피하 또는 경구를 통하여 투여되는 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물이 비만의 예방 또는 치료 용도로 사용되는 경우에는 정맥내 투여가 바람직하고, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료 용도로 사용되는 경우에는 피하 투여가 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 Fas 신호전달 억제용 펩티드는 정맥주사시(전신전달시) 간과 지방조직으로 특이적으로 전달되고, 피하주사시에는 간에 특이적으로 전달되어(도 10) 염증 반응을 억제하는 특징이 있다. 또한, 비만 모델 쥐에 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 정맥주사로 투여한 경우에는 체중이 증가하나(도 24의 A), 피하주사시에는 체중이 유지되는 경향을 보였다(도 37). 이를 통해, 동일한 양의 Fas 신호전달 억제용 펩티드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 사용하더라도 투여 경로에 따라 비만, 지방간 또는 지방간염의 치료/개선 효과의 수준이 달라질 수 있음을 알 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 정맥내 또는 피하 투여가 용이하도록 주사제 형태로 투여될 수 있다. 주사제로 제조될 경우 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합될 수 있고, 단위 투약 앰플 또는 다중 투약 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에서, "유효 성분으로 함유"라는 용어는, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량과 횟수 는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분의 종류에 따라 결정된다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 포함하는 것 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 ㎎/㎏(체중)이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 하기 일반식 I으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 제공한다:
Xaa1-Cys-Asp-Glu-His-Phe-Xaa2-Xaa3
상기 일반식에서,
Xaa1 및 Xaa3는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 임의의 아미노산이고,
Xaa2는 존재하지 않거나 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Ser, Cys, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 Fas 신호전달 억제용 펩티드는 비만, 지방간 또는 지방간염의 치료 또는 개선용 약학적 조성물에 포함되는 Fas 신호전달 억제용 펩티드와 동일하므로 중복되는 내용은 기재를 생략한다.
본 발명의 Fas 신호전달 억제용 펩티드는 비만시 간과 지방조직에서 많이 발현되는 Fas에 특이적으로 결합하므로 비만으로 인한 염증 부위에 대한 전달 효율이 높고, 염증의 주요 신호 전달 체계인 Fas 신호전달을 직접적으로 억제하여 염증 반응을 억제할 수 있으므로 비만, 지방간 또는 지방간염 개선, 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 Fas가 항상 발현되는 Jurkat 세포주에 Fas 신호전달 억제 펩티드인 FBP-8, FBP-A 및 FBP-7을 처리하여 Fas와의 결합 여부를 확인한 결과이다: Mock=비처리군(어떠한 펩티드도 처리하지 않은 실험군); CtrFBP=음성대조군(대조 펩티드 처리군); FBP-8=YCDEHFCY 펩티드 처리군; FBP-A=YCDEHFAY 처리군 및 FBP-7=YCDEHFY 처리군.
도 2는 Jurkat 세포주에 Fas 리간드(FasL)와 Fas 신호전달 억제 펩티드인 FBP-8, FBP-A 또는 FBP-7을 같이 처리한 후 세포사멸 수준을 확인한 결과(A) 및 혈청에서 FBP-8과 FBP-7의 안정성을 확인한 결과(B)이다.
도 3은 3T3L1 세포주에 다양한 농도의 FBP-8을 처리한 후 세포독성 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 3T3L1 세포주에 Fas 리간드(FasL)와 FBP-8을 같이 처리한 후 세포사멸 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 3T3L1 세포주에 Fas 리간드(FasL)와 FBP-8을 같이 처리한 후 염증 반응 관련 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 6은 3T3L1 세포주에 Fas 리간드(FasL)와 FBP-8을 같이 처리한 후 세포 배양액에서 염증 반응 관련 사이토카인의 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 3T3L1 세포주에 Fas 리간드(FasL)와 FBP-8을 같이 처리한 후 세포 배양액으로 방출된 유리 지방산(free fatty acid, FFA)의 농도를 확인한 결과이다.
도 8은 정상 체중 쥐(NCD)와 비만 모델 쥐(HFD)의 백색지방조직 및 간 조직에서 Fas 발현 수준(A 및 B), 비만 모델 쥐(HFD)의 간 조직에서 체중에 따른 Fas 발현 변화(C) 및 Fas 발현세포의 비율(D)을 확인한 결과이다: NCD=정상 사료 급여군(normal control diet); HFD=고지방 사료 급여군(high fat diet); WAT= 백색지방조직(white adipose tissue); 및 Liver=간 조직.
도 9는 비만 모델 쥐(HFD)의 백색지방조직과 간 조직 절편에서 FBP-8의 Fas 결합 여부를 확인한 결과이다.
도 10은 비만 모델 쥐(HFD)에 형광 표지된 FBP-8을 피하주사(A) 또는 정맥주사(B)로 주입하고, 24시간 및 48시간 후에 각 장기의 형광 분포를 확인한 결과이다: Mock=비투여군(펩티드 비투여); CtrFBP=음성대조군(대조 펩티드 투여); 및 FBP-8=FBP-8 투여군.
도 11은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직 절편에서 FBP-8의 형광 신호를 확인한 결과이다.
도 12는 정상 체중의 쥐에 형광 표지된 FBP-8을 정맥주사(IV) 또는 피하주사(SC)로 주입하고, 12시간 후에 각 장기의 형광 분포를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 예에 따른 동물실험 과정을 개략적으로 보여준다.
도 14는 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직 절편에서 TUNEL 염색으로 사멸세포 비율을 확인한 결과이다.
도 15는 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 백색지방조직 절편에서 TUNEL 염색으로 사멸세포 비율을 확인한 결과이다.
도 16은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 백색지방조직에서 염증 유발 대식세포 표지 유전자인 F4/80, CD11c의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 17은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 백색지방조직에서 CLS (crown-like structure) 면적을 확인한 결과이다.
도 18은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 백색지방조직에서 염증 반응 관련 유전자들의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 19는 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 혈액에서 염증 유발 사이토카인의 수준을 측정한 결과이다.
도 20은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 F4/80, CD11c 및 CD206의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 21은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 염증 반응 관련 유전자들의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 22는 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐에서 포도당 저항성을 평가한 결과이다.
도 23은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐에서 인슐린 민감도를 평가한 결과이다.
도 24는 비만 모델 쥐에 정맥주사로 FBP-8을 투여하는 과정에서 일일 사료 섭취량(A) 및 체중 변화(B)를 확인한 결과이다.
도 25는 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 지방 생성 유전자인 SCD-1(stearoyl-CoA desaturase)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 26은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 혈액에서 지방산과 인슐린 농도를 측정한 결과이다.
도 27은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직과 혈청에서 중성지방(triglyceride, TG)의 농도를 측정한 결과이다.
도 28은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직 형태와 무게를 확인한 결과이다.
도 29는 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직 절편에서 간 손상 정도를 확인한 결과이다.
도 30은 정맥주사로 FBP-8을 주입한 비만 모델 쥐의 혈액에서 간 기능 지표인 ALT (alanine aminotransferase) 수준을 측정한 결과이다.
도 31은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직 절편에서 TUNEL 염색으로 사멸세포 비율을 확인한 결과이다: NCD=정상군 (정상 사료 급여군); Mock=비투여군(펩티드 비투여); CtrFBP=음성대조군(대조 펩티드 투여); Saxenda=양성대조군(리라글루티드 투여); 및 FBP-7=FBP-7 투여군.
도 32는 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 염증 반응 관련 대식세포 표지 유전자들의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 33은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 염증 반응 관련 유전자들의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 34는 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 Fas 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 35는 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 혈액에서 염증 유발 사이토카인의 수준을 측정한 결과이다.
도 36은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐에서 포도당 저항성을 평가한 결과이다.
도 37은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 시간 경과에 따른 체중을 측정한 결과이다.
도 38은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 시간 경과에 따른 사료 섭취량을 확인한 결과이다.
도 39는 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직 형태와 무게를 확인한 결과이다.
도 40은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직 절편에서 간 조직 손상 정도를 확인한 결과이다.
도 41은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 지방 축적에 관여하는 유전자인 PPAR-γ의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 42는 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 간 조직에서 중성지방 수준을 확인한 결과이다.
도 43은 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 혈액에서 지방산과 인슐린 농도를 측정한 결과이다.
도 44는 피하주사로 FBP-7을 주입한 비만 모델 쥐의 혈액에서 간 기능 지표인 ALT의 수준을 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험 방법
1. 펩티드
펩티드는 하기 서열을 펩트론사(대전, 대한민국)에서 합성한 후 동결 건조 상태에서 pH 7.4의 PBS에 용해시켜 사용하였다. 첫 번째 펩티드는 선행문헌(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Apr 27;101(17):6599-604)에 개시된 바 있다.
Fas Blocking Peptide (FBP 또는 FBP-8): YCDEHFCY (서열번호 11)
Fas Blocking Peptide 7 (FBP7): YCDEHF-Y (서열번호 10)
Fas Blocking Peptide A (FBPA): YCDEHFAY (서열번호 12)
Control Peptide (CTRP): YCNSTVCY (서열번호 13)
2. 세포 배양
사람 혈액암 세포인 Jurkat 세포주와 쥐 지방세포인 3T3L1 세포주는 ATCC (미국)에서 구매하였고, Jurkat 세포주는 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 25 mM 포도당이 포함된 RPMI 배양액에서 배양하였다.
3T3L1 세포주는 10% FBS, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 25 mM 포도당이 포함된 DMEM 배양액에서 배양하였다. 3T3L1 세포주는 2x105 세포/㎖ 농도로 상기 DMEM 배양액에 분주하여 3일 동안 지방세포 성숙화를 유도하고, 이후 인슐린이 포함된 배양액으로 교체하여 다시 3일 동안 지방세포 성숙화를 유도하였다. 이후 상기 DMEM 배양액에서 2일 동안 추가로 배양하여 지방세포의 완전한 성숙화를 달성하였다.
3. 세포 독성 및 세포사멸 실험
상기 1.에 기재된 펩티드의 세포 독성 실험은 CCK-8 분석 키트(Dojindo Laboratories, 일본)로 수행하였다. 3T3L1 세포주에 다양한 농도(uM)의 펩티드를 처리하고 24시간 후에 세포 독성을 분석하였다.
3T3L1 세포주에 FasL(Fas Ligand)를 500 ng/㎖ 농도로 처리하여 세포사멸을 유도하고, Alexa647과 결합된 FBP 신호차단 펩티드(FBP-8, FBP-A 및 FBP-7) 및 CtrFBP를 각각 처리하였다. 펩티드 처리 4시간 후, 세포를 DPBS로 세척하고, FITC-결합 아넥신 V (BD pharmingen)를 처리하여 유세포 분석기로 세포사멸 억제 효과를 분석하였다.
4. 동물실험
본 발명을 위해 수행된 모든 동물실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 비만모델 쥐를 만들기 위해 6주령의 C57BL/6 쥐에 8주 동안 고지방사료를 급여하고, 쥐의 몸무게가 42 내지 44 g 범위가 되었을 때 무작위로 실험군에 따라 분류하였다. 이후 실험군에 따라 FBP8 60 ㎍/1회을 정맥주사로 1주에 2회씩 총 5주동안 투여하거나(도 13) 또는 FBP7을 매일 2회씩 피하주사로 투여하였다.
5. 조직 면역학적 분석
동물실험 종료 후 쥐를 희생시켜 간 조직과 백색지방조직을 분리하고, 조직 절편을 제작하였다. 제작한 간 조직 및 백색지방조직 절편에 95℃의 항원 노출 버퍼(antigen retrieval buffer)를 25분 동안 처리한 후 실온에서 냉각시켰다. 이후, 조직 절편에 1% 소 혈청 알부민(BSA), 10% 염소 혈청 및 0.05% 트윈 20을 포함하는 TBST(Tris Based Saline+Tween20)를 처리하여 블록킹 과정을 거치고, Fas 수용체 특이적 1차 항체와 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 이후 TBST로 조직 절편을 세척하고, FITC-결합 2차 항체와 2시간 동안 실온에서 반응시켰다.
또한, 펩티드의 조직 결합 능력을 알아보기 위해 Alexa 488이 결합된 펩티드와 1차 항체를 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 핵은 Hoechst 33342(GE Healthcare)로 염색하고 TBST로 세척한 후 확인하였다.
각 조직 절편의 형광 신호는 TCS-SP5 공초점 현미경(Leica, 독일)으로 분석하였다.
6. 펩티드의 조직 전달 여부 분석
비만 모델 쥐에 100 ㎍의 Alexa 647-결합 펩티드를 정맥주사로 투여하고, 12시간, 24시간 및 48시간 후에 조직을 분리하여 Image station 형광분석기 (Carestream)로 각 조직에서의 형광 신호를 분석하였다. 형광 신호 분석 후 각 조직간의 상대적인 형광 세기는 NIH에서 제공하는 ImageJ 프로그램으로 비교하였다.
또한, 간 조직에서 세포 단위의 펩티드 전달 여부를 확인하기 위해 비만 모델 쥐에 100 ㎍의 Alexa 488-결합 FBP를 정맥주사로 투여하고, 12시간, 24시간 및 48시간후에 간 조직을 분리하여 동결 조직 절편을 만들었다. 이후 Hoechst 33342로 핵을 염색하고 TCS-SP5 공초점 현미경으로 형광 신호를 분석하였다.
7. 조직학적 분석 및 TUNEL 분석
간 조직 및 백색지방조직 절편을 헤마토실린&에오신으로 염색한 후 광학 현미경으로 조직학적 분석을 진행하였다.
또한, 각 조직에 대한 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석은 In situ Cell death detection kit (Millipore, 미국)로 수행하였다. 이후 Hoechst 33342로 핵을 염색하여 TCS-SP5 공초점 현미경으로 형광 신호를 분석하고, Image J 프로그램으로 세포 각각의 형광 신호를 분석하였다.
8. 유전자 발현 수준 분석
간 조직 및 백색지방조직으로부터 RNAiso(Takara, 일본)를 이용해 mRNA를 추출하고, iscript cDNA 합성키트(Bio-rad Laboratories, 미국)로 cDNA를 합성하였다. 이후, 7500 Fast Real-time PCR system (Applied Biosystems, 미국)으로 유전자 발현 수준을 분석하였다. 각 유전자의 발현 수준은 GAPDH 유전자의 발현 수준으로 표준화한 후 대조군에 대한 상대적 유전자 발현량으로 계산하였다.
9. 포도당 과민증 및 인슐린 저항성 분석
포도당 과민증 분석을 위해, 12시간 동안 공복상태를 유지한 각 실험군에 2 g/㎏ 용량의 포도당을 복강주사로 주입하고 30분, 60분 및 120분 후 혈중 포도당 농도를 Accu-check(Roche, 미국)로 측정하였다.
인슐린 저항성은 4시간 동안 공복 상태를 유지한 각 실험군에 0.75 U/㎏ 용량의 인슐린을 복강주사로 주입한 뒤, 30분, 60분 및 120분 후 혈중 포도당 농도를 측정하여 분석하였다.
10. 기타 분석
혈청 및 조직의 사이토카인 수준은 ELISA kit (eBioscience, 미국)로 분석하고, 간 조직의 트리글리세리드 수준은 Triglyceride Assay Kit(Cayman, 미국)로 확인하였다.
11. 통계 분석
실험 결과에 대해 서로 다른 실험군이 두 개인 경우 비모수 Mann-Whitney U 분석을 이용하고, 실험군이 세 개 이상인 경우 One-way ANOVA 분석으로 통계적 유의성을 확인하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 5 프로그램을 이용하였다. P 값이 0.05 이하일 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
실험 결과
1. Fas 차단 펩티드의 Fas 발현 세포주에 대한 결합력 및 Fas 신호 제어 효과 확인
기존에 밝혀진 Fas 신호전달 억제 펩티드(YCDEHFCY, FBP-8) 이외에 서열을 변경한 2종의 펩티드 FBP-A (YCDEHFAY) 및 FBP-7 (YCDEHFY)에 대해 Fas 발현 세포주에 대한 특이적 결합력 및 신호 제어 효과를 확인하였다.
Fas가 항상 발현되는 Jurkat 세포주에 FITC-표지 Fas 항체를 처리하고, Alexa647로 표지된 FBP-8, FBP-A, FBP-7 또는 대조 펩티드(YCNSTVCY; CtrFBP)를 처리하였다. 이후 형광 신호를 분석한 결과, 대조군(CtrFBP; 대조 펩티드 처리군)에서는 Alexa647 신호를 거의 확인할 수 없어 대조 펩티드가 Jurkat 세포에 거의 결합하지 않는 것을 알 수 있었고, FBP-8, FBP-A 및 FBP-7 처리군의 경우 서로 유사한 수준으로 Jurkat 세포에 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
또한, Jurkat 세포주에 Fas 리간드(Fas ligand, FasL) 및 Fas 신호전달 억제 펩티드를 처리한 후 세포사멸 수준을 확인한 결과, FBP-8, FBP-A 및 FBP-7 모두 유사한 수준의 Fas 신호전달 억제 효과를 보였다. 구체적으로 음성대조군 (CtrFBP)은 비처리군(Mock; 어떠한 펩티드도 처리하지 않은 실험군)과 세포사멸 수준이 비슷하였으나(각각 31±2.32% 및 29±3.24%), FBP-8, FBP-A 및 FBP-7 처리군은 세포사멸 수준이 각각 17±4.11%, 15±5.26% 및 14±3.22%로 나타나 비처리군(Mock)과 비교하여 세포사멸이 효과적으로 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 2의 A). 아울러, 환형 FBP-8, 선형 FBP-8 및 FBP-7의 혈청 안정성을 확인한 결과, FBP-7이 가장 우수한 것을 알 수 있었다(도 2의 B).
또한, Jurkat 세포주와 다른 Fas 신호 체계를 갖는 3T3L1 세포주에서 동일한 실험을 진행하였다. 분화된 3T3L1 세포주에 FBP-8을 100μM부터 1000μM까지 다양한 농도로 처리하였을 때 세포 독성은 거의 없었으며(도 3), Fas 리간드와 FBP-8을 같이 처리한 경우 비처리군(Mock+) 및 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 세포사멸이 현저히 억제된 것을 확인할 수 있었다. 각 실험군의 세포사멸 수준은 각각 25±3.31%, 23±5.12% 및 14±2.98%이다(도 4).
FBP-8의 우수한 Fas 신호전달 억제 효과는 염증 관련 유전자의 발현 수준을 통해서도 확인할 수 있었다. 분화된 3T3L1 세포주에 Fas 리간드와 FBP-8을 같이 처리한 경우 염증 관련 유전자인 Fas, TNF-α, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), F4/80, IL-6 및 iNOS (inducible nitric oxide synthase)의 발현이 현저히 감소한 것을 관찰할 수 있었다(도 5).
이러한 염증 관련 유전자의 발현 억제는 염증 관련 사이토카인의 생성 감소로 이어졌으며, FBP-8 처리에 의해 세포 배양액 내 IL-6 및 MCP-1의 농도가 감소하는 것을 알 수 있었다(도 6). 이러한 결과는 FBP-8 처리가 Fas 유래 염증 관련 신호전달 체계를 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.
또한, 지방세포의 염증은 세포사멸로 이어져 최종적으로는 세포내 저장된 지방산(FFA)이 세포 밖으로 방출되는데, FBP-8 처리는 이러한 세포 외부로의 지방산 방출 또한 유의미하게 억제하였다(도 7).
2. 비알콜성 지방간염 동물 모델에서 Fas 결합 펩티드의 간 조직 및 백색지방조직으로의 특이적 결합 능력 평가
정상 체중의 쥐에 고지방 사료를 급여하면 비만 모델 쥐가 되고, 이때 간 조직 또는 백색지방조직에서 Fas의 발현량이 증가한다. 구체적으로 고지방 사료 급여군(high fat diet, HFD)의 백색지방조직(white adipose tissue, WAT)과 간 조직(liver tissue)에서 Fas 발현량을 확인한 결과, 정상 사료 급여군(normal control diet, NCD)과 비교하여 각각 4배 및 3배 증가하는 것을 알 수 있었다(도 8의 A 및 B). 특히, 고지방 사료 급여군(HFD)의 경우 체중이 증가함에 따라 Fas의 발현량 또한 비례하여 증가하는 것을 알 수 있었다(도 8의 C). 이러한 발현 증가는 실제 조직에서 Fas 발현 세포의 비율이 증가한 것을 통해 추가로 확인할 수 있었으며, 정상 사료 급여군(NCD)과 비교하여 고지방 사료 급여군(HFD)의 백색지방조직 및 간 조직에서 Fas 발현세포의 비율이 각각 70% 및 75%까지 증가하였다(도 8의 D).
또한, 고지방 사료 급여군(HFD)에서 분리한 간 조직 절편 및 백색지방조직 절편에 Fas 특이적 항체와 형광표지된 FBP-8을 처리한 경우 염색 부위가 일치하였으며(도 9), 이는 비만으로 인해 과발현된 Fas에 FBP-8이 효과적으로 결합함을 의미한다.
실험을 통해 확인한 FBP-8의 Fas 특이적 결합능력을 바탕으로 FBP-8을 정맥주사 또는 피하주사로 전신전달하였을 때 간 조직 또는 지방조직에 특이적으로 전달될 수 있는지 확인하였다. 고지방사료 급여군의 비만 모델 쥐에 형광 표지된 FBP-8을 정맥주사 또는 피하주사를 통해 주입하고, 24시간 및 48시간 후에 각 장기를 분리하여 형광 분포를 조사하였다.
그 결과, 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 피하주사로 주입된 FBP-8은 간 조직에 특이적으로 전달되고, 48시간 이후까지 간 조직에 남아 있는 것을 알 수 있었다(도 10의 A). 정맥주사로 주입된 FBP-8은 간 조직과 백색지방조직에 특이적으로 전달되었다(도 10의 B). 간 조직 절편 관찰 결과, 정맥주사로 주입된 FBP-8은 주사 후 12시간 이후부터 간 조직에 효과적으로 전달되고, 주입 후 48시간까지도 간 조직에 남아있는 것을 알 수 있었다(도 11).
정상 쥐에 정맥주사(IV) 또는 피하주사(SC)를 통해 FBP-8을 주입한 경우, 간 조직에서 유의미한 형광 신호를 관찰할 수 없어 FBP-8이 간으로 전달되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 12).
도 10 내지 도 12의 결과를 통해, 비만에 의해 간 조직 및 백색지방조직에서 Fas 수용체의 발현이 증가하고, FBP-8은 Fas를 발현하는 간 조직 및 백색지방조직에 특이적으로 결합하는 것임을 알 수 있다.
3. 전신전달된 FBP에 의한 비알콜성 지방간염, 인슐린 저항성 및 대사질환 치료 효능 평가
정맥주사로 주입된 FBP-8이 비만 모델 쥐의 간 조직과 백색지방조직에 전달되는 것을 도 10 및 도 11에서 확인하였으므로 FBP의 전신전달에 의한 Fas 신호전달 제어를 통해 간 조직 및 백색지방조직에서 염증 완화, 세포사멸 억제 효과를 얻을 수 있는지 확인하였다.
정상 쥐에 고지방사료를 8주 동안 급여하여 비만 모델 쥐를 만들고, 1주에 2회씩 FBP-8을 정맥주사로 총 5주 동안 투여하였다(도 13). 5주 후 비만 모델 쥐를 희생시켜 백색지방조직과 간 조직을 분리하고 TUNEL 염색으로 사멸세포 비율을 분석하였다.
분석 결과, 간 조직의 경우 비투여군(Mock)과 음성대조군(CtrFBP)의 사멸세포 비율은 각각 19±5.28%와 17±7.98%이나, FBP-8 처리군은 9±2.37%로 나타나 사멸세포의 비율이 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 14).
백색지방조직의 경우 비투여군(Mock)과 음성대조군(CtrFBP)의 사멸세포 비율은 각각 55±3.42%와 51±2.98%이나, FBP-8 처리군에서는 31±1.98%로 나타나 사멸세포의 비율이 현저하게 감소한 것을 알 수 있었다(도 15).
FBP-8에 의한 Fas 신호전달 제어효과는 세포사멸뿐 아니라 염증 반응도 억제하였으며, 백색지방조직에서 염증 유발 대식세포 표지인 F4/80, CD11c의 발현 수준을 확인한 결과 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-8 처리군에서 유의미하게 감소하여 백색지방조직에서 염증 반응이 억제된 것을 알 수 있었다(도 16).
또한, 백색지방조직의 지방세포 주변에 대식세포가 모여들어 형성되는 CLS (crown-like structure)도 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-8 처리군에서 현저하게 감소하였고(도면 17), 백색지방조직에서 Fas, TNF-α, MCP-1, IL-6 등 염증 관련 유전자의 발현 또한 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-8 처리군에서 감소하였다(도 18).
비만 상태에서는 백색지방조직에서 생성된 염증 유발 사이토카인이 혈액을 통해 간 조직으로 전달되어 염증을 유발하는데, FBP-8 처리군에서 혈액 중의 IL-6 및 MCP-1의 농도가 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 19).
간 조직에서도 백색지방조직과 유사한 염증 억제 효과를 확인할 수 있었으며, 염증 유발 대식세포 표지인 F4/80 및 CD11c의 발현 수준이 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-8 처리군에서 감소하였고, 염증 방지 대식세포 표지인 CD206의 발현 수준은 유의한 변화가 없었다(도 20). Fas, TNF-α, MCP-1, IL-6 등 염증 관련 유전자의 발현 수준 또한 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-8 처리군에서 유의미하게 감소하였다(도 21).
FBP-8의 전신전달은 비만 모델 쥐에서 인슐린 저항성 증가에 따른 포도당 대사장애 또한 개선하였다. 구체적으로 포도당 저항성 평가(Glucose Tolerance Test, GTT) 및 인슐린 민감도 평가(Insulin Tolerance Test, ITT)에서 음성대조군(CtrFBP)은 비투여군(Mock)과 비슷한 혈당 변화를 보였으나, FBP-8 처리군은 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 포도당 대사가 개선된 것을 관찰할 수 있었다(도 22 및 도 23).
각 실험군에서 일일 사료 섭취량은 유의미한 변화가 없었으나(도 24의 A), FBP-8 처리군은 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 체중 증가가 둔화된 경향을 보였다(도 24의 B).
FBP-8의 전신전달에 따른 간 조직 및 백색지방조직에서의 염증 완화, 세포사멸 억제, 포도당 대사장애 개선은 결과적으로 비만으로 인해 발생한 비알콜성 지방간염 또한 개선하였다.
구체적으로, 비만 모델 쥐의 간 조직에서 확인한 결과 FBP-8 처리군에서 지방 생성 유전자인 SCD-1(stearoyl-CoA desaturase)의 발현 수준이 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 30±5.32% 정도 감소하였고(도 25), 혈액 중의 지방산 및 인슐린의 농도 또한 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 20% 정도 감소하였다(도 26). 중성지방(triglyceride, TG) 농도는 FBP-8 처리군의 경우 간 조직에서 50%, 혈액에서 25% 정도 감소하였다(도 27).
또한, 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-8 처리군에서는 간 조직의 크기가 작고, 무게 또한 가벼웠으며(도 28), 간 조직 절편의 조직학적 분석을 통해 FBP-8 처리군에서 간 조직의 손상이 억제된 것을 관찰할 수 있었다(도 29). 간 조직의 기능을 평가하는 주요 표지인 혈중 ALT (alanine aminotransferase) 수준 측정 결과에서도 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-8 처리군에서 30% 이상 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 30).
4. 피하주사로 전신전달된 FBP-7에 의한 비알콜성 지방간염, 인슐린 저항성 및 대사질환 치료 효능 평가
정상 쥐에 고지방 사료를 8주 동안 급여하여 비만 모델 쥐를 만들고, 매일 2회씩 FBP-7을 피하주사로 총 3주동안 투여하였다. 음성대조군(CtrFBP)으로는 대조 펩티드, 양성대조군으로는 비만 치료제로 시판되고 있는 리라글루티드 (Liraglutide; 상품명 삭센다(Saxenda))를 투여하였다.
3주 후, 마우스를 희생시켜 간 조직을 분리하고 TUNEL 염색으로 사멸세포 비율을 분석하였다. 그 결과, FBP-7 투여군의 사멸세포 비율은 10±2.45%로 나타나 비투여군(Mock) 및 음성대조군(CtrFBP)보다 현저히 낮았으며 양성대조군인 리라글루티드 투여군(11±4.89%)과 유사한 수준을 보였다(도 31).
FBP-7 투여에 의해 간 조직에서 염증 반응도 억제되었다. 음성대조군 (CtrFBP)과 비교하여 FBP-7 투여군에서 염증 유발 대식세포 표지 유전자인 F4/80 및 CD11c의 발현 수준이 감소하였고, 염증 억제 대식세포 표지인 CD206의 발현 수준은 현저하게 증가하였다(도 32). 특이적으로, 리라글루티드 투여군과 비교하여 FBP-7 투여군에서 CD206의 발현 수준이 더 많이 증가하였고, F4/80의 발현 수준은 유의미하게 감소하였다.
염증 관련 유전자인 TNF-α, MCP-1 및 IL-6의 발현 수준 또한 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-7 투여군에서 감소하였고(도 33), 염증의 주요 표지인 Fas의 발현 또한 FBP-7 투여군의 간 조직에서 현저하게 감소하였다(도 34). 이러한 간 조직에서의 염증 반응 억제에 의해 염증 유발 사이토카인인 IL-6 및 MCP-1의 혈중 농도도 감소하였다(도 35).
FBP-7의 전신전달에 의한 염증 반응 억제 효과는 포도당 대사장애 개선 효과로도 이어졌다. 포도당 저항성 평가 실험에서 FBP-7 투여군은 음성대조군 (CtrFBP)과 비교하여 우수한 혈당량 증가 둔화 효과 및 정상 혈당 회복증을 보여 포도당 대사 장애를 개선시켰으며, 리라글루티드와 유사한 수준의 개선 효과를 보였다(도 36).
이러한 포도당 대사 장애 개선으로 인해 음성대조군과 비교하여 FBP-7 투여군에서는 체중 증가가 현저히 억제되었으며(도 37), 사료 섭취량 또한 다소 감소한 양상을 보였다(도 38).
FBP-7 투여에 의한 간 조직에서의 염증 개선, 세포사멸 억제 효과는 최종적으로 비만으로 인해 유발되는 비알콜성 지방간염을 개선하였다.
FBP-7 투여군의 간은 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 조직 무게가 감소하였고(도 39), 간 조직 절편의 조직학적 분석에서도 리라글루티드 투여군과 유사한 수준의 조직 손상 억제 효과를 보였다(도 40).
또한, 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 간에서 지방 축적에 관여하는 유전자인 PPAR-γ의 발현 수준이 FBP-7 투여군에서 감소하였으며, 이러한 발현 감소 효과는 양성대조군인 리라글루티드 투여군과 비교해서도 현저히 우수한 수준이었다(도 41). 간 조직 내 중성지방 수준, 혈중 지방산 농도 또한 음성대조군(CtrFBP)과 비교하여 FBP-7 투여군에서 유의미하게 감소하였고(도 42 및 도 43), 간기능 회복 지표인 혈중 ALT FBP-7 투여군에서 유의미하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 44).
본 발명의 Fas 신호전달 억제 펩티드는 비만 모델 쥐에 정맥주사로 주입시 간 조직과 백색지방조직에 특이적으로 전달되고, 피하주사로 주입시 간 조직에 특이적으로 전달된다. 주입 후 비만시 간과 지방조직에서 많이 발현되는 Fas에 결합하고, 이후 하위 신호전달을 차단하여 염증 반응, 세포사멸을 억제하고, 결과적으로 체중 증가, 지방 축적 등을 억제할 수 있다.

Claims (10)

  1. 하기 일반식 I으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [일반식 I]
    Xaa1-Cys-Asp-Glu-His-Phe-Xaa2-Xaa3
    상기 일반식에서,
    Xaa1 및 Xaa3는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 임의의 아미노산이고,
    Xaa2는 존재하지 않거나 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Ser, Cys, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Fas 신호전달 억제용 펩티드는 하기 일반식 I으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [일반식 I]
    Xaa1-Cys-Asp-Glu-His-Phe-Xaa2-Xaa3
    상기 일반식에서,
    Xaa1 및 Xaa3는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 Tyr, Phe 및 Trp로 이루어진 군에서 선택되고,
    Xaa2는 존재하지 않거나 Gly, Ala, Ser, Thr 및 Cys로 이루어진 군에서 선택된다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Fas 신호전달 억제용 펩티드는 하기 일반식 I으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [일반식 I]
    Xaa1-Cys-Asp-Glu-His-Phe-Xaa2-Xaa3
    상기 일반식에서,
    Xaa1 및 Xaa3는 각각 독립적으로 Tyr, Phe 및 Trp로 이루어진 군에서 선택되고,
    Xaa2는 Gly, Ala, Ser, Thr 및 Cys로 이루어진 군에서 선택된다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지방간은 비알코올성 지방간인 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정맥내, 피하 및 경구로 이루어진 군에서 선택되는 경로를 통하여 투여되는 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 주사제 형태로 투여되는 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 일반식 I의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 일반식 I의 아미노산 서열은 서열번호 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 일반식 I의 아미노산 서열은 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것인, 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 하기 일반식 I으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 Fas 신호전달 억제용 펩티드를 유효성분으로 포함하는 비만, 지방간 또는 지방간염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [일반식 I]
    Xaa1-Cys-Asp-Glu-His-Phe-Xaa2-Xaa3
    상기 일반식에서,
    Xaa1 및 Xaa3는 각각 독립적으로 존재하지 않거나 임의의 아미노산이고,
    Xaa2는 존재하지 않거나 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Ser, Cys, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택된다.
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