WO2019022482A2 - 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A23V2200/00—Function of food ingredients
- A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
Definitions
- the present invention relates to a composition for preventing or treating a fibrotic disease comprising an extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient.
- ECM extracellular matrix
- Fibrosis can also occur in a variety of organs, tissues, and cells. Fibrosis is a disorder of the skin (hyperprogesic scar, keloid, scleroderma), liver (fibrosis and cirrhosis), lung (fibrosis), heart (fibrosis) Stenosis), joints (arthrosis fibrosis), and bone marrow (fibrosis and dysmorphic syndrome).
- liver fibrosis is a global lesion of liver cirrhosis, which is triggered by the action of various cytokines and growth factors as a result of severe liver damage causing chronic liver disease.
- hepatic fibrosis is reversible and consists of thin fibrils.
- ECM extracellular matrix
- MMP matrix metalloproteinases
- TGF- ⁇ 1 is a 25 kD substance that binds to latent TGF- ⁇ 1-binding protein and is secreted in an inactive latent form. It binds to extracellular matrix such as 1,4-type collagen, laminin and decorin.
- TGF- ⁇ 1 regulates collagen expression by decreasing collagenase production or production of collagenase inhibitor, and increases production of TNF- ⁇ , IL-1 and PDGF in macrophages and plays an important role in fibrosis process.
- TGF- ⁇ 1 is expressed only at the site of fibrosis and is not expressed in normal liver or inactive areas, so TGF- ⁇ 1 plays an important role in liver fibrosis.
- pulmonary fibrosis is a disease that causes dyspnea due to excessive attachment of connective tissue, especially collagen, to the alveolar wall.
- connective tissue especially collagen
- pulmonary fibrosis pulmonary tissue hardens, and in the hardened lung tissue where it is supposed to be smooth and resilient, the volume of respiration is not freely contracted and expanded, so that the volume of respiration is reduced.
- TGF- ⁇ 1 (SMAD), ⁇ -SMA, and endothelin-1 are predictive markers of pulmonary fibrosis.
- fibrotic diseases such as liver fibrosis and pulmonary fibrosis
- chemotherapeutic agents which cause various side effects of the human body. Therefore, there is a need for a novel therapeutic agent It is necessary to develop anti-fibrosis treatment.
- Dendropanax belonging to Araliaceae morbifera Lev. is an evergreen broad-leaved arboreous tree native to the southern coast of Korea and Jeju-do. It is a species that does not fall into winter when it blooms in winter.
- Huangchil has been used as a rare paint that emits golden colors of emperor's armor, helmets and other metal ornaments since the Three Kingdoms period. It has been used in the Goryeo period, written in the Goryeo period, in the Guilin variety in China, , And it is said that it was a special product of Baekje before the time, and it remains in the book service area of the Tang Dynasty history book. In addition, it is said that it is effective for burning removal, eye treatment, jaundice treatment, burn treatment and leprosy, and harmless to the human body.
- the present inventors confirmed that the extract of Hwangcholgak extract has an effect of regulating the expression and activity of TGF-beta1 and fibrosis-related factors, which play an important role in fibrosis, and thus can be used for prevention and treatment of fibrosing diseases
- the present invention has been completed.
- an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a fibrotic disease, which contains an extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or ameliorating a fibrotic disease, comprising an extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrotic diseases, comprising an extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient.
- the extract is a crude extract, a polar solvent extract, or a non-polar solvent extract.
- the crude extract may be an extract obtained by using water containing purified water, a solvent selected from methanol, ethanol, butanol or a mixed solvent thereof.
- the polar solvent-soluble extract may be an extract obtained by using a solvent selected from water, ethanol, butanol or a mixed solvent thereof.
- the non-polar solvent-soluble extract may be an extract obtained using hexane, chloroform, dichloromethane or ethyl acetate.
- the extract is effective to inhibit the TGF-? 1 signaling pathway.
- the fibrotic disease may be selected from the group consisting of hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis, cardiac fibrosis, scleroderma, skeletal muscle fibrosis, and diabetic fibrosis.
- the present invention also provides a health functional food for preventing or ameliorating a fibrotic disease, comprising an extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient.
- the extract is a extract obtained by using a solvent selected from the group consisting of water, methanol, ethanol, butanol, hexane, chloroform, dichloromethane and ethyl acetate.
- the fibrotic disease may be selected from the group consisting of hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis, cardiac fibrosis, scleroderma, skeletal muscle fibrosis, and diabetic fibrosis.
- the extract of Wuchucho extract of the present invention has an activity of effectively inhibiting the signal transduction pathway of TGF- ⁇ 1, which plays an important role in fibrosis, and is effective for inhibiting the extracellular matrix factor such as a-SMA, CTGF, FN-EDAM and collagen induced by TGF- And has a high antioxidative activity.
- the composition of the present invention which contains an extract of Hwangcholgulchil as an active ingredient, is useful for the treatment of fibrotic diseases and the production of health functional foods.
- FIG. 1 shows a process for preparing the extract of U. perch of the present invention.
- FIG. 2 shows the results of RT-PCR analysis of the expression level of a-SMA induced by TGF- ⁇ 1 in HS27 and HHStec cell lines according to the present invention.
- FIG. 3 shows the results of RT-PCR and Western blot analysis of the expression level of a-SMA induced by TGF- ⁇ 1 in HS27 and HHStec cell lines according to the present invention treatment with Hwangchuhehexane fraction extract.
- FIG. 4 shows the results of analysis of the amount of TGF- ⁇ 1 mRNA expression and TGF- ⁇ 1 production according to the concentration of Hwangchuhexhexane fraction in HS27 cell line.
- FIG. 5 shows the results of RT-PCR and Western blot analysis of the expression of TGF- ⁇ 1-induced CTGF (connective tissue growth factor) in HS27 and HHStec cell lines treated with Hwangchuhexane fraction extract.
- TGF- ⁇ 1-induced CTGF connective tissue growth factor
- FIG. 6 shows the results of RT-PCR and Western blot analysis of the expression of TGF- ⁇ 1-induced FN-EDA (fibronectin extra domain A) in the HS27 and HHStec cell lines by treatment with extracts of Houttuynia cylindrica hexane fraction .
- FIG. 7 shows the results of analysis of changes in collagen I and III (ECM) expression by HSH and HHStec cell lines according to the concentration of Hwangchuhexane fraction extract.
- FIG. 8 shows the results of analysis of the soluble collagen secretion amount according to the treatment of extracts of Hwangchuhehexane fraction according to the concentration in HS27 and HHStec cell lines.
- FIG. 9 is a photograph showing the degree of cell migration (resilience) observed under a microscope and the degree of recovery after the treatment of scratched HS27 cell line treated with Hwanyeol Hexane fraction extract at various concentrations for 24 hours.
- FIG. 10 shows the results of analysis of the antioxidative activity according to the solvent of the present invention.
- FIG. 11 shows the results of analysis of DCFH-DA scavenging ability after treatment of the extract according to the present invention on the HS27 cell line by the solvent.
- FIG. 12 shows the results of analysis of mRNA expression levels of MMP1, TNF-a, and TIMP1, fibrosis-related factors, after treatment of the HSH27 cell line extract of the present invention with the concentration of Hwanyeol Hexane fraction.
- FIG. 13 shows the results of the mRNA expression analysis of the mRNA expression of MMP2 and MMP9, fibrosis-related factors, after treatment of HSH27 cell extract with the concentration of Hwanyeol Hexane fraction extract according to the present invention.
- FIG. 14 shows the results of analysis of the degree of mRNA expression of MMP1 and MMP2, fibrosis-related factors, after treating HHStec cell line with the extract of Hwangchuhekhexane fraction according to the present invention.
- FIG. 15 shows the results of measurement of the expression levels of ⁇ -SMA and CTGF expressed in the cells after treatment of the Hwangseong tree ethanol extract (DMEE) according to the present invention on the HHStec cell line, and SM is a positive control group Silymarin-treated group.
- DMEE Hwangseong tree ethanol extract
- FIG. 16 shows the results of measuring the distance of a scratch wound after pretreatment of HHStec ethanol extract (DMEE) according to the present invention and cell scratching.
- FIG. 18 shows the results of measuring the distance of a scratch wound after pretreatment of the extract of Huchulchii ethanol (DMEE) according to the present invention to the HS27 cell line, which is a dermal fibroblast, followed by cell scratching.
- DMEE Huchulchii ethanol
- FIG. 19 shows the results of analysis of the effect of the carbon tetrachloride injection on inhibition of weight loss of mice in the treatment of the extract of Huangchu tree ethanol of the present invention in a rat (SD) animal model.
- the CTL is a control group
- CCl4 was injected with carbon tetrachloride
- DM1 + CCl4 was injected with Hwanyeong tree ethanol extract and carbon tetrachloride injection of the present invention
- SM + CCl4 was injected with silymarin and carbon tetrachloride.
- FIG. 20 shows the results of assaying the levels of ALT and AST, which are serum indicators, on whether or not liver damage caused by carbon tetrachloride injection in the rat (SD) animal model can be improved when treating the extract of Huangchuang ethanol extract of the present invention .
- FIG. 21 shows the result of HE staining to determine whether or not liver tissue damage (liver fibrosis) caused by carbon tetrachloride injection in the rat (SD) animal model can be improved when treating the extract of Huangchuang ethanol extract of the present invention will be.
- FIG. 22 shows the expression of VEGF in the rat model (SD) animal model to determine whether or not hepatocyte injury (hepatic fibrosis) caused by carbon tetrachloride injection can be improved when treated with the extract of Huangchu tree ethanol of the present invention The results are shown.
- the " extract” is characterized by being a crude extract, a polar solvent-soluble extract or a non-polar solvent-
- the crude extract is a solvent selected from water containing purified water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, and butanol, or a mixed solvent thereof, preferably a water and methanol mixed solvent, more preferably 50 to 100% Includes extracts soluble in methanol.
- the " polar solvent-soluble extract” includes extracts which are soluble in water, methanol, butanol or a solvent mixture thereof, preferably water or methanol, more preferably methanol.
- Non-polar solvent-soluble extract includes extracts which are soluble in hexane, chloroform, dichloromethane or ethyl acetate, preferably hexane, dichloromethane or ethyl acetate, more preferably in hexane or ethyl acetate solvents.
- composition is meant a mixture of other woody ingredients such as a woodworm extract of the present invention and a diluent or carrier.
- Carrier is defined as a compound that facilitates the addition of a compound into a cell or tissue.
- DMSO dimethylsulfoxide
- DMSO dimethylsulfoxide
- a " diluent" is defined as a compound that not only stabilizes the biologically active form of the compound of interest, but also dilutes it in the water in which the compound is dissolved. Salts dissolved in buffer solutions are used as diluents in the art. A commonly used buffer solution is phosphate buffered saline, since it mimics the salt state of the human solution. Since buffer salts can control the pH of the solution at low concentrations, buffer diluents rarely modify the biological activity of the compounds.
- Subject " or " patient” means any single entity that requires treatment, including human, cow, dog, guinea pig, rabbit, chicken, In addition, any subject who participates in a clinical study test that does not show any disease clinical findings, or who participates in epidemiological studies or used as a control group is included.
- Tissue or cell sample refers to a collection of similar cells obtained from a subject or tissue of a patient.
- the source of the tissue or cell sample may be a solid tissue from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue sample or biopsy or aspirate; Blood or any blood components; It may be a cell at any point in the pregnancy or development of the subject.
- Tissue samples can also be primary or cultured cells or cell lines.
- an "effective amount" is an appropriate amount that affects a beneficial or desired clinical or biochemical outcome.
- An effective amount may be administered one or more times.
- an effective amount is an amount sufficient to temporarily alleviate, ameliorate, stabilize, reverse, slow down or slow the progression of a disease state. If the recipient animal is capable of enduring the administration of the composition, or the administration of the composition to the animal is suitable, the composition will be " pharmaceutically or physiologically acceptable ". If the dose administered is physiologically significant, it can be said that the formulation is administered in a " therapeutically effective amount ". The formulation is physiologically relevant if the presence of the formulation results in a physiologically detectable change in the recipient.
- treating refers to reversing, alleviating, inhibiting, or preventing the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or disorder .
- " treatment " refers to an act of treating when " treating " is defined as above.
- the term "functional food” means a food having improved functionality of a general food by adding the extract of U. chestnut tree of the present invention to the general food.
- the extract of the present invention is added to a general food, the physical properties and physiological functions of the general food will be improved, and the present invention can be applied to foods having such enhanced functions as a comprehensive 'functional food '.
- the present invention relates to the use of anti-filamentous extracts of Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum), and relates to the exertion of specific physiological activities and functions contained in Fusarium oxysporum extract.
- Dendropanox morbifera LEV. is an evergreen broad-leaved arboreous tree belonging to Araliaceae. It is a native species of Korea which is native to South and West coast of Jeju Island, Wando, Bogildo and Haenam in Korea. The clove contained in the Hwangchil tree contains a small amount of Terpene and a large amount of Sesquiterpene.
- germacrene-d germacrene-d, ⁇ -selinene, ⁇ -amorphene 1-en-2-isopropyl-5-methyl-9-methylene, ⁇ -cadinene, ⁇ -cadinene, ⁇ -cadinene, T-muurolol, ⁇ -elemene, bicyclo ⁇ -cadinene and small amounts of linalool L, ⁇ -terpinene, ⁇ -cubebene, ⁇ -y GmbHe, (+) - calarene, 3,7-guaiadine, isoladene, ⁇ -cubebene, limonene, aromadendrene, and cadina-1,4-diene.
- Hwigae-jinja there is no restriction on the part of the Hwigae-jinja which can be used in the present invention, such as leaves, stems, bark, etc., but leaves can be preferably used.
- the Horticultural extract can be prepared by a method known in the art, a modified method thereof or a method according to the present invention. As one specific example, it can be produced by the following method.
- the extract of Hwigulrugnae or crude extract of the present invention may be prepared by mixing water, methanol, ethanol, butanol, etc., containing purified water of about 1 to 30 times volume, preferably 2 to 15 times volume (w / v% More preferably 50 to 100% methanol, at a temperature of about 0 to 100 ⁇ ⁇ , preferably at room temperature to a temperature of 10 to 100 ⁇ ⁇ , preferably in a solvent selected from the group consisting of water, 60, preferably 30 to 50 hours, by an extraction method such as cold extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, or heat extraction.
- an extraction method such as cold extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, or heat extraction.
- the polar solvent or non-polar solvent-soluble extract of the present invention may be used in an amount of about 1 to 150 times, preferably 5 to 100 times (w / v%), ), And then hexane, ethyl acetate and butanol are fractionated by 1 to 5 times, preferably 2 to 4 times, by adding a volume of about 1 to 10 times, preferably 1 to 5 times, Polar solvent and non-polar solvent-soluble extract of the invention can be obtained.
- a hexane extract can be obtained and used.
- the extract of Hwangchil-myeon having the anti-fiber activity may be ethanol extract as well as the hexane extract.
- the concentrate of the extracts can also be obtained in powder form through lyophilization at -80 ° C or vacuum decompression at 50 ° C.
- the present invention includes a method for producing the Hokutogi (Japanese White Pepper) extract.
- the non-exemplified extraction method according to the present invention can be used in a wide range of applications in the art. And can be successfully performed by a person skilled in the art.
- the present invention is characterized in that it is the first time that the extract has been found to have an activity of preventing, improving or treating a fibrotic disease.
- TGF- ⁇ 1 Factors that play a key role in the progression of fibrosis (fibrosis) are known as TGF- ⁇ 1, and suppression of TGF- ⁇ 1-mediated signaling can inhibit fibrosis.
- astrocytes have become important target candidates as an effective means for inhibiting fibrosis of the liver or pancreas.
- astrocytes are activated by Kupffer cells or cytokines from infiltrating cells and transformed into activated cells to produce extracellular matrix very clearly.
- Astrocytes are known as the storage cells of vitamin A and belong to the stem fibroblast family.
- astrocytes produce proliferative factors such as extracellular matrix protease (MMP), its inhibitory factor (TIMP), cytokines such as TGF- ⁇ and PDGF, and HGF and play a central role in liver fibrosis .
- MMP extracellular matrix protease
- TGF- ⁇ and PDGF cytokines
- HGF histhelial growth factor
- Activated astrocytes are involved in the regulation of blood flow by exaggerating the ability to contract, increasing the expression of various cytokine receptors and increasing susceptibility to cytokines.
- the inventors of the present invention found that the extracts of T. ganoderma lucidum obtained by using the respective solvents were inhibited by ⁇ -SMA induced by TGF- ⁇ 1, CTGF, The effects of FN-EDA and collagen expression were analyzed.
- the Hwangchulchae extract of the present invention can effectively inhibit the expression levels of ⁇ -SMA, CTGF, FN-EDA and collagen increased by TGF- ⁇ 1.
- the CTGF connective tissue growth factor
- ⁇ -SMA and collagen are known to induce fibrosis .
- FN fibronectin
- FN-EDA fibronectin extra domain A
- the extract of Hwangchu-myeon of the present invention has an activity of effectively inhibiting the expression of factors inducing fibrosis and ultimately, it can be usefully used for the production of medicines and health functional foods for prevention, improvement and treatment of fibrotic diseases.
- the present invention can provide a pharmaceutical composition for prevention or treatment of fibrotic diseases, which comprises extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient.
- the fibrotic diseases capable of preventing, ameliorating, or treating the Hwigolin extract of the present invention include, but are not limited to, hyperpigmentation scars, keloids, scleroderma, peritoneal adherence, hepatic fibrosis, pulmonary fibrosis, cardiac fibrosis, skeletal muscle fibrosis, Myelofibrosis and dysplasia syndrome and diabetic retinopathy.
- Skin fibrosis In skin fibrosis, the process of wound healing is divided into three stages: 1) inflammation, 2) proliferation, and 3) remodeling. Skin fibrosis is a physiological scar, hypertrophic scar scars, keloids, and scleroderma.
- Liver fibrosis is a disease with a high mortality rate affecting 100 million people globally. Liver fibrosis is caused by viruses, alcohol poisoning, radiation, cholestasis, oxidative stress, toxic chemicals such as CCl4, nitrosamines, may be induced by chronic liver injury by drugs such as stilbestrol, methyldopa and choline deficient diets, and progression to terminal cirrhosis or hepatocellular carcinoma if fibrosis is not controlled. (ECM), such as collagen and fibronectin, which activates and proliferates to produce hepatic fibrosis during hepatic stellate cell (HSC, liver fat cells, fat storage cells, lto cells, perisinusoidal cells) Causing accumulation.
- ECM hepatic fibrostellate cell
- liver fibrosis is reversible when the cause of the onset is weakened or eliminated, and studies have been made to screen for medicinal plants as anti-fibrotic agents, and as pharmacological efficacy Inhibition of hepatic stellate cell activation and inhibition of extracellular matrix deposition.
- Pulmonary involvement in patients with systemic sclerosis occurs up to 90%, and interstitial lung disease associated with systemic sclerosis is another leading cause of death.
- pulmonary fibroblasts are activated and differentiated into fibroblasts, which can produce collagen-like ECM in pulmonary fibrosis.
- idiopathic pulmonary fibrosis IPF is a chronic progressive pulmonary disease with poor prognosis, characterized by death due to respiratory failure within several years from the onset of symptoms.
- Inhibition of pulmonary transplantation and anti-fibrosis is a method for treating idiopathic pulmonary fibrosis .
- Renal fibrosis is also classified as glomerulosclerosis and renal fibrosis (RIF), which are caused by various pathogenic stimuli such as inflammation, immune response, trauma, hypoxia and decreased blood circulation.
- RIF is a life- Has been found to be found in the development of chronic kidney disease.
- Adhesion also causes complications such as abdominal pain, intestinal obstruction, and infertility after abdominal surgery, and tissue adhesion barriers such as films, membranes, knits, sprays, and hydrogels have been developed to prevent adherence of enterocytes and peritoneum. Research is underway to treat adhesion-related diseases such as peritoneal adhesions through inhibition of fibrosis.
- mucoepiditis is characterized by fibrosis and flexion of the capsular bag, which causes painful problems in movement.
- Myelofibrosis is found in a variety of blood disorders such as myeloproliferative diseases and acute myelogenous leukemia, and up to 50% of patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary angioplasty (PTCA) and stenting are known to cause restenosis
- PTCA percutaneous coronary angioplasty
- stenting are known to cause restenosis
- neointimal proliferation and fibrosis are known to be related to restenosis of damaged artery and vascular stent.
- the extract of D. torrillus L. can be effectively used as a material for preventing, ameliorating or treating such fibrosis-related diseases.
- the present invention can provide a method for blocking the signal transduction of TGF- ⁇ 1 by administering an effective amount of the extract of Huangchu tree to a subject in need thereof, thereby providing a method for treating and preventing fibrosis disease using the extract .
- treating refers to reversing, alleviating, or progressing one or more symptoms of the disease or condition to which the term applies, ≪ / RTI >
- treatment refers to an act of treating when " treating " is defined as above.
- the pharmaceutical composition for prevention and treatment of fibrotic diseases containing the extract of Hokkaido extract of the present invention contains the above extract in an amount of 0.1 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
- the pharmaceutical composition containing the extract of Hokkaido extract of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the production of pharmaceutical compositions.
- composition comprising the extract of Hokkaido extract of the present invention may be formulated or used together with a medicament such as a steroid drug, an antihistamine agent, an antiinflammatory agent and an antibiotic which have been already used.
- a medicament such as a steroid drug, an antihistamine agent, an antiinflammatory agent and an antibiotic which have been already used.
- the pharmaceutical composition containing the extract according to the present invention can be administered orally or parenterally in the form of powders, granules, tablets, capsules, oral preparations such as suspensions, emulsions, syrups and aerosols, external preparations, suppositories, Can be used.
- oral preparations such as suspensions, emulsions, syrups and aerosols, external preparations, suppositories, Can be used.
- it may be formulated in the form of a skin external preparation.
- Examples of carriers, excipients and diluents that may be contained in the composition containing the extract of the present invention include vaseline, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, But are not limited to, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil in the form of tablets, capsules, powders, granules, .
- a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
- Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose , Gelatin, and the like.
- excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose , Gelatin, and the like.
- lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
- the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
- various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included .
- Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
- the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like.
- the base of suppositories may be witepsol, macrogol, tween, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.
- the amount of the extract of the present invention may vary depending on the age, sex and body weight of the patient, but may be 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, once to several times per day.
- the dosage may also be increased or decreased depending on the route of administration, degree of disease, sex, weight, age, and the like. Accordingly, the dosage is not limited in any way to the scope of the present invention.
- the pharmaceutical composition may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like in a variety of routes. All modes of administration may be expected, for example, in the skin, oral, rectal or intravenous, muscular, subcutaneous, intrauterine, epidural or intracerebral, intra-articular and intraperitoneal administration.
- compositions of the present invention may also be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable set.
- the present invention relates to a functional composition for prevention and improvement of fibrotic diseases containing, as an active ingredient, the extract of Hokkaido extract.
- a functional composition includes, for example, a health functional food composition.
- Functionality can be classified into physical properties and physiological functions. When the extract of U. perilla of the present invention is added, the physical properties and physiological functions of the composition will be improved.
- the functional composition for prevention and improvement of fibrotic diseases can be prepared by using the molecular mechanism of the extract of D. burdock of the present invention.
- the extract of U. perch can be used as a main ingredient, an additive and an adjuvant in the production of various functional foods.
- the amount of the extract in the functional composition may be generally from 0.01 to 15% by weight of the total composition.
- a person skilled in the art Can be selected and used.
- composition containing the extract of Tochigi kaki extract of the present invention is a natural vegetable ingredient, it has little toxicity and side effects and can be safely used for prolonged use for preventive purposes.
- FIG. 1 shows the yields according to the process and the solvent fractions obtained by using the solvents.
- DMEM Dulbeccos modified Eagles media
- FBS heat-inactivated fetal bovine serum
- RNA was extracted using an automatic nucleic acid extraction system MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan) By the method according to the product specification. Then, RNA (1 ⁇ g) was reverse transcribed using 200 units of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Invitrogen, USA) and oligo (dT) primer at 37 ° C for 1 hour. Real-time PCR was performed using a Taqman Master Mix (Roche) Light Cycler 2.0 instrument (Roche, Mannheim, Germany) containing 4 ⁇ l of 5-fold diluted cDNA, 10 pmol of each primer and probe, 4 ⁇ l of Master Mix Buffer, dNTPs, MgCl 2, and Tag polymerase. The data were analyzed using Light Cycler software version 4.0 (Roche).
- cytoplasmic RNA was extracted using TRI reagent (RNAiso Plus, Takara, Japan) and the extracted RNA was synthesized using reverse transcription PCR (Invitrogen, USA). The reaction was carried out with 4 ⁇ l of 1: 5 diluted cDNA, 4 mM MgCl 2 , 10 pmol of each primer and 4 ⁇ l of Fast Starter Mix buffer (dNTPs, SYBR Green dye and Tag polymerase) . Each sample RNA was reverse transcribed using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Invitrogen, USA) and oligo (dT) primers at 37 ° C for 1 hour.
- dNTPs Fast Starter Mix buffer
- the cDNA was diluted 1: 5 with water , 2.5 units of Taq polymerase (Promega, USA), and 10 pmol of each primer using a GeneAmp PCR9600 (Perkin-Elmer-Cetus, USA) instrument.
- the primers, probes and PCR conditions used in the PCR reaction of the present experiment are shown in Tables 1 and 2 below.
- Protein concentrations were determined by the Bradford (Schleicher and Wieland, 1978) assay. Standard curves were prepared using serial dilutions of bovine serum albumin (BSA), and BioRad protein assay staining reagents were diluted 1: 4 in water. 4 ⁇ l of standards and samples were added to 1 ml of diluted dyeing reagent and absorbance was measured at 595 nm. The sample protein concentration was determined from a standard curve prepared with BSA.
- BSA bovine serum albumin
- Cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and resuspended in 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 250 mM NaCl, 0.5% Triton X100, 10% glycerol, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Cell lysates were centrifuged, electrophoresed by SDS-PAGE and Western blot was performed.
- PBS phosphate-buffered saline
- the membranes with intracellular proteins were incubated with a primary rabbit for ⁇ -SMA (ACAM, USA), CTGF (ABCAM, USA), FN-EDA (Santa Cruz, USA) and GAPDH polyclonal antibodies were incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody for 2 hours at room temperature and then analyzed using ECL detection kit (Amersham, USA).
- the HS27 cell line was dispensed in a 6-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and cultured until the plate was filled with cells. The plate was then scrubbed with 20 [mu] l of elution tip and the cells were removed by scratching using a PBS buffer. The cells were then cultured for 24 hours in a medium containing 50 ⁇ of the extract according to the present invention, and the cell migration rate to the cell-free region was confirmed.
- the radical scavenging activity was analyzed using DPPH.
- Each of the extract was dissolved in methanol, and 5 ml of the reaction solution containing 3.98 ml of methanol, 20 ⁇ l of each extract and 1 ml of DPPH (dissolved in methanol at a concentration of 0.15 mM) was added to the reaction solution for 30 minutes at room temperature After the incubation, the absorbance was measured at 517 nm using a spectrophotometer (UV-1800, Shimadzu, Japan). Each experiment was repeated 3 times and IC 50 (50% inhibition of DPPH radicals) was calculated as the radical scavenging ability of each extract treatment concentration. Silymarin and ascorbic acid, known to have antioxidant activity, were used as positive control.
- the AML-2 / DX100 cell line and the HS27 cell line (1 ⁇ 10 5 cells / ml) were suspended in PBS buffer, and each sample was treated with the Hwangilchu extract for 30 minutes. Then, 1 ⁇ M DCFH-DA and 4 mM hydrogen peroxide were added and reacted for 2 hours. The amount of DCF was measured at 485 nm and 530 nm using a spectrofluometer (Perkinelmer, USA).
- liver tissue from rats that induced fibrosis sirius red staining was performed according to the experimental method guide of ScyTek Laboratories kit. Specifically, formalin-fixed liver tissue was embedded in paraffin in a usual manner Then, a 4- ⁇ m slice was prepared using a slicer and attached to a slide. Then, the paraffin was removed and treated with a hematoxylin reagent and allowed to react for 5 minutes. After washing twice with distilled water, the bluing reagent was applied to cover the tissue sections and allowed to react for 15 seconds. Thereafter, it was washed twice with distilled water. The tissue sections were immersed in the ethanol solution to terminate the reaction.
- Liver tissues were obtained from fibrosis-induced rats, and immunochemical staining was performed.
- the liver tissues fixed with 10% formalin were embedded in paraffin according to a conventional method, and 4- ⁇ m sections were prepared using a kneader After attaching to the slide, paraffin was removed with xylene and the functional process was completed.
- Antigen recovery was carried out in citrate buffer (pH 6.0) for 40 minutes in a constant-temperature water bath. After washing with distilled water, peroxidase blocking buffer was treated at room temperature for 10 minutes to remove endogenous peroxidase.
- anti-SMA mouse monoclonal antibody (ABCAM, UK) and anti-VEGF mouse monoclonal antibody were diluted 1: 100, 300 ⁇ l was added, and reacted at 4 ° C overnight.
- TBST 0.1% Tween 20
- the cells were reacted with 300 ⁇ l of mouse enhancer in a Polik 2 Plus kit (GBI) at room temperature for 30 minutes, and then washed with TBST.
- GPI Polik 2 Plus kit
- polymer-HRP solution And reacted for 30 minutes.
- the cells were stained with DAB (diaminobenzidine). The color development time was 5 minutes.
- DAB diaminobenzidine
- TGF- ⁇ 1 Activation of TGF- ⁇ 1 during fibrosis increases collagen production and accumulation in cells, leading to fibrosis and loss of tissue and organ function.
- alpha-SMA alpha-smooth muscle actin
- TGF- ⁇ 1 was treated with human skin fibroblast HS27 and human hepatic stellate cell, HHStec (human hepatic stellate cell), respectively. And Western blot.
- Fig. 2 it was shown that the degree of ⁇ -SMA expression significantly increased in both the HS27 cell line and the HHStec cell line upon treatment with TGF- ⁇ 1 was effectively inhibited by the treatment of Hwangchu- Especially, the hexane extract showed better inhibitory effect than ethyl acetate, n-butanol and water extract (fraction).
- the present inventors have found that the effect of suppressing the degree of expression of a-SMA increased by TGF- ⁇ 1 after treatment with HSH27 cell line and HHStec, PCR and Western blot analysis, and further examined whether it affected the expression of TGF- ⁇ 1 itself.
- the inventors of the present invention found that the extract of Wuchulia japonica of the present invention can inhibit the expression and activity of fibrosis-related factors promoted by the fibrosis-promoting cytokines TGF- ⁇ 1 and TGF- ⁇ 1, Of the hexane fraction had the strongest antifibrotic activity.
- TGF- ⁇ 1 is known to play an important role in the production, action, and activity of CTGF.
- Overexpression of CTGF induces accumulation of ECM and stimulates hepatic fibrosis by stimulating hepatic cell proliferation, survival and collagen production have.
- ECM fibronectin
- FN-EDA fibronectin extra domain A
- CTGF and FN-EDA inhibit TGF- ⁇ 1-induced increase in the expression of CTGF and FN-EDA
- the extracts of Hwangchil were treated with HS27 cell line and HHStec, The expression levels of CTGF and FN-EDA in the cells were analyzed by PCR and Western blot.
- the extract of Wuchulia japonica of the present invention has an activity of effectively inhibiting the increase of CTGF and FN-EDA expression by TGF- ⁇ 1
- the inhibitory effect of CTGF was 5 times inhibition at 2 ug / ml, 7 times at 10 ug / ml and 14 times at 50 ug / ml
- HHStec cell line At the concentration of 2 ug / ml, the inhibitory effect was 9 times, and at the concentration of 10 ug / ml, the inhibitory effect was 18 times.
- TGF- ⁇ 1 is known to be a major stimulant for the ECM planet. It is known that inhibition of TGF- ⁇ 1 expression by TGF- ⁇ 1 siRNA inhibits fibroblast activity and inhibits collagen accumulation and production in the liver.
- the HS27 cell line and the HHStec cell line were treated with TGF- ⁇ 1 and Hwangchujang extract at each concentration, The amount of collagen type I and type 3 mRNA expression was analyzed, and the amount of collagen produced was also analyzed.
- the extract of Hokkaido hexane extract of the present invention was able to effectively inhibit both expression of collagen type I and type 3 in a treatment concentration-dependent manner, and induction by TGF- And also inhibited the production and secretion of soluble collagen.
- ROS Reactive oxygen species
- the present inventors confirmed the antioxidative activity test by the DPPH activity scavenging ability analysis and the DCFH-DA analysis described above to confirm whether the extract of the present invention has ROS inhibiting ability.
- MMP1, MMP2, MMP9, TNF- ⁇ , and TIMP1 expressed in the cell line was analyzed by RT-PCR after HS27 cell line treated with TGF- ⁇ 1, At this time, MMP2 and MMP9 were analyzed by performing a zymography analysis.
- the MMP1 is a target gene for TGF-? 1 and is a molecule that is targeted as a therapeutic target for hepatic fibrosis as a factor down-regulated by TGF-? 1.
- TNF- ⁇ is known to be involved in the resolution of fibrotic tissue, leading to apoptosis, and is known to be inhibited by TGF- ⁇ 1. Therefore, promoting the expression and activity of these factors can inhibit the progress of fibrosis by TGF- ⁇ 1.
- the inhibition of TIMP1 expression which affects hepatic stellate cell activation, can inhibit the progression of liver fibrosis, and the effect of the present invention on TIMP1 expression was also analyzed.
- the extract of Hwangchuhe hexane fraction of the present invention has an effect of increasing the expression of MMP1 and TNF- ⁇ , which are decreased in expression by TGF- ⁇ 1, and expressed by TGF- This increased TIMP1 was shown to inhibit.
- the present inventors analyzed the activity of Huanglong extract for the expression of MMP2 and MMP9, which are fibrosis promoting factors, and found that MMP2 and MMP9, which are increased in expression by TGF- ⁇ 1, Respectively.
- the human cell line (HHstec) was used as an experimental cell line and the assay was performed in the same manner.
- the expression of MMP1 was found to be increased depending on the treatment concentration of the extract of Wuchu wood hexane fraction of the present invention, and the degree of expression increase was superior to that of the positive control group Silymarin appear.
- the treatment with the extract of Huangchuhexhexane fraction of the present invention inhibited the expression of MMP2 by TGF- ⁇ 1, and showed the most effective inhibitory effect especially at the treatment of 10 ug / ml.
- DPPH radicals and DCFH-DA radical scavenging activity were analyzed for the ethanol extract of Huangchu tree (30%, 50% and 70% ethanol treated) of the present invention prepared with different ethanol concentrations.
- the inventors of the present invention have found that, when ethanol extract of Huangchu tree is obtained using ethanol, it is effective to use 30% ethanol to obtain excellent antifibrotic activity.
- ⁇ -smooth muscle actin ⁇ -SMA
- CTGF connective tissue growth factor
- the amount of ⁇ -SMA and CTGF expressed in the group treated with Huangchuang ethanol extract (30% ethanol extract) of the present invention was significantly higher than that of the control (CTL) , And 30% ethanol extract was most effective when treated with 40 ug / ml.
- 40 ug / ml showed more than 2 times inhibitory effect whereas 80 ug / ml showed similar effect to 40 ug / ml.
- the cell scratch recovery test for the extract of U. chestnut tree of the present invention was performed.
- the ethanol extract of Huangchu tree of the present invention (30% ethanol extract) of the present invention was added to the cell culture medium for 12 hours, and the cells were scratched and the distance of the scratch wound was measured.
- the present inventors conducted an experiment to determine whether treatment of ethanol extract of Huangchu tree of the present invention has an effect of improving or treating fibrosis in a rat animal model in which fibrosis is induced.
- an experimental group for rats was prepared as shown in Table 4 below and the following experiments were performed.
- the body weights of the four groups of rats were measured and the weight of each group was analyzed.
- weight loss was observed when antifibrotic diseases were induced, and thus it was confirmed that the extract of the present invention can inhibit such weight loss.
- the group treated with CCl 4 which is an anti-fibrosis-inducing substance, showed a weight loss phenomenon more prominently than the control group.
- the group treated with silymarin which is a positive control group.
- ALT alanine aminotransferase
- AST aspartate aminotransferase
- hepatic injury was induced by the activity of ALT and AST in blood of CCl 4- treated group, while the activity of ALT and AST in blood was higher than that of the control group.
- the group treated with carbon tetrachloride (CCl 4 ) showed a significant decrease in the levels of ALT and AST increased by CCl 4 , indicating that it can improve and prevent liver damage caused by carbon tetrachloride I could.
- liver tissues were collected from the rat experimental animals used in ⁇ 8-1>, and liver collagen expression was analyzed by sirius red staining.
- the group treated with carbon tetrachloride (CCl 4 ) (CMC + CCl 4 ) showed a significant sagging phenomenon of the hepatocytes compared with the group treated with carbon tetrachloride (CCl 4 ) And the successive collagen fiber septa were interconnected between the central vein and the central vein and between the central vein and the portal vein.
- the group treated with the extract of Huangchu tree ethanol (DMEE + CCl 4 ) of the present invention showed a decrease in hepatic cell shedding change compared with the group treated with carbon tetrachloride (CCl 4 ) (CCl 4 ), and this improvement was similar to that of silymarin (SM), a positive drug.
- the inventors of the present invention have found that the extract of Hwigulak extract of the present invention can effectively prevent, ameliorate, inhibit and treat fibrosis by controlling the expression and secretion of extracellular matrix such as collagen, And ethanol extracts of Hwangchujang leaves showed more effective antifibrotic activity than SM.
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Abstract
본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항섬유화 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 황칠나무 추출물은 섬유화에 중요한 역할을 하는 TGF-β1의 신호전달 경로를 효과적으로 억제하는 활성이 있어 TGF-β1으로 유도되는 α-SMA, CTGF, FN-EDAM 및 콜라겐과 같은 세포외기질 인자들의 발현 및 활성을 억제할 수 있으며, 높은 항산화 활성이 있으므로 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 섬유화 질환의 치료제 및 건강기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대부분의 장기는 조직 손상 후 염증과 치유과정을 거치게 되는데 지속적인 손상이 있으면 치유과정에서 조직의 섬유화가 일어나게 된다. 섬유화 과정은 콜라겐이나 피브로넥틴(fibronectin) 등의 세포외기질(ECM)이 조직에 축척되어 정상구조를 파괴하여 기능의 장애를 가져오게 된다. 섬유화에 있어서 세포외기질은 섬유 모세포에서 파생되기 때문에 섬유화 및 항섬유화의 연구는 활성화된 섬유아세포 및 섬유아세포의 중심에 위치하는 근섬유아세포(myofibroblast)에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.
또한 섬유화는 다양한 기관, 조직 및 세포에서 발생될 수 있는데, 섬유화 질환은 피부(과증식성반흔, 켈로이드, 경피증), 간(섬유화 및 경화), 폐(섬유화), 심장(섬유화), 장(유착 및 협착), 관절(관절막 섬유화) 및 골수(섬유증 및 이형성 증후군) 등에서 발생하는 것으로 알려져 있다.
특히 간섬유화는 간경변증의 전구병변으로 만성 간질환을 일으키는 심한 간손상의 결과로 여러 가지 사이토카인과 성장인자의 작용에 의해 시작된다. 일반적으로 간섬유증은 가역적이고 thin fibril로 구성되며 결절 형성이 없고 간손상 원인이 한시적인 경우 세포사멸(apoptosis)과정과 matrix metalloproteinases (MMP)에 의해서 증가된 세포외기질(extracellular matrix, ECM)이 분해되어 정상 회복이 가능하지만, 간섬유증 과정이 반복적으로 지속되면 thick fibril을 형성하고 결절이 있는 간경변으로 진행하게 된다. 또한 다양한 염증 유발요인으로 인해 간세포가 손상되어 콜라겐을 포함한 비정상적인 세포외기질 단백질이 축적되는 간섬유증의 과정을 통하여 간경변증이 유발되며 간경변증의 발현 조절을 위해서는 세포외기질의 축적을 조절하는 것이 중요하다. 간세포가 손상되는 경우의 염증반응은 휴지기의 간성상세포를 활성화시켜 세포외 기질과 다양한 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)을 분비하며 그 중 TGF-β1은 강력한 성장억제제의 역할을 한다. TGF-β1은 25 kD의 물질로서 latent TGF-β1-binding protein과 결합하여 inactive latent 형태로 분비되고 1,4형 교원질, laminin 및 decorin 등의 세포외기질과 결합한 상태로 존재하여 여러 가지 자극에 의해 활성화된다. TGF-β1은 collagenase 생산을 감소하거나 collagenase 억제물질 생산을 증가하여 collagen 발현을 조절하며, 대식세포에서 TNF-α, IL-1 및 PDGF 등의 생산을 증가시키며 섬유화 과정에 중요한 역할을 한다. 현재 TGF-β1은 섬유화가 진행된 곳에서만 발현되고 정상 간조직이나 비활동적인 곳에서는 발현되지 않아 간섬유화에서 TGF-β1이 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 폐섬유화(pulmonary fibrosis)는 폐포벽에 결합조직, 특히 콜라겐이 과도하게 참착되면서 호흡곤란을 일으키는 질환이다. 폐섬유화에서는 폐 조직이 딱딱하게 굳어가며, 말랑하고 탄력적이어야 할 폐 조직이 굳은 부위에서는 호흡을 위한 수축과 팽창이 자유롭지 못하기 때문에 호흡량이 줄게 되며, 병증이 진행될수록 상대적으로 남아있는 폐 용적이 줄면서 폐 기능이 감소되고 최악의 경우 호흡곤란 또는 호흡부전으로 인해 사망까지도 할 수 있는 위험한 병증이다. 폐 섬유화 예측마커로는 TGF-β1(SMAD), α-SMA, endothelin-1 등이 있으며 폐섬유화가 발생하면 이들 발현이 증가된다고 보고되고 있다.
이와 같은 간섬유화, 폐섬유화 등 섬유화 질환의 치료를 위한 방법으로는 현재 사용되고 있는 대부분의 치료제는 화학요법제로서 인체 각종 부작용을 초래하는 문제점이 있어, 보다 근본적인 치료 효과가 있으면서도 체내 안정한 천연물 유래의 새로운 항섬유증 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 두릅나무과에 속하는 황칠나무(Dendropanax
morbifera Lev.)는 우리나라의 남부 해안 지역과 제주도에서 자생하는 상록활엽교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠이라고 한다.
황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장신구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 이용되어 왔으며, 고려시대에 쓰여진 고려사절요, 중국의 계림유사, 계림지, 해동역사에 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있고, 그 이전인 백제의 특산품이었다는 것이 당나라 역사서인 책부원구, 통전에 남아있다. 또한, 황칠나무가 번열 제거, 안질치료, 황달치료, 화상치료 및 나병에 효과가 있으며 인체에 무해하다는 기록도 전해지고 있다.
이에, 본 발명자들은 황칠나무 추출물이 섬유화에 중요한 역할을 하는 TGF-β1 및 섬유화 관련 인자들의 발현과 활성을 조절하는 작용이 있음을 확인하였고 따라서 황칠나무 추출물을 섬유화 질환의 예방 및 치료용도로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 극성용매 가용추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 TGF-β1 신호전달 경로를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 섬유화 질환은 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 경피증, 골격근 섬유증 및 당뇨성 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트으로 이루어진 군 중에서 선택되는 용매를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 섬유화 질환은 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 경피증, 골격근 섬유증 및 당뇨성 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물은 섬유화에 중요한 역할을 하는 TGF-β1의 신호전달 경로를 효과적으로 억제하는 활성이 있어 TGF-β1으로 유도되는 a-SMA, CTGF, FN-EDAM, 콜라겐과 같은 세포외기질 인자들의 발현 및 활성을 억제할 수 있으며 높은 항산화 활성이 있어, 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 섬유화 질환의 치료제 및 건강기능성식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 황칠나무 추출물을 제조하는 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 HS27 및 HHStec 세포주를 대상으로 본 발명의 황칠나무 용매별 추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 a-SMA의 발현 정도를 RT-PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HS27 및 HHStec 세포주를 대상으로 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 a-SMA의 발현 정도를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HS27 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1의 mRNA 발현양과 TGF-β1 생성량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 CTGF(connective tissue growth factor)의 발현변화를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 FN-EDA(fibronectin extra domain A)의 발현변화를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 콜라겐 I 및 III(ECM)의 발현변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 용해성 콜라겐 분비량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 스크래치된 HS27 세포주에 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물을 처리하고 24시간 배양 후, 세포이동 정도(회복력)를 현미경으로 관찰한 사진과 회복 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 용매별 황칠나무 추출물에 따른 항산화 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HS27 세포주에 용매별 본 발명의 황칠나무 추출물을 처리한 후, DCFH-DA 소거능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 HS27 세포주에 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물을 농도별 처리한 후, 섬유화 관련 인자인 MMP1, TNF-a 및 TIMP1의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 HS27 세포주에 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물을 농도별 처리한 후, 섬유화 관련 인자인 MMP2 및 MMP9의 mRNA 발현정도를 자이모그래피 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 HHStec 세포주에 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물을 농도별로 처리한 후, 섬유화 관련 인자인 MMP1 및 MMP2의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 HHStec 세포주에 본 발명에 따른 황칠나무 에탄올 추출물(DMEE)을 농도별로 처리한 후, 상기 세포내에서 발현된 α-SMA 및 CTGF의 발현양의 측정 결과를 나타낸 것이며, SM은 양성대조군으로서 Silymarin을 처리한 군을 나타낸 것이다.
도 16은 HHStec 세포주에 본 발명에 따른 황칠나무 에탄올 추출물(DMEE)을 전처리한 후, 세포 스크래치를 낸 후, 스크래치 상처의 거리를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 피부 섬유아세포인 HS27 세포주에 본 발명에 따른 황칠나무 에탄올 추출물(DMEE)을 농도별로 처리한 후, 상기 세포내에서 발현된 α-SMA 및 CTGF의 발현양의 측정 결과를 나타낸 것이며, SM은 양성대조군으로서 Silymarin을 처리한 군을 나타낸 것이다.
도 18은 피부 섬유아세포인 HS27 세포주에 본 발명에 따른 황칠나무 에탄올 추출물(DMEE)을 전처리한 후, 세포 스크래치를 낸 후, 스크래치 상처의 거리를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 흰쥐(SD) 동물 모델을 대상으로 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물의 처리 시, 사염화탄소 주입에 따른 마우스의 체중 감소 억제 효과 정도를 분석한 결과를 나타낸 것으로, CTL은 아무것도 처리하지 않은 대조군, CCl4는 사염화탄소를 주입한 군, DM1+CCl4는 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물과 사염화탄소 주입 군, SM+CCl4는 Silymarin과 사염화탄소를 주입한 군을 나타낸 것이다.
도 20은 흰쥐(SD) 동물 모델을 대상으로 사염화탄소 주입에 따른 간 손상을 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물 처리 시, 개선할 수 있는지의 여부를 혈청 지표인 ALT 및 AST의 함량 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 흰쥐(SD) 동물 모델을 대상으로 사염화탄소 주입에 따른 간 조직 손상(간섬유화 증상)을 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물 처리 시, 개선할 수 있는지의 여부를 HE 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 흰쥐(SD) 동물 모델 모델을 대상으로 사염화탄소 주입에 따른 간 조직 손상(간섬유화 증상)을 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물 처리 시, 개선할 수 있는지의 여부를 VEGF의 발현 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"추출물"은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.
"조추출물"은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
"극성용매 가용 추출물"은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올, 보다 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
"비극성용매 가용 추출물"은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.
"약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 황칠나무 추출물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.
"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
"치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
"기능성 식품"이란, 일반 식품에 본 발명의 황칠나무 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '기능성 식품'이라 정의한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명은 황칠나무 추출물의 항섬유화 용도에 관한 것으로, 황칠나무 추출물이 내포하고 있는 특정 생리활성 및 기능의 발휘에 관한 것이다.
황칠나무(Dendropanox
morbifera LEV.)는 두릅나무에 속하는 상록 활엽교목으로 우리나라의 제주도, 완도, 보길도, 해남 등 남ㆍ서해안 일대에 자생하고 있는 우리나라 특산 수종이다. 황칠나무에 함유된 정향성분은 소량의 터펜(Terpene)류와 다량의 세스퀴터펜(Sesquiterpene)류가 포함되어 있는데, 채취시기나 장소에 따라서 차이가 있지만 germacrene-d, β-selinene,α-amorphene, α-selinene, δ-cadinene,γ-cadinene, T-muurolol, β-elemene, bicyclo [4,4,0] dec- 1 -en - 2 - isopropyl - 5 - methyl - 9-methylene, β-cadinene, germacrene-B, α-copaene, α-humulene, α-cadinene과 소량의 linalool L, α-terpinene, α-cubebene, α-ylangene,(+)-calarene, 3,7-guaiadine, (-)-isoledene, β-cubebene, limonene, aromadendrene, cadina-1,4-diene 등이 함유되어 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 황칠나무의 부위는 잎, 줄기, 수피 등 제한이 없으나, 바람직하게는 잎을 사용할 수 있다.
황칠나무 추출물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물 또는 조추출물은 황칠나무 중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 2 내지 15배 부피 량 (w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 메탄올을 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 10 내지 60 시간, 바람직하게는 30 내지 50 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로 황칠나무 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 50~100% 메탄올 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다. 바람직하게는 헥산 추출물을 수득하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 항섬유 활성을 갖는 황칠나무 추출물은 상기 헥산 추출물뿐만 아니라 에탄올 추출물을 사용할 수 있다.
상기 추출물들의 농축액을 -80℃ 동결건조 혹은 50℃ 진공감압을 통하여 분말상태로도 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 황칠나무 추출물을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다.예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 추출방법은 당 분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해 성공적으로 수행될 수 있다.
본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 황칠나무 추출물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.
본 발명은 황칠나무 추출물의 새로운 용도, 즉 섬유화 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 활성이 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.
섬유화(섬유증) 진행에서 핵심적인 역할을 담당하는 인자는 TGF-β1 으로 알려져 있으며, TGF-β1에 의한 신호전달 체계를 억제하면 섬유화를 억제할 수 있다.
또한, 간장 또는 췌장의 섬유화를 억제하는 유효한 수단으로서 성상세포가 중요한 표적 후보가 되고 있다. 섬유화 과정 중, 성상세포는 쿠퍼 세포(Kupffer cell)나 침윤 세포로부터의 사이토카인에 의해 활성화되고 활성화 세포로 형질 전환되어 세포외기질을 매우 분명하게 생산한다. 성상세포는 비타민 A의 저장 세포로서 알려져 있고, 줄기섬유아세포 패밀리에 속한다. 한편, 성상세포는 세포외기질 분해 효소(MMP), 그 억제 인자(TIMP), TGF-β, PDGF 등의 사이토카인 및 HGF 등의 증식 인자를 생산하고, 간 섬유화에 있어서 중심적인 역할을 완수한다. 활성화된 성상세포는 수축능이 항진하여 혈류의 조절에 관여하는 것 외에, 각종 사이토카인 수용체의 발현을 증가시켜 사이토카인에 대한 감수성을 증가시킨다.
본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 섬유화 질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있는지를 확인하기 위해, 먼저 각 용매를 이용하여 수득한 황칠나무 추출물에 대해 TGF-β1로 유도된 α-SMA, CTGF, FN-EDA 및 콜라겐의 발현 변화 영향을 분석하였다.
그 결과, TGF-β1로 증가된α-SMA, CTGF, FN-EDA 및 콜라겐의 발현수준을 본 발명의 황칠나무 추출물이 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 간의 쿠퍼세포로부터 전-섬유화 사이토카인의 생성을 자극할 뿐만 아니라 간성상세포의 활성화를 통한 섬유증 초기 유발인자인 반응성 활성산소종(ROS)에 대한 황칠나무 추출물의 활성 억제 여부를 확인한 결과, 본 발명의 황칠나무 추출물은 활성산소종(ROS)을 효과적으로 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났다.
상기 CTGF(connective tissue growth factor)는 간성상세포에서 주로 분비되는 물질로서 간성상세포의 증식과, 생존 및 collagen 생산을 자극함으로써 간섬유화를 유발시키는 것으로 알려져 있고, α-SMA 및 콜라겐은 섬유화 유발 시 증가되는 것으로 알려져 있다.
또한, ECM의 성분들 중에서 FN (fibronectin) 및 이의 일부인 FN-EDA (fibronectin extra domain A)은 상처 치유와 같은 비정상적인 상태에서 생산되며, 이들 역시 TGF-β1에 의해 발현이 증가되며 섬유화를 유발시키는 요인이다.
따라서 본 발명의 황칠나무 추출물은 섬유화 유발 원인 및 인자들의 발현을 효과적으로 억제하는 활성이 있어, 궁극적으로 섬유화 질환의 예방, 개선 및 치료를 위한 의약품과 건강기능성 식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물이 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 상기 섬유화 질환으로는 이에 제한되지 않으나, 과증식형반흔, 켈로이드, 경피증, 복막유착증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 골격근 섬유증, 관절막 섬유증, 골수섬유증 및 이형성 증후군 및 당뇨성 망막증일 수 있다.
피부 섬유증(skin fibrosis)에 있어서, 상처의 치료과정은 1) 염증단계, 2) 증식단계 및 3) 리모델링 단계의 3단계로 순차적인 분류를 하며, 피부 섬유증은 생리학적 흉터, 과증식형반흔(hypertrophic scars), 켈로이드(keloid) 및 경피증(scleroderma)을 포함한다.
또한, 간 섬유화는 전 세계적으로 1억 인구에 영향을 미치는 높은 사망률을 갖는 질환으로, 간 섬유화는 바이러스, 알코올 중독, 방사선, 담즙 정체, 산화 스트레스, CCl4, 니트로사민과 같은 독성 화학 물질, 스틸베스트롤(stilbestrol)과 메틸도파(methyldopa) 및 콜린 결핍식이 요법과 같은 약물에 의한 만성 간 손상에 의해 유도될 수 있으며, 섬유화가 조절되지 않으면 말기 간경화 또는 간세포 암종으로 진행될 수 있다. 만성 간 손상이 진행되는 동안 간성상세포(HSC, 간 지방세포, 지방 저장세포, lto 세포, perisinusoidal 세포)가 활성화되고 증식하여 간 섬유화를 초래하는 콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 세포외기질(ECM)의 과도한 축적을 유발한다. 최근 연구 결과에 따르면, 간 섬유화(Liver fibrosis)은 발병의 원인이 약화되거나 제거되면 가역적인 현상이 발생함이 밝혀짐에 따라 항 섬유화 제제로서 약용식물을 스크리닝하려는 연구가 시도되고 있고, 약리 효능으로서 간성상세포 활성화 억제 및 세포외기질 침착 저해에 대한 활성분석이 진행되고 있다.
전신 경화증 환자의 폐 침범은 최대 90 %까지 발생하며 전신성 경화증과 관련된 간질성 폐 질환은 또 다른 사망의 주요 원인이 되고 있다. 간 섬유화와 마찬가지로 폐 섬유아세포는 활성화되어 폐 섬유증에서 콜라겐과 같은 ECM을 생성할 수 있는 근섬유 아세포로 분화된다. 또한, 특발성 폐섬유증(IPF)은 증상의 시작으로부터 수년 내에 호흡 부전으로 인한 사망을 특징으로 하는 예후가 좋지 않은 만성 진행성 폐 질환이며, 폐이식과 항섬유화의 억제는 특발성 폐 섬유증을 치료하기 위한 방법으로 사용되고 있다.
또한, 신장 섬유증(Renal fibrosis)은 염증, 면역 반응, 외상, 저산소증 및 혈액 순환 저하와 같은 다양한 병원성 자극에 의해 유발되는 사구체 경화증과 신장 간질 섬유증(RIF)으로 분류되고 있으며, RIF는 생명을 위협하는 만성 신장 질환의 발달에서 발견되는 것으로 밝혀져 있다. 신장 섬유증이 발병되면, 신장 간질 섬유아세포 유사세포(renal interstitial fibroblast-like cells)는 근섬유 아세포로 활성화되고, 빈혈 유발로 인해 충분한 적혈구 생성인자의 발현 능력을 상실하게 하는 것으로 알려져 있다.
심장 섬유증(Cardiac fibrosis)은 자연적으로 심근 경색을 초래하게 되는데, 심장 섬유증의 진행은 심장 기능의 손상을 초래하여 결국 심장 마비를 일으키게 된다. 따라서, 심장 섬유증의 억제는 심부전을 예방하는 데에도 매우 중요하다.
또한, 유착은 복부 통증, 장 폐쇄 및 복부 수술 후의 불임과 같은 합병증이 유발되기도 하여 장과 복막의 부착을 방지하기 위해 필름, 멤브레인, 니트, 스프레이 및 하이드로 겔과 같은 조직 접착 장벽이 개발되기도 하였으며, 섬유화 억제를 통해 복막유착증과 같은 유착 관련 질환을 치료하기 위한 연구도 진행되고 있다.
또한, 점막낭염은 관절낭의 섬유화와 굴곡이 특징이며 이로 인해 움직임에 고통스런 문제가 발생하게 된다. 골수 섬유증은 골수 증식성 질환 및 급성 골수성 백혈병과 같은 다양한 혈액 질환에서 발견되고 있으며, 경피적 관상동맥 혈관성형술 (PTCA) 및 스텐트 삽입술을 받는 관상동맥 질환환자의 최대 50%가 재협착을 초래하는 것으로 알려져 있고, 신생 내막 증식과 섬유화는 손상된 동맥 및 혈관 스텐트의 재협착과 관련성이 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 섬유화 질환으로 인한 사망은 자연 사망의 약 1/3에 달하지만, 섬유성 병변을 조절하기 위한 효과적인 치료법은 아직 개발되지 못하고 있는 실정이며, 최근에는 간 섬유화의 효과적인 치료를 위한 방안으로 간성상세포 활성화 억제 및 세포외기질 침착 억제 효능을 가지면서 안전성 및 비용측면에서 유리한 약용식물에 대한 연구가 진행되고 있다.
이와 같이, 섬유화는 많은 질환들의 발병에 관여하고 있는 바, 본 발명의 황칠나무 추출물은 이러한 섬유화 관련 질환들의 예방, 개선 또는 치료를 위한 소재로 유용하게 사용할 수 있음을 본 발명에서 규명하였다.
그러므로 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에 유효량의 황칠나무 추출물을 투여하여 TGF-β1의 신호전달을 차단하는 방법을 제공함으로써, 황칠나무 추출물을 사용한 섬유화 질환의 치료 및 예방하는 방법도 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료"란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
본 발명의 황칠나무 추출물을 함유하는 섬유화 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 황칠나무 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 황칠나무 추출물을 포함하는 조성물은 이미 사용되고 있는 스테로이드성 약물, 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제,캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 특히, 창상 치유와 관련하여서는 피부 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 바세린, 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제,감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피부, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내, 경막 또는 뇌혈관 내, 관절강내 및 복강내에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 다른 관점에서 상기 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 섬유화 질환의 예방 및 개선용 기능성 조성물에 관한 것이다. 이러한 기능성 조성물로는 예를 들어, 건강 기능식품 조성물을 들 수 있다.
기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 황칠나무 추출물을 첨가할 경우, 해당 조성물의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이다.
예를 들어, 본 발명의 황칠나무 추출물의 분자적 메커니즘을 이용하여 섬유화 질환의 예방 및 개선용 기능성 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물은 다양한 기능성 식품 제조시 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다. 일 구체예로서, 기능성 조성물 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 전체 조성물 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 상기 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물 또는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.
또한, 여러 가지 영양성분, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜 등을 적절히 함유할 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물 함유 조성물은 천연 식물성 성분이기 때문에, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용하는 경우에도 안심하고 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<재료 및 실험방법>
<1> 황칠나무 추출물의 제조
한국 무안에 위치한 곡우 농장에서 황칠 나무(Dendropanax
morbifera)의 잎을 수거한 후 건조시켰다. 건조된 잎들을 상온에서 메탄올로 추출하였다. 메탄올을 이용한 황칠나무 추출물을 Whatman No. 1 filter paper로 여과하고 회전식 증발농축기로 진공에서 농축시켰다. 이후 메탄올 추출물을 물로 현탁시킨 다음, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 극성에 따라 순차적으로 분획하였다. 각 용매를 이용하여 황칠나무 추출물을 수득한 공정 및 각 용매 분획에 따른 수율은 도 1에 나타내었다.
<2> 세포배양
정상 인간 각질세포주인 HS27세포는 10 % 열불활성 소태아 혈청(FBS)과 100 ㎍/㎖ 항생제가 함유된 DMEM (Dulbeccos modified Eagles media)를 이용하여 5% 이산화탄소 및 37℃의 온도에서 배양하였다. 이들 세포들은 단층 배양이 유지되도록 하였고, 배양된 세포들이 포화가 되면 계대배양을 수행하였다.
<3> 실시간 정량
PCR
총 RNA는 자동핵산 추출시스템인 MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan)의 MagExtractor 을 이용하여 제품 사양에 의한 방법으로 수득하였다. 이후 RNA (1 ㎍)을 200 units의 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Invitrogen, USA) 및 oligo (dT) 프라이머를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행하였다. 실시간 PCR은 Taqman Master Mix (Roche)의 Light Cycler 2.0 기기(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 수행하였는데, 4 μl의 5배 희석된 cDNA,10 pmol의 각 프라이머 및 프로브, 4 μl의 Master Mix 함유 버퍼, dNTPs, MgCl2 및 Tag polymerase가 함유된 총 20 μl의 반응액으로 수행하였고, 데이터 분석은 Light Cycler software version 4.0 (Roche)을 이용하여 분석하였다.
총 세포질 RNA는 TRI 시약(RNAiso Plus, Takara, Japan)을 이용하여 추출하였고, 추출된 RNA는 reverse transcriptionPCR (Invitrogen, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 반응은 4 ㎕의 1:5로 희석한 cDNA, 4 mM MgCl2, 10 pmol 각 프라이머, 4 ㎕의 Fast Starter Mix 버퍼(dNTPs, SYBR Green dye and Tag polymerase)가 혼합된 반응액을 가지고 수행하였다. 각 샘플 RNAs는 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Invitrogen, USA) 및 oligo (dT) 프라이머를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행하였고 합성된 cDNA는 물을 이용하여 1:5로 희석한 후, 2.5 units의 Taq polymerase (Promega, USA) 및 10 pmol 각 프라이머를 가지고 GeneAmp PCR9600 (Perkin-Elmer-Cetus, USA)기기를 사용하여 증폭시켰다. 상기 본 실험의 PCR 반응에서 사용된 프라이머, 프로브 및 PCR 조건은 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
<4>
웨스턴블럿
단백질 농도를 Bradford (Schleicher and Wieland, 1978) 분석법에 의해 측정하였다. 표준 곡선을 BSA(bovine serum albumin)의 연속적 희석을 이용하여 준비하고, Bio Rad 단백질 분석 염색 시약을 수 중 1:4의 비율로 희석하였다. 4 μl의 표준 및 샘플들을 1 mL의 희석된 염색 시약에 첨가하고 흡광도를 595nm에서 측정하였다. 샘플 단백질 농도를 BSA로 준비한 표준곡선으로부터 결정하였다.
세포들은 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척하고 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 250 mM NaCl, 0.5 % Triton X100, 10 % glycerol, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 및 protease inhibitor cocktail(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 이용하여 용해시켰다. 세포용해물은 원심분리 후, SDS-PAGE로 전기영동하고 웨스턴 블럿을 수행하였다. 세포내 단백질들이 부착되어 있는 막(membrane)은 α-SMA (ACAM, USA), CTGF (ABCAM, USA), FN-EDA (Santa Cruz, USA) 및 GAPDH (Santa Cruz, USA)에 대한 1차 rabbit polyclonal 항체들과 1시간 반응시키고, 이후 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 다음, ECL 검출키트(Amersham, USA)를 이용하여 분석하였다.
<5> 세포 이동 분석
HS27 세포주를 6-웰 플레이트에 1×105 cells/well로 분주하고 플레이트에 세포가 가득 채워질 때까지 배양시켰다. 이후 20 ㎕의 엘로팁으로 스크래치를 내고 PBS 버퍼를 이용하여 플레이트를 세척하여 스크래치에 의해 떨어져 나간 세포를 제거하였다. 이후 50 ㎍의 본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 함유한 배지로 세포를 24시간 동안 배양하였고, 세포가 없는 부위로의 세포 이동속도를 확인하였다.
<6>
DPPH
활성
소거능
분석
DPPH를 이용하여 라디칼 소거능을 분석하였다. 본 발명의 각 황칠나무 추출물을 메탄올에 다시 용해시켰는데, 3.98 ㎖ 메탄올, 20 ㎕ 각각의 추출물 및 1㎖ DPPH (0.15 mM 농도로 메탄올로 용해)가 함유된 5ml의 반응액을 30분 동안 상온에서 방치한 후, 517nm에서 spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu, Japan)를 이용하여 흡광도의 감소 정도를 측정하였다. 각 실험은 3회 반복 수행하였고, IC50 (50 % inhibition of DPPH radicals)은 각 추출물 처리 농도별 라디칼 소거능으로 계산하였다. 이때 양성 대조군으로는 항산화 활성을 갖는 것으로 알려진 Silymarin 및 ascorbic acid을 이용하였다.
<7>
DCFH
-DA 분석
AML-2/DX100 세포주 및 HS27 세포주 (1 × 105 cells/㎖)를 PBS 버퍼로 현탁시킨 후, 농도별 각각의 시료(황칠나무 추출물)를 세포에 처리하고 30분 동안 반응시켰다. 이후 1 μM DCFH-DA 및 4 mM 과산화수소를 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 다음, DCF의 양을 spectrofluometer (Perkinelmer,USA)을 이용하여 485nm 및 530nm에서 측정하였다.
<8> 황칠나무 에탄올 추출물(
DMEE
)의 제조
한국 무안에 위치한 곡우 농장에서 황칠 나무(Dendropanax
morbifera)의 잎을 수거한 후 건조시킨 다음, 건조된 잎에 각각 다른 농도의 에탄올을 첨가한 후(30%, 50% 및 70%), 90℃로 가열하면서 에탄올 추출물을 수득하였다. 황칠나무의 에탄올 추출물을 Whatman No. 1 filter paper로 여과하고 회전식 증발농축기로 진공 농축시켰고, 이를 하기 실시예에서 사용하였다.
<9>
CCL4로
간 섬유화가 유도된 쥐 모델의 제조
섬유화 질환이 유발된 쥐 모델의 제조를 위해, 수컷 4주령 흰쥐(Sprague Dawley, SD)를 1주일간 적응시킨 후, 4개의 그룹(용매만 처리한 군(대조군), CCl4
처리군, 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물(DMEE) + CCl4 처리군, 양성대조군(SM + CCl4 처리군)으로 나누고, CCl4 단독 처리군 6마리, 다른 군은 각 군당 5마리씩을 사용하였고, CCl4를 복강내(IP) 주입하기 전 30분에 모든 시료들은 경구(PO)로 투여하였고, 총 6주간 주당 2회 투여하였다. 이러한 동물실험은 조선대학교 동물실험윤리위원회(Chosun University Institutional Animal Care and Use Committe)에서 IRB 계획서를 체출한 후, 승인 받은 후, 모든 실험을 시행하였다.
<10> 간 조직의 콜라겐에
대한 sirius
red stain 염색
섬유화 질환을 유발시킨 쥐를 대상으로 간 조직을 수득한 후, sirius red 염색은 ScyTek Laboratories 키트의 실험방법 가이드에 따라 수행하였는데, 구체적으로, 포르말린으로 고정된 간 조직을 통상의 방법대로 파라핀에 포매한 후, 절편기를 이용하여 4um절편을 만들어 슬라이드에 붙인 후 파라핀을 제거하고, 헤마토크실렌 시약을 처리하여 5분 동안 반응시켰다. 이후 2회 증류수로 세척하였고, bluing 시약을 처리하여 조직 절편을 완전히 덮은 후 15초 동안 반응시켰다. 이후 다시 증류수로 2회 세척하였다. 에탄올 용액에 조직 절편은 침수시켜 반응을 종료시켰다. 그런 뒤, 에오신 Y 용액을 처리하고 3분 동안 반응시킨 다음, 에탄올 용액으로 조직 절편을 포함하는 슬라이드를 세척하였다. 이후 에탄올 용액으로 탈수처리하고 Histomount(National Diagnostics, USA)로 고정시켜 모든 염색 과정을 완료하였다. Sirius red로 염색하면 콜라겐 I 및 콜라겐 III은 광학현미경상에서 빨강색으로 보인다.
<11> 간 조직의 면역화학염색
섬유화 질환을 유발시킨 쥐를 대상으로 간 조직을 수득한 후, 면역화학염색을 수행하였는데, 10% 포르말린에 고정된 간 조직을 통상의 방법대로 파라핀에 포매한 후, 절편기를 이용하여 4um절편을 만들어 슬라이드에 붙인 후 자일렌으로 파라핀을 제거하였고 함수 과정을 마쳤다. 항원복구 과정으로는 Citrate buffer (pH 6.0)에서 40분간 항온수조에서 중탕하였다. 증류수로 세척한 후, Peroxidase blocking buffer 를 10분간 실온에서 처리하여 내인성 퍼록시다아제를 제거하였다. 이후, 항-SMA 마우스 단클론 항체 (ABCAM, UK) 및 항-VEGF 마우스 단클론 항체를 1:100으로 희석하여 300 ul를 가한 후 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 0.1% Tween 20이 첨가된 TBS 완충액 (TBST)으로 세척한 후 GBI사의 Polink 2 Plus kit 내 mouse enhancer 300 ul로 30분간 실온에서 반응시키고 다시 TBST로 세척하였으며 polymer-HRP용액 300 ul를 가한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. 다시 TBST로 세척한 후 DAB (diaminobenzidine)로 발색시켰다. 이 때 발색 시간은 5분이었으며 세척이 끝난 후 다시 Mayer's hematoxylin으로 1분간 반응시킨 후 TBST에 담가 bluing 과정을 하였다. 세척된 슬라이드를 탈수과정을 위해 알코올과 자일렌을 거친 후 Histomount로 봉입하였다.
본 발명의 실험에서 분석한 모든 실험결과는 3번 반복 실험하였고, 결과수치는 means ± SE으로 나타내었으며, 통계학적 의미는 paired Student's t test으로 결정하였으며, P values < 0.05를 유의미한 것으로 판단하였다.
<실시예 1>
TGF
-
β1에
의한 α-
SMA
mRNA
과발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석
섬유화 과정에서 TGF-β1이 활성화되면 세포 내에서 콜라겐의 생성과 축적이 증가하여 섬유화가 진행되고 조직과 기관의 기능이 상실하게 된다. 또한, 섬유화에 의한 세포 또는 조직이 손상될 때 세포내의 지방과 레티노이드 성분을 잃고 α-SMA(알파 민무늬근육액틴)의 발현이 증가되며 세포의 변화가 초래된다. 따라서 연구자들은 간섬유화 방지를 위한 방법으로 TGF-β1의 발현과 활성을 억제하기 위한 연구가 행해지고 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 섬유화 유도에 작용하는 TGF-β1에 의한 α-SMA의 발현에 영향을 미치는지 여부를 분석하였다. 이를 위해 인간 피부섬유아세포주 HS27 및 인간 간성상세포주인 HHStec (human hepatic stellate cell)에 TGF-β1을 처리한 후, 황칠나무 추출물을 각각 처리한 다음, 세포 내에서 α-SMA의 발현정도를 PCR 및 웨스턴블럿으로 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, TGF-β1 처리 시 HS27 세포주 및 HHStec 세포주 모두에서 현저하게 증가된 α-SMA의 발현정도가 본 발명의 황칠나무 추출물 처리에 의해 효과적으로 억제되는 것으로 나타났으며, 특히 헥산 추출물이 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물 추출물(분획물)에 비해 우수한 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.
또한 본 발명자들은 황칠나무의 헥산추출물 처리 농도를 다양하게 하여 HS27 세포주 및 인간 간성상세포주인 HHStec에 처리한 후, TGF-β1에 의해 증가된 a-SMA의 발현정도를 어느 정도 억제하는 효과가 있는지 PCR 및 웨스턴블럿으로 분석하였고, 나아가 TGF-β1 자체의 발현에도 영향을 미치는지 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 2가지 세포주 모두에서 처리 농도 의존적으로 TGF-β1에 의해 증가된 α-SMA의 발현이 현저하게 억제되는 것으로 나타났으며, TGF-β1의 발현도 추출물의 처리 농도 의존적으로 억제되는 것으로 나타났다(도 4 참조).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 섬유화촉진 사이토카인인 TGF-β1 및 TGF-β1에 의해 촉진되는 섬유화 관련 인자들의 발현 및 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 황칠나무의 헥산분획물이 가장 강한 항섬유화 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 2>
CTGF
및
FN
-EDA에 대한 황칠나무 추출물의 영향분석
TGF-β1은 CTGF의 생산, 작용 및 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, CTGF의 과발현은 ECM의 축적을 유발시키고 간성상세포의 증식과 생존 및 콜라겐 생산을 자극하여 간섬유화를 유발하는 것으로 알려져 있다. ECM의 성분들 중에서 FN (fibronectin) 및 이의 다양한 이성질체인 FN-EDA (fibronectin extra domain A)은 상처 치유와 같은 비정상적인 상태에서 생산되며, 이들 역시 TGF-β1에 의해 발현이 증가된다.
이에 본 발명자들은 이러한 CTGF 및 FN-EDA이 황칠나무 추출물 처리 시 TGF-β1에 의한 발현증가가 억제되는 효과가 있는지 확인하기 위해, HS27 세포주 및 인간 간성상세포주인 HHStec에 황칠나무 추출물을 농도별로 처리한 후 세포내에서 CTGF 및 FN-EDA의 발현 정도를 PCR 및 웨스턴블럿으로 분석하였다.
분석 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 추출물은 TGF-β1에 의한 CTGF 및 FN-EDA 발현증가를 효과적으로 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났으며, 특히 헥산추출물의 경우 HS27 세포주에서 CTGF의 억제효과는 2 ug/ml의 농도에서 5배 억제를 나타냈고, 10 ug/ml의 농도에서는 7배, 50 ug/ml의 농도에서는 14배의 억제 효과를 나타냈으며, HHStec 세포주에서는 2 ug/ml 농도에서 9배의 억제 효과를, 10 ug/ml 농도에서 18배의 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명의 황칠나무 헥산추출물은 HS27 및 HHStec 세포주에 FN-EDA를 모두 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
콜라겐 발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석
TGF-β1은 ECM 행성을 위한 주요 자극제로 알려져 있고, TGF-β1 siRNA 으로 TGF-β1의 발현을 억제할 경우, 섬유세포의 활성을 억제하고 간에서는 콜라겐의 축적과 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 콜라겐 IA1 및 3A의 발현을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, HS27 세포주 및 HHStec 세포주에 대해 TGF-β1 및 각 농도별 황칠나무 추출물을 처리하고 세포 내에서 발현되는 콜라겐 타입I 및 타입3의 mRNA 발현양을 분석하였으며, 또한 생성된 콜라겐의 양을 분석하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물은 처리 농도 의존적으로 콜라겐 타입I 및 타입3의 발현을 모두 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났고, TGF-β1에 의해 유도되는 용해성 콜라겐의 생성 및 분비도 억제하는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
세포 이동에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석
본 발명의 황칠나무 추출물이 세포이동에 영향을 주는지 확인하기 위해, 상기 기술된 세포 이동 분석에 따라 실험을 수행하였다.
분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 추출물은 스크래치에 의한 상처를 세포 이동을 통해 회복되어지는 것으로 나타났으며, 헥산추출물 50ug/ml 농도 처리 시 약 50%정도 회복력을 보이는 것으로 나타났다.
<
실시예
5>
황칠나무 추출물의
간섬유화
초기 발생 억제효과
반응성 활성산소종(ROS)은 간의 쿠퍼세포(kupffer cell)로부터 섬유화 촉진 사이토카인의 생성을 자극할 뿐만 아니라, 간성상세포의 활성화를 통한 섬유증을 초기 유발시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항산화 활성은 간섬유증의 초기유발과 진행을 억제할 수 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 ROS를 억제하는 기능이 있는지 확인하기 위해 항산화 활성여부 실험을 상기 기술된 <6> DPPH 활성 소거능 분석 및 <7> DCFH-DA 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 추출물은 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물은 매우 강한 DPPH 소거능을 가지는 것으로 확인되었으며, 에틸아세테이트 분획물은 가장 강력한 DCFH-DA 소거능을 보였으며, 이러한 소거능은 비타민 C와 silymarin에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다. silymarin은 알콜성 간질환, 간강화, 간독성과 같은 간질환의 치료제로 알려져 있으며, 항산화, 항섬유, 항염증 및 간재생 효과를 갖는 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 황칠나무 추출물은 이러한 silymarin 보다 더 우수한 항산화 활성을 나타내고 있어, 기존 약물에 비해 더 월등한 간섬유증 예방, 치료 및 개선 효과가 있을 수 있다.
<실시예 6>
황칠나무 추출물의 섬유화 관련 인자들의 발현에 미치는 영향분석
<6-1>
인간진피
섬유아세포(HS27)에서
MMP1
,
MMP2
,
MMP9
,
TNF
-α,
TIMP1의
발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석
HS27 세포주에 TGF-β1을 처리한 후, 본 발명의 황칠나무 추출물을 처리한 다음, 상기 세포주에서 발현되는 MMP1, MMP2, MMP9, TNF-α, TIMP1의 발현양을 RT-PCR을 통해 분석하였는데, 이때 MMP2 및 MMP9는 자이모그래피 분석을 수행하여 분석하였다.
상기 MMP1은 TGF-β1의 타겟 유전자로서 TGF-β1에 의해 하향 조절되는 인자로서 간섬유증 치료제 타겟이 되는 분자로 알려져 있다. TNF-α는 섬유화조직의 resolution에 관여하여 세포사멸을 초래하는 인자로 알려져 있으며 TGF-β1에 의해 발현이 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 이들 인자의 발현 및 활성을 촉진시키게 되면 TGF-β1에 의한 섬유화 진행을 억제할 수 있다. 간성상세포의 활성화에 영향을 주는 TIMP1의 발현을 억제할 경우, 간섬유화 진행을 억제할 수 있어, 본 발명의 황칠나무 추출물의 TIMP1 발현에 미치는 영향도 분석하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 본 발명의 황칠나무 헥산분획 추출물은 TGF-β1에 의해 발현이 감소된 MMP1 및 TNF-α의 발현을 증가시키는 작용이 있는 것으로 나타났고, TGF-β1에 의해 발현이 증가된 TIMP1은 억제하는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명자들은 섬유화 촉진인자인 MMP2 및 MMP9의 발현에 대한 황칠추출물의 활성을 분석한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 TGF-β1에 의해 발현이 증가된 MMP2 및 MMP9을 농도 의존적으로 발현 억제시키는 것으로 나타났다.
<6-2> 인간 간성상세포(HHstec)에서 MMP1 및 MMP2의 발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석
상기 <6-1>의 실험에서 실험대상 세포주를 인간 간성상세포(HHstec)로 하였고 분석실험을 동일하게 수행하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, MMP1의 발현은 본 발명의 황칠나무 헥산분획 추출물의 처리 농도 의존적으로 발현이 증가하는 것으로 나타났고, 발현 증가 정도는 양성대조군인 Silymarin 처리 군에 비해 더 우수한 것으로 나타났다. 또한, MMP2 발현 분석에서는 본 발명의 황칠나무 헥산분획 추출물 처리군이 TGF-β1에 의해 증가된 MMP2의 발현을 억제하는 것으로 나타났으며, 특히 10 ug/ml 농도 처리 시 가장 효과적인 억제율을 보였다.
<
실시예
7> 황칠나무 에탄올 추출물의
항섬유화
효능분석
<7-1> 에탄올 농도에 따른 황칠나무 추출물의 DPPH 라디칼 및 DCFH-DA 라디칼 소거능 분석
에탄올 농도를 각각 달리하여 제조한 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물(30%, 50% 및 70% 에탄올 처리)에 대해 DPPH 라디칼 및 DCFH-DA 라디칼 소거능 분석을 수행하였다.
그 결과, 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 에탄올 농도를 달리하여 수득한 황칠나무 추출물의 경우, 특히 30% 에탄올 추출물이 50% 및 70% 에탄올 추출물에 비해 DPPH 라디칼 및 DCFH-DA 라디칼 소거능이 더 우수한 것으로 나타났다. 또한, 15-PGDH의 억제 효과도 30% 에탄올 추출물 군이 다른 군에 비해 더 우수한 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명자들은 에탄올을 이용하여 황칠나무 추출물을 수득할 경우, 우수한 항섬유화 효능을 도출하기 위해서는 30% 에탄올을 사용하는 것이 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
<7-2> 간 성상세포에서 황칠나무 에탄올 추출물의 α-SMA 및 CTGF 발현억제 활성분석
본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물에 대한 항섬유화 활성 분석을 위해, 간세포 조직 손상에 의한 섬유화 발병 시, 발현이 증가되는 것으로 알려진 α-SMA (α-smooth muscle actin) 및 CTGF (connective tissue growth factor)의 발현양이 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물 처리시 변화가 있는지 분석하였다. 이를 위해 황칠나무 에탄올 추출물을 각 농도별(20, 40, 80 ug/ml)로 간성상세포(HHstec)에 처리한 후, PCR 분석을 통해 상기 세포내에서 발현된 α-SMA 및 CTGF의 발현양을 측정하였다.
분석 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물(30% 에탄올 추출물)을 처리한 군이 상기 추출물을 처리하지 않은 대조군(CTL)에 비해 α-SMA 및 CTGF의 발현양이 현저하게 억제되는 것으로 나타났고, 30% 에탄올 추출물을 40 ug/ml의 농도로 처리할 경우 가장 효과적임을 확인하였다. 이는 20 ug/ml에 비해 40 ug/ml로 처리한 경우 2배 이상의 억제 효과를 보인 반면, 80 ug/ml 농도로 처리한 군은 40 ug/ml와 비슷한 효과를 보이는 것으로 나타났다.
<7-3> 황칠나무 에탄올 추출물의 간성상세포 스크래치 회복 테스트
본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물에 대한 세포 스크래치 회복 테스트를 수행하였다. 이를 위해 간 성상세포 배양 시 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물(30% 에탄올 추출물)을 세포 배양배지에 첨가하여 12시간 배양 한 후, 세포에 스크래치를 내고 스크래치 상처의 거리를 측정하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 황칠나무 에탄올 추출물 처리 농도 의존적으로 스크래치 상처의 거리가 증가하는 것으로 나타났으며, 2회 반복실험 결과 동일한 결과를 보였다. 이상의 결과는 황칠나무 에탄올 추출물이 간성상세포의 증식 및/또는 이동을 억제한다는 것을 의미한다.
<7-4> 피부 섬유아세포에서 황칠나무 에탄올 추출물의 α-SMA 및 CTGF 발현억제 활성분석
본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물(DMEE)을 피부섬유아세포인 HS27 세포에 처리한 후, 황칠나무 에탄올 추출물이 a-SMA mRNA 발현에 미치는 영향을 측정한 결과, 추출물의 처리농도 20, 40 ug/ml 및 80 ug/ml에서 α-SMA mRNA 발현을 억제하는 것으로 확인되었고, CTGF mRNA 발현에 미치는 영향을 측정한 결과, 황칠나무 에탄올 추출물의 처리농도 20 및 40 ug/mL에서 CTGF mRNA 발현을 억제하는 활성이 있음을 보였으나, 보다 높은 농도인 80 ug/ml에서는 효과가 없는 것으로 나타났다(도 17 참조).
<7-
5> 황칠나무
에탄올 추출물의 피부 섬유아세포
스크래치
회복 테스트
황칠나무 에탄올 추출물(DMEE)을 피부 섬유아세포인 HS27 세포에 24시간 처리한 후, 스크래치(scratch) 회복 여부를 테스트한 결과, 스크래치 상처의 거리가 농도 의존적으로 증가한 것으로 나타났다(도 18 참조). 이상의 결과는 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물이 피부섬유아세포의 증식 및/또는 이동을 억제한다는 것을 의미한다.
<
실시예
8> 동물실험을 통한 황칠나무 에탄올 추출물의
항섬유화
활성 분석
나아가 본 발명자들은 섬유화 질환이 유발된 흰쥐 동물 모델을 대상으로 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물의 처리가 섬유화 질환의 개선 또는 치료 효과가 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 하기 표 4와 같이 쥐를 대상으로 한 실험군을 준비하여 하기 실험들을 수행하였다.
<8-1> 체중 측정
상기와 같이 총 4개 그룹의 흰쥐의 체중을 측정하고 이를 평균내어 각 그룹의 체중을 분석하였다. 참고로, 항섬유화 질환이 유발되면 체중 감소 현상이 나타나므로 이러한 체중 감소 현상을 본 발명의 추출물이 억제할 수 있는지 확인하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 항섬유증 유발물질인 CCl4를 처리한 군은 대조군에 비해 체중 감소 현상이 두드러지게 발생한 것으로 나타난 반면, 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물(DMEE)을 처리한 군은 CCl4로 인한 체중 감소를 효과적으로 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났고, 양성대조군인 실리마린을 전처한 군에 비해서도 체중 감소 억제 효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
<8-2> 사염화탄소에 의한
간조직
손상 동물모델에서 황칠나무 에탄올 추출물 투여에 따른
간지표
분석
상기 <8-1>에서 사용한 흰쥐 동물 실험군을 대상으로 혈액을 채취하여, 혈청 중에 함유된 간 손상 지표인 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase, ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(aspartate aminotransferase, AST)의 함량을 측정하였다. 간 손상 지표로 알려진 아미노산 전이효소인 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(alanine aminotransferase, ALT)와 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(aspartate aminotransferase, AST)는 간 조직의 파괴가 진행됨에 따라 혈중으로 유리되어 높은 활성을 나타낸다고 알려져 있으며, 특히 ALT는 간에 많이 존재하며, AST는 심장 간, 골격근에 많아 그 특이성이 인정되고 있다.
분석 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소(CCl4)를 처리한 군은 대조군에 비해 ALT 및 AST가 혈중에 유리되어 함량이 높은 활성을 보임으로써 간 손상이 유도된 것으로 나타난 반면, 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물을 전처리한 후, 사염화탄소(CCl4)를 처리한 군은 CCl4에 의해 증가된 ALT 및 AST의 수준을 현저하게 감소시키는 것으로 나타나 사염화탄소에 의한 간손상을 개선 및 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
<8-3> 사염화탄소에 의한
간조직
손상 동물모델에서 황칠나무 에탄올 추출물 투여에 따른
간조직의
개선 효과 분석
상기 <8-1>에서 사용한 흰쥐 동물 실험군을 대상으로 간 조직을 채취한 후, sirius red 염색을 통해 간 콜라겐 발현을 분석하였다.
분석 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소(CCl4)를 처리한 군(CMC+CCl4)은 사염화탄소(CCl4)를 처리하지 않은 군(CMC+oil)에 비해 간세포의 심한 소포화 현상이 발생한 것으로 나타났고, 연속적인 콜라겐 섬유 격막이 중심정맥과 중심정맥 사이, 중심정맥과 문맥사이를 상호 연결하면서 간 섬유화 현상이 발생한 것으로 나타났다. 한편, 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물을 처리한 군(DMEE+CCl4)은 사염화탄소(CCl4)를 처리한 군에 비해 간세포의 소포화 변화가 감소되었고, 혈관주변으로 방사되는 콜라겐 섬유 격막이 약하고 불연속적으로 관찰됨으로써 사염화탄소(CCl4)에 의한 간 섬유화 현상이 개선된 것으로 나타났으며, 이러한 개선 효과는 양성 약물인 silymarin (SM)을 처리한 군과 유사하게 나타났다.
또한, 상기 실험 동물군으로부터 수득한 간 조직을 대상으로 VEGF에 대한 면역조직화학염색 방법을 수행하였는데, 이는 간섬유화 유발 시 VEGF의 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 추출물이 간 세포 또는 간 조직에서 VEGF의 발현을 억제하는 활성이 있는지 분석하였다.
그 결과 도 22에 나타낸 바와 같이, 사염화탄소(CCl4)를 처리하지 않은 대조군(CMC+oil)에 비해 사염화탄소(CCl4)를 처리한 군은 간 조직에서 VEGF의 발현이 증가되어 있는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 황칠나무 에탄올 추출물은 VEGF의 발현을 약간 감소시켰으나, 양성대조군(SM 약물처리군)은 사염화탄소(CCl4)에 의해 증가된 VEGF의 발현이 오히려 증가 있는 것으로 나타났다. 이 같은 사실은 황칠나무 에탄올 추출물이 SM과 비교시 더 강력한 효과를 보이거나 VEGF의 발현의 변화에 미치는 기전이 서로 다른 것으로 보인다.
그러므로 상기와 같은 실험결과들을 통해, 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 섬유화에 관여된 인자인 콜라겐과 같은 세포외기질의 발현 및 분비를 조절하여 섬유화를 효과적으로 예방, 개선, 억제 및 치료할 수 있음을 알 수 있었으며, 특히 황칠나무 잎의 에탄올 추출물이 SM과 비교시 더 효과적인 항섬유화 활성이 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 황칠나무 추출물은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서,상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서,상기 극성용매 가용추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서,상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 황칠나무 추출물은 TGF-β1 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 섬유화 질환은 상기 섬유화 질환은 과증식형반흔, 케로이드, 경피증, 복막유착증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 골격근 섬유증, 관절막 섬유증, 골수섬유증 및 이형성 증후군 및 당뇨성 망막증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
- 제8항에 있어서,상기 황칠나무 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트으로 이루어진 군 중에서 선택되는 용매를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
- 제8항에 있어서,상기 섬유화 질환은 과증식형반흔, 케로이드, 경피증, 복막유착증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 골격근 섬유증, 관절막 섬유증, 골수섬유증 및 이형성 증후군 및 당뇨성 망막증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
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