WO2020091463A1 - 분리된 미토콘드리아를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

분리된 미토콘드리아를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2020091463A1
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pharmaceutical composition
tendon
tnf
mitochondria
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최용수
이지민
김미진
민경훈
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차의과학대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tendinitis comprising isolated mitochondria as an active ingredient.
  • Tendinosis is a disease caused by a degenerative change in collagen in the tendon tissue that connects the ankle joint and muscle. For tendinitis, when tendon tissue is damaged, rest is not given time to recover the tendon tissue, and repetitive sprains or excessive use do not restore tendon tissue. In addition, tendinosis is an abnormal alignment of collagen fibers in the tendon tissue, fibrinoid or myxoid degeneration of collagen, fibrosis, etc., and weakened tendon tissue may also rupture.
  • Inflammatory response is emerging as a major cause of tendinitis.
  • Cytokines which are involved in inflammatory reactions, play an important role in wound healing and damage to soft tissues such as muscles, tendons, and blood vessels.
  • the expression of inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, VEGF, and TGF- ⁇ in tenocytes is closely related to tissue function in vivo.
  • TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ are mitochondrial DNA It has been reported that it causes damage and induces apoptosis in chondrocytes (Neal L. Millar et al ., Scientific Reports volume 6, Article number: 27149, 2016).
  • MMP matrix metalloprotease
  • the tendonitis is clinically very common, but there is no clear treatment.
  • Current treatments for tendonitis include conservative treatments such as stretching, physical therapy, taking anti-inflammatory drugs, steroid injections, extracorporeal shock wave therapy, and platelet-rich plasma injections, but most are scientifically based. There is very little. Treatment with steroid injections is mainly performed, but studies have reported that steroid injections destroy soft tissue or reduce muscle strength. In addition, there is a limitation in the scope of steroid treatment in that it is not possible to see the anti-inflammatory effect of steroid injection when it is not accompanied by inflammation. If conservative treatment fails, surgical treatment can be performed, but surgery is a treatment for symptom relief at a level that removes the denatured part, sutures the remaining part, or transplants the other tendon around it, and is not a fundamental solution.
  • Republic of Korea Patent Application No. 2016-0091029 discloses a composition comprising autologous and allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells and a method for manufacturing the same for the treatment of tendon or ligament injury.
  • the above document discloses that when a composition containing autologous and allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells is administered, it secretes collagen, extracellular matrix (ECM) protein, and various growth factors, but the composition is administered once.
  • ECM extracellular matrix
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating tendinosis and a method for treating tendinosis using the same.
  • an aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tendinitis comprising mitochondria as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating tendinosis comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition comprising mitochondria as an active ingredient for the treatment of tendinitis.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition comprising mitochondria as an active ingredient for preparing a medicament for the treatment of tendinitis.
  • the pharmaceutical composition comprising the mitochondria of the present invention as an active ingredient can restore the ATP synthesizing ability and antioxidant capacity of tendon cells damaged due to an inflammatory reaction to the level of normal tendon cells.
  • the expression of Bax, an apoptosis factor can be suppressed, and the expression of the apoptosis inhibitor, Blc-2, can be increased.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when the pharmaceutical composition of the present invention is administered to damaged tendon cells, the expression of MMP1 can be restored to the level of normal tendon cells. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be usefully used to prevent or treat tendinitis.
  • 1 is a view comparing the expression level of apoptosis-related factors of tendon cells after treating TNF- ⁇ in each cell by concentration.
  • FIG. 2 is a view showing the amount of BID protein expression of tendon cells after treatment of TNF- ⁇ in each cell by concentration.
  • 3 is a view showing the Bax / Bcl-2 level of tendon cells after TNF- ⁇ is treated for each cell by concentration.
  • FIG. 4 is a view showing Bcl-2 / Bax levels of tendon cells after treating TNF- ⁇ by concentration in the tendon cells.
  • FIG. 5 is a view comparing the expression level of apoptosis-related factors of tendon cells over time after treatment of TNF- ⁇ on tendon cells.
  • FIG. 6 is a view showing the amount of BID protein expression of tendon cells over time after TNF- ⁇ treatment to tendon cells.
  • FIG. 7 is a diagram showing Bax / Bcl-2 levels of tendon cells over time after TNF- ⁇ treatment to tendon cells.
  • FIG. 8 is a view showing Bcl-2 / Bax levels of tendon cells over time after TNF- ⁇ treatment on tendon cells.
  • FIG. 9 is a view showing the fluorescence intensity of DCF in tendon cells after DCFH-DA treatment on TNF- ⁇ -treated tendon cells.
  • FIG. 10 is a view showing the amount of ATP in tendon cells treated with TNF- ⁇ .
  • FIG. 11 is a diagram of fluorescence staining of tendon cells with Mitotracker green, Mitotracker CMXRos Red, and DAPI after treatment of TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria on the tendon cells.
  • FIG. 12 is a view showing the change in fluorescence intensity of DCF in tendon cells after DCFH-DA treatment on TNF- ⁇ , hydrogen peroxide, vitamin C or TNF- ⁇ and healthy mitochondrial treated tendon cells.
  • FIG. 13 is a diagram showing DCF fluorescence intensity of tendon cells after DCFH-DA treatment on tendon cells treated with TNF- ⁇ , hydrogen peroxide, vitamin C, TNF- ⁇ and healthy mitochondria or TNF- ⁇ and damaged mitochondria.
  • FIG. 14 is a diagram showing the amount of ATP change in tendon cells treated with TNF- ⁇ , hydrogen peroxide, TNF- ⁇ , and healthy mitochondria or TNF- ⁇ and damaged mitochondria.
  • FIG. 15 is a diagram showing the amount of ATP in tendon cells treated with TNF- ⁇ , hydrogen peroxide or TNF- ⁇ and mitochondria.
  • FIG. 16 is a view showing mitochondrial membrane potential in tendon cells treated with TNF- ⁇ , CCCP or TNF- ⁇ and healthy mitochondria.
  • 17 is a diagram showing mitochondrial dehydrogenase activity in tendon cells treated with TNF- ⁇ , vitamin C, TNF- ⁇ and healthy mitochondria or TNF- ⁇ and damaged mitochondria.
  • FIG. 18 is a view comparing the expression level of apoptosis-related factors of tendon cells 12 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria are treated on tendon cells.
  • FIG. 19 is a view comparing the expression level of apoptosis-related factors of tendon cells after 24 hours of treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • 20 is a view showing the amount of BID protein expression in tendon cells after 12 or 24 hours after treatment of TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 21 is a diagram showing Bax / Bcl-2 levels of tendon cells after 12 or 24 hours after treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 22 is a view showing Bcl-2 / Bax levels of tendon cells 12 or 24 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria were treated with tendon cells.
  • FIG. 23 is a view comparing the expression level of MMP1 protein of tendon cells 12 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria are treated on tendon cells.
  • FIG. 24 is a view comparing the expression level of MMP1 protein in tendon cells 24 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ treated with healthy mitochondria in tendon cells.
  • 25 is a view showing the amount of MMP1 protein expression in tendon cells after 12 or 24 hours after treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 26 is a diagram showing the expression level of Collagen 1 protein in tendon cells after 24 hours of treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 27 is a view comparing the expression level of Collagen 1 protein in tendon cells after 24 hours after treating TNF- ⁇ or TNF- ⁇ with healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 28 is a diagram showing the expression level of Collagen 1 protein in tendon cells 24 hours after treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • 29 is a view comparing the expression level of Collagen 1 protein in tendon cells after 24 hours after treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and damaged mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 30 is a view showing the expression level of Collagen 1 protein in tendon cells after 24 hours after treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and damaged mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 31 is a view comparing the expression level of Scleraxis protein of tendon cells after 24 hours of treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 32 is a diagram comparing the expression level of Tenomodulin protein in tendon cells after 24 hours of treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 33 is a graph comparing the expression levels of Fis1, Drp1 and MFN2 proteins in tendon cells after 24 hours of treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 34 is a diagram showing the expression level of Fis1 protein in tendon cells 24 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria were treated to tendon cells.
  • FIG. 35 is a diagram showing the expression level of Drp1 protein in tendon cells 24 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria were treated to tendon cells.
  • FIG. 36 is a diagram showing the expression level of MFN2 protein in tendon cells after 24 hours after treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 37 is a diagram showing the expression level of IL-1 ⁇ in tendon cells 24 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria were treated with tendon cells.
  • FIG. 38 is a diagram showing the expression level of IL-6 in tendon cells 24 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria were treated with tendon cells.
  • 39 is a diagram comparing the expression level of p-NF-kB protein of tendon cells after 24 hours of treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • 40 is a diagram showing the expression level of p-NF-kB protein in tendon cells 24 hours after TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria are treated to tendon cells.
  • FIG. 41 is a diagram comparing the expression level of a gene related to signal transduction in tendon cells after 24 hours of treatment with TNF- ⁇ or TNF- ⁇ and healthy mitochondria in tendon cells.
  • FIG. 42 is a diagram of fluorescence staining of dry tissue with Mitotracker green, Mitotracker CMXRos Red and DAPI after collagenase 1 and healthy mitochondria were injected into the dry tissue.
  • FIG. 43 is a diagram comparing the expression levels of Fis1, Drp1, and MFN2 proteins in tendon tissue after 2 weeks of treatment with collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria in the tendon tissue.
  • FIG. 44 is a diagram showing the expression level of Fis1 protein in tendon tissue 2 weeks after collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria are treated in tendon tissue.
  • FIG. 45 is a diagram showing the expression level of Drp1 protein in tendon tissue after 2 weeks of treatment with collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria in the tendon tissue.
  • FIG. 46 is a diagram showing the expression level of MFN2 protein in tendon tissue 2 weeks after collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria are treated in tendon tissue.
  • FIG. 47 is a diagram comparing the expression levels of TNC and MMP1 proteins in tendon tissue after 2 weeks of treatment with collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria in the tendon tissue.
  • TNC protein is a diagram showing the expression level of TNC protein in tendon tissue after 2 weeks of treatment with collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria in the tendon tissue.
  • FIG. 49 is a diagram showing the expression level of MMP1 protein in tendon tissue 2 weeks after collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria are treated in tendon tissue.
  • FIG. 50 is a diagram showing collagenase content of collagense 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria in dry tissue after 2 weeks, through hydroxyproline assay.
  • FIG. 51 is a diagram showing the expression level of TNF- ⁇ in tendon tissue 2 weeks after collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria are treated in tendon tissue.
  • FIG. 52 is a diagram showing the expression level of IL-1 ⁇ in tendon tissue after 2 weeks of treatment with collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria in the tendon tissue.
  • FIG. 53 is a diagram showing the expression level of IL-6 in tendon tissue 2 weeks after collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria are treated in the tendon tissue.
  • FIG. 54 is a diagram showing the expression level of p-NF-kB protein in tendon tissue after 2 weeks of treatment with collagenase 1 or collagenase 1 and healthy mitochondria in the tendon tissue.
  • FIG. 55 is a view comparing tendon cell proliferation rates after 24 hours after treatment of foreign healthy mitochondria with tendon cells derived from patients with tendonitis by concentration.
  • FIG. 57 is a diagram showing the expression level of TNC protein in tendon cells 24 hours after treatment of foreign healthy mitochondria with tendon cells derived from patients with tendinitis by concentration.
  • FIG. 58 is a view showing the expression level of TNMD protein in tendon cells after 24 hours after treatment of foreign healthy mitochondria with tendon cells derived from patients with tendinitis by concentration.
  • FIG. 59 is a diagram showing the expression level of COL1 protein in tendon cells after 24 hours after treatment of foreign healthy mitochondria with tendon cells derived from patients with tendinitis by concentration.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of tendinitis comprising mitochondria as an active ingredient.
  • active ingredient refers to a component that exhibits activity alone or in combination with an adjuvant (carrier) that is not active in itself.
  • the mitochondria may be obtained from mammals, or may be obtained from humans. Specifically, the mitochondria may be isolated from cells or tissues. For example, the mitochondria may be obtained from somatic cells, germ cells or stem cells. In addition, the mitochondria may be normal healthy mitochondria obtained from cells in which the biological activity of mitochondria is normal. In addition, the mitochondria may be cultured in vitro.
  • the mitochondria may be obtained from autologous, allogenic or xenogenic.
  • autologous mitochondria means mitochondria obtained from tissues or cells of the same individual.
  • allogeneic mitochondria refers to mitochondria obtained from individuals belonging to the same species as individuals and having different genotypes for alleles.
  • heterologous mitochondria means mitochondria obtained from an individual belonging to a different species from the individual.
  • the somatic cells may be muscle cells, hepatocytes, nerve cells, fibroblasts, epithelial cells, adipocytes, bone cells, white blood cells, lymphocytes, platelets or mucosal cells.
  • the germ cells are cells that divide meiosis and somatic cells, and may be sperm or eggs.
  • the stem cells may be any one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, adult stem cells, dedifferentiated stem cells, embryonic stem cells, bone marrow stem cells, neural stem cells, limbal stem cells, and tissue-derived stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be any one selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane and placenta.
  • the term "healthy mitochondria” used in the present invention means mitochondria extracted from normal cells.
  • the term “damaged mitochondria” used in the present invention means a mitochondria whose ATP synthesis function is inhibited.
  • the damaged mitochondria refer to mitochondria at a level that suppresses the mitochondrial ATP synthesis function in cells by treating ATP synthesis inhibitors such as oligomycin on the cells.
  • the mitochondria can be separated through various known methods, for example, using a specific buffer solution or using a potential difference and a magnetic field.
  • the mitochondrial separation can be obtained by crushing and centrifuging the cells in terms of maintaining mitochondrial activity.
  • the cells are cultured, and the pharmaceutical composition containing these cells is firstly centrifuged to produce pellets, the pellets are resuspended in a buffer solution, homogenized, and the homogenized solution is prepared. It may be performed as a step of preparing a supernatant by secondary centrifugation and purifying the mitochondria by performing a third centrifugation of the supernatant. At this time, it is preferable in terms of maintaining cell activity that the time for the second centrifugation is performed is shorter than the time for the first and third centrifugation, and the third centrifugation in the first centrifugation. You can increase the speed as you go.
  • the first to third centrifugation may be carried out at a temperature of 0 °C to 10 °C, preferably at a temperature of 3 °C to 5 °C.
  • the time at which the centrifugation is performed may be performed for 1 minute to 50 minutes, and may be appropriately adjusted according to the number of centrifugation and the content of the sample.
  • the first centrifugation may be performed at a rate of 100 ⁇ g to 1,000 ⁇ g, or 200 ⁇ g to 700 ⁇ g, or 300 ⁇ g to 450 ⁇ g.
  • the second centrifugation may be performed at a rate of 1 ⁇ g to 2,000 ⁇ g, or 25 ⁇ g to 1,800 ⁇ g, or 500 ⁇ g to 1,600 ⁇ g.
  • the third centrifugation may be performed at a rate of 100 ⁇ g to 20,000 ⁇ g, or 500 ⁇ g to 18,000 ⁇ g, or 800 ⁇ g to 15,000 ⁇ g.
  • mitochondria may be included at a concentration of 0.1 ⁇ g / ml to 500 ⁇ g / ml, 0.2 ⁇ g / ml to 450 ⁇ g / ml or 0.5 ⁇ g / ml to 400 ⁇ g / ml.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is 0.01 mg / kg to 5 mg / kg, 0.1 mg / kg to 4 mg / kg or 0.25 mg / kg to 2.5 mg / kg once based on the body weight of the subject to be administered.
  • An amount of mitochondria can be administered. That is, it is most preferable in terms of cell activity that the pharmaceutical composition is administered with mitochondria in an amount in the above range based on the body weight of the individual who caused the tendinitis.
  • the pharmaceutical composition may be administered 1 to 10 times, 3 to 8 times, or 5 to 6 times, and preferably 5 times. At this time, the administration interval may be 1 to 7 days or 2 to 5 days intervals, preferably 3 days interval.
  • the pharmaceutical composition may be subject to tendinopathy, or may be administered to humans or other mammals suffering from such diseases or diseases.
  • the pharmaceutical composition may be characterized by inhibiting inflammation of tendon tissue.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that it is applied to a patient who is damaged by collagen of tendon tissue or a patient whose tendon tissue is chronic degenerative.
  • the pharmaceutical composition may be characterized by increasing the expression of any one selected from the group consisting of collagen I, TNMD (tenomodulin), Scleraxis, and combinations thereof in patients with tendinitis.
  • the pharmaceutical composition is BH3 (BH3 interacting-domain death agonist), Bax (Bcl-2-associated X protein), MMP1, Fis1 (Mitochondrial fission 1 protein), Drp1 (Dynamin-1-like protein) in patients with tendinitis , MFN2 (Mitofusin-2), IL-1 ⁇ , IL-6, p-NF-kB, TNC (tenascin C), characterized by reducing the expression of any one selected from the group consisting of TNF- ⁇ and combinations thereof It can be done.
  • TNMD tenomodulin
  • Tnmd TNMD
  • Scleraxis used in the present invention is a transcription control factor that is one of the members belonging to the basic helix-loop-helix (bHLH) super family. Progenitor cells expressing early Scleraxis contribute to the formation of tendon tissue and other muscle attachments.
  • bHLH basic helix-loop-helix
  • BID BH3 interacting-domain death agonist
  • the pharmaceutical composition may be an injection that can be administered intravenously, preferably an injection preparation.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is a physically or chemically very stable injection by adjusting the pH using a buffer solution such as an acidic solution or phosphate, which can be used as an injection, in order to secure product stability according to the distribution of an injection formulation. Can be manufactured.
  • a buffer solution such as an acidic solution or phosphate
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include water for injection.
  • the water for injection is distilled water made to dissolve a solid injection or to dilute a water-soluble injection, glucose injection, xylitol injection, D-mannitol injection, fructose injection, physiological saline, dextran 40 injection, dextran 70 injection, amino acid injection, Ringer's solution, lactic acid-ringer's solution, or a phosphate buffer solution having a pH ranging from 3.5 to 7.5, or a sodium dihydrogen phosphate-citric acid buffer solution.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a stabilizer or a dissolution aid.
  • the stabilizing agent may be sodium pyrosulfite or ethylenediaminetetraacetic acid
  • the solubilizing agent may be hydrochloric acid, acetic acid, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate or potassium hydroxide.
  • Another aspect of the present invention may provide a method for preventing or treating tendinosis comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • the individual may be a mammal, preferably a human. Also, the subject may have damaged tendon tissue.
  • the pharmaceutical composition may be administered parenterally, intramuscular, intra-venous, intra-tendinous and the like.
  • the administration can be intravenous or intravenous.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can supply foreign mitochondria having normal activity to the veins of an individual suffering from tendinitis, thereby increasing the activity of cells with reduced mitochondrial function or regenerating abnormal cells with mitochondrial function and , Can be used for the prevention or treatment of tendinitis.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition comprising mitochondria as an active ingredient for the treatment of tendinitis.
  • the pharmaceutical composition is the same as described above.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition comprising mitochondria as an active ingredient for preparing a medicament for the treatment of tendinitis.
  • the pharmaceutical composition is the same as described above.
  • Example 1 Confirmation of the change in expression level of apoptosis factor in tendon cells by TNF- ⁇ treatment concentration
  • a tendon-induced cell model was established using Tenocyte (ZenBio Inc., # TNE-F), a human-derived tendon cell. Dulbecco's modified eagle's medium high glucose medium containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin / streptomycin antibiotic and cultured in a flask / plate coated with Collagen type 1 (Sigma; code: C8919). The culture conditions were maintained so that the passage number of the cells did not exceed 4.
  • Recombinant human TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ) was purchased from Peprotech (No. 300-01A). The purchased recombinant human TNF- ⁇ was dissolved in purified ethanol, adjusted so that the concentration of the stock solution was 20 mg / ml, and stored at a temperature of -4 ° C until use. The final concentration was diluted in the medium and used at a concentration of 10 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml or 500 ng / ml.
  • the cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • the protein separated by electrophoresis was transferred to the PVDF membrane under 0.35 mA condition for 3 hours.
  • the PVDF membrane was used after soaking in pure methanol before use.
  • a blocking buffer was prepared by treating 3% bovine serum albumin (BSA) with Bio Basic Inc., Ontario, Canada in 1X TBS added with 0.1% Tween-20. Thereafter, in order to prevent a non-specific binding reaction, a blocking buffer was treated on the PVDF membrane to react for 1 hour.
  • the primary antibody was diluted 1: 1000, treated with PVDF membrane, and reacted overnight at 4 ° C.
  • Primary antibodies include anti-BID antibodies (Santa Cruz; FL-195), anti-Bax antibodies (Santa Cruz; sc-7480), anti-Bcl2 antibodies (Santa Cruz; sc-7480), and anti- ⁇ -actin antibodies ( Santa Cruz; sc-4778).
  • the PVDF membrane was washed three times for 10 minutes with TBST buffer, diluted 1: 5000 with horseradish peroxidase (HRP) labeled goat anti-mouse (Santa Cruz Biotechnology Inc .; sc-2005), and treated with PVDF membrane.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the reaction was performed at room temperature for 1 hour.
  • induction of color reaction using chemiluminescence detection (ECL component from Pierce ClarityTM and Western ECL Substrate from Bio-Rad) and LAS-4000 (Fuji Photo Film Co. , Tokyo, Japan) to confirm the expression levels of BID, Bax, and Bc12.
  • TNF- ⁇ 10 ng was treated with tendon cells 6, 12 or 24 hours later, apoptosis factor protein BID and The expression level of Bax protein was confirmed by Western blot. Western blot was performed in the same manner as in Example 1.
  • the ROS value generated in the tendon cells was measured using a DCFH-DA probe (2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate).
  • the tendon cells were divided into 96-well-plates so that the number of cells was 5 ⁇ 10 3 per well, and then cultured for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • the cell density of the cultivated tendon cells is about 80% to 90%, after treatment with 10 ng, 50 ng, 100 ng or 500 ng of recombinant human TNF- ⁇ in the tendon cells, 37 C. Incubation was carried out for 24 hours at a temperature of 5% CO 2 .
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • tendon cells were washed once with PBS, and then treated with DCFH-DA at a concentration of 10 mM for 30 minutes. Then, the absorbance was measured at a wavelength of 517 nm to 522 nm using a Synergy Mix Multi-Mode Reader (BioTek Inc.). Data were measured individually and the mean and standard deviation were calculated.
  • the amount of ATP in the dry cells was measured using a CellTiter-Glo luminescence kit (Promega, madison, WI). After treating TNF- ⁇ in an amount of 10 ng, 50 ng, 100 ng, or 500 ng to the dry cells, the cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. temperature and 5% CO 2 conditions. As a positive control, hydrogen peroxide at a concentration of 500 ⁇ M (H 2 O 2 ) was treated with tendon cells. Thereafter, 100 ml of growth medium and 100 ml of CellTiter-Glo luminescence test solution were treated in each well, reacted in a plate shaker for 2 minutes, and further reacted for 10 minutes at room temperature. Thereafter, the luminescence signal was measured using a Luminescene microplate reader.
  • a CellTiter-Glo luminescence kit Promega, madison, WI.
  • the amount of ATP in the tendon cells treated with TNF- ⁇ was measured to be lower than that of normal tendon cells (FIG. 10).
  • the mitochondria in the tendon cells do not function normally.
  • FBS fetal bovine serum
  • DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • mitochondrial function was artificially suppressed by treating mitochondrial ATP synthesis inhibitors (oligomycin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) to umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. After 24 hours, it was washed twice with DPBS. The washed cells were treated with 0.25% TE to obtain cells.
  • mitochondrial ATP synthesis inhibitors oligomycin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • the cells obtained were collected at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / ml using a hemocytometer.
  • the cell line was subjected to the first centrifugation at a rate of 350 xg for 10 minutes at a temperature of about 4 ° C.
  • the obtained pellet was recovered, resuspended in a buffer solution, and then homogenized for 10 to 15 minutes.
  • the composition containing the pellet was subjected to a second centrifugation at a temperature of about 4 ° C. for 3 minutes at a rate of 1,100 ⁇ g to obtain a supernatant.
  • the supernatant was subjected to a third centrifugation at a rate of 12,000 ⁇ g for 15 minutes at a temperature of about 4 ° C. to separate the mitochondria from the cell line.
  • the mitochondria thus obtained were mixed with 100 ⁇ l of water for injection in an amount of 5 ⁇ g or 50 ⁇ g, respectively, and then filled in an insulin syringe.
  • Example 4 healthy mitochondria (Intact MT) extracted from normal umbilical cord-derived stem cells were delivered into target tendon cells.
  • the mitochondrial delivery method was performed through a centrifuge as follows. First, 24 hours before the experiment, the cells were treated such that the concentration of TNF- ⁇ was 10 ng / ml. Before delivery of mitochondria, 1 ⁇ 10 5 dry cells were prepared by mixing with 100 ml of PBS, and then stored on ice. 1 ⁇ g, 5 ⁇ g, or 25 ⁇ g of mitochondria isolated in Example 4 was treated with tendon cells and mixed slowly. Then, it was placed in a centrifuge tube and centrifuged at 1,500 xg for 5 minutes. After centrifugation, impurities were removed by washing twice with PBS. After leaving only the pellet, 100 ml of PBS was added to the mixture, followed by incubation on a plate.
  • Mitotracker Green is a sample that stains mitochondria in tendon cells regardless of the mitochondrial membrane potential.
  • Mitotracker CMXRos Red is a sample that accumulates dependent on the mitochondrial membrane potential and shows the viability of the delivered mitochondria.
  • DCF levels increased in TNF- ⁇ -treated tendon cells DCF levels decreased in TNF- ⁇ and healthy mitochondrial-treated tendon cells by DCF levels in normal tendon cells (control). This is interpreted as a decrease in ROS levels in tendon cells due to the small amount of ROS reacted with DCFH.
  • DCF levels increased in tendon cells treated with TNF- ⁇ and damaged mitochondria FIGGS. 12 and 13).
  • mitochondrial dehydrogenase activity was measured after treatment of healthy mitochondria or damaged mitochondria 1 ⁇ g, 5 ⁇ g, or 25 ⁇ g on tendon cells. As a result, mitochondrial dehydrogenase activity decreased in TNF- ⁇ -treated tendon cells, while mitochondrial dehydrogenase activity increased in TNF- ⁇ and healthy mitochondrial-treated tendon cells. On the other hand, mitochondrial dehydrogenase activity did not increase in tendon cells treated with TNF- ⁇ and damaged mitochondria (FIG. 17).
  • Example 4 To confirm that apoptosis of tendon cells by mitochondrial delivery is suppressed, 10 ng of TNF- ⁇ was treated on the tendon cells, and then cultured at 37 ° C. at 5% CO 2 for 12 hours or 24 hours. Thereafter, 1 ⁇ g, 5 ⁇ g, or 25 ⁇ g of healthy mitochondria isolated in Example 4 was treated with tendon cells. Thereafter, the expression level of apoptosis factor of the tendon cells was confirmed by Western blot. Western blot was performed in the same manner as in Example 1.
  • the expression level of BID protein an apoptosis signal factor, was increased in TNF- ⁇ -treated tendon cells.
  • the BID protein expression level of TNF- ⁇ and healthy mitochondrial treated tendon cells did not show a significant difference from the BID protein expression level of TNF- ⁇ treated tendon cells (FIGS. 18 to 20).
  • Bcl-2 an apoptosis inhibitor
  • MMP1 protein expression was significantly increased in TNF- ⁇ -treated tendon cells. This indicates an imbalance in the proteolytic enzymes of tendon cells.
  • the expression level of MMP1 protein in TNF- ⁇ and healthy mitochondria-treated tendon cells was significantly reduced compared to the expression level of MMP1 protein in TNF- ⁇ -treated tendon cells, and there was a significant difference from the expression level of MMP1 protein in normal tendon cells. Not shown (FIGS. 23 to 25).
  • collagen 1 protein expression was significantly decreased in TNF- ⁇ -treated tendon cells. This indicates the breakdown of the stromal proteins of the tendon cells.
  • the expression level of Collagen 1 protein in TNF- ⁇ and healthy mitochondria-treated tendon cells was significantly increased compared to the expression level of Collagen 1 protein in TNF- ⁇ -treated tendon cells.
  • the expression level of Collagen 1 protein in TNF- ⁇ and damaged mitochondria-treated tendon cells did not show a significant difference from the expression level of Collagen 1 protein in TNF- ⁇ -treated tendon cells. Through this, it was confirmed that the balance of matrix metal-decomposing proteins is maintained in healthy mitochondrial-transferred tendon cells (FIGS. 26 to 30).
  • Example 4 After treatment with 1 ⁇ g, 5 ⁇ g, or 25 ⁇ g of healthy mitochondria isolated in Example 4 to the dry cells, the amount of Scleraxis and Tenomodulin protein expression of the dry cells was measured by Western blot.
  • Western blot was performed in the same manner as in Example 1, and the primary antibodies used were anti-Scleraxis antibody (Abcam; ab58655) and anti-Tenomodulin antibody (Abcam; ab203676).
  • Tenomodulin protein expression was significantly decreased in TNF- ⁇ -treated tendon cells.
  • the expression level of Tenomodulin protein in tendon cells treated with TNF- ⁇ and healthy mitochondria was significantly increased compared to the expression level of Tenomodulin protein in tendon cells treated with TNF- ⁇ .
  • the expression level of Tenomodulin protein in tendon cells treated with 25 ⁇ g of healthy mitochondria did not show a significant difference from the expression level of Tenomodulin protein in the normal group (FIG. 32).
  • TNF-a 10 ng was treated on the tendon cells, and then cultured for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 conditions. After treating 1 ⁇ g, 5 ⁇ g, or 25 ⁇ g of healthy mitochondria isolated in Example 4 to tendon cells, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. Then, the protein expression levels of the mitochondrial cleavage factor and mitochondrial fusion factor were confirmed by Western blot. Western blot was performed in the same manner as in Example 1, and the primary antibodies used were anti-Fis1 antibody (Cell signaling; D6C7) and anti-Drp1 antibody (Santa cruz; sc98900) (FIG. 33).
  • the expression level of the mitochondrial fusion factor MFN2 protein was decreased in TNF-a-treated tendon cells.
  • MFN2 protein expression was increased in tendon cells treated with TNF-a and healthy mitochondria (FIG. 36). Through this, it was confirmed that mitochondrial activity is improved by delivering foreign healthy mitochondria to damaged tendon cells.
  • TNF-a TNF-a
  • tendon cells 10 ng were treated with tendon cells, and then cultured for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 conditions. After treating 1 ⁇ g, 5 ⁇ g, or 25 ⁇ g of healthy mitochondria isolated in Example 4 to tendon cells, the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. Thereafter, the expression levels of IL-1 ⁇ , IL-6 and p-NF-kB of tendon cells were confirmed by ELISA and Western blot. ELISA was performed according to the manufacturer's manual.
  • Western blot was performed in the same manner as in Example 1, and the primary antibody used was an anti-p-NF-kB antibody (Cell signaling; 9936S).
  • the primary antibody used was an anti-p-NF-kB antibody (Cell signaling; 9936S).
  • L-1 ⁇ R &D; RLB00
  • IL-6R &D R6000B
  • the expression levels of inflammatory cytokines IL-1 ⁇ and IL-6 were increased in TNF-a-treated tendon cells.
  • the expression levels of inflammatory cytokines IL-1 ⁇ and IL-6 were decreased in tendon cells treated with TNF-a and healthy mitochondria (FIGS. 37 and 38).
  • the expression level of p-NF-kB protein which is an inflammatory signal, was increased in TNF-a-treated tendon cells.
  • the expression level of p-NF-kB protein was decreased in tendon cells treated with TNF-a and healthy mitochondria (FIGS. 39 and 40). Through this, it was confirmed that inflammation in the tendon cells is suppressed by delivering foreign healthy mitochondria to the damaged tendon cells.
  • RNA extracted from the dry cells was extracted using an Easy-spin Total RNA Extraction Kit (iNtRON Bio, Seoul, South Korea), and Nanodrop spectrophotometer (Thermo Fisher, Waltham, USA) (260: 280> 1.9 and 260: 230> 1.9) was used to measure the concentration and purity.
  • the microarray analysis was performed using Affymetrix HuGene 2.0ST chips (Affymetrix, California, USA). Heat map formation was clustered using the Morpheus program (FIG. 41).
  • TNF-a treated TNF-a, TNF signaling, apoptosis, calcium signaling, inflammation mediator regulation, NF-kB signaling The expression rate of factors related to delivery (NF-kB signaling) and ECM-receptor interacrion was high, and the expression rate of factors related to oxidative phosphorylation was low.
  • TNF-a and healthy mitochondrial-treated tendon cells have low expression rates of factors related to TNF signaling, cell death, calcium signaling, inflammatory mediator regulation, NF-kB signaling and ECM-receptor interaction, and oxidative phosphorylation. And the expression rate of the related factor was high (Fig. 41).
  • the foreign healthy mitochondria are stained with L6 cells (ATCC, CRL-1458) using the Mitotracker CMXRos red reagent. Healthy mitochondria were isolated from the stained L6 cells in the same manner as in Example 4, and 25 ⁇ g of the stained healthy mitochondria was injected into the dry tissue. The tendon tissue was cryosectioned. Thereafter, the dried tissue was attached to the slide, treated with 300 nM mitotracker green dye, and incubated at 37 ° C and 5% CO 2 for 30 minutes. Additionally, DAPI staining was performed. Thereafter, a fluorescence image was analyzed at 400 magnification using a confocal laser scanning ZEISS LSM 880 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) (FIG. 42).
  • the expression level of the mitochondrial fusion factor MFN2 protein in the tissue treated with collagenase I was reduced.
  • the expression level of MFN2 protein was increased in tendon cells treated with collagenase I and healthy mitochondria (Fig. 46). Through this, it was confirmed that the mitochondrial activity is improved as the mitochondria are delivered to the damaged dry tissue.
  • Example 4 In order to confirm that the tendon tissue is restored by delivering foreign healthy mitochondria, 0.6 mg collagenase I was injected into the tendon tissue, and induction of inflammation of the tendon tissue for 2 weeks. Thereafter, 10 ⁇ g or 50 ⁇ g of healthy mitochondria isolated in Example 4 was injected into the dry tissue. After 2 weeks, the expression levels of TNC and MMP1 proteins were confirmed by Western blot and ELISA. Western blot was performed in the same manner as in Example 1, and the primary antibody used was an anti-TNC antibody (Abcam, ab203676) and an anti-MMP1 antibody (Santa Cruz; sc-21731). ELISA was performed according to the manufacturer's manual (FIG. 47).
  • TNC tenascin-C
  • MMP1 protein-binding protein
  • collagenase I and healthy mitochondrial treated tendon tissues the expression level of TNC and MMP1 protein was decreased, and there was no significant difference from the expression level of TNC and MMP1 protein in normal tendon tissue (Figs. 48 and 49).
  • a hydroxyproline assay was performed. Dry tissue was quickly frozen in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C. The tissue crushing method and the experimental method were performed according to the manual provided by the hydroxyproline Assay Kit (Abcam, ab222941). After the tissue was crushed, 10 N NaOH and HCl were treated, and then centrifuged at 10,000 ⁇ g for 5 minutes. After recovering the supernatant, an oxidation mix was added and reacted at room temperature for 20 minutes. 50 ml of each developer and DMAB concentrate solution were added to each well and reacted at 65 ° C for 45 minutes. It was measured at a wavelength of 560 nm using a Synergy Mix Multi-Mode Reader (BioTek, Vermont, USA).
  • collagen content in collagenase I-treated tissue was reduced by 32 ⁇ 0.4% compared to normal tissue.
  • collagen content in collagense I and healthy mitochondria (10 mg or 50 mg) treated collagen content increased by 25.4 and 24 ⁇ 0.7%, respectively (FIG. 50). Through this, it was confirmed that mitochondrial delivery promotes regeneration of damaged tendon tissue.
  • Example 4 In order to confirm that the tendon cells derived from the patient with tendinitis are recovered by delivering the foreign healthy mitochondria, 1 ⁇ g, 5 ⁇ g or 25 ⁇ g of healthy mitochondria isolated in Example 4 is isolated from the tendonitis patient (Zenbio, TEN-F). After 2 weeks, the proliferation rate and tendon-related factors of tendon cells were confirmed by WST-1 analysis and Western blot. Western blot was performed in the same manner as in Example 1, and the primary antibodies used were anti-TNC antibody (Abcam, ab203676), anti-TNMD antibody (Abcam, ab203676) and anti-Collagen type 1 antibody (Abcam; ab6308). Used. In addition, WST-1 (EZ-cyto x, EZ-3000, Dozen) analysis was measured at 450 nm wavelength by mixing with medium 1: 9.

Abstract

본 발명은 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 염증반응에 의해 손상된 건세포의 ATP 합성능 및 항산화능을 정상 건세포 수준으로 회복시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 손상된 건세포에 투여할 경우, 세포사멸 인자인 Bax의 발현을 억제하며, 세포사멸 억제 인자인 Blc-2의 발현을 증가시킨다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 손상된 건세포에 투여할 경우, MMP1의 발현을 정상 건세포 수준으로 회복시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 건병증을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

분리된 미토콘드리아를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
건병증은 발목 관절과 근육을 연결시켜주는 건(tendon) 조직 내 콜라겐의 퇴행성 변화에 의해 발생하는 질환이다. 건병증은 건 조직이 손상되었을 때 휴식을 취하여 건 조직이 회복될 시간을 주지 않고 반복적인 염좌 또는 과도한 사용으로 인해 건 조직의 회복이 이루어지지 않는다. 또한, 건병증은 건 조직 내에 콜라겐 섬유의 비정상적인 정렬, 콜라겐의 섬유소(fibrinoid) 또는 점액양(myxoid) 변성, 섬유화 등이 진행되며 약해진 건 조직은 파열되기도 한다.
건병증의 병인으로 염증반응이 주요원인으로 대두되고 있다. 염증반응에 관여하는 사이토카인은 근육, 힘줄, 혈관과 같은 연조직의 손상과 상처 치유과정에서 중요하게 작용한다. 구체적으로, 건세포(tenocyte)에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, VEGF, TGF-β와 같은 염증성 사이토카인의 발현은 생체 내 조직의 기능과 밀접하게 연관되어 있다. 이와 관련하여, IL-6 결핍 마우스의 건 조직은 다른 마우스의 건 조직보다 조직의 강도나 배열 등의 물리적 특성이 우수하다는 연구결과가 보고된 바 있으며, TNF-α와 IL-1β가 미토콘드리아의 DNA 손상을 야기하며, 연골세포에서 세포사멸을 유도한다는 연구결과가 보고된 바 있다(Neal L. Millar et al., Scientific Reports volume 6, Article number: 27149, 2016).
한편, 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloprotease, MMP)는 정상적인 건 조직에서 세포외 기질의 균형을 유지하는 역할을 하는데, 건병증 환자에서 기질 금속 단백질 분해효소의 불균형이 관찰되었다는 연구결과가 보고된 바 있다(Graham Riley, Nature Clinical Practice Rheumatology volume 4, p82-89, 2008).
건병증은 임상적으로 매우 흔하게 발생하지만 아직까지 확실한 치료 방법이 없다. 현재 건병증의 치료법으로는 스트레칭, 물리치료, 소염제 복용, 스테로이드 주사, 체외 충격파 치료(extracorporeal shock wave therapy), 자가 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma) 주사 등의 보존적 치료가 있으나, 대부분 과학적 근거가 거의 없다. 주로 스테로이드 주사를 이용한 치료가 이루어지고 있으나, 스테로이드 주사가 연부 조직을 파괴하거나 근력을 감소시킨다는 연구결과가 보고된 바 있다. 뿐만 아니라, 염증을 동반하지 않는 경우 스테로이드 주사의 소염효과를 볼 수 없다는 점에서 스테로이드 치료범위의 한계가 있다. 보존적 치료에 실패할 경우에는 수술적 치료를 할 수 있지만, 수술은 변성된 부분을 제거하고 남은 부분을 봉합하거나 주변의 다른 건을 이식하는 수준의 증상 경감을 위한 치료이며 근본적인 해결방법은 아니다.
최근, 건병증의 치료와 관련하여 단백질 또는 줄기세포를 이용한 재생치료가 활발히 연구되고 있다. 대한민국 특허출원 제2016-0091029호에서는 건 또는 인대 손상 치유를 위해 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 대해 개시하고 있다. 상기 문헌에는 자가 및 동종의 지방유래 중간엽줄기세포를 포함하는 조성물을 투여하는 경우, 콜라겐, 세포외기질(ECM) 단백질, 및 각종 성장인자를 분비한다는 내용이 개시되어 있으나, 상기 조성물을 단회투여 하였을 경우, 그 효과가 지속적이 않다는 점에서 기술적 한계가 있다. 따라서, 효과적으로 건 조직을 재생시킬 수 있는 새로운 치료법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
건병증을 치료하기 위한 연구가 진행된 바 있으나, 증상만을 일시적으로 완화시키는 치료이거나, 치료 효과의 지속성이 짧다는 한계가 있는 등 아직은 획기적인 치료법이 개발되지 않은 실정이다. 효과적인 건병증 치료제에 대한 지속적인 연구개발이 필요한 상황이다.
따라서, 본 발명은 건병증을 치료하기 위한 약학 조성물 및 이를 이용한 건병증을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 건병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 건병증의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 건병증을 치료하기 위한 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 건병증 치료용 약제를 제조하기 위한 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 염증반응으로 인해 손상된 건세포의 ATP 합성능 및 항산화능을 정상 건세포 수준으로 회복시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 손상된 건세포에 투여할 경우, 세포사멸 인자인 Bax의 발현을 억제하며, 세포사멸 억제 인자인 Blc-2의 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 손상된 건세포에 투여할 경우, MMP1의 발현을 정상 건세포 수준으로 회복시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 건병증을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 건세포에 TNF-α를 농도별로 처리한 후, 건세포의 세포사멸 관련 인자의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 2는 건세포에 TNF-α를 농도별로 처리한 후, 건세포의 BID 단백질 발현량을 나타낸 도면이다.
도 3은 건세포에 TNF-α를 농도별로 처리한 후, 건세포의 Bax/Bcl-2 수치를 나타낸 도면이다.
도 4는 건세포에 TNF-α를 농도별로 처리한 후, 건세포의 Bcl-2/Bax 수치로 나타낸 도면이다.
도 5는 건세포에 TNF-α를 처리한 후, 시간의 경과에 따른 건세포의 세포사멸 관련 인자의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 6은 건세포에 TNF-α를 처리한 후, 시간의 경과에 따른 건세포의 BID 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 7은 건세포에 TNF-α를 처리한 후, 시간의 경과에 따른 건세포의 Bax/Bcl-2 수치를 나타낸 도면이다.
도 8은 건세포에 TNF-α를 처리한 후, 시간의 경과에 따른 건세포의 Bcl-2/Bax 수치로 나타낸 도면이다.
도 9는 TNF-α를 처리한 건세포에 DCFH-DA를 처리한 후, 건세포 내 DCF의 형광세기를 나타낸 도면이다.
도 10은 TNF-α를 처리한 건세포 내의 ATP량을 나타낸 도면이다.
도 11은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리한 후, Mitotracker green, Mitotracker CMXRos Red 및 DAPI로 건세포를 형광염색한 도면이다.
도 12는 TNF-α, 과산화수소, 비타민C 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에 DCFH-DA를 처리한 후, 건세포 내 DCF의 형광세기 변화량을 나타낸 도면이다.
도 13은 TNF-α, 과산화수소, 비타민C, TNF-α와 건강한 미토콘드리아 또는 TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 처리한 건세포에 DCFH-DA를 처리한 후, 건세포의 DCF 형광세기를 나타낸 도면이다.
도 14는 TNF-α, 과산화수소, TNF-α와 건강한 미토콘드리아 또는 TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 처리한 건세포 내의 ATP 변화량을 나타낸 도면이다.
도 15는 TNF-α, 과산화수소 또는 TNF-α와 미토콘드리아를 처리한 건세포 내의 ATP량을 나타낸 도면이다.
도 16은 TNF-α, CCCP 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포 내의 미토콘드리아 막전위를 나타낸 도면이다.
도 17은 TNF-α, 비타민C, TNF-α와 건강한 미토콘드리아 또는 TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 처리한 건세포 내의 미토콘드리아 탈수소효소 활성을 나타낸 도면이다.
도 18은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 12시간 후, 건세포의 세포사멸 관련 인자의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 19는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 세포사멸 관련 인자의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 20은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 12시간 또는 24시간 후, 건세포의 BID 단백질 발현량을 나타낸 도면이다.
도 21은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 12시간 또는 24시간 후, 건세포의 Bax/Bcl-2 수치를 나타낸 도면이다.
도 22는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 12시간 또는 24시간 후, 건세포의 Bcl-2/Bax 수치를 나타낸 도면이다.
도 23은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 12시간 후, 건세포의 MMP1 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 24는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 MMP1 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 25는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 12시간 또는 24시간 후, 건세포의 MMP1 단백질 발현량을 나타낸 도면이다.
도 26은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Collagen 1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 27은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Collagen 1 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 28은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Collagen 1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 29는 TNF-α 또는 TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Collagen 1 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 30은 TNF-α 또는 TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Collagen 1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 31은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Scleraxis 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 32는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Tenomodulin 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 33은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Fis1, Drp1 및 MFN2 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 34는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Fis1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 35는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 Drp1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 36은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 MFN2 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 37은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 IL-1β의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 38은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 IL-6의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 39는 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 p-NF-kB 단백질의 발현량을 비교한 도면이다.
도 40은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 p-NF-kB 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 41은 TNF-α 또는 TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포 내 신호전달 관련 유전자의 발현량을 비교한 도면이다.
도 42는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 주입한 후, Mitotracker green, Mitotracker CMXRos Red 및 DAPI로 건 조직을 형광염색한 도면이다.
도 43은 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 Fis1, Drp1 및 MFN2 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 44는 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 Fis1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 45는 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 Drp1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 46은 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 MFN2 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 47은 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 TNC 및 MMP1 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 48은 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 TNC 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 49는 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 MMP1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 50은 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 콜라겐 함량을 하이드록시프롤린 분석(hydroxyproline assay)을 통해 확인한 도면이다.
도 51은 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 TNF-α의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 52는 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 IL-1β의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 53은 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 IL-6의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 54는 Collagenase 1 또는 Collagenase 1과 건강한 미토콘드리아를 건 조직에 처리하고 2주 후, 건 조직의 p-NF-kB 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 55는 외래의 건강한 미토콘드리아를 농도별로 건병증 환자 유래의 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포 증식율을 비교한 도면이다.
도 56은 외래의 건강한 미토콘드리아를 농도별로 건병증 환자 유래의 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 TNC, TNMD 및 COL1 단백질의 발현정도를 비교한 도면이다.
도 57은 외래의 건강한 미토콘드리아를 농도별로 건병증 환자 유래의 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 TNC 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 58은 외래의 건강한 미토콘드리아를 농도별로 건병증 환자 유래의 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 TNMD 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 59는 외래의 건강한 미토콘드리아를 농도별로 건병증 환자 유래의 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포의 COL1 단백질의 발현량을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 일 측면은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 건병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한,　"유효성분"은　단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체로는 활성이 없는 보조제(담체)와 함께 활성을 나타내는 성분을 지칭한다.
상기 미토콘드리아는 포유동물로부터 수득된 것일 수 있으며, 인간으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 건강한 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 것일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 자가(autologous), 동종(allogenic) 또는 이종(xenogenic)으로부터 수득된 것일 수 있다. 구체적으로, 자가 미토콘드리아는 동일 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 동종 미토콘드리아는 개체와 같은 종에 속하면서 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 이종 미토콘드리아는 개체와 다른 종에 속하는 개체로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.
구체적으로, 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포일 수 있다.
또한, 상기 생식세포는 감수분열과 체세포 분열을 하는 세포로서 정자 또는 난자일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "건강한 미토콘드리아"란, 정상적인 세포로부터 추출한 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "손상된 미토콘드리아"란, ATP 합성 기능이 억제된 미토콘드리아를 의미한다. 구체적으로, 상기 손상된 미토콘드리아는 세포에 올리고마이신과 같은 ATP 합성 억제제를 처리하여 세포 내 미토콘드리아 ATP 합성 기능을 억제한 수준의 미토콘드리아를 의미한다. 한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.
상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고 원심분리하여 수득할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 약학 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.
구체적으로, 상기 제1차 내지 제3차 원심분리는 0℃ 내지 10℃의 온도, 바람직하게는 3℃ 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 원심분리가 수행되는 시간은 1분 내지 50분 동안 수행될 수 있으며, 원심분리 횟수 및 샘플의 함량 등에 따라 적절히 조정될 수 있다.
아울러, 상기 제1차 원심분리는 100 ×g 내지 1,000 ×g, 또는 200 ×g 내지 700 ×g, 또는 300 ×g 내지 450 ×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2차 원심분리는 1 ×g 내지 2,000 ×g, 또는 25 ×g 내지 1,800 ×g, 또는 500 ×g 내지 1,600 ×g의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3차 원심분리는 100 ×g 내지 20,000 ×g, 또는 500 ×g 내지 18,000 ×g, 또는 800 ×g 내지 15,000 ×g의 속도로 수행될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물에 대하여, 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 0.2 ㎍/㎖ 내지 450 ㎍/㎖ 또는 0.5 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 상기 범위로 미토콘드리아를 포함함으로써, 투여 시 미토콘드리아 용량 조절이 용이하고, 환자의 건병증 병증 개선 정도가 보다 향상될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 상기 약학 조성물은, 투여할 개체의 체중을 기준으로 1회 0.01 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 4 ㎎/㎏ 또는 0.25 ㎎/㎏ 내지 2.5 ㎎/㎏ 양의 미토콘드리아를 투여할 수 있다. 즉, 상기 약학 조성물이 건병증이 유발된 개체의 체중을 기준으로 상기 범위의 함량으로 미토콘드리아가 투여되는 것이 세포 활성 측면에서 가장 바람직하다. 또한, 상기 약학 조성물은 1회 내지 10회, 3회 내지 8회 또는 5회 내지 6회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 5회 투여할 수 있다. 이때, 투여 간격은 1일 내지 7일 또는 2일 내지 5일 간격으로 할 수 있으며, 바람직하게는 3일 간격으로 투여할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 건병증에 걸릴 수 있거나, 그러한 질환 또는 질병을 앓고 있는 인간 또는 다른 포유동물에 대하여 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 건 조직의 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 약학 조성물은 건 조직의 콜라겐의 손상을 입은 환자 또는 건 조직이 만성 퇴행(chronic degenerative)인 환자에게 적용되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 건병증 환자의 collagen I, TNMD(tenomodulin), Scleraxis 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 건병증 환자의 BID(BH3 interacting-domain death agonist), Bax(Bcl-2-associated X protein), MMP1, Fis1(Mitochondrial fission 1 protein), Drp1(Dynamin-1-like protein), MFN2(Mitofusin-2), IL-1β, IL-6, p-NF-kB, TNC(tenascin C), TNF-α 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TNMD(tenomodulin)"이란, TNMD (Tnmd) 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 의미하며, 건(tendon) 성숙의 중요한 마커이다. 또한, 상기 TNMD는 자기 재생을 촉진시키고 노화를 억제함으로써, 건 유래 줄기세포 또는 전구세포의 발달에 영향을 미친다.
본 발명에서 사용하는 용어 "Scleraxis"란, bHLH(basic helix-loop-helix) 수퍼 패밀리에 속하는 구성원 중 하나인 전사조절 인자이다. 초기 Scleraxis를 발현하는 전구 세포는 건 조직 및 다른 근육 부착을 형성에 기여한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "BID(BH3 interacting-domain death agonist)" 란, Bcl-2 단백질 패밀리의 전-세포사멸적 멤버(pro-apoptotic member)로서, BH3 도메인만을 함유하는 전-세포사멸적 Bcl-2 단백질이다. 상기 BID는 세포사멸 신호 전달에 반응하여, 다른 Bcl-2 패밀리 단백질인 Bax와 상호 작용하여, Bax가 소기관 막, 주로 외부 미토콘드리아 막으로 삽입되게 한다. 상기 Bax(Bcl-2-associated X protein)는 미토콘드리아 전압-의존성 음이온 채널인 VDAC(voltage-dependent anion channel)와 상호작용하고 개방을 유도한다.
또한, 상기 약학 조성물은 정맥 투여될 수 있는 주사제일 수 있고, 바람직하게는 주사용 제제일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여, 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써, 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 또는 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨-구연산 완충용액 등 일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 안정화제 또는 용해보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)일 수 있고, 용해보조제는 염산, 아세트산, 수산화나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 건병증의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 손상된 건 조직을 가지고 있는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 근육 내(intra-muscular), 정맥 내(intra-venous), 건 내(intra-tendinous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 투여는 정맥 내 투여 또는 건 내 투여일 수 있다.
이를 통해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 건병증을 앓고 있는 개체의 정맥에 정상적인 활성을 갖는 외래 미토콘드리아를 공급할 수 있어, 미토콘드리아 기능이 저하된 세포의 활성을 증가시키거나 미토콘드리아 기능 이상 세포 재생에 유용하며, 건병증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 건병증을 치료하기 위한 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 상기 약학 조성물은 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 건병증 치료용 약제를 제조하기 위한 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 상기 약학 조성물은 상술한 바와 동일하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. TNF-α 처리 농도별 건세포 내 세포사멸 인자 발현량 변화 확인
인간 유래의 건 세포인 Tenocyte(ZenBio Inc., #TNE-F)를 이용하여 건병증 유발 세포 모델을 확립하였다. 10% 우태아혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 포함되어 있는 Dulbecco's modified eagle' s medium high glucose 배지와 Collagen type 1(Sigma; code: C8919)이 코팅된 플라스크/플레이트에서 배양하였다. 배양 조건은 세포의 패시지(passage) 넘버가 4를 넘지 않도록 유지하였다.
재조합 인간 TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 페프로텍(Peprotech, No. 300-01A)으로부터 구매하였다. 구매한 재조합 인간 TNF-α는 정제된 에탄올에 녹인 후, 저장용액(Stock solution)의 농도가 20 ㎎/㎖이 되도록 맞추고 사용 전까지 -4℃ 온도에서 보관하였다. 최종 농도는 배지에 희석하여 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 100 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖ 농도로 사용하였다. 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 100 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖ 농도의 TNF-α를 건세포에 처리한 후 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
TNF-α처리에 따른 농도별 건세포 내 세포사멸 변화를 관찰하였다. 건세포 내 세포사멸 신호 단백질인 BID 및 Bax 발현량을 웨스턴 블롯 방법을 이용해 분석하였다. 구체적으로, 단백질 추출을 위해 프로테아제 억제제(Protease inhibitor)가 첨가된 RIPA buffer 100 ㎖를 각 웰(well)에 분주한 후 건세포를 분리하였다. 그 후, 분리한 건세포를 4℃ 온도, 12,000 rpm 조건에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상층액 내 단백질의 농도를 측정하기 위해 BCA(bicinchoninic acid) 정량법을 이용하였으며, ELISA microplate reader 장비를 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플은 SDS-PAGE sample buffer(62.5 mM tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol 및 5% 2-mercaptoethanol)와 함께 100℃ 온도에서 3분 동안 가열시켰다.
가열한 샘플을 10% SDS PAGE gel에 로딩하고 전기영동한 후, 전기영동으로 분리된 단백질을 PVDF 막으로 0.35 mA 조건으로 3시간 동안 이동시켰다. PVDF 막은 사용 전에 순수한 메탄올에 담근 후 사용하였다. 3% BSA(bovine serum albumin; Bio Basic Inc., Ontario, Canada)를 0.1% Tween-20가 첨가된 1X TBS에 처리하여 블락킹(Blocking) 버퍼를 제조하였다. 그 후, 비특이적인 결합 반응을 방지하기 위해, PVDF 막에 블락킹 버퍼를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체를 1:1000 희석하여 PVDF 막에 처리한 후 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 1차 항체는 항-BID 항체(Santa Cruz; FL-195), 항-Bax 항체(Santa Cruz; sc-7480), 항-Bcl2 항체(Santa Cruz; sc-7480), 항-β-actin 항체(Santa Cruz; sc-4778)를 사용하였다.
다음날, PVDF 막을 TBST 버퍼로 10분간 3번 세척한 후, HRP(horseradish peroxidase)가 표지된 goat anti-mouse(Santa Cruz Biotechnology Inc.; sc-2005) 1:5000 희석하여 PVDF 막에 처리한 후, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, TBST 버퍼로 PVDF 막을 10분간 3번 세척한 후, chemiluminescence detection(ECL component from Pierce ClarityTM and Western ECL Substrate from Bio-Rad)을 이용하여 발색 반응을 유도 하고 LAS-4000(Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 BID, Bax, Bc12의 발현량을 확인하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서 세포사멸 신호 단백질인 BID 및 Bax 단백질 발현량이 증가하였다. 반면, 세포사멸 억제 인자인 Bcl-2 단백질 발현량은 감소하였다(도 1 내지 도 4).
실시예 2. TNF-α 처리 시간별 건세포 내 세포사멸 인자 발현량 변화 확인
TNF-α를 건세포에 처리한 후, 어느 시점에서 세포사멸이 가장 활성화되는지 확인하기 위해, TNF-α 10 ng을 건세포에 처리한 후 6, 12 또는 24시간 후 세포사멸 인자 단백질인 BID 및 Bax 단백질의 발현량를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 웨스턴 블랏은 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, TNF-α를 건세포에 처리한 후 시간이 지남에 따라 세포사멸 인자의 발현량이 증가하였다. 특히, TNF-α를 건세포에 처리한 후 24시간이 지났을 때, 건세포 내 세포사멸이 가장 활성화되는 것을 확인하였다(도 5 내지 도 8).
실시예 3. TNF-α 처리에 따른 건세포 내 미토콘드리아 기능이상 확인
TNF-α를 건세포에 처리함에 따라 미토콘드리아 기능이상이 일어나는 지 확인하였다. 재조합 인간 TNF-α를 건세포에 처리한 후 세포 내 ATP 및 ROS(reactive oxygen species) 수치를 확인하였다.
구체적으로, DCFH-DA probe(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 이용하여 건세포 내에 생성되는 ROS 수치를 측정하였다. 건세포는 96-웰-플레이트에 각 웰당 5×103 개의 세포수가 되도록 분주한 후, 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 중인 건세포의 세포밀도(cell density)가 약 80% 내지 90% 정도가 되었을 때, 10 ng, 50 ng, 100 ng 또는 500 ng 양의 재조합 인간 TNF-α를 건세포에 처리한 후, 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로 과산화수소(H2O2) 500 μM를 건세포에 처리하였다. 배양된 건세포를 PBS로 1번 세척한 후, 10 mM 농도의 DCFH-DA를 처리하여 30분간 배양하였다. 그 후, Synergy Mix Multi-Mode Reader(BioTek Inc.)를 이용하여 517 nm 내지 522 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 개별적으로 측정하였으며, 평균(mean)과 표준편차(standard deviation)를 계산하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서는 정상 건세포에 비해 DCF의 형광세기가 높게 측정되었으며, 이는 세포 내 DCFH와 반응한 ROS가 많다는 것으로 건세포 내 ROS 수치가 높다는 것으로 해석된다(도 9).
또한, 건세포 내 ATP량은 CellTiter-Glo luminescence kit(Promega,madison,WI)를 이용하여 측정하였다. 10 ng, 50 ng, 100 ng 또는 500 ng 양의 TNF-α를 건세포에 처리한 후, 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로 500 μM 농도의 과산화수소(H2O2)를 건세포에 처리하였다. 그 후, 성장배지 100 ㎖와 CellTiter-Glo luminescence test solution 100 ㎖를 각 웰에 처리하고, 2분 동안 플레이트 쉐이커(plate shaker)에서 반응시킨 후, 실온에서 10분 동안 추가 반응시켰다. 그 후, Luminescene microplate reader를 이용해 발광신호를 측정하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 건세포 내 ATP량이 정상 건세포의 ATP량보다 낮게 측정되었다(도 10). 이를 통해, TNF-α를 건세포에 처리할 경우, 건세포 내 미토콘드리아가 정상적으로 작동하지 않음을 확인하였다.
실시예 4. 미토콘드리아를 포함하는 조성물 제조
분당 차병원으로부터 제공받은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 10%(v/v) 우태혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 암피실린을 함유하는 Alpha-MEM(Alpha-Minimum Essential Medium) 배지에 접종하고 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, Gibco)를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25%(v/v) Trypsin-EDTA(TE, Gibco)를 처리하여 세포를 수득하였다.
또한, 손상된 미토콘드리아 수득을 위해서는, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 미토콘드리아 ATP합성 억제제 (올리고마이신, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 미토콘드리아 기능을 인위적으로 억제시켰다. 24시간 뒤, DPBS를 이용하여 2회 세척하였다. 세척된 세포는 0.25% TE를 처리하여 세포를 수득하였다.
이와 같이, 각각 수득한 세포는 미토콘드리아를 추출하기 위하여, 혈구계산기를 이용하여 1×107 cells/㎖ 농도의 세포를 회수하였다. 상기 세포주를 약 4℃의 온도에서 10분 동안 350 ×g의 속도로 제1차 원심분리를 수행하였다. 이때 얻어진 펠렛을 회수하여 버퍼 용액에 재현탁 시킨 후, 10분 내지 15분 동안 균질화시켰다. 그 후, 상기 펠렛을 포함하는 조성물을 약 4℃의 온도에서 3분 동안 1,100 ×g의 속도로 제2차 원심분리시켜 상청액을 수득하였다. 상기 상청액을 약 4℃의 온도에서 15분 동안 12,000 ×g의 속도로 제3차 원심분리시켜 세포주로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 이렇게 얻어진 미토콘드리아를 5 ㎍ 또는 50 ㎍의 양으로 각각 100 ㎕의 주사용수와 혼합한 뒤 인슐린 주사기에 충진하였다.
실시예 5. 건세포 내 미토콘드리아 전달 확인
실시예 4의 방법을 통해, 정상 탯줄 유래 줄기세포로부터 추출한 건강한 미토콘드리아(Intact MT)를 타깃 건세포 내로 전달하였다.
미토콘드리아 전달 방법은 아래와 같이 원심분리기를 통하여 전달하였다. 먼저, 실험 24시간 전에 건세포에 TNF-α의 농도가 10 ng/㎖가 되도록 처리하였다. 미토콘드리아 전달 전, 1×105 개의 건세포를 PBS 100 ㎖에 섞어 준비한 후, 아이스에 보관하였다. 실시예 4에서 분리한 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리하고 천천히 섞어 주었다. 그 후, 원심 분리 튜브에 담아 1,500 ×g에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리가 끝난 후, PBS로 2번 세척하여 불순물을 제거해주었다. 펠릿(Pellet)만 남긴 후, 100 ㎖의 PBS 넣어 섞어준 뒤 플레이트에 배양하였다.
전달된 미토콘드리아를 확인하기 위하여, Mitotracker Green, Mitotracker CMXRos Red, DAPI를 이용하여 건세포를 염색하였다. 이때, Mitotracker Green은 미토콘드리아의 막 전위에 상관없이 건세포 내 미토콘드리아를 염색하는 시료이다. Mitotracker CMXRos Red는 미토콘드리아의 막 전위에 의존적으로 축적되는 시료로서, 전달된 미토콘드리아의 생존력을 나타낸다.
구체적으로, 6-웰-플레이트에 1×105 개의 미토콘드리아를 전달시킨 건세포를 분주한 후, 세포밀도가 80% 내지 90% 되었을 때 DPBS로 세척하였다. 300 nM 농도의 Mitotracker Green, CMXRos Red, DAPI 염료를 배지에 처리하고 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 20분 동안 배양하였다. 그 후, TCP SP5 II confocal microscope(Leica, Heidelberg, Germany) 형광현미경 및 Leica LASAF software, ver 2.6(Leica Microsystems, Mannheim, Germany)를 이용하여 이미지를 촬영하였다.
그 결과, 정상 건세포(control)과 TNF-α를 처리한 건세포의 형광이미지에서는 빨간색 형광(Mitotracker CMXRos Red)을 제외한 녹색형광(Mitotracker Green)과 파란색 형광(DAPI)만 발색되는 것을 확인하였다. 반면, 건강한 미토콘드리아 처리한 건세포의 형광이미지에서는 미토콘드리아 처리 농도에 따라 빨간색 형광 세기가 증가하였다. 이를 통해 건세포 내 건강한 미토콘드리아가 전달된 것을 확인하였다(도 11).
실시예 6. 미토콘드리아 전달에 따른 건세포 내 기능 변화 확인
TNF-α에 의해 손상된 건세포에 미토콘드리아 전달을 통해 건세포 내 기능이 회복되는지 확인하였다. 먼저, TNF-α 10 ng을 건세포에 처리한 후, 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 또는 손상된 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리하고 24시간 후, 건세포 내 ATP량 및 ROS 수치를 확인하였다. ATP, ROS 분석법은 실시예 3과 동일하게 수행하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서는 DCF 수치가 증가하는 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 DCF 수치가 정상 건세포(control)의 DCF 수치만큼 감소하였다. 이는 DCFH와 반응한 ROS가 적다는 것으로 건세포 내 ROS 수치가 감소하였다는 것으로 해석된다. 한편, TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 DCF 수치가 증가하였다(도 12 및 도 13).
또한, TNF-α를 처리한 건세포에서 ATP량이 감소하는 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 ATP량이 증가하였다. 특히, TNF-α와 25 ㎍의 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 TNF-α를 처리한 건세포보다 ATP량이 현저하게 증가하였다. 반면, TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 ATP량이 증가하지 않았다(도 14 및 도 15).
또한, 건강한 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리하고 24시간 후, 미토콘드리아 막전위(Mitochondrial Membrane potential)를 측정하였다. 또한, 양성 대조군으로 50 μM 농도의 CCCP를 처리하고 30분 후에 미토콘드리아 막전위를 측정하였다. 그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서 미토콘드리아 막전위 수치가 감소하는 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 미토콘드리아 막전위 수치가 증가하였다(도 16).
또한, 건강한 미토콘드리아 또는 손상된 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리한 후, 미토콘드리아 탈수소효소 활성(Mitochondrial dehydrogenase activity)을 측정하였다. 그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서 미토콘드리아 탈수소효소 활성이 감소하는 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 미토콘드리아 탈수소효소 활성이 증가하였다. 반면, TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 미토콘드리아 탈수소효소 활성이 증가하지 않았다(도 17).
이를 통해, 건강한 미토콘드리아를 손상된 건세포에 전달함에 따라 건세포 내 기능이 회복되었음을 확인하였다.
실시예 7. 미토콘드리아 전달에 따른 건세포의 사멸 억제 확인
미토콘드리아 전달에 따른 건세포의 세포사멸이 억제되는지 확인하기 위해, TNF-α 10 ng을 건세포에 처리한 후, 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 12시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리하였다. 그 후, 건세포의 세포사멸 인자 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서 세포사멸 신호 인자인 BID 단백질 발현량이 증가하였다. TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 BID 단백질 발현량은 TNF-α를 처리한 건세포의 BID 단백질 발현량과 유의미한 차이가 나타나지 않았다(도 18 내지 도 20).
또한, TNF-α를 처리한 세포에서 세포사멸 신호 인자인 Bax 단백질 발현량이 증가한 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 Bax 단백질 발현량이 감소하였다(도 18, 도 19 및 도 21).
한편, TNF-α를 처리한 건세포에서 세포사멸 억제 인자인 Bcl-2 단백질 발현량은 감소하였다. 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 Bcl-2 단백질 발현량이 증가하였다(도 18, 도 19 및 도 22). 이를 통해, 미토콘드리아를 손상된 건세포에 전달함에 따라 세포사멸 인자가 억제됨을 확인하였다.
실시예 8. 미토콘드리아 전달에 따른 기질 회복 확인
손상된 건세포에 건강한 미토콘드리아를 전달함에 따라 건세포의 세포외기질이 회복되는지 확인하였다. 먼저, TNF-α 10 ng을 건세포에 처리한 후, 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 12시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 또는 손상된 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리한 후, 웨스턴 블롯으로 건세포의 MMP1 단백질 발현량을 측정하였다. 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 항-MMP1 항체(Santa Cruz; sc-21731), 항-Collagen type 1 항체(Abcam; ab6308)를 사용하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서 MMP1 단백질 발현량이 현저하게 증가하였다. 이는 건세포의 금속 단백질 분해효소 불균형을 나타낸다. 반면, TNF-α 및 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 MMP1 단백질 발현량은 TNF-α를 처리한 건세포의 MMP1 단백질 발현량에 비해 현저하게 감소하였으며, 정상 건세포의 MMP1 단백질 발현량과 유의미한 차이가 나타나지 않았다(도 23 내지 도 25).
또한, TNF-α를 처리한 건세포에서 Collagen 1 단백질 발현량이 현저하게 감소하였다. 이는 건세포의 기질 단백질 분해를 나타낸다. 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 Collagen 1 단백질 발현량은 TNF-α를 처리한 건세포의 Collagen 1 단백질 발현량에 비해 현저하게 증가하였다. 반면, TNF-α와 손상된 미토콘드리아를 처리한 건세포의 Collagen 1 단백질 발현량은 TNF-α를 처리한 건세포의 Collagen 1 단백질 발현량과 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 이를 통해, 건강한 미토콘드리아 전달받은 건세포에서 기질 금속 분해 단백질의 균형이 유지됨을 확인하였다(도 26 내지 도 30).
또한, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리한 후, 웨스턴 블롯으로 건세포의 Scleraxis 및 Tenomodulin 단백질 발현량을 측정하였다. 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 항-Scleraxis 항체(Abcam; ab58655), 항-Tenomodulin 항체 (Abcam; ab203676)를 사용하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 건세포에서 Scleraxis 단백질 발현량이 현저하게 감소하였다. 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 Scleraxis 단백질 발현량은 TNF-α를 처리한 건세포의 Scleraxis 단백질 발현량에 비해 현저하게 증가하였다. 특히, 25 ㎍의 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 Scleraxis 단백질 발현량은 정상군의 Scleraxis 단백질 발현량과 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 31).
또한, TNF-α를 처리한 건세포에서 Tenomodulin 단백질 발현량이 현저하게 감소하였다. 반면, TNF-α와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 Tenomodulin 단백질 발현량은 TNF-α를 처리한 건세포의 Tenomodulin 단백질 발현량에 비해 현저하게 증가하였다. 특히, 25 ㎍의 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 Tenomodulin 단백질 발현량은 정상군의 Tenomodulin 단백질 발현량과 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 32).
실시예 9. 미토콘드리아 전달에 따른 건세포 내 미토콘드리아의 활성 개선 확인
미토콘드리아 전달에 따른 건세포의 미토콘드리아 활성(dynamics)이 개선되는지 확인하기 위해, TNF-a 10 ng을 건세포에 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리한 후, 다시 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 미토콘드리아 분열 인자 및 미토콘드리아 융합 인자의 단백질 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 항-Fis1 항체(Cell signaling; D6C7) 및 항-Drp1 항체(Santa cruz; sc98900)를 사용하였다(도 33).
그 결과, TNF-a를 처리한 건세포에서 미토콘드리아 분열 인자인 Fis1 및 Drp1 단백질의 발현량이 증가하였다. 반면, TNF-a와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포의 Fis1 및 Drp1 단백질의 발현량은 감소하였다(도 34 및 도 35).
또한, TNF-a를 처리한 건세포에서 미토콘드리아 융합 인자인 MFN2 단백질의 발현량은 감소하였다. 반면, TNF-a와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 MFN2 단백질 발현량이 증가하였다(도 36). 이를 통해, 외래 건강한 미토콘드리아를 손상된 건세포에 전달함에 따라 미토콘드리아 활성이 개선되는 것을 확인하였다.
실시예 10. 미토콘드리아 전달에 따른 건세포의 염증 억제 효과 확인
외래의 건강한 미토콘드리아를 전달함에 따라 건세포의 염증반응이 억제되는지 확인하기 위해, TNF-a 10 ng을 건세포에 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건세포에 처리한 후, 다시 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 건세포의 IL-1β, IL-6 및 p-NF-kB의 발현량을 ELISA와 웨스턴 블롯으로 확인하였다. ELISA는 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 또한, 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 항-p-NF-kB 항체(Cell signaling; 9936S)를 사용하였다. ELISA의 경우 L-1β(R&D; RLB00), IL-6R&D; R6000B)를 사용하였다.
그 결과, TNF-a를 처리한 건세포에서 염증 사이토카인인 IL-1β와 IL-6의 발현량이 증가하였다. 반면, TNF-a와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서 염증 사이토카인 IL-1β와 IL-6의 발현량이 감소하였다(도 37 및 도 38).
또한, TNF-a를 처리한 건세포에서 염증 신호인 p-NF-kB 단백질의 발현량은 증가하였다. 반면, TNF-a와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 p-NF-kB 단백질 발현량이 감소하였다(도 39 및 도 40). 이를 통해, 외래 건강한 미토콘드리아를 손상된 건세포에 전달함에 따라 건세포 내 염증이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 11. 마이크로어레이 분석
건세포를 6-웰-플레이트에 1×105 세포수로 접종한 후, 2일 뒤에 TNF-a 10 ng/㎖을 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아를 건세포 내 전달하고, 24시간 후에 건세포로부터 RNA를 추출하였다. 상기 건세포로부터 추출한 RNA는 Easy-spin Total RNA Extraction Kit(iNtRON Bio, Seoul, South Korea)를 이용하여 추출하였으며, Nanodrop spectrophotometer(Thermo Fisher, Waltham, USA) (260:280 > 1.9 와 260:230 > 1.9)를 이용하여 농도와 순도를 측정하였다.
상기 마이크로어레이 분석은 Affymetrix HuGene 2.0ST chips(Affymetrix, California, USA)를 이용하여 수행하였다. 히트 맵(heat map) 형성은 모르페우스(Morpheus) 프로그램을 이용하여 클러스터링 하였다(도 41).
그 결과, 전반적으로, TNF-a를 처리한 건세포에서 TNF 신호전달(TNF signaling), 세포 사멸(apoptosis), 칼슘 신호전달(calcium signaling), 염증 매개자 조절(inflammation mediator regulation), NF-kB 신호전달(NF-kB signaling) 및 ECM-수용체 상호작용(ECM-receptor interacrion)와 관련된 인자의 발현율이 높고, 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)와 관련된 인자의 발현율이 낮았다. 반면, TNF-a와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 TNF 신호전달, 세포 사멸, 칼슘 신호전달, 염증 매개자 조절, NF-kB 신호전달 및 ECM-수용체 상호작용와 관련된 인자의 발현율이 낮고, 산화적 인산화와 관련된 인자의 발현율이 높았다(도 41).
이를 통해, TNF-a를 처리한 건세포에서 염증 유도, 세포 사멸, 미토콘드리아 기능 이상 및 건조직이 파괴되는 것을 확인하였으며, TNF-a와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서 염증 유도, 세포 사멸, 미토콘드리아 기능 이상 및 건조직의 파괴가 개선되는 것을 확인하였다.
실시예 12. 건 조직 내 미토콘드리아 전달 확인
건 조직내로 외래의 미토콘드리아가 전달 되는지 확인하기 위해, 먼저, 외래의 건강한 미토콘드리아를 분리하기 전에 L6 세포(ATCC, CRL-1458)에 Mitotracker CMXRos red 시약을 이용하여 염색하였다. 염색된 L6 세포로부터 실시예 4와 동일한 방법으로 건강한 미토콘드리아를 분리하였으며, 염색된 건강한 미토콘드리아를 25 ㎍을 건 조직에 주입하였다. 건 조직은 동결 절단(cryosection)을 하였다. 그 후, 건 조직을 슬라이드에 부착하고 300 nM mitotracker green 염색약을 처리한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 30분간 배양하였다. 추가적으로, DAPI 염색을 진행하였다. 그 후, 공 초점 레이저 스캐닝 ZEISS LSM 880(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)을 이용하여 400배율로 형광 이미지를 분석하였다(도 42).
그 결과, 도 42에 나타난 바와 같이, 전달된 건강한 미토콘드리아(빨간색)와 기존의 건 조직 내 미토콘드리아(녹색)가 관찰되었으며, 이를 통해, 건 조직 내로 외래의 건강한 미토콘드리아가 전달되었음을 확인하였다.
실시예 13. 건 조직 내 미토콘드리아 전달에 따른 미토콘드리아 활성 개선 확인
외래의 건강한 미토콘드리아를 전달함에 따라 건 조직 내 미토콘드리아의 활성이 개선되는지 확인하기 위해, 0.6 ㎎의 collagenase I(Sigma-Aldrich, Dorset, England)을 건 조직에 주입한 후 2주간 건 조직의 염증을 유도하였다. 그 후, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 10 ㎍ 또는 50 ㎍을 건 조직에 주입하였다. 2주 후, 미토콘드리아 분열 인자 및 미토콘드리아 융합 인자의 단백질 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 웨스턴 블롯은 실시예 9 동일하게 수행하였다(도 43).
그 결과, collagenase I를 처리한 건 조직에서 미토콘드리아 분열 인자인 Fis1 및 Drp1 단백질 발현량이 증가하였다. 반면, collagenase I과 건강한 미토콘드리아를 처리한 건 조직에서는 Fis1 및 Drp1 단백질의 발현량이 감소하였다(도 44 및 도 45).
또한, collagenase I을 처리한 건 조직에서 미토콘드리아 융합 인자인 MFN2 단백질의 발현량은 감소하였다. 반면, collagenase I와 건강한 미토콘드리아를 처리한 건세포에서는 MFN2 단백질 발현량이 증가하였다(도 46). 이를 통해, 미토콘드리아를 손상된 건조직에 전달함에 따라 미토콘드리아 활성이 개선되는 것을 확인하였다.
실시예 14. 미토콘드리아 전달에 따른 건 조직의 기질 회복
외래의 건강한 미토콘드리아를 전달함에 따라 건 조직이 회복되는 확인하기 위해, 0.6 mg collagenase I을 건 조직에 주입한 후 2주간 건 조직의 염증 유도하였다. 그 후, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 10 ㎍ 또는 50 ㎍을 건 조직에 주입하였다. 2주 후, TNC 및 MMP1 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯과 ELISA로 확인하였다. 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 항-TNC 항체(Abcam, ab203676) 및 항-MMP1 항체(Santa Cruz; sc-21731)를 사용하였다. ELISA는 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다(도 47).
그 결과, collagenase I을 처리한 건 조직에서 TNC(tenascin-C) 및 MMP1 단백질의 발현량이 증가하였다. 이는 건 조직의 금속 단백질 분해효소 불균형을 나타낸다. 반면, collagenase I과 건강한 미토콘드리아를 처리한 건 조직에서는 TNC 및 MMP1 단백질의 발현량이 감소하였으며, 정상 건 조직의 TNC 및 MMP1 단백질 발현량과 유의미한 차이가 나타나지 않았다(도 48 및 도 49).
또한, 건 조직 내 콜라겐의 함량을 정략적으로 확인하기 위해, 하이드록시프롤린 분석(hydroxyproline assay)을 진행하였다. 건 조직은 빠르게 액체 질소에서 동결시킨 후 -80℃ 온도에서 보관하였다. 조직 파쇄 방법과 실험법은 hydroxyproline Assay Kit(Abcam, ab222941)에서 제공한 매뉴얼에 따라 수행하였다. 조직을 파쇄한 후 10 N NaOH와 HCl을 처리한 후 10,000×g에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 회수한 후, oxidation mix를 넣고 20분간 상온에서 반응시켰다. developer와 DMAB concentrate solution을 각 웰당 50 ㎖씩 넣고 45분간 65℃ 온도에서 반응시켰다. Synergy Mix Multi-Mode Reader(BioTek, Vermont, USA)를 이용하여 560 nm 파장에서 측정하였다.
그 결과, collagenase I를 처리한 건 조직에서 콜라겐 함량이 정상 건 조직 대비 32±0.4 % 감소하였다. 반면, collagenase I와 건강한 미토콘드리아(10 mg 또는 50 mg)를 처리한 건 조직에서는 콜라겐 함량이 각각 25.4, 24 ±0.7% 증가하였다(도 50). 이를 통해, 미토콘드리아 전달이 손상된 건 조직의 재생을 촉진하는 것을 확인하였다.
실시예 15. 미토콘드리아 전달에 따른 건 조직의 염증 억제 효과 확인
외래의 건강한 미토콘드리아를 전달함에 따라 건 조직 내 염증반응이 억제되는지 확인하기 위해, 0.6 mg collagenase I을 건 조직에 주입한 후 2주간 건 조직의 염증 유도하였다. 그 후, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 10 ㎍ 또는 50 ㎍을 건 조직에 주입하였다. 2주 후, 건세포의 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 p-NF-kB의 발현량을 ELISA와 웨스턴 블롯으로 확인하였다. ELISA는 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였으며, 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 항-p-NF-kB 항체(Cell signaling; 9936S)를 사용하였다. ELISA의 경우 TNF-α(R&D; 210-TA-005), L-1β(R&D; RLB00), IL-6R&D; R6000B)를 사용하였다.
그 결과, collagenase I을 처리한 건 조직에서 염증 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량이 증가하였다. 반면, collagenase I과 건강한 미토콘드리아를 처리한 건 조직에서 염증 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량이 감소하였다(도 51 내지 도 53).
또한, collagenase I을 처리한 건 조직에서 염증 신호인 p-NF-kB 단백질의 발현량은 증가하였다. 반면, collagenase I과 건강한 미토콘드리아를 처리한 건 조직에서는 p-NF-kB 단백질 발현량이 감소하였다(도 54). 이를 통해, 외래 건강한 미토콘드리아를 손상된 건 조직에 전달함에 따라 건 조직 내 염증이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 16. 미토콘드리아 전달에 따른 건병증 환자 유래 건세포의 세포 증식 및 관련 인자 변화 확인
외래의 건강한 미토콘드리아를 전달함에 따라 건병증 환자 유래의 건세포가 회복되는지 확인하기 위해, 실시예 4에서 분리한 건강한 미토콘드리아 1 ㎍, 5 ㎍ 또는 25 ㎍을 건병증 환자에서 분리한 건세포(Zenbio, TEN-F)에 처리하였다. 2주 후, 건세포의 증식율 및 건 관련 인자를 WST-1 분석 및 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 웨스턴 블롯은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 항-TNC 항체(Abcam,ab203676), 항-TNMD 항체(Abcam, ab203676) 및 항-Collagen type 1 항체(Abcam; ab6308)를 사용하였다. 또한, WST-1(EZ-cyto x, EZ-3000, Dozen) 분석은 배지와 1:9로 배합하여 450 nm 파장에서 측정하였다.
그 결과, 외래의 건강한 미토콘드리아를 전달함에 따라 건세포의 증식이 증가하였다(도 55). 또한, 건 관련 인자인 TNC 단백질의 발현이 미토콘드리아 전달 농도 의존적으로 감소하였고, TNMD 단백질의 발현 역시 농도 의존적으로 증가하였다. 이외에도, Collagen 단백질의 발현이 미토콘드리아가 전달되지 않은 군 대비 증가하였다(도 56 내지 도 59). 이를 통해, 외래의 건강한 미토콘드리아 전달이 손상된 건변증 환자의 건세포를 회복시키는 것을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 세포 또는 조직으로부터 분리된 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 세포는 체세포, 생식세포, 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 줄기세포가 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 중간엽줄기세포가 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물에 대하여, 상기 미토콘드리아는 0.1 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함되는, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 건 조직의 염증을 억제하는 것을 특징으로 하는 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 건 조직의 콜라겐의 손상을 입은 환자 또는 건 조직이 만성 퇴행(chronic degenerative)인 환자에게 적용되는 것을 특징으로 하는 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 건병증 환자의 collagen I, TNMD(tenomodulin), Scleraxis, hydroxyproline 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 건병증 환자의 BID(BH3 interacting-domain death agonist), Bax(Bcl-2-associated X protein), MMP1, Fis1(Mitochondrial fission 1 protein), Drp1(Dynamin-1-like protein), MFN2(Mitofusin-2), IL-1β, IL-6, p-NF-kB, TNC(tenascin C), TNF-α 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 것인, 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 건병증 예방 또는 치료방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 개체는 손상된 건 조직을 가지고 있는 것인, 건병증 예방 또는 치료방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 투여는 근육 내(intra- muscular), 정맥 내(intra-venous) 또는 건 내(intra-tendinous) 투여인 것인, 건병증 예방 또는 치료방법.
  14. 건병증을 치료하기 위한 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도.
  15. 건병증 치료용 약제를 제조하기 위한 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도.
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