WO2020159191A1 - Mls-stat3를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Mls-stat3를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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박성환
이선영
문수진
김은경
유준걸
최시영
최정원
정경아
이아람
양철우
문정현
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    • C07K2319/07—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a mitochondrial localisation signal

Definitions

  • the present invention is a recombinant peptide in which MLS (Mitochondria Localization Sequence) peptide and STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) are fused;
  • a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the recombinant peptide;
  • it relates to a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases comprising the recombinant peptide or the recombinant vector.
  • a method for treating a disease caused by an excessive immune response is to reduce or reduce various symptoms caused by the disease by administering an immunosuppressant alone or in combination.
  • Immunosuppressive agents refer to various substances used to reduce or block the ability of the host to make antibodies (humoral immune response) or the ability to produce a cellular immune response against the action of an antigen. These immunosuppressive agents can be useful not only for organ transplantation, but also for autoimmune diseases such as lupus and rheumatoid arthritis, and skin hypersensitivity reactions such as atopy and allergies. An excellent immunosuppressant should be able to control the imbalance of the immune response, ensure safety for the human body, and have a low frequency of disease recurrence during long-term treatment.
  • immunosuppressants include cyclosporine A and FK506, which are compounds derived from natural products with a complex chemical structure, and have a problem of high cost in terms of supply and demand of raw materials, which are uneconomical and may cause various side effects due to long-term administration. It has the danger of being there. Therefore, there is an urgent need for the development of new immunosuppressants capable of economic production with low toxicity and induction of immune tolerance.
  • T cells are one of the cell groups that play a central role in the immune system. T cells are produced in the thymus of the human body and undergo a series of differentiation processes to differentiate into T cells with unique characteristics. T cells that have completed differentiation are largely type 1 auxiliary cells (Th1) and type 2 depending on their function. It is divided into auxiliary cells (Th2). Among them, the main function of Th1 cells is involved in cell-mediated immunity, Th2 cells are involved in humoral immunity, and in the immune system, these two cell populations maintain the balance of the immune system through checks against each other so as not to be over-activated with each other.
  • the immune diseases can be attributed to the imbalance between these two immune cells. For example, when the activity of Th1 cells increases abnormally, autoimmune disease may occur, and the activity of Th2 cells increases abnormally. It is known that an immune disease caused by a hypersensitivity reaction occurs.
  • Tregs immunoregulatory T cells
  • Th17 cells are known to be formed through a process similar to the differentiation of Treg cells in the differentiation process of undifferentiated T cells. That is, the differentiation of Treg cells and Th17 cells is commonly done in the presence of TGF- ⁇ , whereas Treg cells do not require IL-6, whereas in the case of Th17 cells, IL-6 is present along with TGF- ⁇ . Differentiate in situations. In addition, differentiated Th17 cells are characterized by secreting IL-17.
  • Th17 cells are involved at the forefront of the inflammatory response seen in immune diseases, maximizing the signal of the inflammatory response and accelerating disease progression. Therefore, in the case of autoimmune diseases that are not controlled by Treg cells among autoimmune diseases, the development of therapeutic agents for autoimmune diseases targeting the inhibition of Th17 cell activity is greatly highlighted.
  • Immunosuppressive agents that block the signal transduction pathway in T cells are the most used immunosuppressive drugs currently used. These immunosuppressive agents are toxic, infectious, lymphoma, diabetes, tremor, headache, diarrhea, high blood pressure, nausea , There is a problem that side effects such as renal dysfunction occur.
  • a treatment method for controlling the amount of cytokines secreted from immune cells and a treatment method using antibodies targeting cytokines secreted from immune cells are developed. In the middle. However, these methods have to take a long time to actually apply to patients after undergoing clinical trials, and the method of using the antibody has a problem that it is too expensive in the antibody production process.
  • MLS Mitochondria Localization Sequence
  • STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the recombinant peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases comprising the recombinant peptide or the recombinant vector as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases, comprising administering an effective amount of the recombinant peptide or the recombinant vector to an individual.
  • the present invention provides a recombinant peptide in which Mito (Mitochondria Localization Sequence) peptide and STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) are fused.
  • the recombinant peptide may be made of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the recombinant peptide.
  • the polynucleotide may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases comprising the recombinant peptide or the recombinant vector as an active ingredient.
  • Diabetic retinopathy rhinitis
  • Ischemia-reperfusion injury Post-angioplasty restenosis
  • COPD Chronic obstructive pulmonary diseases
  • Graves disease gastrointestinal allergy (Gastrointestinal allergies), conjunctivitis (Conjunctivitis), atherosclerosis (Atherosclerosis), coronary artery disease (Coronary artery
  • the recombinant peptide or the recombinant vector may be one that overexpresses STAT3 in the mitochondria.
  • the recombinant peptide or the recombinant vector may be to inhibit the expression of IL-17, an inflammatory cytokine.
  • the composition may be administered parenterally.
  • the composition may be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously or intraarticularly.
  • the present invention provides a method for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases, comprising administering an effective amount of the recombinant peptide or the recombinant vector to an individual.
  • composition according to the present invention can be useful for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases by suppressing the expression of inflammatory cytokines including IL-17 by allowing STAT3 to be overexpressed in the mitochondria.
  • FIG. 1 shows a cleavage map of the MLS-mouse STAT3 recombinant vector.
  • 2A shows specific DNA sequence information of the MLS-mouse STAT3 recombinant vector.
  • 2B shows specific amino acid sequence information of the MLS-mouse STAT3 recombinant vector.
  • Mock Mock
  • WT-STAT WT-STAT
  • MS MLS-STAT3
  • 5A is a result of analyzing an arthritis score and an arthritis incidence after injecting a Mock or MLS-STAT3 recombinant vector into an arthritis-induced mouse.
  • 5B is a result of analyzing the expression level of IgG, IgG1 and IgG2a by separating the serum of the mouse after injecting the Mock or MLS-STAT3 recombinant vector into the mouse inducing arthritis.
  • FIG. 7 shows the expression levels of IL-17, TNF- ⁇ , IL-6 and IL-1 ⁇ through immunohistochemical staining after injecting a Mock or MLS-STAT3 recombinant vector into a mouse induced arthritis. It is the result of the analysis.
  • FIG. 8A shows qPCR expression levels of CYCS (Cytochrome C, Somatic), COX5B (cytochrome c oxidase subunit 5B) and ATP5O (ATP synthase subunit O) after treatment of IL-17 or H2O2+IL-17 on FLS cells. The results are analyzed through.
  • CYCS Cytochrome C, Somatic
  • COX5B cytochrome c oxidase subunit 5B
  • ATP5O ATP synthase subunit O
  • 8B is a result of analyzing the degree of apoptosis through PI/Annexin V staining after treating IL-17 or H2O2+IL-17 on OA (osteoarithritis)-derived FLS cells or RA (rheumatoid arthritis)-derived FLS cells.
  • 8C is a result of analyzing expression of Bcl2 through IL-17 treatment on FLS cells and confocal analysis.
  • FIG. 12 is a diagram showing the cleavage map and genotyping results of the mouse STAT3 overexpression vector (A; mouse STAT3 overexpression vector cleavage map, B; genotyping result).
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of confirming Th17 inhibition and Treg regulation, inflammatory macrophage control, and anti-inflammatory macrophage increase in a flow cytometer in MLS-STAT3 overexpressing mice.
  • FIG. 14 is a diagram confirming the improvement effect of the arthritis index and arthritis invention of MLS-STAT3 in rheumatoid arthritis mice induced by STAT3.
  • 15 is a diagram confirming Th17 and Treg regulatory effects of MLS-STAT3 and migration of pSTAT3 727 into mitochondria in rheumatoid arthritis mice induced by STAT3.
  • Figure 16 is a diagram showing the results of measuring the mouse weight and intestinal length in order to confirm the effect of MLS-STAT3 in inflammatory bowel disease-induced mice.
  • 17 is a diagram confirming the modulating effect of inflammatory macrophage M1 and anti-inflammatory macrophage M2 of MLS-STAT3 in mice in which inflammatory bowel disease is induced.
  • FIG. 18 is a diagram confirming the inhibitory effect of MLS-STAT3 autoantibody (MOG specific IgG) in encephalomyelitis-induced mice.
  • 19A shows a cleavage map of MLS-human STAT3 recombinant vector.
  • Figure 19B is a result of measuring the expression level of STAT3 in mitochondria through Western blotting after introducing Mock (M) or MLS-STAT3 (MS) recombinant vector into human NIH3T3 cells.
  • 19C is a result of analyzing the expression level of pMLKL through Western blotting after introducing a Mock (M) or MLS-STAT3 (MS) recombinant vector into human NIH3T3 cells.
  • M Mock
  • MS MLS-STAT3
  • 20A shows specific DNA sequence information of the MLS-human STAT3 recombinant vector.
  • 20B shows specific amino acid sequence information of the MLS-human STAT3 recombinant vector.
  • 21 is a diagram showing the results of mitochondrial function recovery and Th17 cell activity control of MLS-human STAT3.
  • the present invention is a recombinant peptide in which MLS (Mitochondria Localization Sequence) peptide and STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) are fused;
  • a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the recombinant peptide;
  • it provides a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases, including the recombinant peptide or the recombinant vector.
  • the recombinant peptide of the present invention may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and includes a functional equivalent to a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the “functional equivalent” is a result of addition, substitution, or deletion of an amino acid, and at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and more preferably, the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • the “substantially homogeneous activity” means the activity of the MLS-STAT3.
  • the functional equivalent may include, for example, a part of the amino acid sequence of the amino acid sequence according to the present invention is substituted, a deletion or an added amino acid sequence variant.
  • Substitution of amino acids may preferably be conservative substitutions, and examples of conservative substitutions of naturally occurring amino acids are as follows; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Deletion of amino acids may preferably be located in portions not directly involved in the recombinant peptide activity of the present invention.
  • the polynucleotide encoding the recombinant peptide of the present invention is introduced into an expression vector such as a plasmid or viral vector by a known method, and then the expression vector is transduced or transfected by various methods known in the art. ) Can be introduced into target cells in an expression form.
  • Plasmid expression vector is a FDA-approved gene delivery method that can be used for humans, and is a method for directly delivering plasmid DNA to human cells (Nabel, EG et al, Science, 249:1285-1288, 1990). Unlike viral vectors, it has the advantage that it can be purified to homogeneity.
  • a plasmid expression vector that can be used in the present invention a mammalian expression plasmid known in the art can be used.
  • Plasmid expression vectors comprising nucleic acids according to the present invention are methods known in the art, for example, transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion. , Calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electricity It can be introduced into the target cell by an electroporation, gene gun and other known methods for introducing DNA into the cell, but is not limited thereto (Wu et al, J Bio Chem, 267 :963-967, 1992; Wu et al, Bio Chem, 263:14621-14624, 1988).
  • the vector can be administered into cells, tissues or body by known methods, for example, topically, parenterally, nasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or other suitable means. have.
  • the vector can be injected directly in an effective amount to treat target tissue or target cells.
  • composition according to the present invention may be used as a pharmaceutical composition capable of preventing and treating autoimmune diseases or inflammatory diseases, and the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction or similar reaction, such as gastrointestinal disorder, dizziness, etc., when administered to a human.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, oral administration carriers such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like, and for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, etc. Carriers and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-parabens and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form according to a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. That is, the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in various parenteral or oral dosage forms according to a known method, and isotonic aqueous solution or suspension is preferred as a formulation for injection as a representative of the parenteral dosage form. Injectable formulations can be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component can be formulated for injection by dissolving it in saline or buffer.
  • oral dosage forms include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills and capsules.
  • the present invention provides a method for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases, comprising administering an effective amount of the recombinant peptide or the recombinant vector to an individual.
  • the method of treatment of the present invention comprises administering the recombinant peptide or the recombinant vector to a subject in a therapeutically effective amount.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular individual includes the specific composition, age, weight, general health status, gender and diet, time of administration, and the type and extent of the reaction to be achieved, and, in some cases, whether other agents are used. It is desirable to apply differently depending on the route of administration, the secretion rate of the composition, the duration of treatment, and various factors including drugs used with or concurrently with the specific composition and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • the daily dosage is 0.0001 to 100 mg/kg based on the amount of the pharmaceutical composition of the present invention, preferably 0.01 to 100 mg/kg, and can be administered 1 to 6 times a day.
  • the dosage or dosage of each active ingredient should be such that it does not cause side effects by including the content of each active ingredient too high. Therefore, it is preferable to determine the effective amount of a composition suitable for the purpose of the present invention in consideration of the above.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates, as well as livestock such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • the recombinant peptide or recombinant vector of the present invention can be administered to various mammals such as rats, mice, livestock, and humans by various routes. All modes of administration can be expected, for example, oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dura or intracerebroventricular injection.
  • Example 1 MLS-STAT3 (Mitochondria Localization Sequence-Signal Transducer and Activator of Transcription 3) Production of overexpression recombinant vector and confirmation of overexpression
  • MLS-STAT3 In order to prepare a vector (hereinafter referred to as "MLS-STAT3") in which STAT3 is moved into and expressed in mitochondria, the present inventors of BamHI-NotI in the pEGFP-N3 vector, which is a GFP vector in which a MLS (Mitochondria Localization Sequence) sequence exists. After cutting the restriction enzyme site, the DNA sequence of mouse STAT3 was inserted into the site. The cleavage map of the recombinant vector of MLS-mouse STAT3 overexpression is shown in Fig. 1, and the DNA sequence information and amino acid sequence information of the recombinant vector of MLS-mouse STAT3 overexpression are shown in Fig. 2.
  • the present inventors introduced the produced recombinant vector into HEK293 cells to confirm whether the produced MLS-STAT3 is overexpressed in the mitochondria, and after separating the mitochondria of the introduced cells, whether to express STAT3 through Western blotting To confirm the experiment was performed. As a result, it was confirmed that STAT3 was overexpressed in the mitochondria of HEK293 cells into which the MLS-STAT3 recombinant vector was inserted, which was significantly expressed than when the control (Mock) or STAT3 recombinant vector without the MLS sequence (WT-STAT3) was inserted. It was confirmed that the amount was increased (Fig. 3).
  • the present inventors performed confocal analysis to confirm whether MLS-STAT3 is overexpressed in mitochondria of HEK293 cells. As a result, when the MLS-STAT3 recombinant vector was inserted into HEK293 cells, it was confirmed that STAT3 was overexpressed in the mitochondria of HEK293 cells (FIG. 4 ).
  • Example 2 Treatment effect of rheumatoid arthritis by recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression
  • the present inventors performed an experiment to analyze the therapeutic effect after injecting the vector into an animal model inducing rheumatoid arthritis to confirm the therapeutic effect of rheumatoid arthritis by a recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression.
  • a CIA collagen-induced arthritis-induced mouse animal model was prepared by injecting Type II Collagen into a DBA1/J mouse, and post-mock or MLS-STAT3 recombinant vector to the mouse 1 week after inducing arthritis. Electroporation was performed every week for 11 weeks (100 ⁇ g). Subsequently, the arthritis score and arthritis incidence were analyzed. Arthritis evaluation criteria are as follows.
  • Example 3 Effect of antibody regulation by recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression
  • the present inventors carried out an experiment to confirm whether the antibody modulating effect is achieved by a recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression in an animal model in which rheumatoid arthritis is induced. Briefly, blood was obtained from the arthritis-induced mice used in Example 2 and serum was separated again, and then expression levels of IgG, IgG1 and IgG2a were analyzed by ELISA.
  • Example 4 Inhibition effect of cartilage damage of rheumatoid arthritis by recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression
  • the present inventors conducted an experiment to confirm whether there is an effect of inhibiting cartilage damage by a recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression in an animal model in which rheumatoid arthritis is induced. Briefly, the articular tissue obtained in the arthritis-induced mouse was fixed with 10% formalin, decalcified from the bone, embedded in paraffin, and then the tissue was made into a 7 ⁇ m thick section and attached to the slide. Thereafter, H&E staining and Safranin O staining were performed, and bone damage and cartilage damage were analyzed through an optical microscope.
  • rheumatoid arthritis can be treated by inhibiting cartilage damage when the MLS-STAT3 recombinant vector is injected.
  • Example 5 Inhibitory effect of expression of inflammatory cytokines in joints by recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression
  • the present inventors conducted an experiment to confirm whether there is a change in inflammatory cytokines in the joint by a recombinant vector of MLS-STAT3 overexpression in an animal model in which rheumatoid arthritis was induced. Briefly, immunohistochemical staining was performed from joint tissues obtained from arthritis-induced mice to analyze expression levels of inflammatory cytokines IL-17, TNF- ⁇ , IL-6 and IL-1 ⁇ . .
  • rheumatoid arthritis can be treated by reducing the expression level of inflammatory cytokines when the MLS-STAT3 recombinant vector is injected.
  • Example 6 Effect of reducing expression of mitochondrial gene by inflammatory cytokine IL-17
  • the present inventors conducted an experiment to confirm the effect of mitochondrial function and activity on IL-17, an inflammatory cytokine.
  • IL-17 an inflammatory cytokine.
  • CYCS Cytochrome C, Somatic
  • COX5B cytochrome c oxidase subunit 5B
  • ATP5O ATP synthase subunit O
  • the present inventors in order to analyze whether necroptosis is induced in FLS cells derived from RA (Rheumatoid Arthritis) by IL-17, the osteoarthritis (OA)-derived FLS cells (control) or RA-derived FLS cells Flow cytometry was performed by treating IL-17 and staining with PI/Annexin V.
  • IL-17 an inflammatory cytokine, inhibits the expression of the mitochondrial gene, increases the death of inflammatory cells, but suppresses the death of normal cells.
  • Example 7 Control of Th17 cell activity and confirmation of Treg cell activity by MLS-STAT3 overexpressing recombinant vector
  • Th17 cells are known to accelerate the disease of inflammatory diseases, it was confirmed that the MLS-STAT3 overexpression vector of the present invention inhibits the activity of Th17.
  • Treg cells that differentiate in an environment similar to Th17 are known to suppress inflammation by regulating Th1 cells, thus confirming that the activity of Treg cells is increased by the MLS-STAT3 overexpression vector.
  • mouse spleen cells were obtained 11 weeks after arthritis induction in arthritis-induced mice, FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated antiforkhead box P3 (Foxp3 ), APC-conjugated anti-CD25, FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-IL-17 and FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-pSTAT3(S727), APC-conjugated anti-COX4(eBiosciences) , San Diego, CA, USA).
  • the stained sections were visualized using a Zeiss microscope (LSM 510 Meta; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).
  • Example 8-1 Confirmation of inflammatory cell death control by MLS-STAT3 overexpressing recombinant vector
  • inflammatory cell death was induced by treating RIP1, RIP3 and pMKL with synovial tissue obtained from mice.
  • the MLS-STAT3 overexpression vector was treated, fixed with 10% formalin, embedded in paraffin, and then the tissue was made into a 7 ⁇ m thick section and attached to the slide. Thereafter, H&E staining was performed, and inflammatory cell death of synovial tissue was analyzed through an optical microscope.
  • Example 8-2 Confirmation of increase in normal apoptosis by recombinant vector overexpressing MLS-STAT3
  • Normal apoptosis is one of the processes in which arthritis is treated.
  • the expression of the apoptotic factor BAX in the articular synobium tissue of arthritis-induced mice is expressed. Tissue analysis. It was confirmed that the BAX apoptosis factor was increased in the articular sinobium tissue of the rheumatoid arthritis animal model injected with MLS-STAT3 overexpression vector.
  • the present inventors cut the restriction enzyme site of XhoI-NotI from the pCMV/myc/mito vector in which the MLS sequence is present, and then insert the DNA sequence of mouse STAT3 into the site to insert MLS-mouse A recombinant vector of STAT3 overexpression was constructed.
  • the cleavage map of the recombinant vector of MLS-mouse STAT3 overexpression is shown in FIG. 12.
  • Example 10 MLS-mSTAT3 overexpression Th17 inhibition and Treg induction regulation and pathogenesis-controlled macrophage regulation confirmation
  • Example 11-1 Confirmation of treatment effect of MLS-mSTAT3 overexpression vector on STAT3 induced rheumatoid arthritis
  • rheumatoid arthritis induced by overexpression of STAT3 it was confirmed whether the therapeutic effect of the MLS-mSTAT3 overexpression vector of the present invention was found.
  • An animal model inducing rheumatoid arthritis was prepared by injecting a vector overexpressing STAT3 into a DBA1/J mouse, and electroporation of a vector recombined with STAT3 OVN alone or MLS-mSTAT3 into the mouse 1 week after inducing arthritis. Each week was injected (100 ⁇ g) for 11 weeks. Then, the arthritis score and arthritis invention were analyzed. Arthritis evaluation criteria are as follows.
  • Example 11-2 Confirmation of Th17 and Treg regulatory effects in treatment efficacy of MLS-mSTAT3 overexpression vector against STAT3 induced rheumatoid arthritis
  • mice spleen cells were obtained 35 days after arthritis was induced, FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated antiforkhead box P3 (Foxp3), APC-conjugated anti-CD25, FITC Staining with -conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-IL-17 and FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-pSTAT3 (S727), APC-conjugated anti-COX4 (eBiosciences, San Diego, CA, USA) Did. The stained sections were visualized using a Zeiss microscope (LSM 510 Meta; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).
  • Treg CD4+CD25+Foxp3+
  • p-STAT3 727 expression in the nucleus decreased compared to the control group
  • p-STAT3 727 CD4+COX4+p-STAT3 727+
  • the present inventors drink 2.5% dextran sulfate sodium (DSS) water for 1 week to induce inflammatory bowel disease in order to confirm the effect on the inflammatory bowel disease in the transgenic mice expressing MLS-mSTAT3 of the present invention.
  • DSS dextran sulfate sodium
  • the weight of the control group was found to decrease rapidly after 5 days of administration, and in the MLS-mSTAT3 transgenic group, there was no change in weight, and it was confirmed that the weight was maintained (FIG. 16 ).
  • Example 13 Inflammatory inflammatory disease-induced MLS-mSTAT3 transgenic mouse Inflammatory macrophage M1 inhibition and anti-inflammatory macrophage M2 regulation confirmation
  • inflammatory macrophage M1 and anti-inflammatory macrophage M2 in lymphocytes were identified.
  • the spleen cells were isolated from the mouse experimental group in which intestinal disease was induced, and then stained with FITC-conjugated anti-CD11c and PE-conjugated anti-CD206 in the spleen cells to analyze the flow cytometry.
  • MLS-mSTAT3 overexpressing transgenic mice induced MOG-specific encephalomyelitis disease was collected and the mouse anti-MOG specific IgG concentration was measured by ELISA.
  • C57BL/6 normal mice and EAE-induced C57BL/6 were used as controls.
  • Anti-MOG specific IgG antibody measurement method is as follows. The MOG was diluted in 0.05M sodium carbonate coating buffer (pH 9.6) at a concentration of 4 ⁇ g/ml and applied to a 96-well microtiter plate, and then left at 4° C. for 18 hours.
  • TBS TBS
  • BSA bovine serum albumin
  • Tween 20 50 ⁇ l per well of the diluted serum sample was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the MLS-mSTAT3 overexpressing transgenic mouse having the onset of encephalomyelitis of the present invention significantly reduced the MOG specific antibody MOG specific IgG antibody compared to the control group.
  • the MLS-STAT3 of the present invention can effectively inhibit the autoantibody activity reaction (FIG. 18).
  • Example 15 Construction of recombinant vector of MLS-human STAT3 overexpression and confirmation of overexpression
  • the present inventors cut the restriction enzyme site of XhoI-NotI from the pCMV/myc/mito vector in which the MLS sequence is present for verification of the MLS-STAT3 overexpression vector in human cells, and then cut the DNA sequence of human STAT3 into the site. By inserting, a recombinant vector expressing MLS-human STAT3 was constructed.
  • the cleavage map of the MLS-human STAT3 overexpression vector is shown in FIG. 19A, and specific DNA sequence information and amino acid sequence information of the MLS-human STAT3 overexpression vector are shown in FIG. 20.
  • the present inventors introduced the produced recombinant vector into human-derived NIH3T3 cells to confirm whether the produced MLS-human STAT3 overexpression vector was overexpressed in the mitochondria, and after separating the mitochondria of the introduced cells, Western blotting Through the experiment to determine whether the expression of STAT3 was performed. As a result, it was confirmed that human STAT3 was significantly overexpressed in the mitochondria of NIH3T3 cells into which MLS-human STAT3 overexpression vector was inserted, compared to the control (Mock) (FIG. 19B).
  • the present inventors performed an experiment to confirm the expression levels of the inflammatory cell death factor pMLKL (phospho MLKL, mixed lineage kinase domain like pseudokinase) and caspase after injecting the MLS-human STAT3 overexpressing recombinant vector. As a result, it was confirmed that the MLS-human STAT3 overexpressing recombinant vector has an effect of significantly reducing the expression of inflammatory killing factor pMLKL (FIG. 19C ).
  • pMLKL phospho MLKL, mixed lineage kinase domain like pseudokinase
  • rheumatoid arthritis can be treated by reducing the expression level of the inflammatory killing factor when the MLS-human STAT3 overexpression vector is injected.
  • Example 16 MLS-human STAT3 overexpression vector injection mitochondrial function recovery of T cells and Th17 cell activity control
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell mononuclear cell mononuclear cell
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell mononuclear cell
  • MOCK metal-oxide-semiconductor
  • MLS-human STAT3 overexpression vectors were respectively overexpressed.
  • JC1 was stained for mitochondrial potential analysis, and flow cytometry was performed.
  • PerCP-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-IL-17, and FITC-conjugated anti-IFN ⁇ were stained on each vector-expressed PBMC to analyze pathogenic Th17 cells and Th1 cells, and analyzed by flow cytometry.
  • Example 17 Control of rheumatoid arthritis disease of MLS-human STAT3 overexpression vector
  • a mouse model in which rheumatoid arthritis was induced was prepared. Arthritis was induced by subcutaneous injection of type 2 collagen into DBA1/J mice (8 times a week after induction of arthritis, MLS-human STAT3 overexpression vector and control vector) Each was injected into the mouse in an amount of 50 ul/mice through a hydrodynamic injection method.
  • the hydrodynamic injection method is a method of introducing a gene into the cytoplasm through a cell membrane using physical force, and injecting the recombinant vector of the present invention diluted in physiological saline into the tail vein.
  • type 2 collagen was mixed with an adjuvant (IFA) in a volume ratio of 1:1 and injected into the tail.
  • MLS-human STAT3 was injected into the right thigh, and a week later, it was again injected into the left thigh. MLS-human STAT3 was injected. In this case, a group injecting a mock vector that does not contain the Human STAT3 gene was used as the control group. Arthritis symptoms were then measured.
  • the MLS-STAT3 overexpression vector of the present invention inhibits Th17 activity and induces Treg, has an improvement effect in rheumatoid arthritis induced by STAT3, and suppresses inflammatory macrophage M1 and anti-inflammatory macrophage M2 in inflammatory bowel disease. It can be used as a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases, since it was confirmed that it has an inhibitory ability against autoantibodies in autoimmune cerebrospinal diseases.

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Abstract

본 발명은 MLS(Mitochondria Localization Sequence) 펩타이드와 STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)이 융합된 재조합 펩타이드; 상기 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물으로서, 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터는 STAT3가 미토콘드리아 내에서 과발현되어 미토콘드리아 기능 상향을 통한 IL-17를 포함한 염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

MLS-STAT3를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 MLS(Mitochondria Localization Sequence) 펩타이드와 STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)이 융합된 재조합 펩타이드; 상기 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 펩타이드 또는 상기의 재조합 벡터를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있지만, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다.
면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다.
현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용이 드는 문제점이 있어 비경제적이고, 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성 및 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.
따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 가지 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다.
또한, Treg 세포 이 외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.
또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 MLS(Mitochondria Localization Sequence) 펩타이드와 STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)이 융합된 재조합 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MLS(Mitochondria Localization Sequence) 펩타이드와 STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)이 융합된 재조합 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 자가면역질환 또는 염증성질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 뇌척수염(encephalomyelitis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina) 및 소동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터는 미토콘드리아에서 STAT3를 과발현시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터는 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 비경구로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 관절강내 투여되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 STAT3가 미토콘드리아 내에서 과발현되도록 하여 IL-17를 포함한 염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 MLS-mouse STAT3 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2A는 MLS-mouse STAT3 재조합 벡터의 구체적인 DNA 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 2B는 MLS-mouse STAT3 재조합 벡터의 구체적인 아미노산 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 3은 HEK293 세포에 Mock (M), WT-STAT (W) 또는 MLS-STAT3 (MS) 재조합 벡터를 도입한 후, 웨스턴블럿팅을 통해 미토콘드리아 내의 STAT3 발현량을 측정한 결과이다.
도 4는 HEK293 세포에 MLS-STAT3 재조합 벡터를 도입한 후, 공초점(confocal) 분석을 통해 미토콘드리아 내에서 STAT3의 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 5A는 관절염이 유도된 마우스에 Mock 또는 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 후, 관절염 지수(arthritis score) 및 관절염 발병 정도(incidence)를 분석한 결과이다.
도 5B는 관절염이 유도된 마우스에 Mock 또는 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 후, 마우스의 혈청을 분리하여 IgG, IgG1 및 IgG2a의 발현량을 ELISA를 통해 분석한 결과이다.
도 6은 관절염이 유도된 마우스에 Mock 또는 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 후, H&E 염색 및 Safranin O 염색을 통해 골 손상 정도(bone damage) 및 연골 손상 정도(cartillage damage)를 분석한 결과이다.
도 7은 관절염이 유도된 마우스에 Mock 또는 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 후, 면역조직화학염색(Immunohistochemical Staining)을 통해 IL-17, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현량을 분석한 결과이다.
도 8A은 FLS 세포에 IL-17 또는 H2O2+IL-17을 처리한 후, CYCS(Cytochrome C, Somatic), COX5B(cytochrome c oxidase subunit 5B) 및 ATP5O(ATP synthase subunit O)의 발현량을 qPCR를 통해 분석한 결과이다.
도 8B는 OA(osteoarithritis) 유래 FLS 세포 또는 RA(rheumatoid arthritis) 유래 FLS 세포에 IL-17 또는 H2O2+IL-17을 처리한 후, PI/Annexin V 염색을 통해 세포사멸 정도를 분석한 결과이다.
도 8C는 FLS 세포에 IL-17을 처리한 후, 공초점(confocal) 분석을 통해 Bcl2의 발현을 분석한 결과이다.
도 9는 MLS-STAT3 과발현에 의한 Th17 활성 인자인 IL-17 및 Treg 활성인자의 동시조절과 미토콘드리아 내 pSTAT3 727 이동에 대한 결과이다. (대조군; MOCK, 실험군 MLS STAT3).
도 10은 활막 조직의 염증성 세포사멸과 관련된 인자들의 조절을 확인한 결과이다(대조군; MLS mocl, 실험군; MLS STAT3).
도 11은 활막 조직의 정상 세포사멸 관련 인자들의 조절을 확인한 결과이다(대조군; MLS mocl, 실험군; MLS STAT3).
도 12는 마우스 STAT3 과발현 벡터의 개열지도 및 지노타이핑 결과를 나타낸 도이다(A; 마우스 STAT3 과발현 벡터 개열지도, B; 지노타이핑 결과).
도 13은 MLS-STAT3 과발현 마우스에서 Th17 억제 및 Treg 조절과 염증형 마크로파지 제어와 항염증형 마크로파지 증가를 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 STAT3에 의해 유도된 류마티스관절염 마우스에서 MLS-STAT3의 관절염 지수 및 관절염 발명의 개선 효과를 확인한 도이다.
도 15는 STAT3에 의해 유도된 류마티스관절염 마우스에서 MLS-STAT3의 Th17 및 Treg 조절 효과 및 미토콘드리아 내로의 pSTAT3 727 이동을 확인한 도이다.
도 16은 염증성 장질환이 유도된 마우스에서, MLS-STAT3의 효과를 확인하기 위해 마우스 체중 및 장의 길이를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 염증성 장질환이 유도된 마우스에서, MLS-STAT3의 염증형 마크로파지 M1 및 항염증형 마크로파지 M2의 조절 효과를 확인한 도이다.
도 18는 뇌척수염 유도 마우스에서, MLS-STAT3의 자가 항체(MOG specific IgG) 억제 효력을 확인한 도이다.
도 19A는 MLS-human STAT3 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 19B는 인간 NIH3T3 세포에 Mock (M) 또는 MLS-STAT3 (MS) 재조합 벡터를 도입한 후, 웨스턴블럿팅을 통해 미토콘드리아 내의 STAT3 발현량을 측정한 결과이다.
도 19C는 인간 NIH3T3 세포에 Mock (M) 또는 MLS-STAT3 (MS) 재조합 벡터를 도입한 후, 웨스턴블럿팅을 통해 pMLKL의 발현량을 분석한 결과이다.
도 20A은 MLS-human STAT3 재조합 벡터의 구체적인 DNA 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 20B는 MLS-human STAT3 재조합 벡터의 구체적인 아미노산 서열 정보를 나타낸 것이다.
도 21은 MLS-human STAT3의 미토콘드리아 기능회복 및 Th17 세포 활성 제어 결과를 나타낸 도이다.
도 22은 MLS-human STAT3의 류마티스관절염 질환에 대한 제어 효과를 확인한 결과이다.
본 발명은 MLS(Mitochondria Localization Sequence) 펩타이드와 STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)이 융합된 재조합 펩타이드; 상기 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 펩타이드 또는 상기의 재조합 벡터를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 재조합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드에 대해 기능적 동등물을 포함한다.
상기 "기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 상기 "실질적으로 동질의 활성"이란 상기 MLS-STAT3의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 재조합 펩타이드 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다.
본 발명의 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서(Nabel, E G et al, Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사(microinjection), 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 목적세포 내로 도입할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다(Wu et al, J Bio Chem, 267:963-967, 1992; Wu et al, Bio Chem, 263:14621-14624, 1988).
또한, 상기 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직 또는 표적 세포를 치료하기 위한 유효량으로 직접 주사할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 자가면역질환 또는 염증성질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는, 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 일일 투여량은 본 발명의 약학조성물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 다만, 각 유효성분의 복용량 또는 투여량이 각 유효성분의 함량을 지나치게 높게 포함하여 부작용을 초래하지 않을 정도이어야 함은 당업자에게 자명하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명의 재조합 펩타이드 또는 재조합 벡터는, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. MLS-STAT3 (Mitochondria Localization Sequence-Signal Transducer and Activator of Transcription 3) 과발현의 재조합 벡터 제작 및 과발현 확인
본 발명자들은 STAT3가 미토콘드리아 내로 이동하여 발현되는 벡터(이하, "MLS-STAT3"라 함)를 제조하기 위하여, MLS(Mitochondria Localization Sequence) 서열이 존재하는 GFP 벡터인 pEGFP-N3 벡터에서 BamHI-NotI의 제한효소 부위를 자른 후 상기 부위에 mouse STAT3의 DNA 서열을 삽입하였다. MLS-mouse STAT3 과발현의 재조합 벡터의 개열 지도는 도 1에 나타내었고, MLS-mouse STAT3 과발현의 재조합 벡터의 DNA 서열정보 및 아미노산 서열정보는 도 2에 나타내었다.
이후, 본 발명자들은 제작된 MLS-STAT3가 미토콘드리아 내에서 과발현되는지 확인하기 위하여, 제작된 재조합 벡터를 HEK293 세포에 도입하고, 도입된 세포의 미토콘드리아를 분리한 후, 웨스턴블럿팅을 통해 STAT3의 발현 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, MLS-STAT3 재조합 벡터가 삽입된 HEK293 세포의 미토콘드리아 내에서는 STAT3가 과발현됨을 확인하였고, 이는 대조군(Mock) 또는 MLS 서열이 없는 STAT3 재조합 벡터(WT-STAT3)가 삽입된 경우보다 현저하게 발현량이 증가됨을 확인하였다 (도 3).
또한, 본 발명자들은 MLS-STAT3가 HEK293 세포의 미토콘드리아 내에서 과발현되는지 확인하기 위하여 공초점(confocal) 분석을 수행하였다. 그 결과, MLS-STAT3 재조합 벡터가 HEK293 세포에 삽입된 경우, STAT3는 HEK293 세포의 미토콘드리아 내에서 과발현됨을 확인하였다 (도 4).
실시예 2. MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의한 류마티스 관절염의 치료 효과
본 발명자들은 MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의한 류마티스 관절염의 치료 효과를 확인하기 위하여, 류마티스 관절염이 유발된 동물모델에 상기 벡터를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다. 간단하게, DBA1/J 마우스에 Type II Collagen을 주입하여 CIA(collagen-induced arthritis)가 유도된 마우스 동물모델을 준비하였고, 관절염을 유발시킨 후 1주일 후부터 마우스에 Mock 또는 MLS-STAT3 재조합 벡터를 전기천공법(electroporation)으로 11주 동안 매주 주입(100μg)하였다. 이후, 관절염 지수(arthritis score) 및 관절염 발병 정도(incidence)를 분석하였다. 관절염 평가 기준은 다음과 같다.
-평가 기준-
0점: 부종이나 종창이 없다.
1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
5점 이상: 부종과 발적의 증상이 심각하게 계속 진행되는 경우
그 결과, 관절염이 유도된 마우스에 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 경우 대조군(Mock)에 비해 현저하게 관절염 지수가 낮아짐을 확인하였고, 관절염 발병 정도 역시 대조군에 비해 현저하게 낮아짐을 확인하였다 (도 5A).
따라서, MLS-STAT3 재조합 벡터에 의해 류마티스 관절염을 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의한 항체 조절 효과
본 발명자들은 류마티스 관절염이 유도된 동물모델에서 MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의하여 항체 조절 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단하게, 상기 실시예 2에서 사용한 관절염이 유도된 마우스에서 혈액을 수득하고 다시 혈청을 분리한 후, IgG, IgG1 및 IgG2a의 발현량을 ELISA를 통해 분석하였다.
그 결과, MLS-STAT3 재조합 벡터가 주입된 마우스에서는 대조군(Mock)에 비해 IgG의 발현이 감소되었고, Th2 반응과 관련있는 IgG1의 발현은 약간 증가하였으며, Th1 반응과 관련있는 IgG2a의 발현은 감소하였다 (도 5B).
따라서, MLS-STAT3 재조합 벡터가 주입된 경우, Th2와 같은 항염증성 항체는 증가되고, Th1과 같은 염증성 항체의 생성은 억제됨으로써, 류마티스 관절염을 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의한 류마티스 관절염의 연골 손상 억제 효과
본 발명자들은 류마티스 관절염이 유도된 동물모델에서 MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의하여 연골 손상을 억제하는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단하게, 관절염이 유도된 마우스에서 수득된 관절 조직을 10% 포르말린으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀에 포매한 후 조직을 7 μm 두께의 절편을 만들어서 슬라이드에 부착하였다. 이후, H&E 염색 및 Safranin O 염색을 진행하고, 광학현미경을 통해 골 손상 정도(bone damage) 및 연골 손상 정도(cartillage damage)를 분석하였다.
그 결과, 관절염이 유도된 마우스에 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 경우 대조군(Mock)에 비해 골 손상 정도가 약 75% 정도로 낮아졌고, 연골 손상 정도는 약 40% 정도로 현저히 낮아졌음을 확인하였다 (도 6).
따라서, MLS-STAT3 재조합 벡터가 주입된 경우 연골 손상을 억제함으로써 류마티스 관절염을 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의한 관절 내 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과
본 발명자들은 류마티스 관절염이 유도된 동물모델에서 MLS-STAT3 과발현의 재조합 벡터에 의하여 관절 내의 염증성 사이토카인의 변화가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단하게, 관절염이 유도된 마우스에서 수득된 관절 조직으로부터 면역조직화학염색(Immunohistochemical Staining)을 수행하여 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현량을 분석하였다.
그 결과, 관절염이 유도된 마우스에 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 경우 대조군(Mock)에 비해 IL-17, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현량이 유의적으로 감소됨을 확인하였다 (도 7).
따라서, MLS-STAT3 재조합 벡터가 주입된 경우 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시킴으로써 류마티스 관절염을 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 염증성 사이토카인인 IL-17에 의한 미토콘드리아 유전자의 발현 감소 효과
본 발명자들은 염증성 사이토카인인 IL-17에 미토콘드리아의 기능 및 활성에 관여되는 효과를 확인하는 실험을 수행하였다. 우선, FLS(fibroblast-like synoviocyte) 세포에 IL-17을 처리한 후, 미토콘드리아 유전자인 CYCS(Cytochrome C, Somatic), COX5B(cytochrome c oxidase subunit 5B) 및 ATP5O(ATP synthase subunit O)의 발현량을 qPCR를 통해 분석하였다.
그 결과, IL-17을 처리한 경우에는 대조군(Nil)에 비해 미토콘드리아 유전자의 발현량이 감소되었고, H2O2에 의한 ROS 유도와 함께 IL-17을 처리한 경우에는 미토콘드리아 유전자의 발현량이 더욱 감소됨을 확인하였다 (도 8A).
또한, 본 발명자들은 IL-17에 의한 RA(Rheumatoid Arthritis) 유래 FLS 세포 내에서 네크롭토시스(Necroptosis)가 유도되는지 분석하기 위하여, OA(osteoarthritis) 유래 FLS 세포(대조군) 또는 RA 유래 FLS 세포에 IL-17을 처리하고 PI/Annexin V 염색하여 유세포 분석을 수행하였다.
그 결과, IL-17을 처리한 경우, RA 유래 FLS 세포에서는 대조군인 OA 유래 FLS 세포에 비해 초기 사멸(early apoptotic)되는 염증성 세포가 현저히 증가되었고, H2O2 산화 스트레스 하에서 IL-17이 처리된 경우, RA 유래 FLS 세포에서 초기 사멸되는 세포의 수가 특이적으로 증가됨을 확인하였다 (도 8B). 초기 사멸된 세포는 네크롭토시스가 유도된 세포로서, IL-17은 RA 유래 FLS 세포에서 염증성 세포사멸인 네크롭토시스를 유도하는 것으로 확인하였다. 또한, 공초점(confocal) 분석에서는 IL-17을 처리한 경우 항-세포사멸인자인 Bcl2를 활성시키는 것으로 확인되었다 (도 8C).
따라서, 염증성 사이토카인인 IL-17은 미토콘드리아 유전자의 발현을 억제하고, 염증성 세포의 사멸은 증가시키나, 정상 세포의 사멸은 억제시키는 것으로 확인되었다.
실시예7. MLS-STAT3과발현 재조합 벡터에 의한 Th17세포 활성 제어 및 Treg 세포활성 확인
Th17 세포는 염증성 질환의 질병을 가속화 시키는 것으로 알려져 있어, 본 발명의 MLS-STAT3 과발현 벡터가 Th17의 활성을 억제시키는지 확인하였다. 또한 Th17과 유사한 환경에서 분화하는 Treg 세포는, Th1 세포를 조절하여, 염증을 억제하는 것으로 알려져 있어, Treg세포의 활성이 MLS-STAT3 과발현 벡터에 의해 증가하는지도 확인하였다. Th17, Treg 활성 조절과 미토콘드리아 내 STAT3 이동을 확인하기 위하여, 관절염이 유도된 마우스에서, 관절염 유도 후 11주째에 마우스 비장 세포를 수득하여, FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated antiforkhead box P3(Foxp3), APC-conjugated anti-CD25, FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-IL-17 및 FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-pSTAT3(S727), APC-conjugated anti-COX4(eBiosciences, San Diego, CA, USA)로 염색하였다. 염색된 섹션을 Zeiss microscope(LSM 510 Meta; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 시각화 시켰다.
그 결과, 병인 Th17(CD4+IL-17+) 발현이 대조군 대비 유의적으로 감소한 반면, 면역억제반응을 유도하는 Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 세포의 발현이 증가함으로써 관절염 치료 효과를 보일 수 있는 것으로 나타났다(도 9). 또한 미토콘드리아 내에 pSTAT3 727의 이동이 증가됨을 확인하였다. 미토콘드리아 내로의 pSTAT 727의 이동에 의해서 향상된 미토콘드리아 기능에 의해서 류마티스관절염이 제어 됨을 확인 하였다.
실시예8. MLS-STAT3과발현 재조합 벡터에 의한 활막조직 세포 사멸 제어 확인
실시예8-1. MLS-STAT3과발현 재조합 벡터에 의한 염증성 세포사멸 제어 확인
활막조직의 염증성 세포 사멸을 본 발명의 MLS-STAT3 과발현 벡터가 제어하는지 확인하고자 마우스에서 수득된 활막 조직에, RIP1, RIP3 및 pMKL을 처리하여 염증성 세포사멸을 유도하였다. 염증성 세포사멸이 유도된 활막조직에, MLS-STAT3 과발현 벡터를 처리하여, 10% 포르말린으로 고정시키고, 파라핀에 포매한 후 조직을 7 μm 두께의 절편으로 만들어서 슬라이드에 부착하였다. 이후 H&E염색을 진행하고, 광학현미경을 통해, 활막조직의 염증성 세포 사멸을 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 것과 같이 MLS-STAT3 과발현 벡터가 처리된 활막조직에서 RIP1, RIP3 및 pMKL에 의해 유도된 염증성 세포사멸을 조절하는 것을 확인하였다.
실시예8-2. MLS-STAT3과발현 재조합 벡터에 의한 정상 세포사멸 증가 확인
정상 세포사멸은, 관절염이 치료되는 과정중 하나로서, 본 발명의 MLS-STAT3 과발현 벡터가 정상 세포사멸을 증가시키는지 확인하고자, 관절염 유도 마우스의 관절 시노비움 조직내에서 세포사멸인자 BAX의 발현을 조직 분석 하였다. MLS-STAT3 과발현 벡터 주입된 류마티스관절염 동물 모델의 관절 시노비움 조직 내에서 BAX 세포사멸인자가 증가됨을 확인하였다.
그 결과, 대조군에서 보다 MLS-STAT3 과발현 벡터를 처리한 마우스 관절 시노비움 조직에서 정상 세포사멸이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 9. MLS-mouse STAT3 과발현 벡터 제작
본 발명자들은 MLS-STAT3 과발현 마우스를 제작하기 위하여, MLS 서열이 존재하는 pCMV/myc/mito 벡터에서 XhoI-NotI의 제한효소 부위를 자른 후, 상기 부위에 mouse STAT3의 DNA 서열을 삽입하여 MLS-mouse STAT3 과발현의 재조합 벡터를 제작하였다. MLS-mouse STAT3 과발현의 재조합 벡터의 개열지도는 도 12에 나타내었다.
실시예 10. MLS-mSTAT3 과발현 Th17 억제 및 Treg 유도 조절과 병인-조절 마크로파지 조절 확인
상기 실시예 9에서 제작된 MLS-mSTAT3 과발현 트렌스 제닉 마우스의 비장세포에서 병인-조절 세포의 활성 조절 효력을 분석하였다. 정상 마우스와 MLS-mSTAT3 과발현 트렌스 제닉 마우스의 비장세포를 수득하여 PerCP-conjugated anti-CD4, PE-conjugated antiforkhead box P3(Foxp3), APC-conjugated anti-CD25, PerCP-conjugated anti-CD4, FITC-conjugated anti-IL-17 및 FITC-conjugated anti-CD11c, PE-conjugated anti-CD206를 염색하여 유세포 분석 하였다.
그 결과, MLS-mSTAT3 과발현된 상태에서 Th17의 활성이 억제된 것을 확인하였으며, Treg의 활성(Foxp3)은 증가한 것을 확인하였다(도 13). 또한 병인 마크로파지 1 (M1)의 활성은 저해되고 항염증성 마크로파지 2 (M2)의 발현이 증가된것을 확인 하였다.
실시예 11. STAT3 과발현 유도에 따른 류마티스관절염 모델에서의 효과 확인
실시예 11-1. STAT3로 유도된 류마티스관절염에 대한 MLS-mSTAT3 과발현 벡터의 치료효과 확인
STAT3의 과발현으로 유도된 류마티스관절염에서도 본 발명의 MLS-mSTAT3 과발현 벡터의 치료효과가 있는지 확인하였다. DBA1/J 마우스에 STAT3를 과발현하는 벡터를 주입하여, 류마티스관절염이 유도된 동물모델을 준비하였고, 관절염을 유발시킨 후 1주일 후부터 마우스에 STAT3 OVN 단독 또는 MLS-mSTAT3와 재조합된 벡터를 전기천공법으로 11주 동안 매주 주입(100 μg)하였다. 이후, 관절염 지수(arthritis score) 및 관절염 발명 정도(incidence)를 분석하였다. 관절염 평가 기준은 다음과 같다.
-평가 기준-
0점: 부종이나 종창이 없다.
1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
5정 이상: 부종과 발적의 증상이 심각하게 계속 진행되는 경우
그 결과, STAT3에 의해 유도된 류마티스관절염 마우스에 MLS-STAT3 재조합 벡터를 주입한 경우, 대조군인 STAT3 OVN 단독 처리군에서보다, 낮은 관절염 지수를 확인하였으며, 관절염 발병 정도 역시 대조군에 비해 낮아짐을 확인함으로서, 본 발명의 MLS-mSTAT3 과발현 벡터는 STAT3 과발현으로 유도된 관절염에서도 효과가 있는 것을 확인하였다(도 14).
실시예11-2. STAT3로 유도된 류마티스관절염에 대한 MLS-mSTAT3 과발현 벡터의 치료효에서 Th17 및 Treg 조절 효과 확인
STAT3의 과발현으로 유도된 류마티스관절염에서도 본 발명의 MLS-mSTAT3 과발현 벡터의 치료효과에서 병인-조절 세포의 활성을 조절 할 수 있는지 확인하고자 하였다. Th17 및 Treg 조절 효과를 확인하기 위하여, 관절염이 유도된 후 35일째에 마우스 비장세포를 수득하여, FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated antiforkhead box P3(Foxp3), APC-conjugated anti-CD25, FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-IL-17 및 FITC-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-pSTAT3(S727), APC-conjugated anti-COX4(eBiosciences, San Diego, CA, USA)로 염색하였다. 염색된 섹션을 Zeiss microscope(LSM 510 Meta; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 시각화 시켰다.
그 결과, STAT3 과활성 대비 MLS-mSTAT3 투여된 마우스의 비장 세포내에 병인 Th17(CD4+IL-17+) 세포 억제 및 면역억제반응을 유도하는 Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 세포의 발현이 증가함을 확인 하였다. 또한 핵 내의 p-STAT3 727 발현이(CD4+p-STAT3 727+) 대조군 대비 감소한 반면, 미토콘드리아 내에 존재하는 p-STAT3 727(CD4+COX4+p-STAT3 727+)은 증가한 것을 확인 하였다. 따라서 미토콘드리아 내로의 STAT3 727의 이동에 의해서 류마티스관절염 질환 제어 및 병인-조절 면역 세포의 조절 효과가 있음을 확인하였다 (도 15).
실시예 12. MLS-mSTAT3 과발현 트랜스 제닉 마우스에서 염증성 장질환 치료 확인
본 발명자들은 본 발명의 MLS-mSTAT3 과발현 트랜스제닉 마우스에서 염증성 장질환에 대한 효과를 확인하기 위하여, 2.5% 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS)물을 1주일간 음용하여, 염증성 장 질환이 유도된 마우스 모델에, 대조군으로 C57BL/6 처리한 마우스 및 본 발명의 MLS-mSTAT3 트랜스 제닉군으로 나누어 확인하여였다. 매일 마우스 개체별 몸무게를 측정하여, 염증성 장질환에 의한 체중 변화를 확인하였다.
그 결과, 대조군의 무게는 투여 5일 이후 급격히 감소하는 것으로 나타났고, MLS-mSTAT3 트랜스 제닉군에서는, 무게의 변화가 없었으며, 체중이 유지되는 것을 확인할 수 있었다(도 16).
실시예 13. 염증성 장질환 유발된 MLS-mSTAT3 트랜스제닉 마우스 내염증형 마크로파지 M1 억제 및 항염증형 마크로파지 M2 조절 확인
염증성 장질환에서 MLS-mSTAT3에 의한 마크로파지에 대한 영향을 확인하기 위하여, 림프구 내의 염증형 마크로파지 M1 및 항염증형 마크로파지 M2를 확인하였다. 상기 실험예 12에서 장질환이 유도된 마우스 실험군을 대상으로, 비장세포를 분리한 후, 비장 세포에서 FITC-conjugated anti-CD11c, PE-conjugated anti-CD206를 염색하여 유세포 분석 하였다.
그 결과, 염증성 장질환 유발된 본 발명의 MLS-mSTAT3 과발현 트랜스제닉 마우스에서, 염증형 마크로파지 M1은 대조군 보다 감소된 것을 확인하였으며, 항염증형 마크로파지 M2는 대조군과 유사한 수준으로 유지된 것을 확인하였다(도 17).
실시예 14. 뇌척수염 질환(EAE)에서의 MLS-mSTAT3 유전자 주입을 통한 EAE자가 항체 억제 확인
MLS-mSTAT3 과발현 트랜스제닉 마우스에 MOG 특이적인 뇌척수염 질환을 유발하였으며, 4주 후에 마우스의 혈청을 채취하여 마우스 항 MOG specific IgG 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. 대조군으로는 C57BL/6 정상 마우스 및 EAE 유발된 C57BL/6을 사용하였다. 항 MOG specific IgG 항체 측정방법은 다음과 같다. MOG를 4μg/ml 농도로 0.05M sodium carbonate coating buffer (pH 9.6)에 희석하여 96 웰(well) 마이크로티터 플레이트(microtiter plate)에 도포한 다음 4℃에서 18시간 방치하였다. 도포된 용액을 제거한 후 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 1% 소 혈청 알부민(BSA: Amre-sco, solon, Ohio)이 포함된 TBS(pH 8.0)를 200μl씩 넣고 1시간 실온에서 반응시켰다. 항 MOG specific IgG 측정을 위해서 검체를 1:1,000으로 희석하였으며, 이때 희석 용액은 1% BAS, 0.05% 트윈 20(Amreco)이 포함된 TBS(pH 8.0) 용액을 사용하였다. 다음으로, 희석해 둔 혈청 샘플을 웰(well)당 50μl씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 0.05% 트윈 20(Amresco)이 포함된 TBS 용액(pH 8.0)으로 5회 수세한 후, detection IgG-HRP conjugate(anti-mouse IgG HRP)를 1:75,000으로 희석하여 각 웰당 50μl씩 넣어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, washing buffer로 3회 수세한 후, TMB+H2O2 시스템(KPL, Gaithersbufg, MD)으로 발색하였고, 1N H2SO4를 같은 양으로 넣어 반응을 중지시켰다. 이는 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도로 읽었으며, 항체 측정 결과는 흡광도 자체로 표시하였다.
그 결과, 본 발명의 뇌척수염 발병 MLS-mSTAT3 과발현 트랜스제닉 마우스는 대조군에 비하여 MOG 특이적 항체 MOG specific IgG 항체가 유의적으로 감소된 것을 optical density(O.D) 값을 통해 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 MLS-STAT3가 자가항체 활성 반응을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 18).
실시예 15. MLS-human STAT3 과발현의 재조합 벡터 제작 및 과발현 확인
본 발명자들은 MLS-STAT3 과발현 벡터의 인간 세포 내에서의 검증을 위하여, MLS 서열이 존재하는 pCMV/myc/mito 벡터에서 XhoI-NotI의 제한효소 부위를 자른 후, 상기 부위에 human STAT3의 DNA 서열을 삽입하여 MLS-human STAT3 과발현 재조합 벡터를 제작하였다. MLS-human STAT3 과발현 벡터의 개열지도는 도 19A에 나타내었고, MLS-human STAT3 과발현 벡터의 구체적인 DNA 서열정보 및 아미노산 서열정보는 도 20에 나타내었다.
이후, 본 발명자들은 제작된 MLS-human STAT3 과발현 벡터가 미토콘드리아 내에서 과발현되는지 확인하기 위하여, 제작된 재조합 벡터를 인간유래 NIH3T3 세포에 도입하고, 도입된 세포의 미토콘드리아를 분리한 후, 웨스턴블럿팅을 통해 STAT3의 발현 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, MLS-human STAT3 과발현 벡터가 삽입된 NIH3T3 세포의 미토콘드리아 내에서는 대조군(Mock)에 비해 human STAT3가 현저하게 과발현됨을 확인하였다 (도 19B).
또한, 본 발명자들은 MLS-human STAT3 과발현 재조합 벡터를 주입한 후, 염증성 세포사멸인자인 pMLKL(phospho MLKL, mixed lineage kinase domain like pseudokinase) 및 caspase의 발현량을 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, MLS-human STAT3 과발현 재조합 벡터는 염증성 사멸인자인 pMLKL의 발현을 현저하게 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다 (도 19C).
따라서, MLS-human STAT3 과발현 벡터가 주입된 경우 염증성 사멸인자의 발현량을 감소시킴으로써 류마티스 관절염을 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 16. MLS-human STAT3 과발현 벡터 주입 T세포의 미토콘드리아 기능회복 및 Th17 세포 활성 제어
MLS-human STAT3 과발현 벡터가 T세포에서 미토콘드리아의 기능회복 및 Th17 세포의 활성을 제어하는지 확인하기 위하여, 정상인의 혈액으로부터 PBMC 를 분리하였으며, 분리된 PBMC 에 anti-CD3 와 anti-CD28을 자극하여 T 세포를 활성 시켰으며, T 세포 활성 후 MOCK 및 MLS-human STAT3 과발현 벡터를 각각 과발현 시켰다. 벡터 발현 후 미토콘드리아 포텐셜 분석을 위해서 JC1 염색 하였으며, 유세포 분서하였다. 또한 병인 Th17 세포 및 Th1 세포를 분석하기 위해 각 벡터 발현된 PBMC 에 PerCP-conjugated anti-CD4, PE-conjugated anti-IL-17, FITC-conjugated anti-IFNγ를 염색하였으며, 유세포 분석하였다.
그 결과, MLS-human STAT3 과발현 벡터가 투여된 정상인의 PBMC에서 미토콘드리아 포텐셜이 증가 한것을 확인 하였으며, 병인 Th17 세포는 감소함을 확인 하였다(도 21).
실시예 17. MLS-human STAT3 과발현 벡터의 류마티스관절염 질환 제어
류마티스 관절염이 유발된 마우스 모델을 제조하였는데, DBA1/J 마우스에 제2형 콜라겐을 피하 주사하여(intradermal)관절염을 유도하였으며, 관절염 유도 후 매주 1회씩 총 8회 MLS-human STAT3 과발현 벡터 및 대조군 벡터를 각각 하이드로다이나믹 주입(hydrodynamic injection) 방법을 통해 50ul/mice의 양으로 마우스에 주사하였다. 하이드로다이나믹 주입법은 물리적인 힘을 사용하여 유전자를 세포막을 통과하여 세포질 내로 도입시키는 방법으로 생리 식염수에 희석된 본 발명의 재조합 벡터를 꼬리 정맥으로 주사하는 방법이다. 질환의 유발촉진(Booster)을위해 제2형 콜라겐을 보조제(IFA)와 1:1의 부피비로 섞어 꼬리에 주사하였으며 2일 뒤 오른쪽 허벅지에 MLS-human STAT3를 주입하였고 1주일 뒤 왼쪽 허벅지에 다시 MLS-human STAT3를 주입하였다. 이때 상기 대조군으로는 Human STAT3 유전자를 포함하지 않은 mock 벡터를 주입한 군을 사용하였다. 이후 관절염 증상을 측정하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이 MLS-human STAT3 과발현 벡터가 주입된 관절염 마우스 모델의 경우, 관절염 지수가 대조군 보다 유의적으로 낮아지는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 MLS-STAT3과발현 벡터는 Th17의 활성 억제 및 Treg를 유도하며, STAT3에 의해 유도된 류마티스 관절염에서도 개선 효과를 가지며, 염증성 장질환에서의 염증형 마크로파지 M1 억제 및 항염증형 마크로파지 M2를 조절하고, 자가면역성 뇌척수 질환에서 자가 항체에 대한 억제능을 가지는 것을 확인하였기에, 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용할 수 있다.

Claims (12)

  1. MLS(Mitochondria Localization Sequence) 펩타이드와 STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)이 융합된 재조합 펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 펩타이드.
  3. 제 1 항의 재조합 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제 1 항의 재조합 펩타이드 또는 제 3 항의 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 자가면역질환 또는 염증성질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 뇌척수염(encephalomyelitis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina) 및 소동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터는 미토콘드리아에서 STAT3를 과발현시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 재조합 펩타이드 또는 상기 재조합 벡터는 염증성 사이토카인인 IL-17의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 비경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 관절강내 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항의 재조합 펩타이드 또는 제 3 항의 재조합 벡터의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 자가면역질환 또는 염증성질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 뇌척수염(encephalomyelitis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina) 및 소동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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