WO2016159695A1 - Ssu72를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ssu72를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2016159695A1
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ssu72
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cells
stat3
protein
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조미라
박성환
이창우
곽승기
최종영
이승훈
서현범
문영미
박진실
박민정
이진관
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가톨릭대학교 산학협력단
성균관대학교 산학협력단
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune disease containing Ssu72.
  • Immunity is one of the body's self-protective systems against all foreign polymers (antigens) that invade or are injected into living tissue.
  • the main component of the immune system is lymphocytes, which are white blood cells that are made in the bone marrow and circulate along the blood into lymph tissues and organs, mainly lymph node spleen and tonsils.
  • lymphocytes white blood cells that are made in the bone marrow and circulate along the blood into lymph tissues and organs, mainly lymph node spleen and tonsils.
  • B cells multiply rapidly when stimulated by an appropriate antigen, forming a clone that produces a special antibody (immunoglobulin) that neutralizes that antigen, and the antibodies that B cells produce circulate in body fluids.
  • Humoral immunity is performed.
  • T cells are produced in the thymus and migrate to lymphoid tissue, responsible for cell-mediated immunity that directly attacks antigens.
  • autoimmune diseases are diseases caused by adverse reactions to their cells.
  • immunosuppressive agents that block signal transduction pathways in T cells are most commonly used as therapeutic agents, but these immunosuppressive agents are toxic, infection, lymphoma, diabetes, Side effects such as tremor, headache, diarrhea, high blood pressure, nausea, renal dysfunction, etc. occur. Therefore, there is a need for the development of a new therapeutic agent having no side effects and inexpensive and excellent therapeutic effect.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases, including Ssu72 protein or a polynucleotide encoding Ssu72 protein.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases, including Ssu72 protein or a polynucleotide encoding the Ssu72 protein.
  • the Ssu72 protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide encoding the Ssu72 protein may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide may be contained in an expression vector.
  • the immune disease is a disease associated with the activation of STAT3, rheumatoid arthritis, osteoporosis, plasmacytosis, hyperimmunoglobulinemia, anemia, nephritis, cachexia, tourism disease, angioplasty nephritis, multiple sclerosis , Uveitis, chronic thyroiditis, delayed hypersensitivity, contact dermatitis, atopic dermatitis, systemic erythematoses, Crohn's disease, pancreatitis, psoriasis, juvenile idiopathic atrophy, diabetes and Alzheimer's disease.
  • the present invention comprises the steps of treating the candidate material to a cell or tissue comprising the Ssu72 gene or Ssu72 protein; And measuring the amount of expression of the Ssu72 gene or the amount of Ssu72 protein or the activity of the Ssu72 protein, the method for screening a therapeutic agent for a disease associated with the activation of STAT3.
  • the candidate material when the expression amount of the Ssu72 gene or the amount of Ssu72 protein or Ssu72 protein activity is increased compared to the control group not treated with the candidate material, the candidate material is used to prevent disease associated with activation of STAT3.
  • the method may further include determining a therapeutic material.
  • the expression amount of the Ssu72 gene or the amount of Ssu72 protein or the activity of Ssu72 protein is reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction, immunoprecipitation (coimmunoprecipitation) , Enzyme-linked immunosorbentassay, radioimmunoassay (RIA), immunohistochemistry, Western blotting (Western Blotting) and flow cytometry (FACS) have.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • RIA radioimmunoassay
  • FACS flow cytometry
  • the disease associated with the activation of STAT3 is rheumatoid arthritis, osteoporosis, plasmacytosis, hyperimmunoglobulinemia, anemia, nephritis, cachexia, cattle breeders disease, angioplasty nephritis, multiple sclerosis, uveitis, Chronic thyroiditis, hypersensitivity, contact dermatitis, atopic dermatitis, systemic erythematoses, Crohn's disease, pancreatitis, psoriasis, juvenile idiopathic atrophy, diabetes and Alzheimer's disease.
  • Ssu72 according to the present invention has an effect that can effectively inhibit the activity of STAT3, when overexpressing Ssu72 can suppress the expression of inflammatory cytokines and at the same time IL-4 and IL-10, factors related to immunoregulatory T cells Expression may ultimately effectively prevent and treat immune diseases, preferably STAT3-mediated diseases.
  • Figure 1 shows the results confirmed by Western blotting the phosphorylation inhibitory activity of STAT3 according to the overexpression of Ssu72.
  • Figure 2 shows the results confirmed by confocal microscopy to suppress the expression of p-STAT3 according to the overexpression of Ssu72.
  • Figure 3 shows the results confirmed by RT-PCR the degree of inhibition of the inflammatory cytokines IL-17 and IL-21 by Ssu72.
  • Figure 4 shows the result confirmed by RT-PCR the degree of inhibition of the expression of the Th17 cytokines IL-1beta, IL-6 and IL-6 receptor in Ssu72.
  • Figure 5 shows the results confirmed by RT-PCR to increase the expression of Th2 and Trereg related cytokines IL-4 and IL-10 by Ssu72.
  • Figure 6 shows the results of analyzing the degree of improvement of arthritis symptoms by injecting a mouse with a Ssu72 overexpression expression vector in a rheumatoid arthritis mouse model.
  • Figure 7 shows a Ssu72 overexpressed recombinant vector map according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 shows the results of STAT3 phosphorylation and IL-17 cytokine expression in the SH72 siRNA treated and untreated NIH3T3 cells through RT-PCR and Western blot.
  • Figure 9 shows the results of analyzing the inhibition of expression of inflammatory mediators by RT-PCR and luciferase assay after introducing Ssu72 overexpression vector into NIH3T3 cells and stimulating cells with IL-6.
  • Figure 11 shows the microscopic observation of the expression level of proinflammatory cytokines in the joint tissue after injection of the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group.
  • Figure 12 shows the microscopic observation of the expression level of TRAP, a osteoclast differentiation factor in the joint tissue after injection of the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group.
  • Figure 13 shows the results of analyzing the expression level of osteoclast differentiation inducing factors after injection of the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group.
  • FIG. 14 shows the result of injecting Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group, separating splenocytes from the mouse, and analyzing the Th17 and Treg cell numbers as pathogens by flow cytometry.
  • FIG. 15 shows a photograph of splenocytes isolated from mice after injecting a Ssu72 overexpression vector into a group of collagen-induced mice and observing Th17 cells and Treg cells under confocal microscopy.
  • Figure 16 shows that after injecting the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group, splenocytes were isolated from the mouse and the expression level of p-STAT3 was observed through confocal microscopy.
  • Figure 17 shows that after injecting the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group, the splenocytes were isolated from the mouse and the expression level of inflammatory mediators was observed through confocal microscopy.
  • FIG. 18 shows the results of injecting Ssu72 overexpression vectors into the collagen-induced mouse group, separating lymph nodes from mice, and analyzing Th17 cells and Treg cells in lymph nodes by flow cytometry.
  • Figure 19 shows the results of analyzing the change in the expression of inflammatory mediators in lymph nodes after the injection of Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group.
  • FIG. 20 shows the results of analysis of the degree of inhibition of expression of germinal center B cells, which are pathogenic cells, after the injection of the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group.
  • Figure 21 shows the results of analysis of the expression level of B10 cells showing the ability to inhibit splenocytes and lymph nodes and show immune response after injection of the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group.
  • Figure 22 shows the result of injecting Ssu72 overexpression vector into the group of collagen-induced mice, and confirming the expression of autoantibodies in serum by separating serum from the mouse, B-expressing IL-10 in splenocytes by separating the splenocytes The result of confirming the expression level of the cell is shown.
  • FIG. 23 shows the photographs obtained by injecting the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group, separating splenocytes from the mice, and observing the degree of CD4 + p-STAT3 + IL-17 + cell expression in the splenocytes under confocal microscopy.
  • FIG. 24 shows the results obtained by injecting the Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group, separating the splenocytes from the mouse, and analyzing the degree of inhibition of expression of Th1 cells, which are pathogenic cells in the splenocytes, through a flow cytometer.
  • FIG. 25 shows the results of analysis of flow rate of Th2 cells expressing Th2 cells with lymphocytes isolated from mice and anti-inflammatory activity in lymph nodes after injection of Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group.
  • FIG. 26 shows the results of analyzing the expression level of marginal zone B cells having anti-inflammatory activity in splenocytes from mice after injection of Ssu72 overexpression vector into the collagen-induced mouse group by flow cytometry.
  • the present invention is characterized in that Ssu72 can effectively inhibit the activity of STAT3 and thus can be used as a therapeutic agent for immune diseases.
  • STATs are known as transcription factors that are activated by phosphorylation by means of a receptor tyrosine kinase (JAN), a Kinuse Kinase (JAK), an Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), and a Platelet-derived Growth Factor Receptor (PDGFR).
  • JAN receptor tyrosine kinase
  • JAK Kinuse Kinase
  • EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
  • PDGFR Platelet-derived Growth Factor Receptor
  • STATs activated by phosphorylation are known to induce the transcription of various genes associated with disease by forming dimers, moving inside the nucleus and binding near the promoter of the target gene (Darnell JE Jr. Science . 277, 1630-1635 (1997); Bromberg JF, et al . Cell . 98, 295-303 (1999).
  • STAT3 a class of STATs proteins, is known to be overactive in various types of human tumors, including hematologic and solid cancers (Bromberg JF, et al . Cell . 98, 295-303 (1999)).
  • Activated STAT3 is known to promote cancer cellization of mutated cells by promoting expression of target genes such as Bcl-XL, c-myc and cyclin D1, which are involved in cancer cell survival, proliferation and growth (Vera J, et al. Prog Biophys Mol Biol . 106, 426-434 (2011); Turkson J. Expert Opin Ther Targets . 8, 409-422 (2004).
  • STAT3 signal transducers and activators of transcription 3
  • STAT3 is well known to be activated by the cytokine IL-6, and is also known to be activated by epidermal growth factor (EGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • STAT3 activity induced by IL-6 plays an important role in osteoclast differentiation and bone formation.
  • STAT3-deficient mice have decreased bone density and bone volume, and an increase in the number of osteoclasts negatively affecting osteoporosis has been observed (BBRC 2005). , 328, 800-807).
  • the activation of STAT3 is related to the pathogenesis of autoimmune diseases including rheumatoid arthritis, and when inhibited, STAT3-mediated diseases can be treated.
  • the immune system present in the body controls specific immune responses to autoantigens under normal conditions, and also suppresses immune responses against external antigens.
  • a pregnant woman's response to the fetus and chronic infection Immune response to microorganisms These phenomena are known to be induced by clonal deletion, clone anergy and active control by immunoregulatory T cells (Tregs) as a mechanism by which antigen-specific immunotolerance can be induced.
  • Tregs immunoregulatory T cells
  • Investigation of some patients who accidentally acquired immunotolerance against or experimentally induced animal models showed that all three of these mechanisms are involved in graft-immunity tolerance. It is attracting attention as an important cell involved in controlling almost all immune responses of the living body such as autoimmune, tumoral immunity, infectious immune response as well as immune response.
  • immunoregulatory T cells ie immunoregulatory T lymphocytes (Tregs), whose presence has recently been identified, can be largely divided into natural and adaptive Treg cells, and CD4 + CD25 + T cells, which are natural Tregs, are cells.
  • Tregs immunoregulatory T lymphocytes
  • CD4 + CD25 + T cells which are natural Tregs
  • the mechanism of immunosuppression of this cell is not yet known, but it has recently been discovered that the expression control factor of the gene, Foxp3, plays an important role in the differentiation and activity of the cell.
  • peripheral natural T cells can be differentiated into cells that exhibit immunosuppressive effects upon stimulation of autologous or external antigens under certain circumstances, which are called adaptive or inducible Tregs and secrete IL-10. These include Tr1, TGF-secreting Th3, and CD8 Ts.
  • these T cells also differentiate into Th17 cells through differentiation in addition to Treg cells, which are made in the presence of TGF- ⁇ in common with Treg cells, but do not require IL-6 in the case of Treg cells.
  • Th17 cells are characterized by differentiating in the presence of IL-6 with TGF- ⁇ and secreting IL-17.
  • Th17 cells are characterized by cytotoxicity, which maximizes the signal of the inflammatory response and accelerates disease progression. Therefore, inhibition of differentiation or activity into Th17 cells is one of the ways to treat immune diseases.
  • Ssu72 of the present invention inhibits the activity of Th17 cells and at the same time has a function of promoting the activity of Treg cells, so that it is possible to treat immune diseases more effectively than conventionally developed immune disease therapeutics.
  • Ssu72 is known as a molecule involved in transcription as RNA Polymerase II CTD Phosphatase, but little is known about the function and role of Ssu72 in vivo.
  • Ssu72 can effectively inhibit the activity of STAT3, specifically the phosphorylation of STAT3, inhibit the production of inflammatory cytokines and at the same time promote the activity of promoting the production of immunoregulatory T cell-related cytokines, ultimately STAT3. It is characterized by the fact that it is possible to effectively prevent and treat mediated diseases.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases, including Ssu72 protein or polynucleotide encoding Ssu72 protein.
  • the Ssu72 protein may be one having an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1
  • the polynucleotide encoding the Ssu72 protein may be one having a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • the Ssu72 protein according to the present invention may preferably be a functional equivalent to the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the term 'functional equivalent' refers to a sequence homology with at least 60%, preferably 70%, more preferably 80% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. 2 as a result of the addition, substitution or deletion of amino acids.
  • substantially homogeneous activity means the activity of Ssu72 described above.
  • Such functional equivalents may include, for example, amino acid sequence variants in which some of the amino acids of the amino acid sequence of Ssu72 according to the invention are substituted, deleted or added.
  • Substitution of amino acids may preferably be conservative substitutions, examples of conservative substitutions of amino acids present in nature are as follows; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met).
  • Deletion of amino acids may preferably be located at portions not directly involved in the activity of Ssu72 of the present invention.
  • the functional equivalent range may include polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic skeleton of Ssu72 and its physiological activity.
  • a fusion protein made by fusion with another protein while maintaining structural alteration and physiological activity for altering the stability, storage, volatility or solubility of the polypeptide of the present invention may be included.
  • polynucleotide encoding the Ssu72 protein may be introduced into an expression vector, such as a plasmid or viral vector, by a known method, followed by transduction or transfection of the expression vector by various methods known in the art. It can be introduced into the target cell in the phenotype by.
  • an expression vector such as a plasmid or viral vector
  • Plasmid expression vectors are those that deliver plasmid DNA directly to human cells by FDA-approved gene delivery methods for human use (Nabel, EG et al ., Science, 249: 1285-1288, 1990). Unlike viral vectors, there is an advantage that can be purified homogeneously.
  • plasmid expression vector that can be used in the present invention, mammalian expression plasmids known in the art can be used, and in one embodiment of the present invention, HA, which is a recombinant expression vector into which the Ssu72 gene is inserted, using an HA vector (pHA) -Ssu72 vector was prepared.
  • Plasmid expression vectors comprising nucleic acids according to the present invention are methods known in the art, such as, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction, Cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection , Electroporation, gene gun and other known methods for introducing DNA into cells (Wu. Et al ., J. Bio. Chem., 267: 963-967, 1992; Wu. Et al ., Bio. Chem., 263: 14621-14624, 1988).
  • the vector capable of expressing Ssu72 may be administered into cells, tissues or the body by known methods, for example, topically, parenteral, oral, nasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous or otherwise. It may be administered by appropriate means.
  • the vector can be injected directly in an effective amount for treating a target tissue or target cell.
  • the present invention can provide a method for screening a therapeutic agent for a disease associated with the activation of STAT3 using Ssu72.
  • the method for screening a disease therapeutic agent associated with the activation of STAT3 comprises the steps of: treating a candidate material to a cell or tissue comprising a Ssu72 gene or Ssu72 protein; And measuring the amount of Ssu72 gene expression or the amount of Ssu72 protein or the activity of Ssu7272 protein.
  • a method for discovering a therapeutic agent for a disease related to the activation of a new STAT3 using Ssu72 wherein the "candidate” refers to the amount of expression of the Ssu72 gene, the amount of Ssu72 protein, or the activity of the Ssu72 protein.
  • the sample may include, but is not limited to, a compound, protein, peptide, oligonucleotide, or natural product extract.
  • Treatment of the candidate material may be preferably performed by treating the candidate material with cells or tissues containing Ssu72 gene or Ssu72 protein and then culturing the candidate material.
  • the increase in the intracellular level of the Ssu72 protein in the above means that the expression of the Ssu72 gene is increased or the degradation of the Ssu72 protein is inhibited to increase the amount of the Ssu72 protein.
  • Said Ssu72 gene expression involves the transcription and translation of the Ssu72 gene into proteins. Therefore, when the candidate increases the expression of the Ssu72 gene and the protein level in the cell, the candidate may be determined as a novel therapeutic agent that can treat diseases related to the activation of STAT3.
  • the expression level of the gene is preferably to measure the level of mRNA, the method for measuring the level of mRNA reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RNase protection assay, Northern Blots and DNA chips, etc., but is not limited thereto.
  • the amount of the protein or the activity of the protein can be measured using an antibody, in which case the marker protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a binding, ie, an antigen-antibody complex, and an antigen-antibody complex.
  • the amount of formed can be measured quantitatively through the magnitude of the signal of the detection label.
  • a detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • Analytical methods for measuring protein levels include, but are not limited to, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, Complement fixation assays, FACS, protein chips, and the like.
  • the method for measuring the expression amount of the Ssu72 gene or the amount of Ssu72 protein or the activity of the Ssu72 protein may use various methods known in the art as described, and preferably, reverse transcription polymerase chain reaction (RT).
  • RT reverse transcription polymerase chain reaction
  • PCR real-time reverse transcription polymerase chain reaction
  • coimmunoprecipitation enzyme-linked immunosorbentassay
  • radioimmunoassay RIA
  • immunohistochemistry western blotting and flow cytometry FACS
  • composition according to the present invention can be used as a pharmaceutical composition that can prevent and treat immune diseases, preferably diseases associated with the activation of STAT3, the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically does not cause allergic or similar reactions, such as gastrointestinal disorders, dizziness, and the like.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like, and parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following documents (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form according to methods known in the art together with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral dosage forms according to known methods, and isotonic aqueous solution or suspension is preferable as an injectable formulation as a typical parenteral dosage form.
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills and capsules.
  • compositions formulated in such a manner can be administered in a effective amount via several routes, including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • the term 'effective amount' refers to an amount exhibiting a prophylactic or therapeutic effect when administered to a patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected depending on the route of administration, subject to administration, age, gender weight, individual difference and disease state.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the degree of disease, preferably 1 to 10,000 g / weight kg / day, more preferably 10 to 1000 mg / weight kg
  • the effective dose of / day may be repeated several times a day.
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with known compounds having the effect of preventing, ameliorating or treating immune diseases.
  • immune diseases that can be treated and prevented with the composition containing Ssu72 of the present invention include, but are not limited to, diseases related to the activation of STAT3, rheumatoid arthritis, osteoporosis, plasmacytosis, hyperimmunoglobulinemia, anemia, nephritis, Cachexia, town disease, vasculitis, multiple sclerosis, uveitis, chronic thyroiditis, hypersensitivity, contact dermatitis, atopic dermatitis, systemic erythematosus, Crohn's disease, pancreatitis, psoriasis, combustive idiopathic atrophy, diabetes and Alzheimer's disease.
  • the STAT3-mediated disease refers to a disease caused by activation of the STAT3 pathway. It is known in the art that overexpression, hypersecretion or overactivity of interleukin-1 ⁇ and / or interleukin-6 is known to induce activation of the STAT3 pathway. Furthermore, interleukin-1 ⁇ and / or interleukin-6 are known to increase in expression, secretion or activity due to inflammatory diseases, autoimmune diseases, destructive bone diseases, infectious diseases, degenerative diseases and necrotic diseases, and these diseases are interleukin. It is known to be due to STAT3 pathway activation induced by -1 ⁇ and / or interleukin-6.
  • a recombinant vector for overexpressing Ssu72 was prepared.
  • a cloning of the Ssu72 gene was inserted under the CMV IE (human cytomegalovirus immediate early promoter) promoter, followed by a cassette listing the SV40 polyadenylation signal sequence.
  • Ssu72 was prepared and a vector map of the recombinant vector is shown in FIG. 7.
  • the recombinant expression vector prepared in Example 1 was transduced into NIH / 3T3 cells, and IL-6 was injected into the cells at a concentration of 20ng / ml for 1 hour. After inducing the inflammation-induced environment, the overexpression of Ssu72, the degree of phosphorylation of STAT3 was confirmed by Western blot.
  • the recombinant expression vector prepared in Example 1 was transduced into NIH / 3T3 cells, and IL-6 was injected into the cells at a concentration of 20ng / ml for 1 hour. After inducing the inflammation-induced environment, the overexpression of Ssu72, STAT3 activation was confirmed by Luciferase assay. Luciferase assay was performed to obtain cell lysates of IL-6 treated cells overexpressed Ssu72, and then subjected to Luciferase assay using Luciferase and STOP & Glu solution capable of measuring Renilla and STAT3.
  • Ssu72 is transduced into NIH / 3T3 cells with a recombinant expression vector overexpressed, and the cells are stimulated for 1 hour at a concentration of 20ng / ml IL-6.
  • IL-17 sense primer: CCT CAA AGC TCA GCG TGT CC
  • antisense primer GAG CTC ACT TTT GCG CCA AG
  • IL-21 sense primer
  • IL-17 a Th17 cytokine (inflammatory cytokine)
  • IL-17 a Th17 cytokine (inflammatory cytokine)
  • 21 decreased the expression level by about three times.
  • the present inventors obtained the DNA under the same experimental conditions as in ⁇ 2-1> in order to determine whether Ssu72 also has the activity of inhibiting the expression of proinflammatory cytokines, each primer, that is, IL-1beta (sense) Primer: GGA TGA GGA CAT GAG CAC ATT C, Antisense Primer: GGA AGA CAG GCT TGT GCT CTG A), IL-6 (Sense Primer: AAC GAT GAT GCA CTT GCA GAA A, Antisense Primer: TCT GAA GGA CTC TGG CTT TGT C) and IL-6 receptor (sense primer: ATT TGT GTG CTG AAG GAG GC, antisense primer: AAA GGA CAG GAT GTT GCA GG) were used to confirm the expression level of RNA of each gene by RT-PCR.
  • Antisense Primer GGA AGA CAG GCT
  • IL-4 and IL-10 which are Th2 and Treg related cytokines, that is, IL-4 (sense primer: CGA GTA RT-PCR using ATC TTG CAT GAT GC, antisense primer: ACG GAG ATG GTG CCA AAC GTC) and IL-10 (sense primer: GGC CCA GAA ATC AAG GAG CA, antisense primer: AGA AAT CGA TGA CAG CGC CT) was performed.
  • a mouse model in which rheumatoid arthritis was induced was prepared. Intra-dermal arthritis was induced by subcutaneous injection of collagen type 2 into DBA1 / J mice, and a total of 8 Ssu72 overexpression vectors and control vectors were administered once a week after arthritis induction. The mice were injected in amounts of 50ul / mice, respectively, by hydrodynamic injection. Hydrodynamic injection is a method of injecting a recombinant vector of the present invention diluted in physiological saline into the tail vein by introducing a gene through the cell membrane into the cytoplasm using physical force.
  • Booster type 2 collagen was injected into the tail in a 1: 1 volume ratio with the adjuvant (IFA), the overexpression vector was injected into the right thigh two days later, and the overexpression vector was again in the left thigh one week later. Was injected.
  • the control group was used as a group injected with a mock vector that does not contain the Ssu72 gene. Since then, arthritis symptoms were measured.
  • the arthritis index is nearly zero, indicating that a perfect therapeutic effect can be induced and inducing an arthritis-inducing environment.
  • the group of mice injected with the Ssu72 overexpression vector did not show arthritis.
  • Ssu72 has an activity capable of effectively inhibiting STAT3, thereby effectively treating and preventing STAT3-mediated diseases such as rheumatoid arthritis.
  • the present inventors confirmed that when Ssu72 is overexpressed in cells, phosphorylation of STAT3 is inhibited and expression of IL-17 is reduced. To further prove this, this time, the siRNA of Ssu72 was used to analyze the STAT3 activity and IL-17 expression change according to the inhibition of Ssu72 expression.
  • Ssu72 siRNA (Santa Cruz, Cat.No: sc-76579) into NIH3T3 cells was performed, followed by stimulation with IL-6 (20 ng / ml) for 30 minutes, followed by STAT3 activity. The degree of phosphorylation was confirmed by Western blotting, and the expression level of IL-17 was analyzed by RT-PCR and Rutherase assay.
  • Ssu72 mutant vector (Ssu72 phosphatase activity mutant) was transduced into NIH3T3 cells and analyzed for STAT3 activity and IL-17 expression changes through Western blot, RT-PCR and luciferase assay. At this time, the luciferase assay was analyzed after treating IL-6 (20ng / ml) to the cells for 15 minutes.
  • the cells were stimulated by treating IL-6 (20 ng / ml) for 1 hour, and then inflammatory mediators IL-1beta, IL-6 receptor, MRNA levels of IL-17A, IL-21, TBK1 and IKBKE were analyzed by RT-PCT and luciferase assays.
  • Ssu72 can suppress the inflammatory response by inhibiting the expression of inflammatory mediators.
  • the degree of immune cell infiltration and proinflammatory cytokine expression in the joint tissues of the mice injected with the vector overexpressing Ssu72 and the control group injected with the vehicle vector in the collagen-induced mouse model prepared in Example The degree of osteoclast differentiation was analyzed.
  • proinflammatory cytokines IL-21, IL-6, TNF-a, IL-1beta, IL- Both expression of 17 and RANKL was shown to be inhibited.
  • osteoclast differentiation factor known as osteoclast differentiation factor in joint tissues was suppressed compared to the control (Mock) that did not overexpress Ssu72 in the tissues overexpressing Ssu72 (see FIG. 12), inducing osteoclast differentiation.
  • the expressions of RANKL, MMP-9, Cathepsin-K, and Integrin-beta3 were also significantly decreased compared to the control group, and the number of TRAP-positive cells was also reduced, indicating that Ssu72 can effectively inhibit osteoclast differentiation. It was found that it can be used as a therapeutic agent for bone diseases caused by osteoclasts (see FIG. 13).
  • Spleens were obtained from the mice used in Example 7, and when the Ssu72 overexpression, changes in the number of Treg cells and th17 cells in the splenocytes were analyzed by flow cytometry.
  • Treg cells which are immunoregulatory t cells
  • th17 cells which are pathogenic cells
  • Ssu72 has a function of regulating immune cells in splenocytes.
  • the number of Treg cells with immunomodulatory ability can be increased while the number of th17 cells can be decreased.
  • treg cells which are immunoregulatory t cells, were increased by Ssu72 overexpression, whereas th17 cells were decreased in lymph nodes.
  • overexpression of Ssu72 in lymph nodes also reduced the expression of inflammatory mediators IL-1 beta, IL-6, IL-17A, TBK1 and IKBKE.
  • Spleen and lymph nodes were extracted from the mouse group in which the ssu72 overexpression vector was injected into the mice used in the above examples, that is, the collagen-induced arthritis mice and the control mouse group, and the expression level of germinal center b cells as pathogens in the spleen and lymph nodes. Were analyzed by flow cytometry.
  • germinal center B cells which are pathogens, were found to have reduced cell numbers due to Ssu72 overexpression.
  • B10 cells were found to increase the number of cells upon Ssu72 overexpression in both spleen and lymph nodes.
  • Serum was obtained from mice injected with Ssu72 overexpression vector and control mice injected with mock vector in collagen-induced arthritis mice, and the expression level of autoantibodies in serum was analyzed by ELISA, and also in splenocytes through confocal microscopy. B cells expressing IL-10 and CD4 + p-STAT3 + IL-17 + cells were observed.
  • Ssu72 inhibits the expression of autoantibodies and uses them as a therapeutic agent for autoimmune diseases through the regulation of IL-10 expressing B cells (increase) and IL-17 cells (inhibition) which have immunomodulatory ability. It was possible to find out.
  • the present inventors extracted spleen and lymph nodes from mice injected with Ssu72 overexpression vector and control mice injected with mock vector to collagen-induced arthritis mice, Th1 cells which are pathogenic cells in spleen and lymph nodes, Th2 cells having anti-inflammatory activity, and marginal zone B cell number was analyzed by flow cytometry.
  • the group injected with Ssu72 overexpression vector was suppressed in the expression of Th1 cells, the pathogen cells in the splenocytes compared to the control group, the expression of Th2 cells in the splenocytes showed a significant change Turned out to be absent.
  • expression of Th2 cells with anti-inflammatory activity in lymph nodes was shown to increase upon Ssu72 overexpression (see FIG. 25).
  • the marginal zone B cells with anti-inflammatory activity showed different expression levels in the spleen and lymph nodes. In the spleen, the expression level was increased when Ssu72 was overexpressed, and the expression level was decreased in the lymph nodes (see FIG. 26).
  • Ssu72 of the present invention can be used as a gene therapy and a protein therapy for the treatment of immune diseases, particularly autoimmune diseases.

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Abstract

본 발명은 Ssu72를 유효성분으로 함유하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Ssu72는 STAT3의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 효과가 있어, Ssu72를 과발현시킨 경우 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있고 동시에 면역조절 T 세포와 관련된 인자인 IL-4 및 IL-10의 발현은 촉진시키는 작용을 통해 궁극적으로 면역질환, 바람직하게는 STAT3 매개 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

Description

SSU72를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 Ssu72를 함유하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
면역은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호 체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절비장편도 등으로 순환하는 백혈구다. 면역반응에 관여하는 세포로서, B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성하며, B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. 또한, T세포는 흉선에서 생성되어 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.
한편, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.
이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염 등의 자가면역질환이 발생하게 되며, 뿐만아니라 이식과 같은 시술 이후 면역거부 반응이 발생하게 된다.
구체적으로 자가면역질환은 자기 세포에 대한 이상 반응으로 나타나는 질병으로서 현재 치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있으나, 이러한 면역 억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 따라서, 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이러한 점에서 본 발명의 목적은 Ssu72 단백질 또는 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 STAT3의 활성화와 관련된 질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 Ssu72 단백질 또는 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ssu72 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 STAT3의 활성화와 관련된 질환인 류마티스 관절염, 골다공증, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연과민증, 접촉피부염 아토피성 피부염, 전신성 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 연소성 특발성 위축증, 당뇨병 및 알츠하이머로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 Ssu72 유전자 또는 Ssu72 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및 Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, STAT3의 활성화와 관련된 질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질 활성이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 후보물질을 STAT3의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질의 활성은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 STAT3의 활성화와 관련된 질환은 류마티스 관절염, 골다공증, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연과민증, 접촉피부염 아토피성 피부염, 전신성 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 연소성 특발성 위축증, 당뇨병 및 알츠하이머로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 Ssu72는 STAT3의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 효과가 있어, Ssu72을 과발현 시킨 경우 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있고 동시에 면역조절 T세포와 관련된 인자인 IL-4 및 IL-10의 발현은 촉진시키는 작용을 통해 궁극적으로 면역질환, 바람직하게는 STAT3 매개 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
도 1은 Ssu72의 과발현에 따른 STAT3의 인산화 억제활성을 웨스턴 블럿팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Ssu72의 과발현에 따른 p-STAT3의 발현 억제 효과를 공초점 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Ssu72에 의한 염증성 사이토카인인 IL-17 및 IL-21의 발현 억제 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Ssu72에 Th17 사이토카인인 IL-1beta, IL-6 및 IL-6 수용체의 발현 억제 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Ssu72에 의한 Th2 및 Treg 관련 사이토카인인 IL-4 및 IL-10의 발현 증가 효과를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 류마티스 관절염 마우스 모델을 대상으로 Ssu72 과발현 발현벡터를 마우스에 주입하여 관절염 증상의 개선 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 Ssu72 과발현 재조합 벡터 지도를 나타낸 것이다.
도 8은 NIH3T3 세포에 Ssu72 siRNA를 처리한 군과 처리하지 않은 군에 대한 STAT3 인산화 정도 및 IL-17 사이토카인의 발현정도를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통해 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 NIH3T3 세포에 Ssu72 과발현 벡터를 도입하고 IL-6로 세포 자극 후, 염증성 매개체들의 발현 억제 정도를 RT-PCR 및 루시퍼라제 어세이를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 관절 조직내의 면역세포 침투억제, 관절손상, 파누스 생상 및 골손상 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 관절 조직 내 전염증성 사이토카인의 발현정도를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 12는 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 관절 조직 내 파골분화인자인 TRAP의 발현정도를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 파골세포분화 유도 인자들의 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포를 분리하고 병인세포인 Th17 세포수 및 Treg 세포수를 유세포분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포를 분리하고 Th17 세포 및 Treg 세포를 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 16은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포를 분리하고 p-STAT3의 발현정도를 공초점 현미경을 통해 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 17은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포를 분리하고 염증성 매개체들의 발현정도를 공초점 현미경을 통해 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 18은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 림프절을 분리하고 림프절 내의 Th17 세포와 Treg 세포를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 림프절을 분리하고 림프절 내에서 염증성 매개체들의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포와 림프절을 분리하고 병인세포인 germinal center B 세포의 발현억제 정도를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포와 림프절을 분리하고 면역반응 억제능을 보이는 B10 세포의 발현정도를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 혈청을 분리하여 혈청 내 자가항체의 발현정도를 확인한 결과를 나타낸 것이고, 비장세포를 분리하여 비장세포 내 IL-10을 발현하는 B 세포의 발현정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포를 분리하고 비장세포 내 CD4+p-STAT3+IL-17+ 세포발현 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 24는 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포를 분리하고 비장세포 내 병인세포인 Th1 세포의 발현 억제 정도를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 림프절을 분리하고 림프절 내 항염작용을 하는 Th2 세포의 발현 증진 정도를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 콜라겐 유도 마우스 군에 Ssu72 과발현 벡터를 주입 후, 마우스로부터 비장세포 내의 항염작용을 갖는 marginal zone B 세포의 발현정도를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 Ssu72가 STAT3의 활성을 효과적으로 억제할 수 있어 면역질환의 치료제로서 사용가능함을 규명한 점에 특징이 있다.
STATs은 수용체 타이로신 카이네이즈(receptor tyrosine kinase)의 일종인 JAK(Januse Kinase), EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor), 그리고 PDGFR (Platelet-derived Growth Factor Receptor) 등에 의하여 인산화됨으로써 활성화되는 전사인자로 알려져 있다(Darnell JE Jr. Science. 277, 1630-1635(1997)). 인산화에 의하여 활성화된 STATs는 이합체(dimer)를 형성하고, 핵 내부로 이동하여 표적 유전자의 프로모터 부근에 결합함으로써 질환과 관련된 다양한 유전자의 전사를 유도하는 것으로 알려져 있다(Darnell JE Jr. Science. 277, 1630-1635(1997); Bromberg JF, et al. Cell. 98, 295-303(1999)). STATs 단백질 부류의 하나인 STAT3는 혈액암과 고형암을 포함하는 다양한 종류의 인간 종양에서 과도하게 활성화되어 있는 것으로 알려져 있으며(Bromberg JF, et al. Cell. 98, 295-303(1999)), 과도하게 활성화된 STAT3는 암세포의 생존, 증식 및 성장과 관련된 Bcl-XL, c-myc 및 사이클린 D1 등과 같은 표적 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 변이된 세포의 암세포화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Vera J, et al. Prog Biophys Mol Biol. 106, 426-434(2011); Turkson J. Expert Opin Ther Targets. 8, 409-422(2004)). 또한, 최근의 보고들은 STAT3 억제제가 잠재적인 항암제로서의 가능성을 시사하고 있다(Duan H, et al. Oncogene. 27, 6720-6728(2008); Bai L, et al. Int J Cancer. 130, 2693-2702(2012); Kan CE, et al. Cancer Res. 71, 6930-6939(2011)).
또한, STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)는 류마티스성 관절염을 포함한 자가면역질환 또는 골다공증에 있어서 NF-B와는 또 다른 하나의 중요한 전사인자로서 역할을 하는 것이 알려져 있다. 특히, STAT3는 사이토카인인 IL-6에 의해서 활성화되는 것이 잘 알려져 있으며, 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF)에 의해서도 활성화되는 것으로 알려져 있다. 최근, 골다공증과 IL-6와의 연관성에 대한 연구결과가 많이 보고되고 있으며, 특히 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 활성이 파골세포의 분화와 뼈 생성에 중요한 역할을 한다는 것이 동물모델을 통하여 입증된바 있으며(Bone 2006, 39, 505-512), STAT3 결핍 마우스(STAT3-deficient mice)의 경우, 골밀도 및 골부피가 감소되어 있으며, 골다공증에 부정적인 영향을 미치는 파골세포 수의 증가가 관찰되었다(BBRC 2005, 328, 800-807).
이와 같이 STAT3의 활성화는 류마티스성 관절염을 포함한 자가면역질환의 발병기작과 관련이 있어 이를 저해할 경우, STAT3 매개 질환을 치료할 수 있다.
또한, 체내에 존재하는 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.
특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5 ~ 10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.
또한, 이러한 T 세포는 Treg 세포 이외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
그러나 Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.
이러한 점에서 본원발명의 Ssu72는 Th17 세포의 활성은 억제하고 동시에 Treg 세포의 활성은 촉진하는 작용을 가지므로 종래 개발된 면역질환 치료제에 비해 보다 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있다.
한편, Ssu72는 RNA Polymerase II CTD Phosphatase로 전사(transcription)에 관여하는 분자로 알려져 있을 뿐 생체 내에서 Ssu72의 기능 및 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
그러나 본원발명은 Ssu72가 STAT3의 활성, 구체적으로 STAT3의 인산화를 효과적으로 억제할 수 있으며, 염증성 사이토카인의 생성은 억제하고 동시에 면역조절 T세포 관련 사이토카인의 생성은 촉진하는 활성은 촉진시켜 궁극적으로 STAT3 매개 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 규명한 점에 특징이 있다.
따라서 본 발명은 Ssu72 단백질 또는 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
바람직하게, 상기 Ssu72 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 Ssu72 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 Ssu72와 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 Ssu72의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 Ssu72의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 Ssu72의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 Ssu72의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합 단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한 상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 HA 벡터(pHA)를 사용하여 Ssu72 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터인 HA-Ssu72 벡터를 제조하였다.
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 목적세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
또한 상기 Ssu72를 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직 또는 표적세포를 치료하기 위한 유효량으로 직접 주사할 수 있다.
나아가, 본 발명은 Ssu72를 이용한 STAT3의 활성화와 관련된 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 STAT3의 활성화와 관련된 질환 치료제의 스크리닝 방법은, Ssu72 유전자 또는 Ssu72 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및 Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu7272 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 상기 방법은 새로운 STAT3의 활성화와 관련된 질환의 치료제를 Ssu72를 이용하여 발굴할 수 있는 방법으로서, 상기 "후보물질"이란 Ssu72 유전자의 발현양, Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화합물, 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 또는 천연물 추출물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 후보물질의 처리는 바람직하게 Ssu72 유전자 또는 Ssu72 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리한 후 배양하는 과정으로 수행할 수 있다.
또한, 상기에서 Ssu72 단백질의 세포 내 수준 증가의 의미는 Ssu72 유전자의 발현이 증가되거나 또는 Ssu72 단백질의 분해가 억제되어 Ssu72 단백질의 양이 증가되는 것을 말한다. 상기 Ssu72 유전자 발현은 Ssu72 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다. 따라서 상기 후보물질이 세포 내에서 Ssu72 유전자의 발현 및 단백질의 수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 STAT3의 활성화와 관련된 질환을 치료할 수 있는 신규 치료제로 판단할 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 단백질의 양 또는 단백질의 활성 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
이와 같이, 상기 Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질의 활성을 측정하는 방법은 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 바람직하게 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 면역질환, 바람직하게는 STAT3의 활성화와 관련된 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 면역질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
또한 본 발명의 Ssu72를 함유한 조성물로 치료 및 예방할 수 있는 면역질환으로는 이에 제한되지는 않으나, STAT3의 활성화와 관련된 질환인 류마티스 관절염, 골다공증, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연과민증, 접촉피부염 아토피성 피부염, 전신성 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 연소성 특발성 위축증, 당뇨병 및 알츠하이머 일 수 있다.
본 발명에서 상기 STAT3 매개 질환은 STAT3 경로의 활성화에 의해 유발되는 질환을 의미한다. 당업계에 공지된 바에 의하면 인터루킨-1β 및/또는 인터루킨-6의 과발현, 과분비 또는 과다활성이 STAT3 경로를 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 나아가, 인터루킨-1β 및/또는 인터루킨-6은 염증성 질환, 자가면역질환, 파괴성 골질환, 감염성 질환, 퇴행성 질환 및 괴사성 질환 등에 의해 발현, 분비 또는 활성이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 이들 질환은 인터루킨-1β 및/또는 인터루킨-6에 의해 유도되는 STAT3 경로 활성화에 기인하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 질환에 대한 치료제 개발에 있어서, STAT3 경로 활성화를 유도하는 인터루킨-1β 및/또는 인터루킨-6을 저해할 수 있는 항 인터루킨 수용체를 개발하거나 또는 STAT3를 직접적으로 저해할 수 있는 저해제의 개발 등 다양한 방법이 연구되고 있는데 본 발명에서는 STAT3를 억제할 수 있는 신규 저해제로서 Ssu72의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
Ssu72가 도입된 재조합 벡터 제조
Ssu72가 과발현되기 위한 재조합 벡터를 제조하였는데, 이를 위해 먼저 CMV IE (human cytomegalovirus immediate early promoter) 프로모터 하에 Ssu72 유전자를 삽입하는 클로닝을 수행하고, SV40 폴리아데닐레이션 신호 서열을 나열한 카세트로 재조합 벡터인 pHA-Ssu72를 제조하였으며, 재조합 벡터의 벡터 map을 도 7에 나타내었다.
<실시예 2>
Ssu72 과발현에 따른 STAT3 활성 억제 효과 분석
<2-1> 웨스턴 블럿
Ssu72의 과발현이 STAT3의 활성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 발현벡터를 NIH/3T3 세포에 형질도입하고, 상기 세포에 IL-6를 20ng/ml의 농도로 1시간 동안 처리하여 염증 유발 환경을 유도한 후, Ssu72의 과발현 시, STAT3의 인산화 정도를 웨스턴블럿을 통해 확인하였다. 웨스턴 블럿은 Ssu72이 과발현된 IL-6 처리 세포의 세포 용해물을 수득하여, 단백질 분획을 얻은 다음, p-STAT3 tyr 705 (mouse, cell signaling), total STAT3 (mouse, cell signaling), Ssu72 (mouse, cell signaling) 및 beta-actin (mouse, santacruz)의 항체를 각각 사용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
<2-2> Luciferase assay
Ssu72의 과발현이 STAT3의 활성을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 발현벡터를 NIH/3T3 세포에 형질도입하고, 상기 세포에 IL-6를 20ng/ml의 농도로 1시간 동안 처리하여 염증 유발 환경을 유도한 후, Ssu72의 과발현시, STAT3의 활성화 정도를 Luciferase assay을 통해 확인하였다. Luciferase assay는 Ssu72이 과발현된 IL-6 처리 세포의 세포 용해물을 수득하여, 단백질 분획을 얻은 다음, Renilla와 STAT3을 측정할 수 있는 Luciferase와 STOP&Glu 용액을 사용하여 Luciferase assay을 수행하였다.
분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 염증이 유발된 상태에서 Ssu72가 과발현된 경우, STAT3의 활성화는 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 Ssu72는 염증유발 환경에서 STAT3의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
<2-3> 공초점 현미경 분석
상기 실시예 <2-1>에서 사용한 동일한 세포군을 대상으로 공초점 현미경 분석을 수행하였는데, 이를 위해 먼저 Cryo section후 -70℃ 보관해놓은 세포시료를 꺼내어 후드 안에서 1시간 동안 말린 다음, 차가운 아세톤 원액으로 세포를 15분 동안 고정시키고 coplin jar 이용시킨 후, coplin jar에 들어 있는 슬라이드 꺼내서 뒷면을 닦은 후 후드 안에서 2분간 건조시킨 다음, 조직용 1x PBS 버퍼로 5분씩 3회 세척하고, 10% nomal goat serum으로 상온에서 30분간 블록킹을 수행한 다음, 1st Ab를 한 조직당 100ul씩 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후, 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이후 다음날 시료를 꺼내서 슬라이드를 staining jar에 끼운 후, 1X PBS로 15분동안 세척하고 각 슬라이드의 블럭 주위의 물기를 조심히 닦은 후, 2차 항체를 다시 슬라이드에 100ul씩 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 조직용 1x PBS 버퍼로 5분씩 3회 세척하고 핵 염색이 필요할 경우, DAPI (-20℃ 보관)를 1:500으로 희석하여 한 조직당 100ul씩 떨어뜨려 염색을 수행하였다. 이후 조직용 1x PBS 버퍼로 다시 5분씩 3회 세척 후, fluorescent mounting medium으로 봉입 후, 현미경으로 관찰을 수행하였다.
분석결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 웨스턴 결과와 동일하게 염증이 유발된 상태에서 Ssu72가 과발현된 경우, STAT3의 인산화는 감소되어 있는 것으로 나타났다.
<2-4> Ssu72 의 염증성 사이토카인 발현 억제효과 분석
Th17 사이토카인 억제효과
Ssu72가 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과가 있는지 확인하기 위해, Ssu72가 과발현되는 재조합 발현벡터로 NIH/3T3 세포에 형질도입하고, 상기 세포를 IL-6 20ng/ml의 농도로 1시간 동안 세포 자극한 후, 당업계에 공지된 DNA Prep방법으로 DNA를 수득한 후, IL-17 (센스프라이머: CCT CAA AGC TCA GCG TGT CC, 안티센스 프라이머: GAG CTC ACT TTT GCG CCA AG) 및 IL-21(센스프라이머: CCC TTG TCT GTC TGG TAG TCA TC, 안티센스 프라이머: ATC ACA GGA AGG GCA TTT AGC)에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.
분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Th17 사이토카인(염증성 사이토카인)인 IL-17은 Ssu72가 과발현된 경우, 과발현되지 않은 대조군에 비해 약 5배 정도 발현양이 감소된 것으로 나타났고, IL-21은 약 3배 정도 발현양이 감소된 것으로 나타났다.
전 염증성 사이토카인 억제효과
또한, 본 발명자들은 Ssu72가 전염증성 사이토카인의 발현도 억제하는 활성이 있는지 확인하기 위해, 상기 <2-1>과 동일한 실험 조건 하에서 DNA를 수득한 후 각각의 프라이머, 즉, IL-1beta(센스 프라이머: GGA TGA GGA CAT GAG CAC ATT C, 안티센스 프라이머: GGA AGA CAG GCT TGT GCT CTG A), IL-6(센스 프라이머: AAC GAT GAT GCA CTT GCA GAA A, 안티센스 프라이머: TCT GAA GGA CTC TGG CTT TGT C) 및 IL-6 수용체(센스 프라이머: ATT TGT GTG CTG AAG GAG GC, 안티센스 프라이머: AAA GGA CAG GAT GTT GCA GG)를 사용하여 각 유전자의 RNA의 발현 정도를 RT-PCR을 수행하여 확인하였다.
분석결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, Ssu72가 과발현된 경우, 과발현되지 않은 대조군에 비해 IL-1beta는 약 4배, IL-6 및 IL-6 수용체는 각각 2배 정도 발현이 억제된 것으로 나타났다.
<실시예 3>
Ssu72 의 Th2 관련 사이토카인 상승효과 분석
Ssu72가 Th2 및 Treg 관련 사이토카인의 발현에는 상승 효과를 미치는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 상기 실시예 2에서 사용한 방법과 동일하게 각 실험군 세포들로부터 DNA를 수득한 후, Th2 및 Treg 관련 사이토카인인 IL-4 및 IL-10에 대한 프라이머, 즉, IL-4 (센스 프라이머: CGA GTA ATC TTG CAT GAT GC, 안티센스 프라이머: ACG GAG ATG GTG CCA AAC GTC)및 IL-10 (센스 프라이머: GGC CCA GAA ATC AAG GAG CA, 안티센스 프라이머: AGA AAT CGA TGA CAG CGC CT)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.
분석결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, Ssu72가 과발현된 경우, 과발현되지 않은 대조군에 비해 IL-4는 약 2.2배 증가한 것으로 나타났고, IL-10은 약 2.7배 증가한 것으로 나타나, Ssu72가 Th2 및 Treg 관련 사이토카인의 발현은 증가시키는 역할을 하는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
Ssu72 의 류마티스 관절염 치료효과 분석
류마티스 관절염이 유발된 마우스 모델을 제조하였는데, DBA1/J 마우스에 제2형 콜라겐을 피하 주사하여(intra-dermal) 관절염을 유도하였으며, 관절염 유도 후 매주 1회씩 총 8회 Ssu72 과발현 벡터 및 대조군 벡터를 각각 하이드로다이나믹 주입(hydrodynamic injection) 방법을 통해 50ul/mice의 양으로 마우스에 주사하였다. 하이드로다이나믹 주입법은 물리적인 힘을 사용하여 유전자를 세포막을 통과하여 세포질 내로 도입시키는 방법으로 생리 식염수에 희석된 본 발명의 재조합 벡터를 꼬리 정맥으로 주사하는 방법이다. 질환의 유발촉진(Booster)을 위해 제2형 콜라겐을 보조제(IFA)와 1:1의 부피비로 섞어 꼬리에 주사하였으며 2일 뒤 오른쪽 허벅지에 과발현벡터를 주입하였고 1주일 뒤 왼쪽 허벅지에 다시 과발현벡터를 주입하였다. 이때 상기 대조군으로는 Ssu72 유전자를 함유하지 않은 mock 벡터를 주입한 군을 사용하였다. 이후 관절염 증상을 측정하였다.
분석결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Ssu72 과발현 벡터가 주입된 관절염 마우스 모델의 경우, 관절염 지수가 거의 제로에 가까운 것으로 나타나, 완벽한 치료 효과가 유도될 수 있는 것으로 나타났으며, 관절염 유발 환경을 유도한 경우에도 Ssu72 과발현 벡터가 주입된 마우스 군은 관절염이 유발되지 않은 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 Ssu72가 STAT3를 효과적으로 억제할 수 있는 활성이 있어 류마티스 관절염과 같은 STAT3 매개 질환을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5>
Ssu72의 발현억제에 따른 STAT3 활성도 및 IL-17 발현변화 분석
상기 실시예의 결과를 통해 본 발명자들은 Ssu72를 세포 내에서 과발현시킬 경우, STAT3의 인산화가 억제되고 IL-17의 발현이 감소됨을 확인하였다. 이를 더욱 증명하기 위해, 이번에는 Ssu72의 siRNA를 이용하여 Ssu72의 발현 억제에 따른 STAT3의 활성 및 IL-17의 발현 변화를 분석하였다.
이를 위해 NIH3T3 세포에 Ssu72의 siRNA(Santa Cruz, Cat.No: sc-76579)를 형질도입한 다음, IL-6(20ng/ml)을 30분간 세포에 처리하여 자극한 후, STAT3의 활성도, 즉 인산화 정도를 웨스턴블럿을 통해 확인하였고, IL-17의 발현정도를 RT-PCR 및 루스퍼라제 어세이를 통해 분석하였다. 더불어, Ssu72 변이벡터(Ssu72의 phosphatase activity mutant)를 NIH3T3 세포에 형질도입 후, 웨스턴블럿, RT-PCR 및 루시퍼라제 어세이를 통해 STAT3의 활성 및 IL-17 발현변화를 분석하였다. 이때 상기 루시퍼라제 어세이는 IL-6(20ng/ml)을 15분간 세포에 처리한 후 분석하였다.
분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, siRNA를 이용하여 Ssu72의 발현을 억제한 경우, Ssu72의 발현을 억제하지 않은 대조군에 비해 STAT3의 인산화가 증가하는 것으로 나타났고, IL-17의 발현도 증가하는 것으로 나타났다.
또한 Ssu72의 활성을 잃은 변이체를 세포 내에서 발현시킬 경우, siRNA를 처리한 경우와 동일하게 STAT3의 발현 및 IL-17의 발현이 대조군에 비해 증가하는 것으로 나타났다.
<실시예 6>
Ssu72에 의한 염증성 매개제의 발현변화 분석
NIH3T3 세포에 상기 실시예에서 제조한 Ssu72 과발현 벡터를 형질도입 후, IL-6(20 ng/ml)을 1시간 동안 처리하여 세포 자극을 한 다음, 염증성 매개체인 IL-1beta, IL-6 수용체, IL-17A, IL-21, TBK1 및 IKBKE의 mRNA 정도를 RT-PCT과 루시퍼라제 어세이로 분석하였다.
분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 Ssu72를 과발현시킬 경우, 염증성 매개체인 IL-1beta, IL-6 수용체, IL-17A, IL-21, TBK1 및 IKBKE의 mRNA가 과발현시키지 않은 대조군에 비해 현저하게 감소되는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 Ssu72가 염증성을 매개하는 인자들의 발현도 억제함을 통해 염증반응을 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 7>
Ssu72 유전자를 이용한 관절조직 내 손상억제 효과 및 전염증성 사이토카인의 생성 억제분석
상기 실시예에서 제조한 콜라겐 유도 마우스 모델을 대상으로 Ssu72를 과발현시키는 벡터를 주입한 군과 베히클 벡터를 주입한 대조군의 마우스를 대상으로 각 관절조직 내의 면역세포 침투정도, 전염증성 사이토카인 발현정도, 파골세포 분화 정도를 분석하였다.
면역세포 침투정도 분석은 관절조직을 헤마토크실렌 및 에오신 염색법을 사용하였고 사프라닌 O 염색법을 수행하였는데, 분석결과, 관절내 염증정도, 관절손상정도, 파누스 생성 및 골 손상정도가 모두 Ssu72 과발현 벡터를 주입한 군이 대조군 대비 유의하게 감소한 것으로 나타났다(도 10 참조).
또한, 전염증성 사이토카인의 발현정도를 면역염색화학법을 통해 수행한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 전염증성 사이토카인인 IL-21, IL-6, TNF-a, IL-1beta, IL-17 및 RANKL의 발현이 모두 억제되는 것으로 나타났다.
<실시예 8>
Ssu72 유전자를 이용한 파골세포 분화억제 효과 분석
상기 실시예 7에서 사용한 마우스 모델로부터 관절조직을 수득하고, 파골세포 분화인자로 알려진 TRAP, RANKL, MMP-9, Cathepsin-K, Integrin-beta3의 발현수준을 면역화학염색법을 통해 확인하였다.
분석결과, 관절조직 내 파골세포 분화인자로 알려진 TRAP의 발현은 Ssu72가 과발현된 조직 내에서는 Ssu72를 과발현시키지 않은 대조군(Mock)에 비해 억제된 것으로 나타났고(도 12 참조), 파골세포 분화를 유도하는 인자들인 RANKL, MMP-9, Cathepsin-K, Integrin-beta3의 발현 또한 대조군에 비해 유의적으로 감소된 것으로 나타났으며, TRAP 양성 세포수도 감소한 것으로 나타나, Ssu72가 파골세포 분화를 효과적으로 억제할 수 있어 파골세포에 의한 골질환의 치료제로도 사용할 수 있음을 알 수 있었다(도 13 참조).
<실시예 9>
비장세포에서 Ssu72에 의한 Treg 증가 및 Th17 억제효과 분석
상기 실시예 7에서 사용한 마우스들로부터 비장(spleen)을 수득하고, Ssu72 과발현 시, 비장세포 내 Treg 세포 및 th17 세포수의 변화를 유세포 분석기를 통해 분석하였다.
분석 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 면역조절 t 세포인 Treg 세포는 Ssu72 과발현 시 세포수가 증가하는 것으로 나타났고(5.88→10.9), 반면 병인 세포인 th17세포는 세포수가 감소하는 것으로 나타났다(3.25→1.03). 이러한 결과는 Ssu72가 비장세포 내에서 면역세포를 조절할 수 있는 기능이 있다는 것을 나타내며 특히 면역조절능을 갖는 Treg 세포수는 증가시키면서 동시에 th17 세포수는 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한 상기와 같은 결과는 공초점 현미경 관찰을 통해서도 알 수 있었는데, Ssu72를 과발현시킨 군의 비장세포 및 Ssu72를 과발현시키지 않은 대조군의 비장세포를 대상으로, 1)CD4 Foxp CD25, CD4 IL-17양성을 보이는 세포를 관찰하였고, 2)CD4 pSTAT3 705, CD4 pSTAT3 727, CD4 pSTAT5, CD4 pSTAT3를 관찰하였고, 3) 염증성 매개체인 CD4 TBK1, CD4 IKBKE에 양성을 보이는 세포를 관찰하였다.
분석결과, 도 15 내지 도 17에 의하면, 1) Ssu72를 과발현시킨 경우, 대조군에 비해 Foxp 양성 세포인 Treg 세포수가 증가한 것으로 나타났고, 반면 th17세포는 감소한 것으로 나타났으며, 2) 인산화 STAT3 705 및 인산화 STAT3 727의 보이는 세포수는 Ssu72 과발현시 감소한 것으로 나타난 반면, pSTAT5의 세포수는 증가한 것으로 나타났다. 또한, 3) 염증성매개체인 TBK1, IKBKE 양성 세포수도 Ssu72 과발현시 감소되어 있는 것으로 나타났다.
<실시예 10>
림프절에서 Ssu72에 의한 Treg 증가 및 Th17 억제효과 분석
본 발명자들은 림프절(lymph node)에서도 Ssu72 과발현에 의해 Treg 세포수 및 th17 세포수의 변화가 있는지 확인하기 위해, 상기 실시예에서 사용된 마우스 모델들을 대상으로 림프절을 추출한 후, Treg 세포수 및 th17 세포수를 유세포 분석기를 통해 확인하였다.
분석결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 림프절에서도 비장세포에서와 동일하게 면역조절 t세포인 treg 세포수는 Ssu72 과발현에 의해 증가하는 것으로 나타났고 반면 th17 세포수는 감소하는 것으로 나타났다.
<실시예 11>
림프절에서 Ssu72에 의한 염증성 매개체 발현변화 분석
실시예 10에서 사용한 마우스의 림프절에서 Ssu72 과발현에 따른 염증성 매개체의 발현변화를 RT-PCR을 통해 분석하였다.
분석결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 림프절에서도 역시 Ssu72를 과발현시킬 경우, 염증성 매개체인 IL-1 beta, IL-6, IL-17A, TBK1 및 IKBKE의 발현이 감소되는 것으로 나타났다.
<실시예 12>
비장 및 림프절에서 Ssu72에 의한 Germinal center B 세포발현 억제효과
상기 실시예들에서 사용한 마우스, 즉 콜라겐 유도 관절염 마우스에 ssu72 과발현 벡터를 주입한 마우스 군과 대조군 마우스 군으로부터 비장과 림프절을 각각 적출하고, 비장과 림프절 내에서 병인세포인 germinal center b 세포의 발현정도를 유세포 분석기를 통해 분석하였다.
분석결과, 도 20에 나타낸 바와 같이 병인세포인 germinal center B 세포는 Ssu72 과발현에 의해 세포수가 감소되는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명자들은 염증반응 억제능을 보이는 B10 세포의 발현정도도 유세포 분석기를 통해 분석하였는데, 도 21에 나타낸 바와 같이, B10 세포는 비장과 림프절 모두에서 Ssu72 과발현시 세포수가 증가하는 것으로 나타났다.
<실시예 13>
Ssu72의 자가항체 억제효과
콜라겐 유도 관절염 마우스에 Ssu72 과발현 벡터를 주입한 마우스와 mock 벡터를 주입한 대조군 마우스로부터 혈청을 수득하고, 혈청 내 자가항체의 발현정도를 ELISA를 통해 분석하였으며, 또한 공초점 현미경을 통해 비장세포 내에서 IL-10을 발현하는 B 세포와 CD4+p-STAT3+IL-17+ 세포를 관찰하였다.
분석 결과, 도 22 및 도 23에 나타낸 바와 같이, Ssu72가 과발현된 경우, 자가항체의 발현(IgG)이 감소된 것으로 나타났고, 비장세포 내에서 IL-10을 발현하는 B 세포의 발현이 증대되어 있는 것으로 나타났으며(도 22), 반면, CD4+p-STAT3+IL-17+ 세포는 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 23).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 Ssu72가 자가항체의 발현은 억제시키고, 면역조절능을 갖는 IL-10 발현 B 세포(증가)와 IL-17세포(억제) 조절을 통해 자가면역질환의 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.
<실시예 14>
비장세포에서 Ssu72 과발현에 따른 Th1 세포, Th2 세포 및 marginal zone B 세포발현 조절 분석
나아가 본 발명자들은 콜라겐 유도 관절염 마우스에 Ssu72 과발현 벡터를 주입한 마우스와 mock 벡터를 주입한 대조군 마우스로부터 비장과 림프절을 추출하고, 비장과 림프절 내에서 병인세포인 Th1 세포, 항염활성을 갖는 Th2 세포 및 marginal zone B 세포수를 유세포 분석기를 통해 분석하였다.
분석결과, 도 24에 나타낸 바와 같이, Ssu72 과발현 벡터를 주입한 군이 대조군에 비해 비장세포에서 병인세포인 Th1 세포의 발현이 억제되는 것으로 나타났고, 비장세포에서 Th2 세포의 발현변화는 유의미한 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한, 림프절에서는 항염작용을 갖는 Th2 세포의 발현이 Ssu72 과발현시 증가하는 것으로 나타났다(도 25 참조). 항염활성을 갖는 marginal zone B 세포는 비장과 림프절에서 다른 발현수준을 나타내었는데, 비장에서는 Ssu72 과발현시 발현정도가 증가한 것으로 나타났고, 림프절에서는 발현정도가 감소한 것으로 나타났다(도 26 참조).
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 Ssu72는 면역질환, 특히 자가면역질환의 치료를 위한 유전자 치료제 및 단백질 치료제로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. Ssu72 단백질 또는 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Ssu72 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Ssu72 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 면역질환은 STAT3의 활성화와 관련된 질환인 류마티스 관절염, 골다공증, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연과민증, 접촉피부염 아토피성 피부염, 전신성 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 건성안, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 연소성 특발성 위축증, 당뇨병 및 알츠하이머로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. Ssu72 유전자 또는 Ssu72 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, STAT3의 활성화와 관련된 질환의 치료제를 스크리닝 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질 활성이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되는 경우, 상기 후보물질을 STAT3의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 Ssu72 유전자의 발현양 또는 Ssu72 단백질의 양 또는 Ssu72 단백질의 활성은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 STAT3의 활성화와 관련된 질환은 류마티스 관절염, 골다공증, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연과민증, 접촉피부염 아토피성 피부염, 전신성 에리테마토스, 크론병, 췌장염, 건선, 건성안, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 비만, 대사 증후군 동반 자가면역질환, 연소성 특발성 위축증, 당뇨병 및 알츠하이머로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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