CN106950364A - 一种检测鉴定干眼症的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测鉴定干眼症的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测白细胞介素6(IL‑6)蛋白水平的物质，所述试剂盒可通过检测样品中IL‑6水平作为干眼症早期诊断指征，检测快速简便、成本较低、灵敏度高、特异性好、安全可靠，可以实现早期判断患者是否干眼，排除心理精神障碍导致的主观不适，还可以提示干眼的内在病因(如SS干眼)，为干眼的分级治疗提供客观依据，为治疗干眼的新药研发提供客观的评价体系。

Description

一种检测鉴定干眼症的试剂盒
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种检测鉴定干眼症的试剂盒。
背景技术
干眼症，又称为干性角膜结膜炎，是泪液和眼表面的一种多因素疾病，该疾病导致的症状有不适、视觉障碍、以及具有对眼表面潜在损害的泪膜不稳定，并伴随有泪膜的渗透性增加以及眼表面的炎症。干眼症被认为是一种泪腺功能单位的障碍，一个泪腺功能单位的完整系统包括：泪腺、眼表面(角膜、结膜、以及睑板腺)、以及眼睑、以及连接它们的感觉和运动神经。这种泪腺功能单位以一种调节的方式控制该泪膜的主要成分并且对环境、内分泌学的、以及皮质的影响做出应答。该单位的功能是保持泪膜的完整性、角膜的透明性、以及投影到视网膜上映像的质量。对泪腺功能单位的任何部分(传入感觉神经、传出自主神经以及运动神经、以及泪液分泌腺)的疾病或损害可以使泪膜不稳定并且导致其本身表现为干眼症的眼表面疾病。
近年来，随着电脑和空调环境的普及、佩戴隐形眼镜人数的增多及环境的不断恶化，干眼症的发病率有提高的趋势，从而使干眼症成为眼科门诊比较常见的疾病。干眼症导致的不适和疼痛等症状会显著影响患者的生活质量，如日常生活中的阅读、开车等。
现存的各种干眼的辅助检查包括泪膜干涉成像仪、泪液乳铁蛋白含量测定、泪液渗透压测定、睑板腺成像检查、印痕细胞学检查等，由于其各自的局限性，并未在干眼的临床诊断中担当起主要角色。近年来评估干眼的新兴技术包括角膜地形图、共聚焦显微镜、光学相干断层扫描及眼表热成像技术等，其可靠性还有待验证。临床数据表明，干眼患者的眼表表达异常的与眼表炎症相关的细胞和分子介质。近年来，泪液中生物标记物对干眼诊断的价值逐渐引起国外学者的关注。目前仅在临床上得到应用的是对泪液中金属蛋白酶-9(metalloprotein，MMP-9)的定性检测。MMP-9阳性提示炎症的严重程度、与中重度干眼的相关性好，但阴性提示及灵敏度不高。开发干眼症的快速灵敏的早期诊断产品和方法，有助于早期干预眼表的局部炎症，阻止干眼向全身的慢性疾病进展。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种检测鉴定干眼症的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测白细胞介素6(IL-6)蛋白水平的物质。
优选的，所述的试剂盒中还包含用于检测白细胞介素17(IL-17)蛋白水平的物质；
优选的，所述检测IL-6和/或IL-17蛋白水平的物质为IL-6和/或IL-17蛋白的特异性配体或特异性抗体或其抗原结合片段；
优选的，所述的IL-17为IL-17A；
优选的，所述的抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体；
从来源上，所述单克隆抗体可为动物源如鼠源单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人源单克隆抗体等；
优选的，所述的检测对象为哺乳动物，更优选为人；
优选的，所述的检测样品为泪液；所述泪液是采用非侵入性方式采样得到；
优选的，所述的试剂盒中还包括检测试纸；更优选的，所述检测IL-6和/或IL-17蛋白水平的物质浸润或固定在所述检测试纸上，所述检测样品滴或点在所述检测试纸上进行检测；
在本发明的一个实施例中，可以通过预处理检测样品以增加靶分子的可接近性，如通过裂解(机械、化学、酶裂解等)、纯化、离心、分离等；还可以标记检测样品中靶分子以便于靶分子的检测，如荧光、放射性、发光、化学、酶标记等。
优选的，所述的检测包括定量检测和定性检测。
本发明还提供一种上述试剂盒在制备检测鉴定干眼症的产品中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒包含用于检测IL-6蛋白水平的物质，所述的鉴定是通过测定检测样品中IL-6的水平来进行的，其中检测样品中被检测的因子水平升高是所述检测对象患有干眼症的指征；
优选的，检测样品中IL-6水平升高是指检测样品中IL-6水平高于40pg/ml；
在本发明的一个实施例中，检测样品中IL-6水平高于40pg/ml而小于300pg/ml是所述检测对象患有非综合征(SS)干眼症的指征；
在本发明的一个实施例中，检测样品中IL-6水平高于300pg/ml是所述检测对象患有SS干眼症的指征；
研究发现，IL-6既是启动急性干眼炎症(固有免疫)的细胞因子，同时也被认为是导致慢性干眼炎症由固有免疫向适应性免疫转化的炎性介质，而IL-17与慢性干眼有很好的相关性；
在本发明的一个实施例中，所述试剂盒还包含用于检测IL-17蛋白水平的物质，所述的鉴定是通过测定检测样品中IL-6、IL-17的水平来进行的，其中检测样品中IL-6水平升高是所述检测对象患有干眼症的指征；
在本发明的一个实施例中，上述检测样品中IL-6水平升高，IL-17水平正常，为所述检测对象患有急性干眼症的指征；
在本发明的另一个实施例中，上述检测样品中IL-6、IL-17水平均升高为所述检测对象患有慢性干眼症的指征；
优选的，检测样品中IL-17水平升高是指检测样品中IL-17水平高于1000pg/ml；
在本发明的一个实施例中，检测样品中IL-17水平高于1000pg/ml而小于7000pg/ml是所述检测对象患有非SS干眼症的指征；
在本发明的一个实施例中，检测样品中IL-17水平高于7000pg/ml是所述检测对象患有SS干眼症的指征；
优选的，所述的IL-17为IL-17A。
在本发明的一个优选实施例中，所述的IL-6、IL-17A的检测方法为Luminex多重免疫珠检测方法。
本发明提供的用于检测鉴定干眼症的试剂盒，可通过检测样品中IL-6水平作为干眼症早期诊断指征，检测快速简便、成本较低、灵敏度高、特异性好、安全可靠，可以实现早期判断患者是否干眼，排除心理精神障碍导致的主观不适，还可以提示干眼的内在病因(如SS干眼)，为干眼的分级治疗提供客观依据，为治疗干眼的新药研发提供客观的评价体系。
附图说明
图1所示为本发明实施例1提供的IL-6浓度检测结果；统计学方法：单因素方差分析。*，P＜0.05；**，P＜0.01。
图2所示为本发明实施例1提供的IL-23浓度检测结果；统计学方法：单因素方差分析。*，P＜0.05；**，P＜0.01。
图3所示为本发明实施例1提供的IL-6蛋白质水平与眼表参数的相关性分析结果；OSDI：眼表疾病指数；Schirmer test：泪液分泌试验；BUT：泪膜破裂时间；CFS：角膜荧光素染色评分。统计学方法：Spearman相关性分析。
具体实施方式
如在此使用，“干眼症”是一种宽的概念，它旨在包括水液缺乏型干眼症、蒸发过强型干眼症、更年期相关联的干眼症、流泪不足、泪液缺乏、干眼病、斯耶格伦综合征、干性角膜结膜炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、眼类天疱疮、睑缘炎、眼睑闭合障碍和感觉神经瘫痪、过敏性结膜炎相关性干眼症、病毒性结膜炎后干眼症、白内障手术后干眼症、激光原位角膜磨镶术后慢性干眼症(LASIK)、VDT操作相关性干眼症以及隐形眼镜佩戴相关性干眼症、年龄相关性干眼症、角膜损伤、感染、赖利-戴综合征、先天性无泪症、营养失调或不足(包括维生素)、药理学副作用、眼部紧张以及眼腺和组织破坏、对烟雾、抽烟、过度干燥空气、空气播散性微粒的环境接触、自身免疫及其他免疫缺陷紊乱、以及不能眨眼的昏迷患者。另外，“干眼症”包括由干眼症所引起的疾病，如角膜结膜上皮的损害、角膜上皮疮、角膜溃疡(如角膜基质层的溃疡)以及眼部传染病。
本文中，所述因子的水平可以通过检测该因子的变体或同源物的水平来进行，其中检测样品中所述因子的变体或同源物的水平升高是所述对象具有发生干眼症的指征。
本文中，蛋白的变体或同源物是指包含与所示氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的相同性的氨基酸序列的多肽。
两个蛋白质序列的相同性对应于两个蛋白质链中位于相同或类似位置的相同氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62阵列计算相同性百分比，该算法可在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。在本文中，所述变体或同源物优选是功能性变体或同源物，即其与所示氨基酸序列具有显著的相似性(例如在氨基酸水平大约50％序列相同性)并且具有相同或相似的功能。至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、或至少大约99％序列相同性的功能性变体或同源物是优选的功能性变体或同源物。
用于检测IL-6、IL-17、IL-23或其变体或同源物的物质可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义RNA、重组蛋白质、抗体、或者其缀合物或融合蛋白。关于RNAi，可见Milhavet O，Gary DS，Mattson MP.(PharmacolRev.2003Dec；55(4)：629-48.Review.)，关于反义RNA，可见Opalinska JB，Gewirtz AM.(Sci STKE.2003Oct 28；2003(206)：pe47)。
例如，为了确定对象中IL-6、IL-17或其变体或同源物的水平，本发明的方法可以使用结合IL-6、IL-17、的物质测定来自所述对象的生物学样品中IL-6、IL-17或其变体或同源物的水平(浓度或绝对量)，在对象的所述生物学样品中IL-6、IL-17或其变体或同源物水平升高指示所述对象患有干眼症。
本文所述检测物质可以是受体靶向物质、细胞因子、激素、生长因子、受体特异性抗体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实例中，所述物质是配体或抗体(或其抗原结合片段)。可以利用本领域技术人员已知的任意技术揭示或者分析样品中的IL-6、IL-17或其变体或同源物，尤其是例如利用特异性配体，抗体或者片段或者抗体衍生物。优选所述物质是所述蛋白的特异性抗体或者这类抗体的片段(如Fab，Fab′，CDR等等)或者这类抗体的衍生物(诸如单链抗体，ScFv)。通过检测靶和所述物质的复合物如利用标记的物质、利用第二种标记的检测物质等等可以检测样品中靶蛋白的存在或者量。可以使用公知的免疫技术包括ELISA、RIA等等。
可以通过常规技术尤其是利用包括所述蛋白(或者其免疫原性片段)的免疫原免疫非人动物并回收抗体(多克隆)或者生成细胞(以产生单克隆抗体)产生靶蛋白的特异性抗体。用于制备多克隆或者单克隆抗体、ScFv片段以及人的或者人源化抗体的技术例如在下列文献中描述：Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，CSH Press，1988；Ward et al.，Nature 341(1989)544；Bird et al.，Science 242(1988)423；WO94/02602；US5,223,409；US5,877,293；WO93/01288。
本文所述“抗体”、“抗原结合片段”或“免疫原性部分”均具有本领域技术人员通常已知的含义。例如抗体的“抗原结合片段”是指通过重组DNA技术或者通过酶或化学切割完整的抗体而产生的，包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链抗体(svFc)。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物。抗体标记可以是放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或者生物素基团标记。抗体或其片段其制备及使用是熟知的并且公开在例如Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1999。
本领域已知很多测定本发明所述因子的方法，包括例如ELISA、布阵法等，还可以利用质谱分析等相关领域的技术人员已知的技术检测蛋白质表达和/或结构的变化，这类技术一般来说被分到蛋白质组分析名下，以便检测患者血液中的特异性特征序列。本领域提供了许多用于测定因子水平的可商购试剂盒，例如Quansys(Quansys Biosciences，Logan，Utah)的Human9-plex分析试剂盒和R&D(R&D SYSTEMS，Minneapolis，MN)的MosaicTMELISA检测试剂盒。
本文所述“水平升高”是指通过检测上述生物学样品获得的值与参照值例如在正常人中观察到的中间值或者平均值、或者与基于实验证据和/或现有技术数据所得到的针对干眼症患者相应的截断值相比是升高的。
在一个实施方案中，所述检测样品中因子水平升高是检测样品中因子水平与对照样品中因子水平相比是升高的。
本文所用术语“对照样品”典型地是指来自正常人的生物学样品。靶的水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(参见例如Current Protocols inImmunology.Wiley&Sons，Hoboken，NJ；Current Protocols in MolecularBiology.Wiley&Sons，Hoboken，NJ)。确定可以在蛋白质水平进行，例如使用酶联免疫分析或Western印迹方法进行蛋白水平检测。
在本发明中，术语“检测鉴定干眼症”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的试剂盒和应用方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性或预防性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病或者具有患有该疾病的风险。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1泪液中IL-6、IL-23浓度与干眼症
1.样品来源
SS干眼组：SS干眼患者15例(30眼)；
非SS干眼组：非SS干眼患者15例(30眼)；
正常对照组：健康志愿者15例(30眼)。
所有患者在进入研究前均签署知情同意书，且该研究经北京大学生物医学伦理委员会批准，批号：IRB00001052-08081。
2.泪液收集
将毛细管置于患者泪河，小心收集1μl泪液，应尽量避免刺激患者眼球，以得到其基础分泌泪液。将收集到的泪液迅速转移到EP管中，EP管中应提前加入9μl的1％BSA。用封口膜将EP管四周封闭，置于-80℃冰箱内保存备用。
3.Luminex多重免疫珠测定
(1)珠子：将所需珠子超声30秒，漩涡1分钟，然后各出去60μl加入混合瓶，剩余体积用珠子稀释液补足至3ml，充分混匀后置于4℃冰箱待用。
(2)控制品：用250μl蒸馏水分别溶解控制1和控制2，颠倒多次使其充分混匀，静置5-10分钟，然后分别移入两个试管中，置于4℃冰箱待用。
(3)标准品：用250μl蒸馏水分别溶解标准品，颠倒多次使其充分混匀，静置5-10分钟，移入试管中，标记为S6。另取5个试管，分别标记为S5、S4、S3、S2、S1，每个试管中加入200μl检测缓冲液，最后从S6中取出50μl进行梯度稀释。
(4)96孔板中每孔加入200μl洗涤缓冲液，室温摇10分钟润洗，然后直接倒掉，充分擦干。
(5)分别加25μl的血清基质到背景品、标准品和控制品种，加25μl的检测缓冲液到样品孔和背景品，加25μl标准品、控制品和样品到各自的孔，最后加25μl珠子到每个孔，4℃避光过夜，震荡孵育。
(6)洗板机洗2遍。
(7)每个孔加25μl检测抗体，室温避光摇1小时。
(8)每个孔加25μl的重组链霉亲和素，室温避光摇30分钟。
(9)洗板机洗2遍，最后每孔加150μl鞘液上机。
样品中IL-6、IL-23的浓度检测结果分别如图1和2所示。
结果表明，和正常对照组相比，非SS组患者泪液中IL-6和IL-23浓度均增高，SS组样品中IL-6和IL-23浓度均呈现显著增高。但干眼症内部比较显示，SS组样品种IL-6浓度较非SS组显著增高(P＜0.001)，而两组样品之间的IL-23浓度差异无统计学意义(P＝0.712)。
将所有样品中IL-6浓度与眼表参数(包括OSDI评分、ST、BUT、CFS)进行相关性分析，结果如图3所示，结果表明，IL-6浓度与眼表参数具有相关性(P＜0.01)。
实施例2基于IL-6检测干眼症
筛选出泪液中IL-6这个细胞因子后，以40pg/ml为截断值，样品中IL-6含量高于该截断值，判断为干眼症，低于该截断值，判断为正常，未患干眼症，检测基于IL-6的诊断试剂盒和方法在干眼诊断中的灵敏度和特异度，以InflammaDry MMP-9测试仪的数值为对照(如Sambursky R,Davitt WF 3rd,Latkany R,et al.Sensitivity and specificity of apoint-of-care matrix metalloproteinase 9immunoassay for diagnosinginflammation related to dry eye.JAMA Ophthalmol.2013Jan；131(1):24-8中所述)，结果如表1和表2所示。
表1样品中基于IL-6检测的干眼鉴定结果
灵敏度＝A/(A+C)×100％；特异度＝D/(B+D)×100％；阳性预测值＝A/(A+B)×100％；阴性预测值＝D/(C+D)×100％。
表2检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值结果对比
灵敏度/％ 特异度/％ 阳性预测值/％ 阴性预测值/％
基于IL-6的检测 95 95 97 90
InflammaDry MMP-9 85 94 97 73
表2结果表明，与MMP-9测试仪InflammaDry比较，泪液中IL-6的表达在干眼诊断中的灵敏度和阴性预测值均高。
实施例3干眼症分级与IL-17A
采用Luminex多重免疫珠检测慢性干眼症患者泪液中细胞因子进行检测，检测结果如表3所示。
表3IL-6、IL-17A检测结果
实施例4基于IL-6、IL-17A检测干眼症
以检测样品中IL-6水平高于40pg/ml，IL-17水平正常，为所述检测对象患有急性干眼症的指征；
以检测样品中IL-6水平高于40pg/ml、IL-17水平高于1000pg/ml，为所述检测对象患有慢性干眼症的指征。
检测基于IL-6和IL-17A的诊断试剂盒和方法在干眼诊断和分级中的灵敏度和特异度，结果如下：检测急性干眼症的灵敏度为95％、特异度95％；检测慢性干眼症的灵敏度为96％，特异度为97％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种检测鉴定干眼症的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测IL-6蛋白水平的物质。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含用于检测IL-17蛋白水平的物质。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测IL-6、IL-17蛋白水平的物质为IL-6、IL-17蛋白的特异性配体或特异性抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的IL-17为IL-17A；和/或，所述的抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体。
5.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测的样品为泪液；和/或，所述的试剂盒中还包括检测试纸，所述检测IL-6和/或IL-17蛋白水平的物质浸润或固定在所述检测试纸上。
6.一种权利要求1-5任一项所述试剂盒在制备检测鉴定干眼症的产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测IL-6蛋白水平的物质，所述的鉴定是通过测定检测样品中IL-6的水平来进行的，其中检测样品中被检测的因子水平升高是所述检测对象患有干眼症的指征。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的检测样品中IL-6水平升高是指检测样品中IL-6水平高于40pg/ml。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测的样品中IL-6水平高于40pg/ml而小于300pg/ml是所述检测对象患有非SS干眼症的指征；和/或，
所述检测的样品中IL-6水平高于300pg/ml是所述检测对象患有SS干眼症的指征。
10.如权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包含用于检测IL-17蛋白水平的物质，所述的鉴定是通过测定检测样品中IL-6、IL-17的水平来进行的；
其中，所述检测样品中IL-6水平升高，IL-17水平正常，为所述检测对象患有急性干眼症的指征；
所述检测样品中IL-6、IL-17水平均升高为所述检测对象患有慢性干眼症的指征。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的检测样品中IL-17水平升高是指检测样品中IL-17水平高于1000pg/ml。
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