KR102193937B1

KR102193937B1 - 염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트

Info

Publication number: KR102193937B1
Application number: KR1020200009320A
Authority: KR
Inventors: 조일훈; 최민지; 박범근; 송인창; 심향주
Original assignee: 을지대학교 산학협력단; 송인창
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2020-12-23

Abstract

본 발명은 기존 상용화 안구건조증 키트와 차별화된 염증성 안구건조증의 정상/경증/중증의 안구건조증을 반정량적으로 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트를 제공한다.

Description

염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트{Semi-quantitative immunoassay diagnostic kit for diagnosing inflammatory dry eye syndrome}

본 발명은 염증성 안구건조증 진단용 키트에 관한 것으로서, 더 상세하게는 염증성 안구건조증의 중증도를 반정량적으로 진단할 수 있는 면역분석 진단 키트에 관한 것이다.

최근 안구건조증(dry eye syndrome)으로 인해 눈에 불편감을 호소하는 환자들이 증가 추세이다. 이는 대기오염, 습도 저하, 환기 부족과 같은 현대인들의 생활환경이 이유가 될 수 있으며, 또한 장시간의 영상 기기 사용 및 렌즈 착용 등도 안구건조증을 유발할 수 있는 주요 원인 중 하나이고 이로 인한 의료비 지출은 매년 증가 추세에 있으며 모바일 기기 사용 연령의 다변화로 인해 이러한 현상은 점차 가속화될 것으로 보인다. 안구건조증에 대해서는 Dry eye Workshop(DEWS)에서 눈물과 안구표면의 다원적인 질병으로 정의하고 있는데, 이는 불편함, 시각장애, 눈물 막의 불안정성과 같은 증상을 초래하며, 눈물 막의 삼투압 증가 및 안구 표면의 염증을 동반할 수 있으며, 그 증상이 심해질 시 안구 표면 손상 및 염증 및 시력 저하를 초래할 수 있다고 보고되고 있다. 이러한 안구건조증을 치료하기 위해서는 앞서 언급한 생활환경과 습관의 개선이 필요한데 일반적으로 인공눈물을 사용하여 눈물 층을 유지하는 것이 하나의 방법이며, 오메가-3를 복용하는 것도 증상 개선에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 또한 눈물의 배출을 감소시켜 눈물을 유지하기 위해 눈물 점을 폐쇄시키는 누점폐쇄술 이라는 수술적 방법도 존재하고 있다.

현재 안구건조증을 진단하는 방법으로는 세극등 현미경 검사, 쉬르머 검사, 눈물막 안정성 검사 등이 있고 이중 세극등 현미경 검사는 조명의 광속을 이용하여 눈꺼풀, 결막, 각막, 전방, 수정체, 유리체를 검사하는 것으로 검사 장비와 검사자의 전문적인 진료가 요구된다. 쉬르머 검사 (Schirmer test)는 누액분비량의 임상적 검사법으로, 하안검 외반부의 결막낭에 여과지를 넣어 5분 경과 후 누액으로 젖은 부분의 길이를 측정하는 방법이지만 쉬르머 검사의 경우 여과지를 넣는 위치가 잘못 되었을 시 통증을 유발하고 그로 인해 눈물이 한 번에 다량으로 분비되어 측정이 어려워지는 문제점이 있다. 눈물막 안정성 검사 (Tear film break up time, TBUT)의 경우 플루오레세인(fluorescein)을 점안하여 검사하는데 각막 상에서의 누액 유지력과 안정성을 진단하는 검사로, 이 또한 세극등 현미경이 사용된다. 이 때 검사 시 점안한 플루오레세인은 일정 시간 동안 잔여감을 줄 수 있다는 문제점이 있다. 이외에도 안구 표면의 삼투압을 측정하여 안구건조증을 신속 진단하는 Tearlab이라는 장비가 이용되기도 하는데, 해당 장비는 고가이기 때문에 모든 진료실에 적용하기 어렵다는 단점이 있다. 이와 관련하여 국제공개특허 제2016-126556호는 안구 건조증의 객관적인 평가 방법 및 시스템에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 테스트라인 하나로서만 안구건조증의 유·무를 판단하여 적절치 못한 진단 및 항생제 처방이 이루어질 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 기존 상용화 안구건조증 키트와 차별화할 수 있는 정상·경증·중중의 안구건조증을 20분 이내에 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 시료가 적재되는 샘플 패드; 상기 샘플 패드 상부에 위치한 탐지 항체(detection antibody)-골드나노입자(금 나노입자) 결합체(conjugate)를 포함하는 항체 접합체 패드, 상기 항체 접합체 패드 상부에 위치한 대조 라인 및 테스트 라인이 형성된 멤브레인; 및 상기 멤브레인 상부의 흡습패드를 포함하는, 면역 스트립에 있어서,

상기 테스트 라인은 복수로 구성되어 복수의 라인에 따라 고농도에서 저농도로 또는 저농도에서 고농도로 농도구배를 형성하면서 고정된 포획 항체(capture Ab)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역스트립이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역스트립을 포함하는, 면역크로마토그피 키트가 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트는 측면유동 분석(lateral-flow assay) 기반으로 신속하고 간편하게 염증성 안구건조증을 진단하므로 염증성 안구건조증의 정상/경증/중증도 구분이 가능한 반정량 분석시스템의 구현을 통하여 안과에서 손쉽게 진단과 처방을 할 수 있는 플랫폼 구축할 수 있다. 또한 염증의 중증도를 테스트라인의 개수로 판단하여 염증 정도에 맞춘 처방을 의사가 효과적으로 할 수 있도록 판단하는 것을 도와줄 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트의 분석 개념을 나타내는 개요도이다. 증상 정도에 따라 Normal(정상), Mild(경증), Moderate(경중증), Severe(중증)로 분류되고 바코드(barcode) 형태로 표시된다.
도 2는 본 발명의 반정량 면역분석 진단 키트의 고정화 형태에 따른 두 가지 version의 분석 모델의 구성을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 3은 본 발명의 Ver 1 반정량 면역분석 진단 키트의 신호방향을 재설정한 분석 모식도이다.
도 4는 본 발명의 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 Streptavidin 조절을 통한 반정량적 분석 모식도이다.
도 5는 본 발명의 Ver 1 반정량 면역분석 진단 키트의 Capture Ab 조절을 통한 반정량적 분석 모식도이다.
도 6은 본 발명의 Ver 1 반정량 면역분석 진단 키트의 신호방향을 재설정한 반정량 개념 분석 결과를 나타내고 있는 사진이다.
도 7은 본 발명의 Ver 1 반정량 면역분석 진단 키트의 탐지항체-AuNP 중합체 반응 방식에 따른 신호 차이 결과를 나타내고 있는 사진이다.
도 8은 본 발명의 Ver 1 반정량 면역분석 진단 키트의 탐지항체-AuNP 중합체 과량 사용 시의 영향을 분석한 사진이다.
도 9는 본 발명의 Ver 1 반정량 면역분석 진단 키트의 세척 과정 도입의 효과(Ver 1 최종 조건)를 분석한 사진이다.
도 10은 본 발명의 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 SA-BSA 중합 비율에 의한 신호 비교를 분석한 사진이다.
도 11은 본 발명의 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 부위 특이적 비오티닐화(Site-specific biotinylation)를 나타내는 모식도이다.
도 12는 본 발명의 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 SA-BSA 중합체 고정화 형태에 따른 반정량 신호 영향을 분석한 사진이다.
도 13은 본 발명의 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 Biotinylated 항체 사용량에 따른 반정량적 신호 양상을 분석한 사진이다.
도 14는 본 발명의 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 탐지항체-AuNP 중합체 사용량에 따른 반정량적 신호 양상을 분석한 사진이다.
도 15는 본 발명의 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 반정량 최적화 조건을 분석한 사진이다.
도 16은 본 발명의 Ver 1 및 Ver 2 반정량 면역분석 진단 키트의 고정 물질에 따른 신호 비교 결과를 나타낸 사진이다.
도 17은 본 발명의 반정량 면역분석 진단 키트를 이용한 분석 절차를 나타낸 개요도이다.
도 18은 상용화 안약 5종을 이용한 특이도 테스트 결과를 나타내는 사진이다.
도 19는 현재 상용화된 InflammaDry MMP-9 진단키트의 사용 방법 및 분석 결과를 나타내는 사진이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "안구건조증(dry eye syndrome)"은 눈물기능이상 증후군이라 하며 안구 건조 워크숍(International Dry Eye Workshop; DEWS) 정의에 의해 눈물 및 안구 표면의 다인성 질환으로 안구의 다양한 불편감 유발, 시력 장애 및 눈물막 불안정의 증상을 초래하며 안구 표면 손상 가능성을 수반한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)"는 안구 표면의 스트레스를 받는 상피 세포에 의해 분비되는 단백분해 효소로, 특히 MMP-9은 안구건조증 환자의 눈물에서 일관적으로 그 농도가 상승되는 것으로 밝혀져 있는 비특정 염증 표지자이다. 이에 관한 연구 결과, 심한 안구건조증 환자에서 MMP-9 수치가 더 높으며 MMP-9 수치가 임상 검진 소견 및 대비 민감도와 상관관계가 있는 것으로 알려져, 객관적인 측정 방법을 통해 안구 표면 염증 존재를 확인하면 안구건조증에 대한 치료 알고리즘에 중요한 영향을 미칠 수 있을 것으로 보고되었다.

발명의 상세한 설명:

상기 면역스트립에 있어서, 상기 테스트 라인은 고농도에서 저농도로 농도구배를 가질 수 있고 상기 탐지 항체(detection antibody)-골드나노입자(AuNP) 결합체의 함량은 2.5 내지 4 ㎕일 수 있다.

상기 면역스트립에 있어서, 상기 포획 항체는 상기 멤브레인에 직접 고정되거나 바이오틴화되어 상기 멤브레인에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)-BSA(bovine serum albumin) 결합체와 연결될 수 있고 상기 스트렙타비딘-BSA 결합체는 LC-SPDP{(succinimidyl 6-(3(2-pyridyl- dithio)propionamido)hexanoate)} 링커에 연결된 BSA(bovine serum albumin)의 이황화 결합을 환원제에 의해 티올기(thiol functional groups)로 환원시킨 후 LC-SMCC 링커에 연결된 스트렙타비딘의 말레이미드(Maleimide)와 일정한 비율로 반응시켜 제조될 수 있으며 상기 스트렙타비딘 및 BSA는 1:3 내지 3:1의 몰비율(molar ratio)로 혼합되어 반응될 수 있다.

상기 면역크로마토그피 키트에 있어서, 상기 탐지 항체 및 포획 항체가 MMP-9에 특이적으로 결합할 수 있고 안구건조증의 진단에 사용될 수 있으며 샘플의 반응신호를 정상, 경증 및 중증 세 단계로 구분할 수 있는 반 정량적 분석이 가능할 수 있다.

현재 안구건조증을 진단하는 방법으로는 세극등 현미경 검사, 쉬르머 검사, 눈물막 안정성 검사 등이 있지만 이러한 검사법들은 안구의 물리적인 현상만을 분석하기 때문에 안구건조증 주요 원인 중 하나인 염증의 유무에 대해서는 분석이 어렵다는 단점을 내포하고 있다. 실제로도 안구건조증 치료에서 가장 중요한 것은 염증의 유무라고 보고가 되고 있는데, 염증에 의한 안구건조증일 경우, 항염제의 처방이 필수적이다. 따라서 염증 유무의 판단이 제대로 되지 않는다면 염증이 없음에도 항염제를 오남용할 수 있는 우려가 있으며, 반대로 염증이 있는 환자에게는 적절한 시기에 항염제를 처방해주지 못하는 불상사가 발생할 수도 있다. Quidel사의 InflammaDry의 경우 현재 상용화된 유일한 염증성 안구건조증 신속 진단법으로, 면역크로마토그래피 분석법을 기반으로 하며 진단 마커로 Matrix metallopreteinase-9 (MMP-9)을 이용하고 있다. 현재 상용화된 InflammaDry MMP-9 진단키트는 눈물을 이용하여 분석이 이루어지는데 InflammaDry는 샘플링 시 흡수패드를 직접 눈에다 대고 여러 번 압박을 가하여(약 9회 정도) 시료를 얻고 이후 샘플이 채취된 부분을 본 키트에 합체 후 제공된 solution을 이용하여 측면 흐름(lateral-flow)을 유발시켜 10분 동안 결과를 관찰한 후 음성 결과 시 추가로 10분을 더하여 총 20분 내 붉은색 라인이 형성이 되면 양성으로 판단한다(도 19).

InflammaDry 키트의 경우 일반적인 lateral-flow immunoassay와 마찬가지로 나노입자(골드 또는 비드)에 항체를 중합하여 사용하는 것으로 알 수 있으며 샘플이 채취된 부분을 키트 중간 부분에 위치시켜 buffer solution으로 흐름 유발을 통해 발색 신호를 발생시키는 방법은 일반 상용화된 신속 면역분석 키트와 같다.

문헌상의 기초연구 결과에 의하면 MMP-9은 여러 연구에서 안구건조증과의 상관성이 입증됨이 보고되었다. 발생 메커니즘으로 안구 건조에 의해 안구 표면의 삼투압이 증가하면 안구 표면에 스트레스를 유발하게 되는데 이는 염증성 세포 신호전달 단백질 및 MMP를 발현시킬 수 있는 경로를 활성화시키게 된다. 이러한 MMP-9 마커는 정상적인 눈물 내에서 대략 3∼40 ng/mL의 농도 범위로 존재하는 것이 보고되었다. 이러한 염증성 안구건조증 특이 단백질로 알려진 MMP-9을 진단 마커로 한 InflammaDry는 1차 진료기관에서 간편하게 사용할 수 있는 장점을 가진다. 하지만 해당 제품은 외국에서 수입된 것으로 아직 여타 진단과는 달리 보험이 적용되지 못해 진료 시 환자의 부담이 큰 실정이다. 따라서 국내 기술력을 이용한 진단 키트의 개발이 필요한 실정이다.

또한 InflammaDry 진단 키트는 정성 검사로 대상 물질의 유·무만을 결과로서 판단하지만 이는 그 질병의 심각성을 판별하기는 어렵다는 문제가 있다. 물론 정량적인 방법을 적용시킬 수 있지만 그렇게 되면 측정 장비가 필요하게 되고 그에 따라 진단 수가가 증가될 수 있으므로 기본적인 정성키트 수준에서 정량까지 가능할 수 있는 방법 고안이 필요하였다. 이를 통해 반정량적 검사가 가능하다면 염증성 안구건조증 증상의 중증도를 육안으로 판별하는데 도움이 될 수 있다.

기존의 상용화 진단 키트는 대부분 정성 검사로 대상 물질의 유무만을 결과로서 판단하지만 이는 그 질병의 심각성을 판별하기는 어렵다는 문제가 있고 물론 정량적인 방법을 적용시킬 수 있지만 그렇게 되면 측정 장비가 필요하게 되고 그에 따라 진단 수가가 증가될 수 있으므로 기본적인 정성키트 수준에서 정량까지 가능할 수 있는 방법의 고안이 필요하다. 이에 본 발명자들은 기존 상용화 안구건조증 키트와 차별화할 수 있는 반정량 개념의 분석법 구현하기 위하여 MMP-9을 반정량적으로 진단함에 따라 정상·경증·중중의 안구건조증을 20분 이내에 판별할 수 있는 염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트를 개발하였다.

일반적인 면역크로마토그래피 정성 검사에서는 테스트라인의 신호 발생 여부에 따라 검사의 양성/음성을 판별하지만, 본 발명에서는 반 정량적 진단을 위한 방법으로 여러 개의 다중 테스트라인을 구현하는 방식을 고안하였다. 즉 시료내의 항원인 MMP-9의 양이 많을수록 관찰되는 테스트라인의 개수를 증가시키는 것인데, 특정 MMP-9 양에서 나타나는 테스트라인의 개수를 설정하여 별도의 측정 장비 없이도 손쉽게 육안으로 반정량적 진단이 가능하다. 따라서 반정량 분석시스템의 구현을 통하여 안과에서 손쉽게 진단과 처방을 할 수 있는 플랫폼 구축함과 동시에 안구건조증 진단키트의 국산화 가능성 제고를 통한 향후 환자부담금 감소를 기대할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

반정량 진단키트의 분석 개념

본 발명자들은 반정량적 진단을 위한 방법으로 MMP-9 양을 나타내는 여러 개의 다중 테스트라인을 구현하는 방식을 적용한 진단키트를 제조하였다. 구체적으로 본 발명에서는 테스트라인에 고정하는 물질에 따라 두 가지 형태의 분석 디자인을 고안하였다(도 1). 먼저, 포획 항체(capture Ab)를 고정하여 MMP-9과 금 나노입자(금 나노입자)가 결합된 탐지항체(detection antibody)를 샌드위치(sandwich) 형태로 구현하는 분석 방식(Ver 1)과, streptavidin(SA)을 고정한 후 비오티닐화 포획 항체(biotinylated capture antibody)를 연결시켜 sandwich 분석을 하는 방식(Ver 2)을 두 번째로 설정하였다. 특히 Ver 2의 경우 capture Ab의 힌지 영역(hinge region)에 특이적인 biotinylation을 수행하여 항체분자의 배향성(orientation)을 증가시키고자 하였다(도 2).

우선 ver 1의 반정량 개념을 구현하기 위하여 capture 항체를 위쪽부터 아래쪽으로 구배(gradient)를 주어 고정하고 분석을 진행한 결과 MMP-9 농도에 따라 감별할 수 있는 신호를 얻을 수 있었다. 해당 방식을 기반으로 capture Ab의 고정량을 최적화하여 line 형태로 나이트로셀룰로스(nitrocellulose)에 고정하였을 경우 단계별로 비교적 명확하고 재현성 있는 신호를 수득하였다(도 3). 또한 상기 Ver 2의 반정량 개념을 구현하기 위해서는 SA-BSA 중합체를 방향만 다르게 하여 고정하였는데 이 경우 capture Ab를 고정하여 신호를 조절하던 ver 1 방식과 상반된 경향이 관찰되었다. Ver 2와 같이 결합력이 강한 SA-biotin 반응을 이용할 경우, 나이트로셀룰로스 아래쪽에서 우선적으로 결합이 일어나는 현상이 보이는데 이를 이용해 아래 부분을 강하게 고정할 경우 위쪽 부분의 신호가 감소되는 패턴을 관찰하였다. 이러한 특성 파악을 통해 관찰되는 line의 개수에 차별성을 둘 수 있도록 추가적인 테스트를 진행하였다(도 4).

실시예 1: Ver 1 분석 시스템

본 발명자들은 상기 Ver 1에서는 capture Ab를 단계적으로 고정하여 각 테스트라인에서의 감도를 조절하는 방식을 적용하였다. 구체적으로 기본적인 sandwich 형태의 면역분석법을 이용하였으며 신호발생체(signal tracer)로 탐지항체(detection antibody)-골드나노입자(AuNP, 금 나노입자) 중합체를 사용하였다. 따라서 샘플패드에 MMP-9이 포함된 시료가 가해지면 탐지항체-AuNP 중합체와 반응을 우선적으로 하게 되고 신호 생성 패드(signal generation pad)로 이동하다가 미리 고정화가 되어있는 capture Ab와 결합을 하게 되는데 이 때 면역 결합체의 양에 따라 육안으로 관찰할 수 있는 색깔이 표시된다(도 5).

실시예 2: 반정량 분석개념 구현

본 발명자들은 Ver 1 시스템 구현을 위하여 초반에는 capture Ab의 고정량을 아래쪽에서 위쪽으로 구배(gradient)를 주어 고정하고 테스트를 진행하였으나 반정량 패턴 형태를 관찰할 수 없었다. 상기 원인으로는 스트립 상에서 시료의 흐름이 비교적 빠른 속도로 일어나고 nitrocellulose membrane 표면에 고정된 항체 분자와 시료 내 항원이 적절하게 반응할 수 있는 조건이 아니기 때문에 (나이트로셀룰로스 막 구조는 기본적으로 3차 구조이고 항원-항체의 affinity constant는 보통 10⁸∼10⁹ L/mol 으로 중간정도의 결합력을 지님) MMP-9이 순차적으로 결합하지 못하고 위쪽으로 넘어가는 것으로 판단되었다. 상기 현상은 단순히 아래로부터 위로 고정화 양에 변화를 주는 것만으로는 해결하기가 용이하지 않을 것이라 판단되어 신호의 관찰 방식을 재설정 할 필요가 있었다. 이를 위해 위쪽에서부터 신호가 증가하는 방식으로 항체 고정량을 바꾸어 진행하였다(도 3).

상기 재설정한 반정량 개념을 구현하기 위하여 capture Ab의 고정량을 위쪽부터 아래쪽으로 gradient를 주어 고정한 후 분석을 진행한 결과 이전 버전과는 달리 감별력 있는 신호를 얻을 수 있었고 신호의 세기 및 신호의 방향성이 비교적 명확한 것을 확인할 수 있었다. 해당 방식을 기반으로 capture Ab의 고정량을 최적화하여 line으로 고정하였을 경우에도 line 단계별로 spot에 비하여 비교적 명확하고 재현성 있는 신호를 얻을 수 있었다(도 6).

또한 본 발명자들은 탐지항체-AuNP 반응 방식에 따른 테스트로 순차적 흐름과 샘플패드에 미리 분주한 경우 두 가지를 비교하였다. 상기 테스트는 순차적 흐름 방식이 NC membrane 전체적으로 붉은색의 배경신호를 발생시킴을 알 수 있는데 이는 테스트라인의 신호를 명확하지 못하게 할 수 있기 때문에 채택하지 않았다. 반면 탐지항체-AuNP 중합체를 샘플패드에 미리 분주하여 사용한 경우에는 배경이 깨끗한 상태에서 신호를 얻을 수 있었다(도 7). 두 방식 모두 감도에는 큰 차이가 없었기 때문에 탐지항체-AuNP 중합체는 미리 분주하는 방식을 선정하였다.

그 후, 관찰되는 신호를 더욱 명확히 하고 고농도 MMP-9에서 관찰되는 신호를 증가시키기 위해 탐지항체-AuNP 중합체의 사용량을 증가시키면서 신호 경향을 분석하였다. 그 결과, 탐지항체-AuNP 중합체를 과량으로 사용할 경우 샘플패드와 NC membrane 경계면에서 정체 현상이 발생함을 알 수 있었는데 이로 인해 탐지항체-AuNP 중합체가 고르게 흐르지 못해 배경이 깨끗하지 않고 신호 증가 효과를 얻기가 어려웠다(도 8). 따라서 탐지항체-AuNP 중합체의 사용량을 조절하기 위해서는 시료 volume의 변화를 시도할 필요가 있는데 이를 위해 위하여 탐지항체-AuNP 중합체를 기존 20X에서 40X로 농축하여 사용할 수 있도록 volume을 줄이는 방법을 적용하였다. 또한 일정 시간 반응 후 buffer를 추가적으로 흘려주는 세척 효과를 통해 향상된 결과를 얻고자 하였다. 그 결과 탐지항체-AuNP 중합체를 기존보다 과량으로 사용했음에도 깨끗한 신호를 얻을 수 있었고 MMP-9 양에 따른 신호의 증가도 뚜렷하게 관찰이 가능하였다. 이는 고농도의 중합체로 항원-항체 반응의 효율성을 증가시키고 NC membrane에 잔존하는 미반응 중합체를 세척 이라는 공정을 통해 제거함으로써 구현할 수 있었다(도 9). 상기 분석 조건을 Ver 1의 최종 조건으로 하여 dose response, 민감도, 특이도 및 재현성 실험 등을 추가적으로 진행하였다.

실시예 3: Ver 2 분석 시스템

본 발명자들은 Ver 2 분석시스템을 구현하기 위해서 니트로셀룰로오스(NC) 막에 스트렙타비딘(SA)을 고정하였으나 실제 SA 단독으로는 NC 막에 효율적으로 고정이 잘 되지 않는 문제점을 발견하였다. 상기 문제를 해결하기 위하여 우혈청 알부민(BSA)을 SA에 결합시켜 BSA의 높은 결합력을 이용해 스트렙타비딘을 효율적으로 고정하고자 하였다. 이 때 중합을 위하여 두 가지의 가교(crosslinker)를 사용하였는데, 먼저 SA에 LC-SMCC를, BSA에 LC-SPDP를 각각 1:20의 비율로 연결하였다. LC-SPDP의 경우 가교 내 포함된 이황화 결합을 20 mM DTT로 환원시켜 티올기(-SH)를 형성시킨 후 해당 부위가 LC-SMCC의 말레이미드와 결합을 하도록 하였다. 가교로 연결된 각각의 단백질은 결합 전에 Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO을 이용하여 유리 가교를 제거하는 정제(purification) 과정을 거쳤다. 상기 모든 전처리가 완료된 스트렙타비딘과 BSA는 각각 1:1, 3:1 두 가지의 몰비율(molar ratio)로 중합하였고 모든 반응은 실온에서 빛이 차단된 조건에서 진행되었다.

그 결과, 상기 제작한 두 가지의 SA-BSA 결합체는 스트렙타비딘만을 고정화 하였을 때와 NC 막에서의 고정 효율을 비교하였고 SA을 단독으로 고정하는 것보다 SA-BSA 결합체를 사용하는 것이 효율이 월등히 좋음을 확인하였다. 특히 SA-BSA(몰비율=1:1)이 다른 SA-BSA(몰비율=3:1) 결합체에 비해 신호가 강하게 관찰되었는데, 이는 분자량이 유사한 두 분자 사이의 최적 결합비율이 약 1:1이었을 때 BSA 분자의 강한 고정화 능력과 SA 분자의 활성이 최적이 되었다는 것을 알 수 있다. 이 현상을 금 나노입자 신호 발생체에 적용하였을 시에도 SA-BSA 비율이 1:1 일 때 3:1에 비해서 신호가 강하게 발생함을 확인할 수 있었다. 따라서 SA-BSA(1:1)을 ver 2의 최종 고정화 결합제로 사용하였다(도 10).

또한, 상기 Ver 2에서 NC 막에 고정된 SA에 결합하기 위해 포획항체(capture Ab)를 비오틴화(biotinylation)하였다. 일반적으로 항체의 비오틴화는 사용하는 가교제에 따라 그 방법과 특성이 달라질 수 있는데, 본 발명에서는 항체의 힌지 영역(hinge region) 부위에 주로 분포되어 있는 티올기(thiol group)을 이용하는 부위-특이적(site-specific) 비오틴화를 시행하였다. 항체의 특정부위에 비오틴(biotin)을 중합시킬 경우 무작위 비오틴화에 비해 부착 개수는 비교적 적은 편이지만 항체의 면역활성에 큰 영향을 미치지 않고 포획항체의 배향성(orientation) 증가로 항원에 대한 접근성(accessibility)이 좋아지는 장점이 있다. 그 후, 항체의 이황화 결합을 환원시키기 위해 20 mM DTT를 사용하였으며 환원 완료 후에는 Zeba Spin Desalting Columns 40K MWCO을 이용하여 겔 여과를 수행하였다. 이후 형성된 티올기에 말레이미드 반응기가 포함된 비오틴 링커(BMCC-biotin)를 1:30의 비율로 연결하였고 연결이 완료된 비오틴화 Ab는 Zeba Spin Desalting Columns 40K MWCO로 한 번 더 정제 과정을 수행하였으며 비오틴화 전 공정은 빛이 차단된 상태에서 실온 조건에서 이루어졌다(도 11).

실시예 4: Ver 2 반정량 분석개념 구현

본 발명자들은 상기 Ver 1의 실험을 통해 면역 스트립 반응 특성상 신호 관찰 방향을 한 번에 선정하기 어렵다는 것을 확인하였기 때문에 ver 2에서는 우선 SA-BSA 결합체 고정량의 변화를 두 가지 다른 방향(아래에서 위로 & 위에서 아래로 고정화 양 변화)으로 설정하여 신호의 경향을 조사하였다.

그 결과, SA-BSA 중합체를 방향만 다르게 하여 고정하였을 때 앞선 ver 1의 포획 항체를 고정하여 신호를 조절하던 방식과 상반된 경향이 관찰되었다. 특히 비교적 결합력이 강한 SA-비오틴 반응을 이용할 경우, 아래쪽에서 우선적으로 결합이 일어나는 현상이 보였는데 이를 완화하고자 아래쪽의 고정 농도를 낮게 하여도 약하게나마 신호가 관찰되었다. 반대로 아래쪽을 강하게 고정할 경우 위쪽의 신호가 감소되는 것을 볼 수 있었다(도 12). 이는 SA-비오틴 반응의 강한 친화성(affinity)에 기인하는 것으로 판단되어 상기 특성 파악을 통해 관찰되는 라인의 개수에 차별성을 둘 수 있도록 추가적인 분석을 수행하였다. 이어서, 효율적인 반정량적인 신호 패턴을 얻기 위해 SA-BSA 중합체를 dispenser 기기를 이용하여 라인 형태로 고정시켜 스트립을 제작하였고, SA-BSA를 단계적으로 라인 형태로 고정하였을 때 사용하는 비오틴화 항체 사용량에 따른 신호 경향을 분석하였다.

그 결과, 비오틴화 항체의 사용량이 많을수록 관찰되는 신호가 위쪽으로 증가하는 경향을 확인하였는데, 특히 고농도의 MMP-9에서 관찰되는 위쪽의 신호를 강하게 하는 데 효과가 있는 것으로 나타났다(도 13). 상기 결과에 따라 테스트라인을 5개까지 명확하게 관찰하기 위해서는 비오틴화 항체의 양을 증가시켜야 함을 확인하였다.

또한, 상기 비오틴화 항체 사용량의 최적화에 이어 탐지항체-AuNP 중합체의 양의 변화를 통해 관찰되는 신호의 경향을 파악한 결과, 신호발생체인 탐지항체-AuNP 중합체의 사용량이 증가할수록 저농도 MMP-9에서 관찰할 수 있는 테스트라인의 개수가 증가하는 경향을 나타내었고 고농도 MMP-9에서 관찰되는 신호가 더욱 선명해짐을 확인하였다(도 14). 이는 면역 결합체의 양이 중합체의 양과 비례관계에 있기 때문에 발생할 수 있는 현상이지만 적절한 중합체의 사용량의 범위를 벗어나게 되면 오히려 반정량 분석을 구현하기가 어려워지므로 여러 요소들과의 비율이 중요하다 할 수 있다. 즉 탐지항체-AuNP 중합체를 과량으로 사용할 경우 MMP-9 양에 따른 신호 감별력이 저하될 수 있기 때문에 적정량의 중합체를 사용하는 것이 중요하다.

아울러, 추가적인 최적화 과정을 통해 비오틴화 항체 40 ng, 탐지항체-AuNP 중합체(5x 기준) 2 μL를 사용하였을 때 가장 양호한 반정량 신호 패턴을 나타냄을 확인하였으나 가장 위쪽의 테스트라인을 명확하게 하기 위해 신호를 조절할 경우, 저농도 MMP-9에서 관찰되는 테스트라인의 개수가 증가되는데, 이 때문에 테스트라인 개수를 통해 감별을 하기 위해선 가장 위쪽의 테스트라인 까지는 선명하게 관찰하기는 용이하지 않은 것으로 분석되었다(도 15). 또한 상기 실험들의 결과에 따라 ver 2에서 신호에 가장 큰 영향을 주는 요소는 SA-BSA의 고정량과 탐지항체-AuNP 중합체의 사용량으로 이를 이용한 반응비율이 반정량을 구현하는데 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.

실시예 5: Ver 1 및 Ver 2의 반정량 분석 비교

상기 실시예 결과에 기반한 경우 두 가지 고정 물질을 적용하여 반정량적 진단 키트를 구현하고자 하였을 때 고정 물질의 종류와 물리화학적 고정상태가 신호에 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다. 우선 가장 큰 차이점은 반정량적 신호를 관찰할 수 있는 방향으로 포획항체가 고정된 스트립에서는 시료 내의 표적 물질이 아래쪽부터 순차적으로 반응하는 현상을 기대하기 어려웠던 반면 SA-BSA 중합체를 고정한 경우, 먼저 만나는 테스트라인에 결합되는 표적 물질의 양이 상대적으로 많았는데 이는 SA-biotin의 강한 결합력에 의한 현상에 의해서이다. 이로 인해 포획 항체를 고정한 경우에는 신호를 위쪽에서부터, SA을 고정했을 때는 아래쪽에서부터 관찰하는 것이 반정량 패턴을 구현할 수 있는 조건이었다. 특이점으로는 동일한 양의 MMP-9을 두 버전의 스트립에 반응시켰을 때, 포획 항체를 고정한 ver 1에서 스트립에서의 신호가 비교적 뚜렷한 것을 볼 수 있다는 것이다. SA-BSA 중합체를 고정한 경우 신호가 ver 1에 비해 다소 명확하지 못하고 테스트라인의 경계가 모호한 현상이 관찰되었다. 또한 두 고정 물질을 동일한 두께의 테스트라인 형태로 고정하였음에도 SA-BSA 중합체를 고정한 테스트라인이 더 두껍게 관찰되는 경향을 관찰하였다. 이는 항체와 SA-biotin 결합력에 의한 차이점이 극명하게 드러난 결과라 할 수 있다.

더욱이 신호 조절에 가장 큰 영향을 미치는 요소가 고정 물질의 양과 탐지항체-AuNP 중합체량이라는 점은 두 버전에서 공통적으로 확인되었으나, 반정량적인 신호 패턴을 얻기 위해서는 각 테스트라인에 대한 표적 물질의 감도를 조절하는 것이 관건이었다. 따라서 고정 물질의 양이 신호 조절에 큰 역할을 할 수 밖에 없게 됨을 알 수 있다. 신호 발생체인 탐지항체-AuNP 중합체는 사용량에 조금만 차이를 주어도 관찰되는 테스트라인의 개수에 영향을 주는 것으로 보여 분석 조건 수립 시 세심하게 고려되어야 한다. 결론적으로 상기 실험 결과 두 가지 방식을 통해 MMP-9의 양에 따라 관찰되는 테스트라인의 개수를 조절할 수 있었으나, 감별력을 주기 위해서는 낮은 농도의 MMP-9(1500 pg 이하)에서 관찰되는 신호가 매우 약해 농도 범위를 올려서 반정량 패턴을 구현할 수 있었다(도 16).

실시예 6: 성능 평가 결과

본 발명의 염증성 안구건조증 진단용 반정량 면역분석 진단 키트의 주요 성능지표로는 4가지(분석시간, 민감도, 반정량분석, 특이도)로서 이에 대한 평가는 KOLAS 인증기관인 과천에 위치한 한국화학융합시험연구원(KTR)에 의뢰하여 진행하였다. 본 발명의 진단 키트 개발을 위한 주요 성능 지표 및 측정방법을 하기 표 1에 요약하였다. 이를 보면 분석시간 항목은 나머지 세 개의 시험항목에 대한 평가를 20분으로 통일하여 적용하였으므로 별도의 추가 시험은 없도록 하였다. 민감도의 경우는 과제에서 목표로 하였던 50 pg을 달성하기 위하여 개봉을 하지 않은 표준물질을 직접 담당자에게 전달하였으며 담당자가 동결건조 MMP-9을 직접 녹여 농도 설정 후 진행하였다. 반정량 분석의 경우는 정상, 경증, 중증 세 단계로 구분하여 테스트를 진행하였고 각각의 증상에 대한 MMP-9 테스트 양은 정상 200 pg, 경증 600 pg, 중증 3000 pg으로 정하여 진행하였다. 특이도에 대해서는 현재 약국에서 판매중인 5종의 상용 인공눈물을 이용하였으며 시료 완충액에서 안약을 희석하여 분석에 적용하였다. 상기 분석 절차는 하기 표 2에 요약하였다(도 17). 시중 약국에서 판매중인 5종의 인공눈물을 이용하여 상용화 안약을 이용한 특이도 테스트를 수행한 결과, 대조라인을 제외하고는 특이적인 테스트라인은 형성(위양성)은 관찰되지 않았다(도 18).

주요 성능지표

시험 항목	시험 목표	참고 사항
분석 시간	샘플을 키트에 로딩 후 결과 신호를 얻을때까지 소요된 시간(반응+세척)을 20분으로 함	민감도, 반정량분석, 특이도 시험에 일괄적으로 동일하게 적용함으로써 별도의 추가 시험은 없음
민감도	MMP-9 50 pg을 반응시켰을 때 테스트 라인에서 신호가 관찰될 수 있는 감도를 충족하고자 함	*50 pg(=약 630 pg/mL의 MMP-9을 80 ㎕ 주입하였을 시 사양)
반정량 분석	샘플 내 MMP-9양에 따른 테스트라인 개수를 통한 반정량적 분석하고자 함	*분석기준 정상: 테스트라인1개 (400 pg미만) (200 pg: 2.5 ng/ml, 80 ㎕) 경증: 테스트라인 2-3개(400-800 pg미만) 중증: 테스트라인 4개 이상 (800 pg 초과) (3000 pg: 37.5 ng/ml, 80 ㎕)
특이도	여러 종의 상용화 인공눈물을 반응시켰을 때 위양성 결과가 없어야 함	5종 이상의 상용 인공눈물을 사용 *샘플 버퍼 70 ㎕ +안약 10 ㎕

분석 절차

순서	내용
1	스트립을 Kit 하판에 장착.
2	스트립 하단 샘플패드 중상부에 신호발생체인 금 나노입자 결합체 2.5 μL 분주 - 금 나노입자 결합체: 검출항체에 금 나노입자를 결합시킨 것
3	스트립의 위치가 변하지 않도록 고정하여 키트의 상판과 하판을 타이트하게 조립.
4	키트의 시료 로딩 부분에 제조된 시료 80 ㎕ 분주. - 시료(MMP-9) 희석 Buffer : 0.5% casein PBS with 0.1% Tween20
5	15분 반응 후 깨끗한 신호 관찰을 위하여 완충액 30 μL를 추가적으로 반응하여 세척- 세척 완충액: 0.5% casein PBS with 0.1% Tween20
6	Wash 5분후 관찰되는 신호를 통해 결과를 해석

아울러, 한국화학융합시험연구원(KTR)에서 실시한 테스트 결과는 민감도의 경우 30개 시료 전부 목표치인 테스트라인 한 개만 관찰되어 100%를 달성하였고 반정량분석 항목은 정상인 경우 100%, 경증인 경우 100%, 중증인 경우 100%로 전체 100% 달성을 하였다(표 3). 또한 중증인 경우 테스트라인 수가 4개가 관찰된 스트립이 있었지만 목표치를 테스트라인 수 4개 이상으로 하였으므로 100%로 결과를 표현하는 것은 문제가 없음을 말해준다(표 4). 마지막으로 특이도에 대한 평가 결과는 5종의 인공눈물에 대해 모두 테스트라인 수가 하나도 나오지 않는 것으로 관찰되어 특이도 100%를 달성하였다(표 5).

민감도

시험항목	단위	측정 시료 수	목표치	결과치
민감도 50 pg	테스트라인의 수	30	1	1(30/30)

반정량 분석

시험항목	단위	측정 시료 수	목표치	결과치
반정량분석 200 pg(정상)	테스트라인의 수	10	1	1(10/10)
반정량분석 600 pg(경증)	테스트라인의 수	10	2-3	3(10/10)
반정량분석 3000 pg(중증)	테스트라인의 수	10	≥4	4(1/10) 5(9/10)

특이도

시험항목	단위	측정 시료 수	목표치	결과치
특이도(아이톡 광동제약)	테스트라인의 수	6	0	0(6/6)
특이도 (틴클 유니메드 제약)	테스트라인의 수	6	0	0(6/6)
특이도(나조린 한림제약)	테스트라인의 수	6	0	0(6/6)
특이도(아이티어 플러스 신일제약)	테스트라인의 수	6	0	0(6/6)
특이도 (아이드롭 중외제약)	테스트라인의 수	6	0	0(6/6)

결론적으로 현재 안구건조증 검사는 모든 병원에서 시행되고 있으며, 생활환경의 변화로 건성안(안구건조증) 환자는 급속도로 늘어나는 추세로 본 발명의 MMP-9 POCT 진단키트를 이용하여 염증성 안구건조증의 신속, 정확한 진단 검사가 가능하며, 특히 정확하지 못한 진단으로 인한 환자의 잘못된 처치를 미연에 방지함으로써 치료비용을 궁극적으로 절감하는 효과와 안과 현장에서 손쉽게 건성안의 중증도를 판단함으로써 항생제 남용 방지 등 한 단계 향상된 의료서비스를 제공하는데 기여할 수 있다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

시료가 적재되는 샘플 패드; 상기 샘플 패드 상부에 위치한 탐지 항체(detection antibody)-골드나노입자(금 나노입자) 결합체(conjugate)를 포함하는 항체 접합체 패드, 상기 항체 접합체 패드 상부에 위치한 대조 라인 및 테스트 라인이 형성된 멤브레인; 및 상기 멤브레인 상부의 흡습패드를 포함하는, 면역 스트립에 있어서,
상기 테스트 라인은 복수로 구성되어 복수의 라인에 따라 고농도에서 저농도로 농도구배를 형성하고 상기 멤브레인에 직접 고정되거나 바이오틴화되어 상기 멤브레인에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)-BSA(bovine serum albumin) 결합체와 연결되는 포획 항체(capture Ab)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역스트립.
삭제
제1항에 있어서,
상기 탐지 항체(detection antibody)-골드나노입자(AuNP) 결합체의 함량은 2.5 내지 4 ㎕인, 면역스트립.
삭제
제1항에 있어서,
상기 스트렙타비딘-BSA 결합체는 LC-SPDP{(succinimidyl 6-(3(2-pyridyl- dithio)propionamido)hexanoate)} 링커에 연결된 BSA(bovine serum albumin)의 이황화 결합을 환원제에 의해 티올기(thiol functional groups)로 환원시킨 후 LC-SMCC 링커에 연결된 스트렙타비딘의 말레이미드(Maleimide)와 일정한 비율로 반응시켜 제조되는, 면역스트립.
제1항에 있어서,
상기 스트렙타비딘 및 BSA는 1:3 내지 3:1의 몰비율(molar ratio)로 혼합되어 반응되는, 면역스트립.
제1항, 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 면역스트립을 포함하는, 면역크로마토그피 키트.
제7항에 있어서,
상기 탐지 항체 및 포획 항체가 MMP-9에 특이적으로 결합하는, 면역크로마토그래피 키트.
제7항에 있어서,
안구건조증의 진단에 사용되는, 면역크로마토그래피 키트.
제7항에 있어서,
샘플의 반응신호를 정상, 경증 및 중증 세 단계로 구분할 수 있는 반 정량적 분석이 가능한, 면역크로마토그래피 키트.