KR20180110384A - 제어된 사이즈의 금 나노입자를 이용한 측면 흐름 분석-기반 바이오센서 및 b형 간염 바이러스를 진단하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 시드 성장 방식을 이용하여 제어된 사이즈를 갖는 금 나노입자를 이용하여 제조된 접합체(conjugates)를 측면 흐름 분석(lateral flow assay)-기반 바이오센서의 제작에 적용하고, 상기 바이오센서를 이용하여 B형 간염 바이러스를 정성적 및/또는 정량적으로 진단(또는 검출)하는 방법이 기재된다.

Description

제어된 사이즈의 금 나노입자를 이용한 측면 흐름 분석-기반 바이오센서 및 B형 간염 바이러스를 진단하는 방법{Lateral Flow Assay-based Biosensors Using Size-controlled Gold Nanoparticles and Method for Diagnosing Hepatitis B Virus}

본 개시 내용은 측면 흐름 분석-기반 바이오센서 및 이를 이용한 B형 간염 바이러스의 진단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 시드 성장 방식을 이용하여 제어된 사이즈를 갖는 금 나노입자로부터 제조된 접합체(conjugates)를 측면 흐름 분석(lateral flow assay)-기반 바이오센서의 제작에 적용하고, 상기 바이오센서를 이용하여 B형 간염 바이러스를 정성적 및/또는 정량적으로 진단(또는 검출)하는 방법에 관한 것이다.

종래에 알려진 병원균 등의 검출 방법은 세포 배양, PCR, 및 효소 면역분석을 포함하기 때문에 노동 집약적이고 결과를 얻는데 수 시간에서 수 일이 소요되는 것이 문제점으로 지적되고 있다(Foudeh et al., Microfluidic designs and techniques using lab-on-a-chip devices for pathogen detection for point-of-care diagnostics. Lab Chip, 2012, 12, 3249-3266). 이에 신속 정확하며 소량의 시료를 이용하여 검출할 수 있는 현장진료기기(point of care; POC) 관련 기술에 대한 연구가 진행 중인 바, 이러한 POC 테스트는 현재 각종 병원, 연구기관 등에서 널리 적용되고 있다.

POC 테스트를 수행하기 위하여 다양한 종류의 디바이스를 기반으로 제품화가 이루어지고 있다. 특히, 마이크로 유체 디바이스는, 예를 들면, 매우 미소 체적을 갖는 샘플 액체를 이용하여 복잡한 생물화학적 반응을 달성할 수 있기 때문에 최근 각광을 받고 있는 분야이다.

현재, 바이오센싱 및 POC 시스템에 적용하는 기술로서, (i) 고분자 기반의 미세유체 디바이스, (ii) 멤브레인 기반의 디바이스 등이 이용되고 있는 바, 상술한 기술은 작은 스케일로 짧은 시간 내에 분석을 수행할 수 있고, 샘플 및 시약(reagent)의 소비량이 적고, 또한 높은 분석 재현성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이때, 분석 또는 검출 가능한 물질은 글루코오스, 콜레스테롤, 단백질, 효소, 박테리아, 바이러스, 핵산 서열 등이다.

전술한 분석 테크닉에 있어서, 멤브레인-기반 디바이스의 경우에는 미세다공성 멤브레인의 모세관 작용을 이용하는 것으로, 예를 들면, 이동상 시료 용액에 포함된 검체(analytes)는 다른 화합물로부터 분리되는데 이는 고정된 고체상에 고정화된 포획 분자들(capture molecules)과의 결합 친화도(affinity)에 의한다. 멤브레인-기반 디바이스는 바이오 물질을 용이하게 고정하고 저렴한 비용으로 바이오 물질을 간편하게 검출할 수 있기 때문에, 여러 연구 및 산업 분야에서 활용되고 있다. 통상적으로 사용하는 멤브레인 타입의 재료로서, 니트로셀룰로오스(nitrocellulose)가 널리 알려져 있다. 니트로셀룰로오스는 기본적으로 친수성의 다공성(porous) 구조를 가질 것이 요구되는데, 이는 종래의 POCT 또는 신속 검사 키트(rapid kit) 등에서 검체에 대한 흡습을 이용하기 때문이다. 또한, 니트로셀룰로오스는 비교적 저렴한 단가, 모세관 유동 특성, 높은 단백질 결합능, 상대적으로 용이한 조작법(직접 캐스트법 또는 지지형 막) 등의 장점을 갖고 있다. 이외에도, 나일론 및 PVDF 막을 비롯한 다른 타입의 재료를 사용하려는 시도 역시 이루어진 바 있다.

전술한 멤브레인 기반의 바이오센서의 예로서 측면 흐름 분석(lateral flow assay; LFA) 기반의 바이오센서를 들 수 있다. 상기 방식은 외력에 의하여 검출하고자 하는 검체(analyte)를 함유하는 액상 샘플(fluid sample)을 검체와 상호작용할 수 있는 화학성분 또는 분자가 부착되어 있는 다양한 영역의 테스트 스트립(test strip)을 통하여 이동시킨다. 상기 샘플은 상기 테스트 스트립 상의 화학 성분 또는 분자와 반응하여 스트립이 특성 변화를 일으키도록 한다. 이와 관련하여, 검출은 가정용 임신 검사기 등과 같이 육안 식별이 가능한 표시자를 사용할 수도 있고, 또는 감응성 광학 센서(예를 들면, 미국특허번호 제7,297,529호), 열 대조 분석 판독기(예를 들면, 국내특허공개번호 제2014-127275호)와 같은 판독 장치를 이용하여 검출 또는 판독의 정확도를 높일 수 있다.

이처럼, 신속한 현장진단(point-of-care)용 진단장치 또는 시스템에 대한 필요성이 증가하는 상황 하에서 측면 흐름 분석-기반의 검출 장치는 비교적 저렴하면서 간단하고, 또한 휴대 가능한 장점을 갖고 있기 때문에 활용 범위가 점차 확대되고 있는 바, 최근에는 AIDS-관련 크립토코쿠스성 뇌수막염, 폐렴구균 폐렴, 결핵 등과 같은 다양한 감염성 질병의 진단에도 사용되고 있다.

한편, B형 간염은 가장 흔하고 심각한 간 감염 질환으로서, B형 간염 바이러스(hepatitis B virus; HBV)는 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 과에 속하는 DNA 바이러스로서, 간 세포를 공격하여 간 기능 상실, 간경화 또는 간암을 유발하는 주요 원인 인자이다. B형 간염 바이러스에 노출된 건강한 성인의 90%는 자가 회복되어 자신을 보호하는 표면 항체를 형성하나, 성인의 10%, 소아의 50% 및 유아의 90%에서는 만성 감염으로 발전하는 것으로 알려져 있다.

2012년 WHO의 보고에 따르면, 전 세계적으로 2억 4천만 명 가량의 만성 HBV 감염환자가 존재하며 매년 50만 명 내지 70만 명이 B형 간염에 기인하는 질병으로 사망하는 것으로 보고되고 있다. 국내의 경우 성인의 5 내지 8%가 HBV 보유자인 것으로 파악되고 있으며, 성인에서 만성 간염 환자의 80%, 간경변증의 65%, 그리고 간세포암종 환자의 70%가 HBV 감염과 연관되어 있다.

1980년대 이후 우리나라의 B형 간염 유병률은 백신의 보급으로 현저히 감소하고 있으나, HBV의 감염은 여전히 만성 간 질환의 가장 중요한 원인으로서, 간 질환은 국내에서 가장 중요한 사회문제 중 하나이다.

HBV 감염 진단을 위한 기본 마커(marker)는 B형 간염 표면 항원(HBsAgs) 및 급성 또는 만성 감염 헤파토사이트의 B형 간염 외피 항원을 포함한다. HBV 감염 여부를 모니터링하기 위하여 몇 가지 생리적 및 생화학적 방법이 개발되었으며, DNA PCR 분석을 이용하여 HBV를 정량적으로 분석하는 기술도 알려져 있다.

비록 전술한 방법이 정확하고 높은 감도를 제공함에도 불구하고, 상당한 시간 및 숙련된 분석을 필요로 한다. 따라서, 보다 신속하고 간단하면서도 감도가 높은 현장진단 방식의 HBV 감염 테스트를 위한 진단 시스템에 대한 요구가 존재한다.

임상적 분석에 있어서, 현장 진단 테스트 테크닉의 중요성으로 인하여 신속하면서 저렴하고 고효율의 질병 바이오마커의 검출 방법이 필요한 바, 전술한 측면 흐름 진단 방법은 혈액 단백질로부터 미코톡신까지, 그리고 바이러스성 병원체로부터 박테리아 독소까지 다양한 검체를 검출할 수 있는 유용한 수단이다. 일부 측면 흐름 분석 기반의 바이오센서의 성능은 실험실-기준의 방법에 상응하기는 하나, 대부분의 경우에 분석 감도(또는 검출 한계)는 mM 내지 μM의 범위로서 효소결합 면역학적 검정(enzyme-linked immunoassays; ELISA)과 같은 다른 분자생물학적 기술에 비하여 감도가 낮다. 따라서, 측면 흐름 분석 방식은 항원(antigen)의 농도가 낮은 경우에 질병 단계의 초기의 검출 또는 진단에 유용하다고 보기 어려운 경우가 있다.

이와 관련하여, 현재 널리 사용되고 있는 측면 흐름 분석 기반의 바이오센서는 금(Au) 나노입자(AuNPs)의 응집으로부터 생성되는 색상 신호의 변화에 의존한다. 이러한 바이오센서의 감도는 샌드위치-타입의 면역반응을 통하여 항체-고정 사이트 상에 포획된 금 나노입자의 축적량에 의존한다. 이때, 금 나노입자의 직경(또는 사이즈)은 금 나노입자-기반의 면역크로마토그래피 분석(immunochromatographic assay)의 감도에 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있는데, 약 20 내지 40 nm 사이즈의 금 나노입자가 다양한 측면 흐름 분석에 사용되고 있다. 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서의 감도를 높이기 위하여는 좁은 사이즈 분포를 가지면서 금 나노입자의 사이즈가 최적화될 필요가 있다.

따라서, 종래에 알려진 방식이 갖는 기술적 한계를 극복하면서 샘플 내 미량의 검체, 특히 HBV를 높은 정확도 및 낮은 비용으로 진단 또는 검출할 수 있는 측면 흐름 분석-기반 바이오센서에 대한 요구가 여전히 존재한다.

본 개시 내용에 따른 구체예에서는 종래의 금 나노입자를 이용한 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서가 갖는 문제점, 특히 원하는 수준의 HBV에 대한 검출 감도를 얻을 수 없는 기술적 한계를 극복하고, 간편하고 저비용으로 제조 가능한 신규 현장 진단용 바이오센서 및 이를 이용한 HBV를 효율적으로 검출하는 방법을 제공하고자 한다.

본 개시 내용의 제1 면에 따르면,

타겟 검체의 진단용 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서를 제조하는 방법으로서,

a) 시드 성장법에 의하여 20 내지 140 nm의 사이즈를 갖는 금 나노입자를 제조하는 단계;

b) 타겟 검체에 특이적인 제1 바인더와 상기 단계 a)에서 제조된 금 나노입자가 접합되어 있는 접합체(conjugates)를 제조하는 단계; 및

c) 일단으로부터 타단 방향으로 순차적으로 (i) 흡수성 샘플 패드, (ii) 상기 단계 b)에서 제조된 접합체를 포함하는 접합 패드, (iii) 상기 접합체의 제1 바인더와 결합된 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 제2 바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1 바인더와 결합하는 제3 바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역, 및 (iv) 흡수 패드를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 센서를 제조하는 단계;

를 포함하는 방법이 제공된다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 단계 a)는,

a1) 시드 금 나노입자의 수분산물을 제공하는 단계;

a2) 상기 시드 금 나노입자 수분산물에 캡핑제(capping agent) 및 금 전구체를 첨가하는 단계; 및

a3) 상기 수분산물에 함유된 시드 금 나노입자를 성장시켜 증가된 사이즈의 금 나노입자를 형성하는 단계;

를 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 단계 a3)는 2회 이상 반복될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 단계 a3)는 80 내지 97℃의 온도에서 수행될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 시드 금 나노입자는 10 내지 18 nm 범위의 사이즈(또는 직경)을 가질 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 단계 a1)은,

캡핑제를 함유하는 수용액을 제공하는 단계, 및

상기 수용액을 승온시킨 후에 금 전구체를 첨가하여 반응시킴으로써 시드 금 나노입자의 수분산물을 형성하는 단계;

를 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 금 전구체는 금 염화물일 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 금 전구체는 HAuCl₄, AuCl, AuCl₂, AuCl₃, Na₂Au₂Cl₈, NaAuCl₂, 및 이의 수화물로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 금 전구체는 HAuCl₄일 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 캡핑제는 시트레이트(citrate), 말레이트(malate), 옥살레이트(oxalate), 아스파르테이트(aspartate) 및 글루타메이트(glutamate)로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 캡핑제는 소디움 시트레이트일 수 있다.

본 개시 내용의 제2 면에 따르면,

금 나노입자를 이용한 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서로서,

일단으로부터 타단 방향으로 순차적으로 배치된 (i) 흡수성 샘플 패드, (ii) 타겟 검체에 특이적으로 결합하는 제1 바인더와 금 나노입자가 접합되어 있는 접합체(conjugates)를 포함하는 접합(conjugation) 패드, (iii) 상기 접합체의 제1 바인더와 결합되는 타겟 검체를 특이적으로 결합하는 제2 바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1 바인더와는 결합하는 제3 바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역, 및 (iv) 흡수 패드;

를 포함하고,

여기서, 상기 금 나노입자는 시드 성장법에 의하여 20 내지 140 nm의 사이즈를 갖도록 조절되는 바이오센서가 제공된다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 금 나노입자는 10% 미만의 표준 편차를 갖는 사이즈 분포를 가질 수 있다.

본 개시 내용의 제3 면에 따르면,

A) 액상의 분석용 샘플을 제공하는 단계;

B) 전술한 스트립 형태의 측면 흐름분석-기반의 센서를 제공하는 단계, 상기 타겟 검체는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원임;

C) 상기 샘플을 상기 측면 흐름분석-기반의 센서의 샘플 패드에 로딩시키는 단계; 및

D) 상기 센서의 검출 영역 내 테스트 영역으로부터 상기 접합체에 의하여 생성된 시그널을 측정하여 상기 분석용 시료 내에 B형 간염 바이러스(HBV) 항원을 정성적 및/또는 정량적으로 분석하는 단계;

를 포함하는 B형 간염 바이러스의 진단방법이 제공된다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 항원은 HBsAgs을 포함할 수 있다.

본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 시드 성장 방식을 이용하여 제어된 사이즈를 갖는 금 나노입자와 타겟 검체에 특이적으로 결합하는 바인더의 접합체를 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서 내 접합 패드에 적용함으로써 기존의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서에 비하여 검출 효과를 개선할 수 있는 신규 플랫폼을 제공한다. 특히, 본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 바이오센서는 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서 고유의 장점(휴대 편리성, 비용 경쟁력 등) 뿐만 아니라, 가장 흔하고 심각한 간 감염 질환을 유발하는 B형 간염 바이러스의 정성적 및/또는 정량적 분석에 효과적으로 적용할 수 있는 장점을 갖는다.

따라서, 향후 광범위한 활용이 기대된다.

도 1은 본 개시 내용의 일 구체예에 따른 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서의 개략적인 구성을 도시하는 도면이고;
도 2a 내지 도 2f 각각은 상이한 성장 단계로부터 수득된 금 나노입자(AuNPs)의 전형적인 형태학적 특징을 나타내는 TEM 사진 및 상이한 사이즈의 금 나노입자의 사이즈 분포를 나타내는 도면이고;
도 3은 상이한 성장 단계로부터 수득된 금 나노입자(AuNPs)의 단계 별 동적 광 산란(dynamic light scattering: DLS) 분석으로부터 측정된 입자 사이즈를 나타내는 그래프이고;
도 4는 상이한 사이즈를 갖는 분산물에 대한 UV-vis 스펙트럼 및 상이한 시드 성장 단계(성장 단계 1 내지 14) 각각으로부터 수득된 금 나노입자 분산물의 사진이고;
도 5는 금 나노입자(AuNP) 및 금 나노입자와 항체(AuNP-Ab) 분산물에 대한 UV-vis 스펙트럼이고;
도 6a 내지 도 6f 각각은 다양한 pH 값에서 NaCl을 첨가한 후의 금 나노입자의 흡수도(OD₅₂₀, OD₅₂₅ 및 OD₆₁₀) 변화, 그리고 금 나노입자와 항체 간의 접합(conjugation) 시 NaCl의 첨가 후 흡수도(OD₅₂₀, OD₅₂₅ 및 OD₆₁₀) 변화를 나타내는 그래프이고((a) 및 (b)는 34.0±1.2 nm AuNP; (c) 및 (d)는 42.7±0.8 nm AuNP; 및 (e) 및 (f)는 137.8±0.45 nm AuNP);
도 7a 내지 도 7e 각각은 상이한 사이즈를 갖는 금 나노입자를 기반으로 하는 측면 흐름 분석 테스트 결과를 나타내는 사진이고;
도 8은 시드 성장법(단계 1, 3, 7, 10 및 15) 및 Turkevich 합성법 각각에 따라 상이한 사이즈를 갖는 금 나노입자를 기초로 하는 측면 흐름 분석 기반의 바이오센서의 테스트 라인에서의 색 강도를 나타내는 그래프이고; 그리고
도 9a 내지 도 9c 각각은 인체 전혈(human whole blood) 샘플을 이용하여 수행된, (a) 상용 측면 흐름 분석 기반의 바이오센서, (b) Turkevich 합성법에 따른 측면 흐름 분석 기반의 바이오센서 및 (c) 시드 성장 합성법에 따른 측면 흐름 분석 기반의 바이오센서에 대하여 테스트한 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.

"바이오센서"는 생물학적 요소와 분석 대상 물질과의 반응에서 나타나는 전기화학적 변화, 열 에너지 변화, 형광 또는 색의 변화 등을 인식가능한 신호로 변환시켜주는 디바이스와 결합하여 제작된 디바이스를 의미할 수 있다.

"바인더"는 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체일 수 있다.

"항원"은 특이한 면역 반응을 일으킬 수 있는 임의의 물질(substance)로서, 구체적으로 적어도 하나의 항체에 의하여 인식 가능한 임의의 분자 또는 분자 그룹을 의미할 수 있다. 항원은 적어도 하나의 에피토프(epitope; 항체의 의하여 인식될 수 있는 특정 생화학적 유닛)을 함유한다.

"항체"는 완전한 다클론(또는 폴리클론) 또는 단클론(모노클론) 항체뿐만 아니라, 이의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일사슬 (ScFv), 다이아바디, 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체, 그의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 요망되는 특이성의 항체 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 기타 변형 배열을 의미할 수 있다. 항체로는 임의의 범주에 해당되는 항체, 예를 들면 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 서브클래스), 및 특정 클래스에 속하지 않는 항체를 포함할 수 있다.

"특이적으로 결합한다"는 표현은 결합 시약(reagent), 예를 들면 항체의 특이성을 의미하는 것으로, 정의된 검체 또는 타겟 물질에 우선적으로 결합하는 것을 의미할 수 있다. 다른 잠재적인 타겟의 존재 하에서 특정 검체 또는 타겟 물질의 결합 시약 또는 항체에 의하여 인식되는 것은 이러한 결합의 일 특징일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 검체에 특이적으로 결합하는 결합 시약은 검사하고자 하는 샘플 내의 다른 간섭 부분 또는 부분들과의 결합을 회피할 수 있다.

"샘플"은 검출하고자 하는 검체를 함유할 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액(전혈), 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집괴로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다.

"검체(analyte)"는 검출될 샘플 내 분자 또는 기타 물질을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들면, 검체는 항원성 물질, 리간드(모노- 또는 폴리에피토프), 합텐(haptens), 항체 및 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 구체적으로, 검체는, 예를 들면 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 약물 중간체 또는 부산물, 세균, 바이러스 입자, 효모, 진균, 원생 동물 및 상기 물질들의 대사물 또는 그에 대한 항체를 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 통상적으로 항원 또는 항체일 수 있다. 이와 관련하여, 예시적인 검체로서, 페리틴; 크레아티닌키나아제 MB(CK-MB); 디곡신; 페니토인; 페노바르비톨; 카르바마제핀; 반코마이신; 젠타마이신; 테오필린; 발프로산; 퀴니딘; 황체화 호르몬(LH); 소포 자극 호르몬(FSH); 에스트라디올, 프로게스테론; C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP); 리포칼린; IgE 항체; 사이토카인; 비타민 B2 마이크로-글로블린; 당화 헤모글로빈(Gly.Hb); 코르티졸; 디지톡신; N-아세틸프로카인아미드(NAPA); 프로카인아미드; 풍진-IgG 및 풍진 IgM과 같은 풍진에 대한 항체, 예를 들면 톡(톡소-IgG) 및 톡소포자충증 IgM과 같은 톡소포자충증에 대한 항체; 테스토스테론; 살리실레이트; 아세트아미노펜; 간염 B 바이러스 표면 항원(HBsAgs); 간염 B 코어 항원에 대한 항체, 예를 들면 항-간염 B 코어 항원 IgG 및 IgM(항-HBC); 인간 면역 결핍 바이러스 1 및 2(HIV 1 및 2); 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1 및 2(HTLV); 간염 B e 항원(HBeAg); 간염 B e 항원에 대한 항체(항-HBe); 인플루엔자 바이러스; 갑상선 자극 호르몬(TSH); 티록신(T4); 총 트리요오도티로닌(총 T3); 자유 트리요오도티로닌(자유 T3); 암종배아 항원(CEA); 지질 단백질, 콜레스테롤, 및 트리글리세리드; 및 알파 페토단백질(AFP)을 예시할 수 있다. 오용 및 제어 물질의 약물로서, 구체적으로 암페타민; 메타암페타민; 바르바투레이트, 예를 들면 아모바르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈 및 바르비탈; 벤조디아제핀, 예를 들면 리브리움 및 발리움; 칸나비노이드, 예를 들면 하쉬쉬 및 마리주아나; 코카인; 펜타닐; LSD; 메타쿠알론; 아편제, 예를 들면 헤로인, 몰핀, 코데인, 히드로몰폰, 히드로코돈, 메타돈, 옥시코돈, 옥시몰폰 및 오피움; 펜시클리딘; 및 프로폭시헨을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

"접합체(cojugate)"는 광의로는 특정 물질 및 이에 접합된 검출 가능한 표지(label)를 의미할 수 있는 바, 본 개시 내용에서는 표지로서 금 나노입자를 사용하고, 이에 바인더 성분(구체적으로 제1 바인더)이 접합된 것을 의미할 수 있다.

"접촉한다"는 용어는 협의 상 2개의 물질간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 구성 요소와 액체 흐름 간의 접촉이 이루어지는 한, 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 특정 방식, 즉 시드 성장 합성법으로 제조되어 제어된 사이즈를 갖는 금 나노입자를 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 바인더(제1 바인더)와 접합시킨 접합체를 스트립 형태의 측면 흐름 분석(LFA) 기반의 바이오센서의 접합 패드에 적용함으로써 종래의 LFA-기반 기술에 비하여 우수한 검출 감도를 달성할 수 있는 바이오센서 구조가 제공된다. 이와 관련하여, 도 1은 예시적인 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서의 개략적인 구성을 도시한다.

도시된 바와 같이, 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서(100)의 전형적인 예는 스트립의 길이를 기준으로 하여 일단에서부터 타단 방향으로, (i) 샘플 패드(101), (ii) 접합 패드(conjugation pad; 102), (iii) 테스트 영역(104) 및 컨트롤 영역(105)이 형성되어 있는 멤브레인을 포함하는 검출 영역(103), 및 (iv) 흡수 패드(adsorbent pad; 107)가 순차적으로 배열되어 있다. 이러한 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서를 구성하는 4개의 영역은 전형적으로 플라스틱 접착제에 의하여 백킹 카드 또는 백킹 시트(106) 상에 적층되어 있다. 또한, 각각의 패드는 상호 간에 접촉되거나 중첩된(overlapped) 형태로 배치될 수 있는 바, 이는 분석 과정에서 샘플 용액이 측면 흐름 분석-기반 바이오센서를 따라 이동할 수 있도록 하기 위함이다. 전형적으로, 중첩된 영역의 폭은, 예를 들면 약 1 내지 3 mm, 구체적으로 약 1.5 내지 2 mm 범위일 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

도시된 구체예에 있어서, 샘플(또는 샘플 용액)은 샘플 패드(101)를 거쳐 접합(conjugate) 패드(102)을 통과하고, 또한 멤브레인 형태의 검출 영역(103)을 거치면서 테스트 영역(104) 및 컨트롤 영역(105)에 도달할 때까지 흐르게 된다. 이처럼, 샘플 패드(101), 접합 패드(102), 멤브레인 형태의 검출 영역(103) 및 흡수 패드(107)는 모두 유체 연통되어 있다.

예시적 구체예에 있어서, 샘플 내 타겟 검체의 최소량(즉, 검출 한계; 검출 시 샘플 또는 샘플 용액에 존재해야 하는 타겟 검체의 최소량)은, 예를 들면, 적어도 약 0.01 ng/ml, 구체적으로 적어도 약 0.1 ng/ml, 보다 구체적으로 적어도 약 1 ng/ml 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로서 타겟 검체의 종류, 특성 등에 따라 변화 가능하다.

구체적으로, 샘플 패드(101)는 전형적으로 샘플(구체적으로 액상의 분석용 샘플)을 균일하게 분포시키고, 또한 이를 인접하는 접합 패드(102)로 전달하는 복수의 기능을 담당한다. 샘플은 모세관 현상에 의하여 샘플 패드(101)로부터 화살표로 표시된 바와 같이 흡수 패드(107) 방향으로 이동하게 된다. 예시적 구체예에 따르면, 샘플 패드(101)는 완충 염, 단백질, 계면 활성제 및 샘플의 유속을 조절할 수 있는 다른 액체를 포함하는 조성물로 함침될 수 있다. 또한, 샘플 패드(101)의 포어는 잉여 성분(예를 들면, 적혈구 세포)을 필터링하는 기능을 수행할 수 있다.

접합 패드(102)의 경우, 금 나노입자와 제1 바인더의 접합체를 보유하고, 테스트가 수행될 때까지 접합체가 기능적으로 안정하도록 유지하는 역할을 담당할 수 있다. 구체적으로, 접합체가 건조된 상태로 존재하다가 타겟 검체를 함유하는 샘플(또는 샘플 용액)이 흡수됨에 따라 유동성을 부여하여 하류에 위치하는 멤브레인 재질의 검출 영역(103)으로 이동하도록 한다. 이를 위하여, 예를 들면 탄수화물(예를 들면, 수크로오스) 및 재용해제(resolubilization agent)를 함유하는 접합 완충액 조성을 이용할 수 있다. 이 경우, 접합체 입자가 당의 존재 하에서 건조될 경우에는 당 분자가 입자 주변에 층을 형성하여 안정화시킬 수 있다. 샘플 용액이 접합 패드(102)로 도입됨에 따라, 당 분자는 신속하게 용해되어 접합체 입자를 유체 흐름 내로 운반할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 접합 패드(102)는 제1 바인더에 부착된 금 나노입자, 즉 접합체를 포함하는 바, 이를 위하여 스프레이, 함침 등의 방법을 이용할 수 있다. 이때, 제1 바인더는 타겟 검체와 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있는 것일 수 있고, 이러한 특이적 결합은 상보적 결합을 수반할 수 있다. 즉, 제1 바인더는 특정 타겟 검체에만 결합하고(즉, 특이적으로 결합하고), 샘플 내에 있는 다른 분자 등과는 결합하지 않는 것일 수 있다. 예시적으로, 제1 바인더는 항체(또는 항체 단편)일 수 있으며, 상기 항체는 타겟 검체인 항원에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있는 것이다. 접합체 내에서 제1 바인더와 접합되는 금 나노입자의 경우, 검출 가능한 특성은 색상이며, 예를 들면 오렌지색, 적색, 자주색 등일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 접합체(제1 바인더와 금 나노입자의 접합체)는 샘플 내 타겟 검체와 결합되어(샘플 내에 타겟 검체가 존재하는 경우) 검출 영역(103)으로 이동한다.

도시된 구체예에 있어서, 상기 검출 영역(103)은 멤브레인, 구체적으로 다공성의 멤브레인 형태로 이루어지는 바, 예시적으로 셀룰로오스, 유리 섬유, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하변형된 나일론, 폴리에테르 설폰 등으로부터 선택될 수 있다. 보다 건형적으로는 니트로셀룰로오스가 사용될 수 있다. 상기 검출 영역(103)에는 샘플의 흐름 방향으로 순차적으로 테스트 영역(104) 및 컨트롤 영역(105)이 배열되어 있는 바, 예시적으로 상기 테스트 영역(104) 및 컨트롤 영역(105) 각각은 멤브레인 상에서 가로질러 연장되는 라인 패턴으로 형성될 수 있다. 또한, 컨트롤 영역(105)은 샘플의 흐름 방향 기준으로 테스트 영역(104)의 하류에 위치할 수 있다.

상기 테스트 영역(104)에서는 전술한 접합체(제1 바인더와 금 나노입자의 접합체) 내 제1 바인더와 결합되는 타겟 검체를 특이적으로 결합하는 제2 바인더가 고정되어 있다. 이때, 제2 바인더 역시 제1 바인더와 유사하게 타겟 검체에 특이적으로(또는 선택적으로) 결합할 수 있는 바, 구체적으로 접합체의 제1 바인더와 특이적으로 결합되어 있는 타겟 검체(샘플 내에 타겟 검체가 존재하는 경우)를 경유하여 상기 접합체를 포획할 수 있다(샌드위치 방식). 이와 관련하여, 타겟 검체가 항원인 경우에 제2 바인더는 항체일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 접합체는 모세관 현상을 통하여 다공성 재질의 검출 영역(103) 내에서 흡수 패드(107) 방향으로 이동한다. 이때, 다공성 재질의 멤브레인의 포어 사이즈는, 예를 들면 약 0.05 내지 12 ㎛, 구체적으로 약 0.1 내지 7 ㎛ 범위일 수 있다.

샘플 내에 타겟 검체가 존재할 경우, 접합체에 결합된 제1 바인더와 특이적으로 결합하여 일종의 복합체(예를 들면, 항원-항체-금 나노입자)를 형성한다. 이와 같이 형성된 복합체는 테스트 영역(104) 상에 고정되어 있는 제2 바인더(예를 들면, 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 항체)에 의하여 포획되며, 그 결과 테스트 영역(104)에 금 나노입자가 축적하여 특정 색상을 발현하게 된다(양성 테스트 결과). 이때, 금 나노입자의 사이즈는 다공성 멤브레인의 검출 영역(103)의 포어를 통하여 이동할 수 있도록 설계된다. 또한, 금 나노입자는 제1 바인더(예를 들면, 항체)에 용이하게 결합 또는 코팅될 수 있다.

이와 같이, 테스트 라인(104)에 금 나노입자가 포획될 경우, 가시광선과 상호작용하여 육안 또는 다양한 검출 장치(또는 분석 장치)에 의하여 검출 가능한 변화(구체적으로 색상)를 일으키게 된다. 반면, 접합체가 타겟 검체와 결합되지 않은 경우, 상기 접합체는 샘플의 흐름과 함께 테스트 영역(104)을 통과하게 된다.

한편, 검출 영역(103) 중 컨트롤 영역(105)의 경우, 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나, 제1 바인더와 결합하는 제3 바인더가 고정될 수 있다. 예를 들면, 제3 바인더는 제1 바인더와 특이적으로 결합될 수 있다. 이와 관련하여, 제1 바인더는 타겟 검체와 결합되어 있는 1차 항체일 수 있다. 따라서, 접합체가 타겟 검체와 결합되지 않은 관계로 테스트 영역(104)을 지나치더라도 제3 바인더와 결합되어 컨트롤 영역(105) 상에서 포획될 수 있다. 예를 들면, 샘플 내에 타겟 검체가 존재하지 않는 경우, 테스트 영역(104)에서 색상 등이 발현하지 않더라도 컨트롤 영역(105)에서는 색상 등이 발현하게 된다. 이처럼, 상기 컨트롤 영역(105)에서의 응답(response)은 액상 샘플이 센서를 적절히 통과하고 있음(즉, 컨트롤 영역으로부터의 시그널은 접합체가 존재하고 제3 바인더가 이러한 접합체와 결합(binding)되어 있음을 지시하므로 바이오센서가 적절히 작동하고 있음)을 의미한다.

구체적으로, 제3 바인더는 샘플에 타겟 검체의 존재에 관계없이, 접합체 중 금 나노입자와 접합되어 있는 제1 바인더와 결합하여 컨트롤 영역 상에 축적된다. 예시적 구체예에 따르면, 상기 제3 바인더는 2차 항체로서 Fc 영역 또는 Fab 영역과 같은 항체 단편(antibody fragments) 또는 전체 Ig 분자에 대하여 특이성을 나타내는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 예를 들면, 접합체로서 금 나노입자와 마우스 항-휴먼 IgG(mouse-anti human IgG)의 접합체가 사용될 경우, 컨트롤 영역(105)에서의 제3 바인더는 항체로서 항-마우스 IgG(anti-mouse IgG), 예를 들면 염소 항-마우스(goat anti-mouse) IgG 항체 등일 수 있다.

전술한 바와 같이, 컨트롤 영역(105)을 통과한 샘플(또는 샘플 용액)은 하류에 위치하면서 멤브레인 재질의 검출 영역(103)에 접촉되어 있는 흡수 패드(107) 내로 흡수된다. 상기 흡수 패드(107)는 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반 바이오센서의 단부에 부착되어 과량의 반응 시약을 흡수하여 액체의 역흐름(backflow)을 방지하고 처리된 액체를 수집하는 기능을 하는 바, 흡수 패드(107)는 보다 큰 샘플 용액의 체적의 사용을 허용함으로써 테스트의 감도를 증가시킨다. 예시적 구체예에 있어서, 흡수 패드(107)는 셀룰로오스 필터 등의 재질일 수 있다.

본 개시 내용의 일 구체예에 있어서, 주목할 점은 접합체를 구성하는 금 나노 입자가 금(Au) 시드로부터 증가된 사이즈를 갖는 금 나노입자를 형성하는 방식, 즉 시드 성장법에 의하여 제조된다는 것이다. 이와 같이 제조된 금 나노입자는 종래 기술(예를 들면, Turkevich 합성법)과 대비할 때, 입자 사이즈를 정밀하게 조절할 수 있기 때문에 보다 균일한 입자 사이즈를 갖는다. 이와 같이 시드 성장법에 의하여 제조된 금 나노입자와 제1 바인더를 접합시킨 접합체를 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서 중 접합 패드에 적용할 경우, 보다 높은 검출 감도, 특히 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 보다 높은 검출 감도를 제공할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 용매(예를 들면, 물)의 존재 하에서 금 전구체와 캡핑제(capping agent)를 반응시켜 금(Au) 시드의 분산물(예를 들면, 수용액 매질 내 금 시드 나노입자의 분산물)을 제조할 수 있다. 통상적으로, 캡핑제는 이온 결합 또는 공유 결합에 의하여 금 시드 나노입자의 표면 원자에 결합할 수 있는 관능기를 갖는 유기 분자를 의미할 수 있는 바, 예시적으로 특정 캡핑제는 환원제로도 작용할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 캡핑제로서 시트레이트(citrate), 말레이트(malate), 옥살레이트(oxalate), 아스파르테이트(aspartate) 및/또는 글루타메이트(glutamate)를 사용할 수 있는 바, 이때 시트레이트, 구체적으로 소디움 시트레이트는 캡핑제 및 환원제로 기능하기 때문에 유리할 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 금(Au) 시드 입자의 분산물을 제조하기 위하여 캡핑제(및/또는 환원제)를 함유하는 수용액을 제조한다. 이때, 수용액 내 캡핑제의 농도는, 예를 들면 약 1.5 내지 60 mM, 구체적으로 약 2 내지 10 mM, 보다 구체적으로 약 2.1 내지 5 mM 범위일 수 있다.

상기 캡핑제의 수용액을, 예를 들면 비점 이상의 온도(구체적으로 약 100℃까지)로 승온시킨 다음, 금 전구체를 첨가할 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 캡핑제의 수용액을 비점 이상의 온도로 가열한 후에 금 전구체를 첨가할 수 있다.

상기 금 전구체는, 전형적으로 Au(III) 이온을 함유하는 형태로서, 예를 들면 금(III) 염화물 형태일 수 있다. 예시적으로, 금 전구체는 HAuCl₄, AuCl, AuCl₂, AuCl₃, Na₂Au₂Cl₈, NaAuCl₂, 및 이의 수화물로 이루어진 군으로부터 1 또는 2 이상이 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로는 HAuCl₄일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 금 전구체 : 캡핑제의 비(몰 기준)가, 예를 들면 약 12 내지 0.4 : 1, 구체적으로 약 10 내지 0.7 : 1, 보다 구체적으로 약 7 내지 1 : 1의 범위에서 금 전구체의 첨가량을 조절할 수 있다. 또한, 반응 시간은, 예를 들면 약 5 내지 120분, 구체적으로 약 10 내지 60분, 보다 구체적으로 약 15 내지 40분 범위일 수 있다.

상기 반응 결과, 생성된 시드 금 나노입자의 수분산물에 함유된 시드 금 나노입자의 사이즈(평균 입경; 복수의 나노입자에 있어서 나노입자 사이즈 분포의 산술 평균)는, 예를 들면 약 10 내지 18 nm, 구체적으로 약 13 내지 17 nm, 보다 구체적으로 약 14 내지 17 nm 범위일 수 있다.

전술한 바와 같이, 시드 금 나노입자의 수분산물이 제조되면, 이에 캡핑제 및 금 전구체를 동시에 또는 순차적으로 투입하여 반응시킴으로써 증가된 사이즈의 금 나노입자를 제조할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 상기 시드 금 나노입자의 수분산물이, 예를 들면 약 80 내지 97℃, 구체적으로 약 85 내지 95℃, 보다 구체적으로 약 88 내지 92℃로 냉각된 후에 캡핑제 및 금 전구체를 투입할 수 있다. 예시적 구체예에 있어서, 금 전구체 : 캡핑제의 비(몰 기준)가, 예를 들면 약 12 내지 0.4 : 1, 구체적으로 약 10 내지 0.7 : 1, 보다 구체적으로 약 7 내지 1 : 1의 범위에서 금 전구체의 첨가량을 조절할 수 있다.

상기 캡핑제 및 금 전구체의 투입과 함께 성장 반응이 개시되며, 이때 반응 온도는, 예를 들면 약 80 내지 97℃, 구체적으로 약 85 내지 95℃, 보다 구체적으로 약 88 내지 92℃ 범위에서 유지되도록 조절될 수 있고, 또한 반응 시간(반응 사이클 당)은, 예를 들면 약 10 내지 150분, 구체적으로 약 20 내지 100분, 보다 구체적으로 약 30 내지 90분 범위일 수 있다.

상기 반응 결과, 시드 금 나노입자 상에 금(Au) 층이 성장하면서 금 나노입자의 사이즈는 증가하게 되는 바, 이때 금 나노입자의 표면은 캡핑제가 코팅되거나 존재하는 관능화된(functionalized) 형태일 수 있다. 특히, 금 나노입자의 표면에 캡핑제가 박막의 컨포멀(conformal) 코팅 형태로 존재할 수 있다.

이러한 금 나노입자의 성장 단계는 원하는 금 나노입자의 사이즈에 도달할 때까지 1회에 걸쳐 수행될 수도 있으나, 택일적으로 2회 이상의 사이클로 반복하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 2 내지 15회, 구체적으로 3 내지 14회의 사이클로 반복 가능하다. 상술한 반응 회수의 범위는 예시적인 것으로서 본 발명이 반드시 이에 한정되지는 않는다.

이와 관련하여, 금 나노입자의 사이즈는 약 20 내지 140 nm, 구체적으로 약 30 내지 60 nm, 보다 구체적으로 약 40 내지 50 nm 범위일 수 있다. 상기 금 나노입자의 사이즈 범위는 검출 강도에 중대한 영향을 미치는 요인으로서, 시드 성장법에 따라 제조되며 상기 사이즈 범위를 갖는 금 나노입자와 제1 바인더의 접합체를 이용할 경우, 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서에 있어서 개선된 검출 강도를 확보할 수 있다. 특히, 후술하는 바와 같이 B형 간염 바이러스(HBV) 검출 시 개선된 검출 감도를 달성할 수 있다. 예시적 구체예에 있어서, 상기 금 나노입자는, 예를 들면 약 10% 미만, 구체적으로 약 5% 미만, 보다 구체적으로 약 2% 미만의 표준 편차를 갖는 사이즈 분포 특성을 가질 수 있다.

또한, 상기 금 나노입자는 6각형, 로드형, 구형, 삼각형 등의 다양한 형상을 가질 수 있으나, 구형을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 전술한 바와 같이 금 나노입자가 제조되면, 이를 이용하여 측면 흐름 분석-기반 바이오센서의 접합 패드에 적용하기 위한 제1 바인더와 금 나노입자의 접합체를 제조한다. 이때, 금 나노입자는 전술한 금 나노입자의 형성 반응으로부터 수득된 수분산물일 수도 있고, 이로부터 금 나노입자를 분리한 후에 다시 물에 투입하여 제조된 수분산물일 수도 있다. 예시적으로, 상기 수분산된 금 나노입자의 광학밀도(UV Optical density)는, 예를 들면 약 6 내지 9, 보다 구체적으로 약 7 내지 8의 범위일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 제1 바인더와의 접합에 적합한 pH 범위를 유지하는 것이 바람직할 수 있는 바, 예시적인 pH 범위는, 예를 들면 약 6 내지 10, 구체적으로 약 7 내지 9.5, 보다 구체적으로 약 8.5 내지 9.2 범위일 수 있다. 이때, pH가 일정 수준에 미달하거나 초과할 경우에는 항체와 금 나노입자 간의 응집(aggregation) 현상이 발생할 수 있기 때문에 전술한 범위 내에서 적절히 조절할 수 있다.

이때, 접합 과정 중 pH 범위를 조절하기 위하여, 염기 성분을 첨가할 수 있는 바, 이러한 염기 성분은, 예를 들면 탄산칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등일 수 있고, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 금 나노입자와 제1 바인더(특히, 항체)의 접합은 당업계에서 알려진 다양한 방법에 의하여 구현될 수 있으며, 본 개시 내용의 구체예는 금 나노입자와 제1 바인더의 접합이 가능한 한, 특정 방법으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 당업계에서 공지된 접합 방법의 예로서 화학적 관능기 및/또는 분자를 링커(예를 들면, 금 나노입자와 제1 바인더 사이에서 공유 또는 비공유 결합에 의한 연결할 수 있는 화합물로서 아미노기, 카르복시기, 옥소기 또는 티올기와 같은 작용기(functional group))를 가질 수 있음)로 사용하여 금 나노입자와 제1 바인더를 접합하는 방법을 들 수 있다. 택일적으로, 제1 바인더의 말단에 바이오틴(biotin)을 부착하고, 금 나노입자의 표면에 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 단백질을 코팅하여 바이오틴과 아비딘 간의 강력한 결합력을 이용하는 방법 등을 이용할 수도 있다.

다른 예시적 구체예에 따르면, 금 나노입자의 분산물(수분산물)에 제1 바인더(예를 들면, 타겟 검체가 항원인 경우, 이에 특이적으로 결합하는 항체)를 첨가하여 접합하되, 접합 과정에서 pH 및 제1 바인더의 농도를 조절하면서 제1 금 나노입자의 표면에 직접 제1 바인더를 접합시킬 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 제1 바인더의 농도는, 예를 들면 약 1 내지 20 μg/ml, 구체적으로 약 2 내지 10 μg/ml, 보다 구체적으로 약 3 내지 5 μg/ml 범위 내에서 선정될 수 있다.

매질 내 pH 및 제1 바인더의 농도 범위는 금 나노입자의 사이즈에 따라 조절될 수 있는 바, 전술한 pH 범위 및/또는 제1 바인더의 농도는 특히 전술한 금 나노입자 사이즈의 범위에서 유효하게 적용될 수 있다. 이와 관련하여, 제1 바인더 이외의 다른 성분(예를 들면, 단백질)이 결합되는 것을 방지하기 위하여, 소 혈청 알부민(BSA), 카세인(Casein), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol) 등을 첨가할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 전술한 바와 같이 금 나노입자와 제1 바인더의 접합체를 제조한 후, 이를 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서 구조 내 접합 패드에 함유시킬 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 상기와 같이 시드 성장법에 따라 제조된 금 나노입자와 제1 바인더의 접합체가 적용된 접합 패드를 사용하여, 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서를 제작할 수 있다. 구체적으로, 일단으로부터 타단 방향으로 순차적으로 (i) 흡수성 샘플 패드(101), (ii) 상술한 접합체를 포함하는 접합 패드(102), (iii) 테스트 영역(104) 및 컨트롤 영역(105)을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역(103), 및 (iv) 흡수 패드(107)를 조립하여 스트립 형태의 바이오센서를 제작할 수 있다.

택일적 구체예에 따르면, 샘플 패드(101), 접합 패드(102), 검출 영역(103) 및 흡수 패드(107)를 조립하여 스트립 형태의 바이오센서를 제작하고, 이후 접합 패드(102)에 전술한 접합체를 스프레이, 함침 등의 방식으로 함유시킬 수 있다. 이와 별도로 또는 후속적으로, 상기 검출 영역(103)의 테스트 영역(103) 및 컨트롤 영역(104) 각각에 제2 바인더 및 제3 바인더를 고정시킴으로써 바이오센서를 제작할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 샘플 내에 함유된 타겟 검체와 결합된 접합체가 테스트 영역에 고정됨에 따라 금 나노입자의 축적으로부터 생성되는 시그널(예를 들면, 색상 시그널)을 육안으로 또는 검출 장치를 이용하여 정성적 및/또는 정량적 분석을 수행할 수 있다.

한편, 본 개시 내용의 다른 구체예에 따르면, 전술한 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서는 B형 간염 바이러스(HBV)를 정석적 및/또는 정량적으로 진단하는데 유용하게 적용될 수 있다. 이때, 타겟 검체는 B형 간염 바이러스 항원으로서, 구체적으로는 B형 간염 바이러스의 표면 항원일 수 있다. 본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 개시 내용의 구체예에 따른 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서가 B형 간염 바이러스(HBV)의 검출에 특히 유리하게 적용 가능한 이유는 시드 성장법에 의하여 특정 사이즈 범위 내에서 균일한 사이즈 분포 특성을 갖도록 제조된 금 나노입자를 접합체 제조에 적용하기 때문으로 판단된다. 이와 관련하여, 샘플(또는 샘플 용액) 내 B형 간염 바이러스의 검출 한계는, 예를 들면 100 ng/ml 이하, 심지어 약 1 ng/ml의 낮은 수준일 수 있는 바, 이는 본 구체예에서 사용된 LFA 기반의 센서의 B형 간염 바이러스에 대한 검출 감도가 현저히 높은 수준임을 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예에서 사용된 물질은 하기와 같다.

- Au(III) 클로라이드 트리하이드레이트(HAuCl₄ㅇ3H₂O, 99%), 트리소디움 시트레이트 디하이드레이트, KH₂PO₄ 및 소 혈청 알부민(BSA)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.

- 수크로오스, K₂CO₃, Tween 20, 디소디움 하이드로겐 포스페이트(Na₂HPO₃·12H₂O) 및 폴리비닐 알코올 1500 (PVA 1500)은 Junsei사로부터 구입하였다.

- 정제된 HBsAg에 대한 항체, 염소 항-마우스 IgG, 및 재조합 HBsAg는 Bore Da Biotech Co. Ltd.로부터 구입하였다.

- 흡수 배드, 백킹 카드, 니트로셀룰로오스 멤브레인(NC), 샘플 패드 및 접합 패드는 Bore Da Biotech Co. Ltd.로부터 구입하였다.

(1) 실험 절차

가. 금 나노입자(AuNPs)의 제조

시드 성장법에 의하여 상이한 사이즈를 갖는 금 나노입자를 합성하였다. 먼저, Au 시드는 하기의 절차에 따라 제조되었다.

소디움 시트레이트 용액(2.2 mM 및 150 mL)을 3구 둥근바닥 플라스크(three-necked round-bottomed flask)에 주입한 다음, 15분 동안 가열하였다. 상기 과정 동안 응축기를 이용하여 용액의 증발을 블로킹하였다. 이후, 1 mL의 HAuCl₄ (25 mM)를 첨가하여 10분 동안 반응시켰다. 노란색으로부터 짙은 분홍색으로의 색상 변화가 관찰되었다. 상기 제조된 Au 시드 분산물을 90℃에서 유지하였다.

금 나노입자의 사이즈를 조절하기 위하여, 1 mL의 소디움 시트레이트 용액(60 mM) 및 1 mL의 HAuCl₄(25 mM)를 순차적으로 주입하였다. 30분 동안 반응시킨 후, 결과로서 얻어진 생성물은 금 나노입자이었다. 상기 공정을 14회까지 반복하여 금 나노입자의 직경을 증가시켰다. 각각의 사이클 수행 후, 샘플을 수집하여 TEM(transmission electron microscopy), UV-vis 스펙트로스코피 및 DLS(dynamic light scattering)을 이용하여 특성화하였다.

나. 금 나노입자와 항체의 접합체 제조

금 나노입자를 항체와 접합하기에 앞서, 0.25 M K₂CO₃ 용액을 첨가함으로써 금 나노입자의 분산물의 pH를 조정하였다. 그 다음, 항체를 금 나노입자의 분산물(5 mL)에 첨가한 후, 교반기를 이용하여 30분 동안 혼합물을 상온에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에 혼합물을 15분 동안 10000 rpm로 원심분리시켰다. 이후, 상층액을 제거한 다음, 1 mL의 BSA를 첨가하여 샘플을 재분산시켰다. 후속적으로, 교반기를 이용하여 30분 동안 상기 혼합물을 상온에서 인큐베이션시켰다. 원심분리 및 분산(서스펜션) 프로세스를 2회 반복하였으며, 최종 단계에서 400 μL의 BSA (1%)를 첨가하였다. 접합 공정을 최적화하기 위하여, 1중량%의 NaCl 용액을 첨가한 후에 OD₅₂₅에서 흡수도의 최소 감소를 측정함으로써 pH(6.17 내지 10.0) 및 항체의 농도(1 내지 20 μg/ml)를 스크리닝하였다.

다. 면역크로마토그래피 테스트 스트립의 제작

측면 흐름 분석(LFA) 스트립은 샘플 패드, 접합 패드, 니트로셀룰로오스(NC), 및 흡수 패드로 구성되었다. 상기 구성 요소를 조립하기에 앞서, 접합 패드를 0.05% PVA 및 0.05% Tween 20으로 포화시켰고, 24 시간 동안 상온에서 건조시켰다. 접합 패드를 항체-접합된 금 나노입자(AuNP) 분산물로 적신 후에 건조기 내에서 하룻밤에 걸쳐 상온에서 건조시켰고, 이후 포획 항체(1 mg/mL) 및 염소 항-마우스 IgG(1 mg/mL)를 각각 분배(dispersal) 시스템을 이용하여 NC의 테스트 라인 및 컨트롤 라인에 고정시켰다. 제조된 샘플 패드, 접합 패드, 니트로셀룰로오스, 및 흡수 패드를 백킹 카드 상에서 조립하였다. 제조된 카드를 5 mm 스트립으로 절단함으로써 LFA 스트립을 얻었다. 금 나노입자 사이즈의 영향을 검사하기 위하여, 1, 3, 7, 10, 및 14의 성장 단계 후에 얻어진 금 나노입자를 사용하여 LFA 스트립을 제작하였다.

라. 색상 시그널 강도 측정

타겟 검체의 량을 정량화하기 위하여 Immuno-strip 101 Analyzer(T&S Co., Ltd.)를 이용하여 테스트 라인 상의 금 나노입자로부터 얻어지는 색상 또는 비색(colorimetric) 시그널을 측정하였다. 100μL의 HBV 항원(농도: 500 ng/mL, 100 ng/mL, 및 10 ng/mL)을 샘플 패드 상에 로딩하는 한편, 항체-접합된 금 나노입자(1, 3, 7, 10 및 14의 상이한 성장 단계 후에 수득됨)를 접합 패드 상에 스프레이하였다. 접합 패드 상에서 항체-접합된 금 나노입자는 HBV 항원과 커플링되었고, 이후 AuNP와 연결된 HBV 항원은 테스트 라인 상에 고정된 항체에 의하여 포획되었다. Aptina MT9P031 CMOS 센서를 구비한 Basler Ace 카메라 107(acA2500-14uc)을 이용하여 색상 시그널을 얻었다. 스트립 이미지 캡쳐링 과정에서 일정한 광 조건을 형성하기 위하여 암실 내에서 아날로그 제어기(LS501A, Image Focus Company)를 구비한 60 W LED 램프를 이용하였다. 캡쳐링된 이미지를 Visual Inspector 2D 소프트웨어(Visual C++)에 기반한 자체 제작 분석 프로그램)를 통하여 프로세싱하였다.

(2) 실험 결과 및 분석

도 2a 내지 도 2f 각각은 상이한 성장 단계로부터 수득된 금 나노입자(AuNPs)의 전형적인 형태학적 특징을 나타내는 TEM 사진 및 상이한 사이즈의 금 나노입자의 사이즈 분포를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 성장 단계가 증가할수록 금 나노입자의 직경은 점차적으로 증가하였다: 각각 15.9±2.5 nm(시드), 21.7±1.7 nm(1 step), 30.1±2.5 nm(3 steps), 43.7±1.2 nm(7 steps), 91.2±8.1 nm(10 steps), 및 105.9±11.2 nm(14 steps).

DLS를 이용하여 금 나노입자의 평균 사이즈를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, 사이즈는 각각 34.0±1.2 nm(1 step), 42.7±0.8 nm(3 steps), 64.7±0.2 nm(7 steps), 106.5±0.1 nm(10 steps), 및 137.8±0.45 nm(14 steps)이었다.

고-해상도 TEM 이미지로 관찰 시, 시트레이트 캡핑제의 박막의 컨포멀(conformal) 코팅이 금 나노입자의 표면 상에서 명확히 관찰되었다. 상이한 성장 단계를 이용한 금 나노입자 분산물의 광학적 물성을 UV-vis 스펙트로스코피에 의하여 검사하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 금 나노입자(1 성장 단계)에 대한 520 nm에서의 초기 피크는 적색 쉬프트(shift)를 나타내었고, 금 나노입자의 사이즈가 34 nm에서 137.8 nm로 증가함에 따라 확장되었다. 이러한 결과는 금 나노입자가 준구형(quasi-sphere) 형상 및 균일한 분산도를 갖고 있음을 지시한다. 금 나노입자 분산물의 색상은, 금 나노입자의 사이즈가 증가함에 따라 적색으로부터 약갈색의 적색으로 변화하였다(도 4의 삽입도 참조). TEM 및 UV-vis 스펙트로스코피에 기초하여, 합성된 금 나노입자는 양호하게 제어된 나노입자 사이즈를 갖는 고품질의 특성을 나타내었다.

항체와 접합된 금 나노입자(AuNP-Ab)를 UV-vis 스펙트럼에 의하여 특성화하여 접합 안정성 및 초기 색상 유지능을 평가하였다. 도 5는 금 나노입자(AuNP) 및 금 나노입자와 항체(AuNP-Ab) 분산물에 대한 UV-vis 스펙트럼을 나타내며, 상기 도면의 삽입도에서는 접합 전후의 사진을 보여준다. 최적 조건 하에서, AuNP-Ab은 AuNP 분산물과 동일한 색상을 나타내었다. 항체와 접합한 후, AuNP-Ab은 점차적인 적색 쉬프트 및 감소된 흡수 피크 강도를 나타내었다. 높은 염 농도에 노출됨에 따라 콜로이드 AuNP의 표면 플라즈몬 공명이 변화하였다. AuNP 사이의 정전기적 반발 부하의 감소로부터 기인하는 고농도의 전해질로 인하여 AuNP 응집(flocculation) 현상이 발생하였다. AuNP가 응집될 때, AuNP 분산물의 색상은 회색 또는 검정색으로 변화하였다. 안정적인 AuNP 및 항체의 접합에 대하여 응집분석(Flocculation assay)을 수행하였으며, 그 결과를 도 6a 내지 도 6f에 나타내었다. 이때, 상이한 사이즈의 AuNP(34.0±1.2 nm, 42.7±0.8 nm, 및 137.8±0.45 nm)를 사용하였다.

상기 도면에 따르면, 상이한 pH 값(약 6 내지 10) 및 항체 농도(1 내지 20 μg/ml)에 따른 OD₅₂₀, OD₅₂₅ 및 OD₆₁₀에서 흡수도의 최소 감소 및 적색에서 회색을 띄는 청색으로의 겉보기 색상 변화가 존재하지 않음을 기초로 하여 최적화된 접합 조건을 선정하였다.

도 6a 내지 도 6d에 따르면, UV-vis 스펙트럼 및 색상 변화에 기초한, 최적 pH 및 AuNP-Ab(34.0±1.2 및 42.7±0.8)에 대한 농도는 각각 9 및 10 μg/ml이었다. 보다 큰 사이즈의 AuNP(137.8±0.45 nm)를 사용할 경우, 최적 pH 및 농도는 각각 7.22 및 20 μg/ml으로 변화하였다(도 6e 및 도 6f).

나노입자 사이즈의 영향을 규명하기 위하여 최적화된 접합 조건에 기초하여 상이한 사이즈를 갖는 금 나노입자(1, 3, 7, 10, 및 14 성장 단계)를 이용한 측면 흐름 분석(LFA)-기반 스트립을 제작하였다(도 1 참조). LFA 테스트는 다양한 생물학적 및 비생물학적 구성 요소에 의존하기 때문에 동일한 실험 조건 하에서 금 나노입자의 사이즈를 변화시키면서 LFA를 제작하였다.

1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 μg, 10 μg, 및 100 μg의 항원(Ag) 농도에서 LFA를 분석하였는 바, 금 나노입자의 사이즈가 LFA 성능에 명백히 영향을 미치는 점을 확인하였다. 구체적으로, 1 및 3 금 나노입자의 성장 단계는 7, 10 및 14 성장 단계에 기초한 LFA보다 명확한 결과를 나타내었다. 또한, 1 및 3 성장 단계에 기초한 LFA는 1 ng만큼 낮은 항원(Ag) 농도까지 검출할 수 있었다. AuNP 사이즈가 LFA 성능에 미치는 영향을 규명하기 위하여, Immuno-strip Analyzer를 이용하여 LFA의 테스트 라인에서의 색상 강도를 측정하였다(도 8 참조). 모든 강도는 항원(Ag) 로딩하고 10분이 경과한 후에 검출되었고, 기록 데이터는 하기 수학식 1을 이용하여 백분율로 나타내었다.

[수학식 1]

여기서, V_c는 음성 대조군의 컨트롤 라인의 강도이고, V_n은 처리되지 않은(bare) 니트로셀룰로오스 멤브레인의 강도이고, 그리고 V_m은 각각의 샘플로부터의 테스트 라인의 강도이다. 도 8에 도시된 바와 같이, 검출 강도는 HBV 농도에 따라 증가하였고, 3 성장 단계(42.7±0.8 nm)에 기반한 LFA는 LFA 중 가장 양호한 성능을 나타내었다. 이러한 42.7±0.8 nm에 기반한 LFA의 시그널은 Turkevich-Frens 합성법으로부터 수득된 금 나노입자에 기반한 LFA와 대비하면 우수하였다.

이러한 결과는 금 나노입자의 사이즈가 검출 감도에 있어서 중대한 역할을 하게 됨을 지시한다. LFA의 시그널 가시성은 금 나노입자의 직경을 1 단계로부터 3 단계로 증가시킴에 따라 개선될 수 있는 바, 이는 사이즈에 있어서 관찰 가능한 차이를 증가시키기 때문이다. 그러나, 금 나노입자의 사이즈가 3 단계로부터 15 단계로 증가함에 따라 시그널 강도는 금 나노입자의 감소된 접합 효율로 인하여 저감되어 LFA의 강도를 낮추게 된다.

실제 테스트를 위하여, 인체 전혈 샘플(500 ng/mL HBsAg)에 대하여 3개의 상이한 LFA(예를 들면, 상용 HBV 키트(Humasis), Turkevich-Frens 합성법에 기초한 LFA, 및 실시예에 따른 LFA(42.7±0.8 nm AuNPs)를 이용하여 테스트하였으며, 그 결과를 도 9a 내지 도 9c에 나타내었다. Turkevich-Frens 합성법에 기초한 LFA와 대비하면, 실시예에 따른 LFA는 보다 명확한 시그널을 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 실시예에 따른 LFA로부터 얻어진 시그널은 상용 LFA에 필적할만한 수준이었다.

전술한 바와 같이, B형 간염의 표면 항원의 검출을 위하여 상이한 사이즈를 갖는 금 나노입자를 기반으로 하는 LFA 바이오센서를 제작하였다. 시드 성장 합성법을 통하여 양호하게 제어된 사이즈(34.0±1.2 nm에서 137.8±0.45 nm까지)를 갖는 금 나노입자를 제조하였다. 상이한 사이즈를 갖는 금 나노입자는 TEM 이미지 및 UV-vis 스펙트로스코피에 기초하여 특성화되었다.

실험 결과, 항체와 금 나노입자의 응집을 방지하기 위하여 접합 조건은 pH 9 및 10 μg/ml(항체 농도)에서 최적화되었다. 또한, 5개의 상이한 사이즈를 갖는 금 나노입자를 이용하여 LFA 바이오센서를 제작하였고 색상 강도를 분석한 결과, 42.7±0.8 nm의 금 나노입자를 기반으로 하는 LFA 바이오센서가 B형 간염 표면 항원을 검출하는데 가장 우수한 감도를 나타내었다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

100: 측면 흐름 분석-기반 바이오센서
101: 샘플 패드
102: 접합 패드
103: 검출 영역
104: 테스트 영역
105: 컨트롤 영역
106: 백킹 카드
107: 흡수 패드

Claims (20)

1. 타겟 검체의 진단용 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서를 제조하는 방법으로서,
   a) 시드 성장법에 의하여 20 내지 140 nm의 사이즈를 갖는 금 나노입자를 제조하는 단계;
   b) 타겟 검체에 특이적인 제1 바인더와 상기 단계 a)에서 제조된 금 나노입자가 접합되어 있는 접합체(conjugates)를 제조하는 단계; 및
   c) 일단으로부터 타단 방향으로 순차적으로 (i) 흡수성 샘플 패드, (ii) 상기 단계 b)에서 제조된 접합체를 포함하는 접합 패드, (iii) 상기 접합체의 제1 바인더와 결합된 타겟 검체와 특이적으로 결합하는 제2 바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1 바인더와 결합하는 제3 바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역, 및 (iv) 흡수 패드를 포함하는 측면 흐름 분석-기반의 센서를 제조하는 단계;
   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)는,
   a1) 시드 금 나노입자의 수분산물을 제공하는 단계;
   a2) 상기 시드 금 나노입자의 수분산물에 캡핑제(capping agent) 및 금 전구체를 첨가하는 단계; 및
   a3) 상기 수분산물에 함유된 시드 금 나노입자를 성장시켜 증가된 사이즈의 금 나노입자를 형성하는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 단계 a3)는 적어도 2회 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 단계 a3)는 80 내지 97℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 시드 금 나노입자는 10 내지 18 nm 범위의 사이즈를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제2항에 있어서, 상기 단계 a1)은,
   캡핑제를 함유하는 수용액을 제공하는 단계, 및
   상기 수용액을 승온시킨 후에 금 전구체를 첨가하여 반응시킴으로써 시드 금 나노입자의 수분산물을 형성하는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제2항 또는 제6항에 있어서, 상기 금 전구체는 HAuCl₄, AuCl, AuCl₂, AuCl₃, Na₂Au₂Cl₈, NaAuCl₂, 및 이의 수화물로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 금 전구체는 HAuCl₄인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제2항 또는 제6항에 있어서, 상기 캡핑제는 시트레이트(citrate), 말레이트(malate), 옥살레이트(oxalate), 아스파르테이트(aspartate) 및 글루타메이트(glutamate)로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 캡핑제는 소디움 시트레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)는 수분산물 내에서 수행되며, 상기 수분산물의 pH는 6 내지 10, 그리고 제1 바인더의 농도는 1 내지 20 μg/ml 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제2항 또는 제6항에 있어서, 상기 금 전구체의 첨가 량은, 금 전구체 : 캡핑제의 비(몰 기준)가 12 내지 0.4 : 1인 범위 내에서 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 금 나노입자를 이용한 스트립 형태의 측면 흐름 분석-기반의 바이오센서로서,
    일단으로부터 타단 방향으로 순차적으로 배치된 (i) 흡수성 샘플 패드, (ii) 타겟 검체에 특이적으로 결합하는 제1 바인더와 금 나노입자가 접합되어 있는 접합체(conjugates)를 포함하는 접합(conjugation) 패드, (iii) 상기 접합체의 제1 바인더와 결합되는 타겟 검체를 특이적으로 결합하는 제2 바인더가 고정된 테스트 영역 및 상기 타겟 검체에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 제1 바인더와는 결합하는 제3 바인더가 고정된 컨트롤 영역을 포함하는 다공성 멤브레인 재질의 검출 영역, 및 (iv) 흡수 패드;
    를 포함하고,
    여기서, 상기 금 나노입자는 시드 성장법에 의하여 20 내지 140 nm의 사이즈를 갖도록 조절되는 바이오센서.
14. 제13항에 있어서, 상기 금 나노입자는 10% 미만의 표준 편차를 갖는 사이즈 분포를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
15. 제13항에 있어서, 상기 제1 바인더, 상기 제2 바인더 및 상기 제3 바인더는 각각 항체, 항원, 핵산, 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 또는 호르몬-수용체인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
16. 제13항에 있어서, 상기 타겟 검체는 B형 간염 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
17. A) 액상의 분석용 샘플을 제공하는 단계;
    B) 제13항에 따른 스트립 형태의 측면 흐름분석-기반의 센서를 제공하는 단계, 상기 타겟 검체는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원임;
    C) 상기 샘플을 상기 측면 흐름분석-기반의 센서의 샘플 패드에 로딩시키는 단계; 및
    D) 상기 센서의 검출 영역 내 테스트 영역으로부터 상기 접합체에 의하여 생성된 시그널을 측정하여 상기 분석용 시료 내에 B형 간염 바이러스(HBV) 항원을 정성적 및/또는 정량적으로 분석하는 단계;
    를 포함하는 B형 간염 바이러스의 진단방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 항원은 HBsAgs을 포함하는 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스의 진단방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 접합체는 금 나노입자와 마우스 항-휴먼 IgG(mouse-anti human IgG)의 접합체이며, 상기 컨트롤 영역 상의 제3 바인더는 항체로서 항-마우스 IgG(anti-mouse IgG)인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스의 진단방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 스트립 형태의 측면 흐름분석-기반의 센서의 B형 간염 바이러스(HBV) 항원에 대한 검출 한계는 1 ng/ml인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스의 진단방법.

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