KR20200136705A

KR20200136705A - 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법

Info

Publication number: KR20200136705A
Application number: KR1020190062610A
Authority: KR
Inventors: 이소연; 박경숙; 권정선; 배판기; 이의진; 신용범
Original assignee: 재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2020-12-08
Also published as: KR102314073B1

Abstract

본 발명은 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 본 발명은 피콜린-1을 포획제(capture agent)로 사용함에 따라 서로 다른 표적물질을 짧은 시간 안에 높은 민감도로 다중 진단할 수 있다. 본 발명을 사용하면 감염성 질환의 신속, 정확한 진단 및 검출이 가능하고, 이를 통해 다양한 새로운 감염균 및 감염 바이러스에 대한 분자진단 기술개발 분야에 널리 활용될 수 있음은 물론, 신속한 처치를 통해 감염성 질환의 효율적인 치료에 크게 일조할 것으로 기대된다.

Description

피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법{Composition for detecting target material comprising ficolin-1 and method for detecting using the same}

본 발명은 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.

아르보바이러스(arboviruses, 또는 절지동물매개바이러스)는 모기, 진드기, 모래 파리와 같은 흡혈 절지동물(hematophagous arthropod)에 물려 감염되는 바이러스 감염병을 말한다. 이 중, 지카바이러스(Zika virus, ZIKV), 뎅기열(Dengue, DENV), 치쿤구니야(Chikungunya, CHIKV)와 같은 모기 매개 바이러스는 전지구적 확산에 따라 전세계적으로 중요한 공중보건 문제가 되었고, 2016년 국제보건기구(WHO)는 지카바이러스의 전세계적 대유행이 예상되어 국제 보건 비상사태를 선포한 바 있다. 최근에는, 무증상 감염을 포함하여 매년 3억 9천만 건의 아르보바이러스 감염 사례가 보고되고 있다. 전세계가 일일 생활권이 되고 지구 온난화로 매개체의 서식지가 넓어져, 이와 같은 감염성 질병은 전세계적으로 지속적으로 발생할 것으로 예상된다. 따라서, 이러한 질환들이 토착화되는 것을 예방하고, 신속한 진단, 검역, 매개체 관리 등을 통해 사전에 확산을 예방하기 위한 진단 분야 연구가 절실한 실정이다.

현재 이와 같은 바이러스의 감염 진단은 발열, 발진 및 관절통, 두통과 같은 임상 증상을 보이는 환자를 대상으로 혈액에서 바이러스를 분리하거나 검체에서 항원 또는 유전자를 검출하여 PCR을 수행하는 방법이 사용되고 있으나, 바이러스 감염이 비슷한 증상을 보여 신속한 임상적 구분 및 검출에 많은 시간과 비용이 발생할 뿐만 아니라, 확진에도 어려움이 있다. 혈청검사의 경우 병의 급성기에 채취된 혈청에서 바이러스-특이 IgM을 검출하여 감염 진단 및 면역 측정이 가능하나, 항원 검출보다 민감성이 떨어지며 감염 직후 처음 5~6일 동안은 적절하지 않다.

피콜린(ficolin)은 콜라겐-유사 도메인, 피브리노겐-유사 도메인으로 구성된 단량체의 복합체로 구성되어 있는 올리고머 단백질로, N-말단 도메인은 탄수화물을 특이적으로 인식하여 외부 미생물을 구분하고, 인간 선천 면역 체계에서 렉틴 보체 경로(lectin complement pathway)의 활성화를 시작하는 단백질로 알려져 있다. 인간에는 피콜린-1(M-ficolin), 피콜린-2(L-ficolin), 피콜린-3(H-ficolin)의 3가지 유형이 존재하며, 이 중 피콜린-1은 피브리노겐 도메인을 통해 미생물 탄수화물의 시알산에서 N-아세틸화된 잔기를 인식하여 렉틴 보체 경로를 활성화시킨다고 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 피콜린-1 기반의 표적물질 검출용 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 피콜린-1을 포획제(capture agent)로 사용하는 경우 피콜린-1이 타겟-항체 복합체(target-antibodies complex)와 비특이적으로 결합함에 따라 짧은 시간 안에 높은 민감도로 2개 이상의 서로 다른 표적물질을 동시에 검출가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 표적물질 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피콜린-1 기반의 표적물질 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 피콜린-1 기반의 검출용 키트를 이용한 표적물질 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 피콜린-1을 포획제(capture agent)로 사용함에 따라 서로 다른 표적물질을 짧은 시간 안에 높은 민감도로 다중 진단할 수 있다. 본 발명을 사용하면 감염성 질환의 신속, 정확한 진단 및 검출이 가능하고, 이를 통해 다양한 새로운 감염균 및 감염 바이러스에 대한 분자진단 기술개발 분야에 널리 활용될 수 있음은 물론, 신속한 처치를 통해 감염성 질환의 효율적인 치료에 크게 일조할 것으로 기대된다.

도 1은 피콜린-1의 DENV 및 CHIKV의 외피 단백질(envelope protein, EP)과의 상호작용 특성을 (a) ELISA, (b) 공-면역침강법(Co-immunoprecipitation), (c) 점블럿검정을 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립을 사용한 DENV 및 CHIKV의 검출 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 피콜린-1을 포획제(capture agent)로 사용하는 경우 피콜린-1이 타겟-항체 복합체(target-antibodies complex)와 비특이적으로 결합함에 따라 짧은 시간 안에 높은 민감도로 2개 이상의 서로 다른 표적물질을 동시에 검출 가능함을 확인하고, 피콜린-1 기반의 표적물질 검출용 조성물이 시료로부터 표적물질을 고민감도로 검출하는 용도로 가치가 매우 높음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 표적물질은 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 박테리아 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 바람직하게는 아르보바이러스(arbovirus)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 진드기(tick) 또는 모기(mosquito) 매개 바이러스일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 모기 매개 바이러스 일 수 있다.

상기 진드기 매개 바이러스는 카샤늘숲바이러스(Kyasanur forest disease virus) 또는 진드기 매개 뇌염바이러스(Tick-borne encephalitis virus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 모기 매개 바이러스는 뎅기 바이러스(Dengue virus, DENV), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV), 머레이 계곡 뇌염 바이러스(Murray Valley encephalitis virus, MVEV), 성루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus, SLE), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus, WNV), 스폰드웨니 바이러스(Spondweni virus, SPOV), 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV), 황열(yellow fever) 및 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 박테리아는 하나 또는 두 종류 이상의 외인성 박테리아(세균, 그람-음성균 또는 그람-양성균을 모두 포함한다)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 검출용 조성물은 검출의 신속도 및 편리성을 높이기 위해 적합한 담체 또는 지지체 상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다. 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로오스, 니트로셀룰로로오스 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs)이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면) 또는 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 포함하는 피콜린-1 기반의 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 검출용 키트는 이에 제한되지는 않으나 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 면역분석(immunoassay)용 키트일 수 있고, 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트일 수 있다.

상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, ELISA 키트, 또는 면역학적 도트 키트 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

상기 검출용 키트는 가장 바람직하게는 면역크로마토그래피 분석법을 기초로 하는 측면 유동 검사(lateral flow assay, 또는 측면 유동 면역분석(lateral flow immunoassay)) 키트의 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 상기 진단 키트는 면역 크로마토그래피 분석 스트립으로 제공될 수 있고, 보다 바람직하게는 측면 유동 면역분석용 스트립으로 제공될 수 있다.

측면 유동 면역분석법(lateral flow immunoassay, LFA)은 금 입자가 결합된 항원 또는 항체가 고정된 멤브레인 및 액체시료의 모세관 이동을 하는 것을 이용하여 시료 내 표적물질(항원, 항체)을 진단 및 검출하는 방법으로, 실온에서도 장기보존이 가능하고 특별한 장비 없이도 빠른 시간 내에 결과를 얻을 수 있어 현장분석에 널리 이용된다. 그러나, 측면 유동 면역분석법은 육안 식별 평가에 의존함에 따라 ELISA에 비해 분석 민감도가 낮고 정량성이 없다는 문제점이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 포획제로 콜라겐-유사 도메인(collagen-like domain), 피브리노겐-유사 도메인(fibrinogen-like domain)으로 구성된 단량체의 복합체로 구성되어 있는 올리고머 단백질인 피콜린-1을 사용한 피콜린-1 기반의 분석 스트립(측면 유동 면역분석용 스트립)을 개시하면서, 피콜린-1을 포획제로 사용함에 따라 경우 바이러스 또는 박테리아의 외피 단백질에 특이적으로 결합하여 검출하고자 하는 타겟(표적물질)을 신속하고 정확하면서도 동시에 여러 개 검출할 수 있음을 확인하고 있다. 이를 통해, 본 발명자들은 본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립을 사용하면, 종래의 측면 유동 면역분석 스트립의 기본 측정 원리를 따르면서도, 피콜린-1을 포획제로 선택하여 높은 민감도로 신속하게 다수 개의 병원균을 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다.

보다 상세하게는, 본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립은 시료(또는 샘플)가 적용되는 샘플 패드(sample pad), 타겟(항원)-항체 복합체가 이동하는 전개용 멤브레인 및 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수 패드(absorption pad)를 포함한다. 상기 멤브레인 상에는 샘플 패드로부터 흡수 패드 방향으로 테스트 라인 및 컨트롤 라인이 형성되어 있고, 상기 테스트 라인에는 타겟(항원)에 결합하는 포획제(capturing agent)가 고정되어 있고, 상기 컨트롤 라인에는 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “샘플 패드”는 분석을 수행할 샘플을 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 수행할 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면(cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립은 스트립 내에 탐지용 항체가 코팅되어 있는 접합 패드 또는 방출 패드(releasing pad)를 두는 대신, 검출하고자 하는 샘플과 상기 샘플을 타겟으로 하여 미리 준비한 항체 용액(antibody solution)을 혼합하여 타겟-항체 복합체(target-antibodies complex)를 형성하고, 상기 혼합물을 스트립의 샘플 패드에 적용하여 전개시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 용액은 나노입자에 결합된 검출항체를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 검출가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다. 상기 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 루테늄(Ru)의 귀금속; 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf), 바나듐(V), 나이오븀(Nb), 탄탈럼(Ta), 크로뮴(Cr), 몰리브데늄(Mo), 텅스텐(W), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os)의 전이금속; 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co)등의 금속; 산화마그네슘(MgO), 이산화티타늄(TiO₂), 오산화바나듐(V₂O₅), 산화아연(ZnO)의 금속산화물 등의 금속 나노입자, 라텍스 비드(latex bead), 자성 입자(magnetic bead), 양자점(quantum dot), 상방전환나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP), 그래핀(graphene)-나노입자 복합체 및 색염색 나노입자(color dyed particles)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 금(Au) 나노입자 또는 라텍스 비드(latex bead), 가장 바람직하게는 라텍스 비드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 색이 있는 라텍스 비드를 사용하여 항체를 표지하였다.

본 발명에 있어서, 상기 검출항체는 검출 또는 분석하고자 하는 표적물질에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 결합 특이성을 보유한다면 항체의 단편도 포함하는 의미이다.

상기 검출항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.

상기 나노입자와 검출항체의 결합은 예컨대 이온결합, 공유결합, 금속결합, 배위결합, 수소결합 및 반데르발스 결합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 “멤브레인”은 샘플 물질이 통과할 수 있는 어떠한 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO₄, 또는 다른 무기미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있고, 바람직하게는 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 “흡수패드”는 상기 멤브레인의 말단 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 상기 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 샘플을 받아들이며, 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.

본 발명에 따른 분석 스트립은 상기 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 동일한 지지체상에 순차적으로 연결되어 구성될 수 있다.

상기 지지체는 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나, 일반적으로 상기 멤브레인을 통해 확산하는 샘플의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대, 유리; 중합체물질 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 멤브레인상에는 샘플 패드로부터 흡수 패드 방향으로 테스트 라인(test line) 및 컨트롤 라인(control line)이 순차적으로 형성되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “테스트 라인”에는 검출 또는 분석하고자 하는 항원(표적물질)에 결합하는 포획제(capture agent)가 고정되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “컨트롤 라인”에는 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있다. 컨트롤 라인의 2차 항체는 나노입자에 결합된 검출항체에 결합하여 이에 대한 검출 신호를 발생시킨다.

본 명세서에서, 용어 “항원”은 농도 또는 존재 여부를 분석하고자 하는 대상물질을 지칭하는 의미이며, 본 명세서 내에서 “표적물질”과 혼용되어 사용될 수 있고, 예컨대 단백질, 펩타이드, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 박테리아 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 박테리아 또는 바이러스일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 피콜린-1 기반 분석 스트립에서, 샘플을 샘플 패드에 로딩시키면, 상기 샘플은 모세관 현상에 의해 테스트 라인, 컨트롤 라인을 거쳐 전개된다. 이때, 샘플 중에 존재하는 표적물질은 멤브레인을 통과하면서 테스트 라인, 컨트롤 라인에 고정화된 피콜린-1, 항체와 결합하여, 표적물질의 존재여부를 검출하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 샘플은 스트립에 투입되기 전 검출 또는 분석하고자 하는 표적물질(타겟)이 존재할 것으로 예상되는 샘플과 본 발명에 따른 항체 용액을 혼합하여 타겟-항체 복합체를 형성한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 용액은 나노입자에 결합된 검출항체를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 나노입자의 종류는 전술한 바와 같이 금속 나노입자, 라텍스 비드 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 색이 있는 라텍스 비드(latex bead)가 결합된 항-CHIKV 및 항-DENV를 포함하는 항체 용액을 사용하여 샘플 내에서 치쿤구니야 바이러스 및 뎅기 바이러스를 동시에 검출할 수 있음을 확인하고 있다.

본 발명의 피콜린-1 기반 검출용 키트는 표적물질의 검출에 필요한 시약 및 검출 장치 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 검출용 키트를 사용하여 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 바람직하게는 피콜린-1 기반의 분석 스트립을 이용하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 표적물질을 포함하는 시료를 본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립의 샘플 패드에 투입하는 단계; 및 멤브레인에서 발색을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “시료”는 분석하고자 하는 항원을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 물질을 의미한다. 예컨대, 혈액, 간질액, 타액, 접안 렌즈 유체, 뇌척수액, 땀, 소변, 젖, 복수, 점액, 비강유체(nasal fluid), 객혈, 관절혈액, 복강액, 질액, 월경분비물, 양수 및 정액을 포함하며, 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터도 유래될 수 있다. 한편, 본 명세서 내에서 상기 “시료”는 “샘플”과도 혼용되어 사용된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 바이러스 외피 단백질에 대한 피콜린-1의 결합 분석

스트렙타비딘 결합 펩타이드(streptavidin binding peptide, SBP) 태그된 피콜린-1, HIS 태그된 CHIKV E2 Δ당단백질 및 DENV EΔ당단백질은 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)를 사용하여 곤충세포에서 발현시키고 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제한 것을 사용하였다.

1-1. ELISA

ELISA를 통해 피콜린-1의 외피 당단백질에 대한 결합을 분석하였다. 먼저, 소혈청알부민(BSA) 또는 탄산염 완충액(50 mM Na₂CO₃, 50 mM NaHCO₃, pH9.0)으로 1μg/ml 농도로 희석된 CHIKV 및 DENV의 정제된 외피 단백질을 플레이트(microtiter plate)에 첨가하고, 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅하였다. 항원이 코팅된 각 웰에 2% BSA가 포함된 인산완충용액(PBS)을 처리하여 비특이적 결합을 차단하고, SBP 태그된 피콜린-1 10μM이 함유된 결합 완충액(20mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl₂, 0.05% Tween 20, 0.1%(w/v) BSA, 10mM MgCl₂ 및 10mM CaCl₂)을 첨가하여 실온에서 한시간 동안 배양하였다. 세척 후, HRP가 결합된 스트렙타비딘(Thermo Fisher Scientific, USA)을 첨가하고 배양한 다음, 다시 PBST로 6회 세척하고, TMB(Sigma, USA) 기질 용액을 각 웰에 첨가하고 정지 용액(stop solution; Abcam Inc., USA)을 처리하여 반응을 정지시켰다. 반응 후, 96-웰 플레이트 ELISA 리더기를 이용하여 O.D.값 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 단계 사이에 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 5회 세척하였다. 그 결과를 도 1의 a에 나타내었다.

도 1의 a에 나타낸 바와 같이, 피콜린-1은 DENV2 및 CHIKV 외피 단백질에 대하여 높은 결합력을 가짐을 확인하였다.

1-2. 공- 면역침강법 (co- immunoprecipitation )

공-면역침강법을 통해 피콜린-1의 외피 당단백질에 대한 결합을 분석하였다. 먼저, SBP 태그된 피콜린-1 10μM를 스트렙타비딘 마그네틱 비드(magnetic bead)와 함께 배양하였다. 피콜린-1로 코팅된 마그네틱 비드를 2% BSA로 블로킹하고, 정제된 HIS 태그된 EP(5μM)가 포함된 결합 버퍼로 면역침강 분석을 수행하였다. 5회 세척 후, 상기 샘플들을 SDS-PAGE(12%~4% gradient; Invitrogen, USA)를 이용하여 전기 영동상에서 분리하였다. 그 후, 토끼 항-HIS 폴리클로날 항체 1μg/ml와 HRP가 결합된 항-토끼 IgG(BIO-RAD, U SA)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과를 도 1의 b에 나타내었다.

도 1의 b에 나타낸 바와 같이, 대조군인 BSA와 비교하여 DENV2 및 CHIKV 외피 단백질에 대하여 50KDa에서 유의미한 밴드가 나타남을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 피콜린-1은 DENV2 및 CHIKV 외피 단백질에 대하여 높은 결합력을 가짐을 확인하였다.

1-3. 점블럿검정 (닷 블럿 분석)

단백질 점블럿검정(닷 블럿 분석) 분석을 통해 피콜린-1 및 바이러스 간 상호작용을 분석하였다. CHIKV (1 × 10⁷ TCIC₅₀/mL) 및 DENV (1 × 10⁷ TCIC₅₀/mL) 2μl을 Hybond C-extra 니트로셀룰로오스 막(BIO-RAD, USA)에 스팟팅하였다. 그 후, 0.05% Tween 20, 10mM CaCl₂ 및 5% 탈지유(skim milk)가 포함된 TBS(Tris-buffered saline)로 실온에서 1시간 동안 막을 블로킹하고, SBP 태그된 피콜린-1 10μM와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 20분씩 3회 세척한 후, 상기 막을 추가로 HRP가 결합된 스트렙타비딘과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 증가된(enhanced) 화학발광(chemiluminescence)(ECL) 키트로 상호작용을 검출하였다. 그 결과를 도 1의 c에 나타내었다.

도 1의 c에 나타낸 바와 같이, 피콜린-1은 DENV-2 및 CHIKV 바이러스와 모두 높은 친화성을 가짐을 확인하였다.

실시예 2. 피콜린-1 기반의 분석 스트립의 제조

본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립은 시료 주입을 위한 샘플 패드(sample pad), 접합 패드 또는 방출 패드(releasing pad), 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane, NC) 및 흡수 패드(absorption pad)로 이루어져 있다. 각 항체는 디스펜서(DCI100; Zeta Corporation, Korea)를 사용하여 니트로셀룰로오스 막에 분무하여 고정시켰다. 테스트 라인과 컨트롤 라인은 각각 피콜린-1(10μM)을 포획제(capturing agent)로 사용하고, 항-마우스 IgG(0.03mg/ml)를 사용하여 제작하였다. 항체를 분무한 니트로셀룰로오스 막을 상온에서 건조하였다. 빨간 라텍스 비드(latex bead)가 결합된 항-CHIKV mAb와 파란 라텍스 비드가 결합된 항-DENV mAb를 검출 항체로 사용하고 피콜린-1(1μM)로 블로킹하였다. 상기 제조한 본 발명에 따른 피콜린-1 기반의 분석 스트립을 도 2에 나타내었다.

실시예 3. 시험 스트립의 효과 검증

상기 실시예 2에서 제조한 시험 스트립의 효과를 검증하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. 25mM tris-HCl(pH 7.4), 100mM NaCl, 10mM CaCl₂, 10mM MgCl₂ 및 0.1% v/v Tween-20(Thermo Fisher Scientific, USA)가 혼합된 활성화 용액(activation solution)에 색이 있는 라텍스 비드(latex bead)가 결합된 항-CHIKV 및 항-DENV를 첨가하여 항체 용액(antibody solution)을 제조하였다. 각 바이러스 샘플을 50μl 검출 항체 용액과 혼합하고, 타겟-항체 복합체를 형성하기 위해 5분간 배양하였다. 그 후, 각 혼합물을 시험 스트립의 샘플 패드 상에 피펫팅(pipetting)하였다. 혼합물이 모세관 현상에 의해 스트립을 따라 이동하는 동안, 타겟-항체 복합체는 포획제인 피콜린-1와 상호작용함을 확인하였다. 각 바이러스들은 1 × 10⁷, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³ TCID₅₀/ml에서 실험되었고, PBST+HAS(human serum albumin)의 완충액을 사용한 음성대조군에 대하여도 동일한 시험을 수행하였다. 모든 발색 신호는 빨간색 또는 파란색의 라텍스 비드에 의해 생성되었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, DENV-2 및 CHIKV 모두에서 1 x 10⁵TCID₅₀/ml 까지 항-DENV mAb(파란색) 항-CHIKV mAb(빨간색)이 모두 검출됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 분석 스트립은 피콜린-1을 포획제로 사용함에 따라 높은 민감도로 신속하게 다수 개의 병원균을 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 기술적 범위는 전술한 실시예에 한정되지 않고 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 이때, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 고려해야 할 것이다.

Claims

피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 표적물질은 단백질, 펩타이드, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 박테리아 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 바이러스는 카샤늘숲바이러스(Kyasanur forest disease virus), 진드기 매개 뇌염바이러스(Tick-borne encephalitis virus), 뎅기 바이러스(Dengue virus, DENV), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV), 머레이 계곡 뇌염 바이러스(Murray Valley encephalitis virus, MVEV), 성루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus, SLE), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus, WNV), 스폰드웨니 바이러스(Spondweni virus, SPOV), 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV), 황열(yellow fever) 및 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 박테리아는 그람-음성균 또는 그람-양성균인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항의 검출용 조성물을 포함하는 표적물질 검출용 키트.
제5항에 있어서, 상기 검출용 키트는 분석 스트립 및 항체 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제6항에 있어서, 상기 분석 스트립은 표적물질을 포함하는 시료가 투입되는 샘플 패드; 상기 표적물질과 결합할 수 있는 피콜린-1이 고정화된 테스트 라인을 포함하는 멤브레인; 및 흡수패드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제7항에 있어서, 상기 멤브레인은 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정화된 컨트롤 라인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제6항에 있어서, 상기 스트립은 샘플 패드, 멤브레인 및 흡수패드가 지지체 상에 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 키트.
제6항에 있어서, 상기 항체 용액은 나노입자에 결합된 검출항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제10항에 있어서, 상기 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 루테늄(Ru)의 귀금속; 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf), 바나듐(V), 나이오븀(Nb), 탄탈럼(Ta), 크로뮴(Cr), 몰리브데늄(Mo), 텅스텐(W), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os)의 전이금속; 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co)등의 금속; 산화마그네슘(MgO), 이산화티타늄(TiO₂), 오산화바나듐(V₂O₅), 산화아연(ZnO)의 금속산화물 등의 금속 나노입자, 라텍스 비드(latex bead), 자성 입자(magnetic bead), 양자점(quantum dot), 상방전환나노입자(upconversion nanoparticle, UCNP), 그래핀(graphene)-나노입자 복합체 및 색염색 나노입자(color dyed particles)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 키트.
제5항의 키트를 이용하여 표적물질을 검출하는 방법.